公开/公告号CN1909922A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-02-07
原文格式PDF
申请/专利权人 马克西根公司;
申请/专利号CN03809357.X
申请日2003-02-26
分类号A61K39/12;C12P21/06;
代理机构北京市柳沈律师事务所;
代理人巫肖南
地址 美国加利福尼亚州
入库时间 2023-12-17 18:16:49
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-03-20
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K39/12 授权公告日:20130821 终止日期:20170226 申请日:20030226
专利权的终止
2013-08-21
授权
授权
2011-12-21
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K39/12 变更前: 变更后: 登记生效日:20111115 申请日:20030226
专利申请权、专利权的转移
2007-04-04
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-02-07
公开
公开
相关申请的交叉引用
本申请享有2002年2月26日申请的美国临时专利申请No.60,360,030的优先权，在此引用该临时申请公开的所有用途的全部内容作为参考。
版权公告
依照37 C.F.R.1.7.1(e)，申请人申明本申请公开的部分内容中含有被版权保护的材料。根据专利与商标机构专利文件或记录的内容显示，该版权所有者对于在专利文件或专利公开文本中任何人的复制行为并无异议，但是保留其它所有的权利。
关于联邦政府支助研究及发展的申明
本发明的部分研究过程得到了来自政府防御高级研究计划机构(DARPA)的资金支持(基金No.N65236-99-1-5421)。政府拥有本发明的一定权利。
发明领域
本发明一般涉及能诱导对一种或多种登革病毒和/或其它黄病毒(flaviviruse)的免疫应答的多肽，编码多肽的多核苷酸，制造和使用该多肽、多核苷酸的方法，以及应用该多肽和多核苷酸的诊断化验。
背景技术
黄病毒属的病毒是黄病毒科家族中的正义、单链RNA病毒，其中许多与人类和其它哺乳动物的疾病有关。黄病毒的例子包括有蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、圣·路易脑炎病毒、丙型肝炎病毒和西罗尼病毒。黄病毒属的黄病毒一般由三个主要的成熟结构蛋白构成：包膜(E)蛋白、衣壳(C)蛋白和膜(M)蛋白。M蛋白通常为前膜(prM)(pre-memberane)蛋白的水解片段。参见例如FIELDS VIROLOGY 997-998，Raven Press，Ltd.，NewYork(D.M.Knipe等人编，2001年第4版)，996(下文中简称为“FIELDSVIROLOGY”)，和ENCYCLOPEDIA OF VIROLOGY(R.G.Webster等人编，Academic Press，1999年第2版)，在此以各种目的来引述它们作参考。
登革(dengue viruse)(DEN)病毒是黄病毒中已知的人类疾病的病因。登革病毒包含4种已知不同但抗原性相关的血清型：登革-1(DEN-1或Den-1)，登革-2(DEN-2或Den-2)，登革-3(DEN-3或Den-3)和登革-4(DEN-4或Den-4)。登革病毒颗粒为典型的球形并且含有一个由脂双层包裹的致密核心(FIELDSVIROLOGY，同上)。
与其它黄病毒一样，登革病毒的基因组典型地包括一段单链正义RNA多核苷酸(FIELDS VIROLOGY，同上，第997页)。基因组RNA作为信使RNA将一段长开放读码框(ORF)翻译为一个大的多聚蛋白，该多聚蛋白被细胞内蛋白酶和病毒编码的蛋白酶的共同作用下翻译，并且在翻译后加工为许多蛋白产物(同上)。这些产物包括结构蛋白和非结构蛋白。基因组N端部分编码结构蛋白-C蛋白、prM(前膜)蛋白和E蛋白-是按以下顺序进行：C-prM-E(同上第998页)。C蛋白的C端含有一个疏水区，该疏水区在prM蛋白转移到内质网腔的过程中起到信号序列的作用(同上第998-999页)。随后prM蛋白被剪切为结构M蛋白，来自prM蛋白C末端的小结构蛋白，和极亲水的N端“pr”片段，该部分将被分泌到细胞外间质中(同上第999页)。E蛋白是膜蛋白，其C端部分含有跨膜区，该区域将E蛋白锚定在细胞膜上且作为信号序列转移非结构蛋白(同上)。E蛋白是主要的病毒颗粒表面蛋白并且被认为是病毒颗粒中最具有免疫原性的成分。E蛋白可能与病毒受体互相作用，中和病毒感染性的抗体通常识别E蛋白(同上第996页)。M蛋白和E蛋白的C端有跨膜片段，该片段能将蛋白锚定在膜上(同上第998页)。
登革病毒主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)传染给人类的。登革热感染对在热带区域居住或到访热带区域的人造成了很大的威胁。事实上，大约有25亿人居住在具有感染风险的区域并且每年有超过1亿人受到感染。每年估计有大约20-25,000名儿童死于登革病毒的感染。
初次登革病毒感染在多数病例中临床表现为登革热(DF)，这是一种自限性的原纤维疾病。虽然很少致命，但是DF表现为经常性的严重的弥漫的身体疼痛、头疼、发热、皮疹、淋巴结病和白细胞减少。随后异种登革病毒的感染将导致更加严重甚至致命的疾病登革出血热(DHF)或登革休克综合症(DSS)。有假说认为初次感染的血清型病毒的抗体将在第二次感染中增强异种血清型病毒的感染。这种现象被称为疾病的抗体依赖性增强(ADE)。
如何有效的诊断登革病毒通常是成问题的。全部四种登革病毒能够在同一个地方流行，因此同时将患者的血清样品对全部四种登革病毒血清型进行测试是很重要的。
现在对于登革病毒的感染没有特效的治疗方法。虽然过去50年内登革病毒疫苗的研制一直都在进行，但是还没有生产出成功的登革病毒疫苗而且也无法获得任何得到许可的登革病毒疫苗。主要的挑战在于需要获得一种能够同时诱导产生针对全部四型登革病毒的中和抗体的四价疫苗，以避免当个体在遇到两种或更多种不同的血清型时出现ADE。使用混合的DEN 1-4减毒病毒的疫苗策略是非常不成功的，因为一种类型的抗原将倾向于支配或“掩盖”其它的抗原，所以产生针对四种类型而言不完全的免疫应答。
现在依然需要分子、组合物和方法来有效的诊断一种或更多登革病毒，诱导、增强或促进对黄病毒的免疫应答，尤其是对登革病毒，优选对所有四种血清型的登革病毒，并且预防性的或治疗性的治疗与一种或多种上述病毒相关的紊乱或疾病。本发明提供了这种分子、方法和组合物。本发明上述和其它的优点以及另外的发明特征均能显而易见的从本发明提供的描述中得出。
发明概述
本发明提供了如下所述的新的重组、合成、突变和/或分离的多肽，含有这种多肽的融合蛋白以及编码这种多肽和/或蛋白的核酸，这些用于促进(例如诱导和/或增强)对一种或更多黄病毒，尤其是一种或多种登革病毒的免疫应答，以及检测或诊断一个生物样品中是否存在至少对一种属于黄病毒科家族的病毒(如黄病毒属的成员)有抗性的抗黄病毒科病毒的抗体(如抗黄病毒抗体)，和/或至少对一种登革病毒具有抗性的抗登革病毒的抗体。
一方面，例如，本发明提供了重组、合成、突变和/或分离的多肽，其氨基酸序列中至少有大约80％，83％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的氨基酸序列与本发明的截短的重组、合成或突变登革病毒包膜(E)蛋白多肽，比如至少SEQ IDNOS：1-49和153-155中的任意一个的氨基酸序列同一性。部分上述多肽能在体外或回体(ex vivo)细胞和/或在受试者体内或细胞或其组织内诱导受试者，如哺乳动物或哺乳动物细胞群对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少一种血清型的至少一种登革病毒或登革病毒抗原产生免疫应答。上述重组登革E蛋白多肽是“截短的”，这是因为与野生型(WT)登革病毒E蛋白的全长序列相比，其缺少全长E蛋白序列C端的一个或多个氨基酸残基。通常截短的E蛋白缺少大约3％，5％，10％，15％或20％到大约25％的全长E蛋白C端氨基酸残基。每个上述多肽含有具有免疫原性或抗原性的氨基酸序列，其能够诱导对一种或多种血清型，优选多种(如2，3，4)血清型的一种或多种登革病毒或类病毒颗粒(virus-like particle)(VLP)或其抗原的免疫应答。一些上述多肽在表达到或传输到动物或动物细胞时能够诱导对全部4种登革病毒血清型(四价免疫应答)或抗原的免疫应答。具有该特性的特殊多肽在表达到或传输到动物或动物细胞后能够诱导出多种登革病毒血清型的登革病毒的中和抗体，优选的，能在受试者，比如哺乳动物如灵长类或人类中诱导对四种登革病毒血清型中至少一种的保护性免疫应答。更优选的，重组多肽能在受试者如哺乳动物中诱导对全部四种登革病毒血清型的保护性免疫应答。
本发明上述截短的E蛋白多肽诱导受试者产生的对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒或VLP或其抗原的免疫应答等于或强于分别在至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒中所说的野生型截短E蛋白诱导受试者产生的对至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒或VLP或其抗原的免疫应答，所说的野生型截短的E蛋白的氨基酸序列长度与本发明的重组、合成或变体多肽的长度基本相等。
上述每一重组、合成或变体多肽诱导产生与至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒结合的一种或多种类型的抗体。在本发明的一个方面，部分上述多肽诱导产生与至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒结合的抗体，其数量大致等于或大于相应的由至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的野生型截短的E蛋白所分别诱导产生的抗体数量。
本发明上述每一重组、合成或变体多肽诱导或产生了至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体效价。更进一步的，部分上述多肽诱导或产生的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体效价大致等于或大于相应的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的野生型截短的E蛋白所分别诱导产生的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体效价，其中上述每一野生型截短的E蛋白均选自SEQ ID NOS：338-341。
部分上述重组、合成或变体多肽进一步包含：(a)连接到重组或合成多肽的氨基酸序列N端上的至少约150个氨基酸残基的氨基酸序列，其与SEQ IDNOS：117-126中至少一个序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性；(b)连接到重组或合成多肽的氨基酸序列C端上的至少约40个氨基酸残基的氨基酸序列，其与SEQ ID NOS：127-136中至少一个序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性；或(c)氨基酸序列(a)和氨基酸序列(b)。
本发明还提供了一种重组、合成或突变的截短的或未截短的登革包膜蛋白，其中重组或合成多肽的编码核酸所含有的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ ID NOS：285-330的至少一个多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：285-330的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列有至少约70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的核苷酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下(under at least stringent condition)与基本上全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，能至少在严格条件下与基本上全长的(a)-(d)中多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意组合的(a)-(e)中多核苷酸序列特征的多核苷酸序列；或其互补序列。
在另一方面，本发明提供分离的、重组的、合成的或突变的多肽，其包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NOS：65-116的至少一个序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性。每一上述多肽一般包含一个重组的、合成的或突变的登革病毒抗原，该抗原含有PRM15/截短的E多肽。上述PRM15/截短的E蛋白多肽包含第一个氨基酸序列，其在N端有一个蛋氨酸连接到重组、突变或合成的第二个氨基酸序列上，第二个氨基酸序列含有对应于重组、合成或突变的登革病毒prM蛋白C端大约最后15个氨基酸的大约15个氨基酸残基。第二个氨基酸序列的C端依序连接到第三个序列的N端，该序列包含重组、突变或合成的截短的登革病毒(dengue virus)E蛋白。截短的E蛋白被认为是“截短的”，因为与WT全长登革病毒E蛋白相比，其在E蛋白C端缺少一个或多个氨基酸。截短的E蛋白包含大约75，80，85或90％的E蛋白，所述75，80，85或90％的E蛋白分别表示含有从N端第1个氨基酸开始约75，80，85或90％的蛋白长度的E蛋白部分。上述重组或合成的PRM15/截短的E多肽能诱导对至少一种血清型的至少一种登革病毒或VLP或抗原的免疫应答。
一些上述PRM15/截短的E多肽诱导受试者对一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或强于由从该登革病毒血清型中获得的PRM15/截短的E多肽在哺乳动物中所诱导的对同一种血清型的同一种登革病毒的免疫应答。一些上述PRM15/截短的E多肽诱导的受试者对属于两种不同血清型的至少两种登革病毒中每种的免疫应答大约等于或强于由从所述两种登革病毒血清型中任一个获得的PRM15/截短的E多肽所诱导的受试者对上述属于不同血清型的两种登革病毒中每种的免疫应答。一些上述PRM15/截短的E多肽诱导的对属于三种不同血清型的至少三种登革病毒中每种的免疫应答大约等于或强于由从所述三种登革病毒血清型中任一个获得的PRM15/截短的E多肽所诱导的该细胞对上述属于三种不同血清型的三种登革病毒的免疫应答。一些上述PRM15/截短的E多肽诱导的对属于四种不同血清型的至少四种登革病毒中每种免疫应答大约等于或强于由从所述四种登革病毒血清型中任一个获得的PRM15/截短的E多肽所诱导的该细胞对上述属于四种不同血清型的四种登革病毒的免疫应答。在一方面，WTPRM15/截短的E蛋白多肽选自于SEQ ID NOS：149-152。
PRM15/截短的E多肽能够诱导产生大量的抗体，包括一种或多种类型的抗体，其与至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒结合。部分上述多肽所诱导产生的与至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒结合的抗体的数量，大约等于或超过了至少1，2，3或4种血清型中每种野生型PRM15/截短的E蛋白多肽所能诱导的抗体的数量。
进一步的，重组、合成或突变的PRM15/截短的E多肽所诱导产生抗体与相应的至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的野生型PRM15/截短的E多肽所分别诱导的抗体相比，其能够更加特异性的与至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒结合，其中每种野生型PRM15/截短的E多肽均选自SEQ ID NOS：149-152。
在一方面，重组、合成或突变的PRM15/截短的E多肽诱导对至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒有抗性的中和抗体的效价的产生。在特定的方面，部分该重组、合成或突变的PRM15/截短的E多肽所诱导产生的对至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒有抗性的中和抗体的效价大约等于或超过了相应的至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的野生型PRM15/截短的E蛋白多肽(“WT PRM15/截短的E融合蛋白”)所分别诱导受试者产生的对相应的至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒有抗性的中和抗体的效价，其中所述WT PRM15/截短的E多肽均选自SEQ ID NOS：149-152。例如，SEQ ID NO：149的序列包含以下氨基酸序列：蛋氨酸作为首个氨基酸残基，来自WT DEN-1的prM序列的C端的最后15个氨基酸，以及DEN-1包膜蛋白的截短的氨基酸序列，其被称为“截短的”是由于其从DEN-1包膜蛋白C端除去了许多氨基酸残基。例如，在一个实施方案中，Den-1的E蛋白C端氨基酸残基中有大约11-14％(优选大约13％)被去除了。
本发明还提供重组、合成或突变的PRM15/截短的E多肽，其中编码每个多肽的核酸所含有的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ ID NOS：156-200，235，342和344的至少一个多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：156-200，235，342和344的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，能至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(d)中的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意组合的(a)-(e)中多核苷酸序列特征的多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供重组、合成、突变和/或分离的多肽，其包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NOS：139-148，236-253，343和345的至少一个序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性。每一上述多肽一般包含一个重组的、合成的或突变的登革病毒抗原，该抗原包含的的融合多肽含有C15/全长prM蛋白/全长E蛋白。C15/全长prM蛋白/全长E蛋白多肽诱导受试者对至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答。进一步，对部分上述多肽，对至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过相应的至少1，2，3或4种血清型中每种的野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽所分别诱导的上述细胞对至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答，其中相应的野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白选自SEQ ID NOS：227-230。
对于上述一些C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白，免疫应答包括产生能结合至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的抗体。此外，部分上述多肽所诱导产生的能结合至少1，2，3或4种血清型中每种至少一种登革病毒的抗体大约等于或超过相应的至少1，2，3或4种血清型中每种的野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽所分别诱导的抗体，其中野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白选自SEQ ID NOS：227-230。
在另一方面，本发明部分上述C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽诱导或产生至少一种、两种、三种或四种登革病毒血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体效价。更进一步的，部分上述多肽在受试者中诱导或产生的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体效价大约等于或超过了相应的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽所分别诱导或产生的至少一种、两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的中和抗体的效价，其中上述每一野生型C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽均选自SEQ ID NOS：227-230中。
发明还提供重组、合成或突变的C15/全长prM蛋白/全长E融合蛋白多肽，其中编码每个多肽的核酸所含有的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ IDNOS：201-210，254-271，342和344的至少一个多核苷酸序列有至少约80％，85％，90％，93％，95％，98％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)含有一段所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：201-210，254-271，342和344的DNA序列的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，能至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(d)中的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；以及(f)具有任意组合的(a)-(e)中多核苷酸序列特征的多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供的组合物含有至少一种本发明所述的重组、突变、合成和/或分离的多肽或核酸以及赋形剂或载体，包括药学药学上可接受的载体或赋形剂。
在一方面，本发明提供的组合物含有至少一种重组、突变、合成和/或分离的多肽，该多肽包含选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的氨基酸序列，或相应的抗原性或免疫原性多肽片段，其诱导的受试者对至少一种病毒血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗原性或免疫原性多肽所诱导的免疫应答；以及赋形剂或载体。
在另一方面，本发明提供分离、重组、突变或合成的核酸所含有的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ ID NOS：211-218的序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)与所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：211-218的DNA序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；与(c)至少在严格条件下与基本全长的(a)或(b)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，或其互补序列。
在另一方面，本发明包括的分离、重组、突变或合成的核酸序列包含的多核苷酸序列选自：(a)核苷酸序列与选自SEQ ID NOS：285-330的序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的核酸序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ ID NOS：1-49和153-155的多肽的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(c)与所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：285-330的DNA序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下与基本全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(d)中的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)与选自SEQ ID NOS：285-330的至少一个多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码的多肽所诱导的受试者对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型截短的包膜(E)蛋白所诱导的受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，其中所述野生型截短的E蛋白选自SEQ IDNOS：338-341；以及(g)具有任意组合的(a)-(f)中多核苷酸序列特征的多核苷酸序列。发明提供的组合物包含赋形剂或载体和至少一种本发明的核酸，包括例如至少一个符合上述(a)-(g)中任一规定的多核苷酸序列。
还提供分离、重组、突变和/或合成的核酸，其包含的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ ID NOS：156-200，235，342和344的序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ ID NOS：65-116的多肽的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(c)与所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：156-200，235，342和344的DNA序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下与基本全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(d)中的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)与选自SEQ ID NOS：156-200，235，342和344的至少一个多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段，或其互补多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列或相应片段编码的多肽所诱导的受试者对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型截短的包膜(E)蛋白所诱导的受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，其中所述野生型截短的E蛋白选自SEQ ID NOS：149-152；以及(g)具有任意组合的(a)-(f)中序列特征的多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供分离、重组、突变和/或合成的核酸，其包含的多核苷酸序列选自：(a)与选自SEQ ID NOS：201-210，254-271，342和344的序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ IDNOS：139-148，236-253，343和345的多肽的多核苷酸序列或其互补多核苷酸序列；(c)与所有的胸腺嘧啶核苷酸残基均被替换为尿嘧啶核苷酸残基的选自SEQ ID NOS：201-210，254-271，342和344的DNA序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的RNA多核苷酸序列或其互补RNA多核苷酸序列；(d)至少在严格条件下与基本全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)排除遗传密码的简并性，至少在严格条件下与基本上全长的选自(a)-(e)中的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)与选自SEQ ID NOS：201-210，254-271，342和344的至少一个多核苷酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的序列同一性的多核苷酸序列或其片段，或其互补多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列或相应片段编码的多肽所诱导的受试者对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4中的至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过至少一种血清型的至少一种登革病毒的WT截短的包膜(E)蛋白所诱导的受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，其中所述WT截短的E蛋白选自SEQ ID NOS：227-230；以及(g)具有任意组合的(a)-(f)中多核苷酸序列特征的多核苷酸序列。
上述多肽和编码该多肽的多核苷酸的其它优点包括能够诱导受试者，如包括哺乳动物在内的动物或相应的细胞对一种或多种登革病毒，优选对多病毒血清型的登革病毒的保护性免疫应答。上述多肽令人满意的特性包括如本文所述的对比于野生型登革病毒蛋白，包括例如C15/全长prM/全长E融合蛋白、全长prM/全长E融合蛋白、PRM15/截短的E蛋白多肽、PRM15/全长E融合蛋白、全长E或截短E蛋白和/或上述多肽的一个或多个片断，该多肽显示出更高的表达、更高的分泌和/或更多或更具特异性的抗体。
本发明进一步提供包含本发明前述多核苷酸的融合蛋白；包含一个或更多条本发明多核苷酸的载体；包含上述多肽、载体、多核苷酸和融合蛋白的细胞；以及包含上述多肽、多核苷酸、载体、融合蛋白和/或细胞的药学组合物。本发明提供的示范载体包括病毒载体，包括例如黄病毒载体(包括例如用本发明的多核苷酸替代至少一部分编码C15/全长prM/全长E融合蛋白、全长prM/全长E融合蛋白、PRM15/截短的E蛋白多肽、PRM15/全长E融合蛋白、全长E或截短E蛋白和/或相应片断的黄病毒(flaviviruse)载体基因组的减毒黄病毒载体)和核酸载体，例如质粒载体pMaxVax10.1(描述于实施例1中并且显示于图1和2中)，发明人构建的该载体是一种在哺乳动物宿主中有效的基因传输载体。
关于多核苷酸，例如，本发明进一步提供的多核苷酸，其含有至少约1200个核苷酸的核酸序列，该序列与SEQ ID NOS：285-330中的至少一个有至少约65％，75％，80％，85％或90％的核酸序列同一性，以及与上述多核苷酸杂交的多核苷酸和含有该核酸序列互补序列的多核苷酸。在另一方面，本发明提供核酸，其含有至少约1200个核苷酸的序列，该序列与SEQ IDNOS：211-214中的至少一个有至少约65％，75％，80％或90％的核酸序列同一性。
本发明还提供通过给予本发明所述多肽、融合蛋白、多核苷酸、载体或细胞从而促进(诱导和/或增强)受试者(例如动物，如哺乳动物)对登革病毒的免疫应答的方法。在部分上述方法中，给予本发明的免疫原性或抗原性多肽(优选的，例如诱导对多病毒血清型的一种或多种登革病毒的中和抗体应答的多肽)到受试者中后，在一定的时间间隔下继续重复给药，从而导致加强的免疫应答。这种“加强式(boosting)”的给药策略有效的适用于本发明多核苷酸(例如预防或治疗性的应用编码免疫原的多核苷酸(例如DNA疫苗))的给药，优选随后进行附加的本发明所述的编码免疫原或抗原的多核苷酸和/或本发明的免疫原性或抗原性多肽的继续给药。
在另一方面，本发明提供包含至少含有两个重组或合成核酸的库所构成的组合物，该库是通过重组至少一个含有选自SEQ ID NOS：211-214序列的第一核酸和至少一个第二核酸以构建重组或合成核酸库的方法所获得的，其中第一和第二核酸相互间有两个或更多的核苷酸不同。
本发明还包括包含核酸库的组合物，该库是通过重组至少一个含有选自SEQ ID NOS：215-218的序列的第一核酸和至少一个第二核酸以构建重组或合成核酸库的方法所获得的，其中第一和第二核酸相互间有两个或更多的核苷酸不同。
在另一方面，发明提供能特异性结合由针对至少一种抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一种抗原包含选自SEQ ID NOS：1-49和153-155的氨基酸序列或相应的抗原性或免疫原性片断，其中所述相应的抗原性或免疫原性多肽片段所诱导的受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗原性或免疫原性多肽片断诱导受试者所产生的免疫应答，其中多克隆抗血清被消减至少一个：选自SEQ ID NOS：338-341的截短的包膜蛋白和含有已知的野生型截短登革病蛋白序列的截短的包膜蛋白，或对应于已知野生型登革病毒E蛋白的多肽序列的氨基酸序列片断，其中所述氨基酸序列片断具有长度基本等同于(例如至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％或94％，和更加优选至少约95％(如约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)SEQ ID NOS：338-341中任一个的截短包膜蛋白。
本发明还提供能特异性结合由针对至少一种抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一种抗原包含选自SEQ ID NOS：65-116中的氨基酸序列，其中多克隆抗血清被消减至少一个：选自SEQ ID NOS：149-152的PRM15/截短的包膜蛋白和其它含有已知登革病毒PRM15/截短的包膜蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供能特异性结合由针对至少一种抗原的多克隆抗血清的多肽，所述至少一种抗原包含选自SEQ ID NOS：139-148，236-253，343和345中的氨基酸序列，其中多克隆抗血清被消减至少一个：含有选自SEQ IDNOS：227-230的C15/全长prM蛋白/全长E蛋白的融合蛋白和其它包含已知登革病毒C15/全长prM蛋白/全长E蛋白PRM15/截短的包膜蛋白的氨基酸序列。
本发明还包括通过给予本发明截短的E多肽到受试者所产生的抗体或抗血清，该抗体或抗血清特异性结合至少一种抗原，所述至少一种抗原包含含有选自SEQ ID NOS：1-49和153-155中的至少一个氨基酸序列的多肽，该抗体或抗血清不能特异性结合以下一种或多种多肽：SEQ ID NOS：338-341的多肽和含有已知野生型截短登革病毒蛋白序列的截短的包膜蛋白，或对应于已知野生型登革病毒E蛋白的多肽序列的氨基酸序列片断，其中所述氨基酸序列片断具有长度基本等同于(例如至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％或94％，和更加优选至少约95％(如约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)SEQ ID NOS：338-341中任一个的截短包膜蛋白。
在另一方面，本发明提供通过给予本发明截短的E多肽到受试者所产生的抗体或抗血清，该抗体或抗血清特异性结合至少一种抗原，所述至少一种抗原包含含有选自SEQ ID NOS：65-116中的至少一个氨基酸序列的多肽，该抗体或抗血清不能特异性结合以下一种或多种多肽：选自SEQ IDNOS：149-152的PRM15/截短的包膜蛋白和其它含有已知登革病毒PRM15/截短的包膜蛋白的氨基酸序列。在又另一方面，本发明提供通过给予本发明截短的E多肽到受试者所产生的抗体或抗血清，该抗体或抗血清特异性结合至少一种抗原，所述至少一种抗原包含含有选自SEQ ID NOS：139-148，235-253，343和345的至少序列的多肽，该抗体或抗血清不能特异性结合以下一种或多种多肽：含有选自SEQ ID NOS：227-230的C15/全长prM蛋白/全长E蛋白的融合蛋白和其它含有已知登革病毒C15/全长prM蛋白/全长E蛋白PRM15/截短的包膜蛋白的氨基酸序列。
本发明还包括药物组合物，其包含至少一种本发明的多肽(或至少一种本发明的多核苷酸)，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中该至少一种多肽(或多核苷酸)在数量上足以有效的提供受试者对至少1、2、3或4登革血清型的至少一种登革病毒的保护性免疫。
本发明还包括药物组合物，其包含至少一种本发明的多肽(或至少一种本发明的多核苷酸)，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，其中该至少一种多肽(或多核苷酸)在数量上足以有效的诱导对至少一种、两种、三种或四种登革病毒血清型的至少一种登革病毒的免疫应答(例如特异性的免疫应答)和/或提供受试者对至少一种、两种、三种或四种登革病毒血清型的至少一种登革病毒的保护性免疫。
在另一方面，本发明提供疫苗，其包含在数量上足以有效的提供受试者对至少一种、两种、三种或四种病毒血清型的至少一种登革病毒的保护性免疫的至少一种本发明的多肽(或本发明的多核苷酸)，以及以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
还提供在受试者中产生针对至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的方法，其包括给予受试者至少一种本发明的核酸或多肽或两者的组合。也包括产生一种或多种能结合至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的方法，其包括给予细胞群有效量的本发明的多肽和/或核酸，或任一的或两者的组合物，从而导致细胞产生一种或多种结合至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体。
本发明进一步提供在受试者中产生针对至少一种、两种、三种或四种登革病毒血清型中每种至少一种登革病毒的保护性免疫应答的方法，其中方法包括给予受试者足够有效量的至少一种本发明的核酸以产生保护性免疫应答来抵抗相应的至少一种、两种、三种或四种登革病毒血清型中每种至少一种登革病毒的侵袭。对于部分上述方法，免疫应答是保护性抗体应答，即当所述至少一种核酸表达的时候，在受试者中产生足够水平的至少一种、两种、三种或四种血清型中每种至少一种登革病毒的抗体从而产生保护性免疫应答以抵抗相应的至少一种、两种、三种的四种登革病毒血清型中每种至少一种登革病毒的侵袭
在另一方面，本发明提供诱导受试者，如哺乳动物，对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予受试者有效剂量的至少一种本发明的多肽，或有效剂量的相应组合物，或同时包括两者。本发明还提供诱导受试者对至少一种血清型的至少一种病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予受试者有效剂量的至少一种本发明的核酸，或有效剂量的相应组合物，或同时包括两者。所述有效剂量通常指免疫原或抗原的剂量能够方便的诱导出保护性免疫应答或进行治疗性或预防性的处理。
另外，本发明提供促进受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答的方法，该方法包括引入至少一种本发明核酸或多肽到细胞群并且传输(例如植入)该细胞到受试者中。在引入核酸或多肽前，细胞群最初可以从受试者中获得。
在另一方面，本发明提供靶核酸，排除遗传密码的简并性，该核酸能至少在严格条件下与唯一的编码寡核苷酸杂交，该寡核苷酸能够编码选自SEQID NOS：65-116的多肽的唯一亚序列，其中唯一亚序列是指与已知的登革病毒抗原包膜多肽、选自SEQ ID NOS：149-150的任一多肽或由任一SEQ IDNOS：231-234编码的多肽比较而言是唯一的。
在另一方面，本发明提供重组或合成的多肽，其包含有与含有选自SEQID NOS：236-253的至少一个多肽序列的多肽片断的氨基酸序列至少有约90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中该多肽片断不包含从SEQIDS：236-253中选出的多肽的前16个氨基酸残基，并且其中重组或合成的多肽所诱导的受试者或受试者细胞对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了相应的选自SEQ ID NO：338，339，340和341的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的野生型包膜(E)蛋白所诱导的受试者或相应细胞对至少两种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。
还包括重组或合成的多肽，其包含与选自SEQ ID NOS：1-49和153-155至少一个的氨基酸序列至少有约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中重组或合成多肽所诱导的受试者或相应的细胞群对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了相应的每个上述的至少一种登革病毒的WT E蛋白所诱导的免疫应答，其中所述WT E蛋白的氨基酸序列长度基本上等于或相当于重组或合成的多肽。
在另一方面，本发明提供重组或合成多肽，其包含与选自SEQ IDNOS：1-49和153-155至少一个的氨基酸序列至少有约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中重组或合成多肽所诱导的受试者，如哺乳动物或相应的细胞，对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了相应的每个登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的WT截短的E蛋白所诱导的受试者或相应细胞对选自登革-1、登革-2、登革-3和登革-4的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答，其中所述WT截短的E蛋白的氨基酸序列长度基本上等于或相当于重组或合成多肽的氨基酸序列。
在又另一方面，本发明提供重组或合成多肽，其包含与选自SEQ IDNOS：65-116至少一个的氨基酸序列至少有约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中重组或合成多肽所诱导的受试者或相应的细胞群，如哺乳动物或相应的哺乳动物细胞群，对选自DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过了相应的每个DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的WT PRM15/截短的E蛋白所诱导的受试者(例如哺乳动物或哺乳动物细胞群)对所述至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答，其中每条所述WT PRM15/截短的E蛋白多肽均选自SEQ ID NOS：149-152。
本发明进一步提供重组或合成多肽，其包含与选自SEQ IDNOS：139-148，236-235，343和345的至少一个的氨基酸序列至少有约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中重组或合成的多肽所诱导的受试者或相应细胞群对选自DEN-1、-2、-3和-4病毒的至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答大约等于或超过所述至少两种血清型中每种的WT C15/全长prM/全长E融合蛋白所诱导的哺乳动物细胞对至少两种血清型的每种至少一种登革病毒的免疫应答，其中所述WT C15/全长prM/全长E融合蛋白选自SEQ IDNOS：227-230。
还包括由至少两条本发明重组或合成多肽所构成的蛋白集合体。该蛋白聚合物包括本发明多肽的二聚物、三聚物等以及其它多聚物，其中多肽不需要是同源的。
包括含有至少两条本发明的多肽的类病毒颗粒，其中多肽不需要是同源的。部分上述类病毒颗粒由选自重组、变异或合成的多肽的至少两条多肽所构成。部分上述类病毒颗粒由编码至少两条本发明多肽的一个或更多的核酸的表达产物所构成。
还提供病毒，例如减毒病毒，其包含至少下述之一：(1)本发明的核酸；(2)本发明的多肽；和/或(3)本发明的载体。病毒可包括用本发明的核酸、多肽和/或载体修饰过的黄热(YE)病毒。还包括含有登革病毒(例如DEN-2或DEN-4)的嵌合病毒，其中包含至少一个本发明多肽以分别替换或加上全长或截短的E蛋白、登革病毒全长prM蛋白或其片断(例如PRM15)和/或含有天然登革病毒C15/全长prM/全长包膜蛋白的登革病毒融合蛋白。还包括减毒或复制缺陷型嵌合黄病毒(例如登革病毒或YF病毒)或腺病毒，其包含至少一个本发明的核酸或多肽以分别替代黄病毒或腺病毒中相应的核酸或多肽。
还提供DNA或RNA构建体或活的嵌合重组黄病毒，所述DNA或RNA构建体或嵌合重组黄病毒包含将编码本发明重组蛋白(例如PRM15/截短E，C15/全长prM/全长E，或prM&E蛋白)的第一核酸区可操作的连接于编码黄病毒(例如YF病毒或DEN-2、DEN-4)非结构蛋白的第二核酸区。
发明还包括整合系统，其包含存储有含有至少一个序列记录的数据库的计算机或计算机可读介质，每一上述至少一个序列记录包括至少一个对应于选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少一个多肽序列或选自SEQ ID NOS：156-210，235，254-271，285-330，342和344的核酸序列的字符串，整合系统进一步包括用户输入界面，其使得用户能够有选择的显示上述的至少一个序列记录。
还提供用计算机系统显示数据库中大量序列记录中至少一个的有关信息的方法，每一序列记录包括对应SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-210，235-271，285-330，342-345的至少一个字符串，方法包括：(a)确定对应SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-210，235-271，285-330，342-345或相应亚序列的至少一个字符串的列表；(b)确定用户所选择的列表中的所述至少一个字符串；以及(c)显示每一选择的字符串，或用附加的字符串排列每一选择的字符串。
本发明进一步提供改良的或新的方法或技术以检测和/或诊断样品中(包括例如生物样品，如从受试者例如有登革病毒感染风险的动物包括如哺乳动物如人类中获得的血清样品)对一种、两种、三种或四种登革病毒血清型的抗体的存在。本发明还提供方法或技术以同时检测和/或诊断单个样品中对一种、两种、三种或四种登革病毒血清型的抗体的存在。本发明的多肽和编码其的核酸能用于检测或诊断生物样品中上述抗体的存在。方便的，含有仅仅10μl转染了本发明多核苷酸的细胞培养物上清液的组合物能够用作均一且合适的底物以同时诊断或检测样品，例如生物样品，如从受试者，如人类等有登革病毒感染风险的哺乳动物中获得的样品中对全部四种血清型的登革病毒的抗体。生物样品能够为例如从受试者中获得的血清样品。
在另一方面，本发明提供方法以诊断样品或检测样品中一种或多种结合至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的存在，方法包括：(a)在一定条件下将样品与至少一种本发明的多肽接触，这样如果样品含有一种或多种能结合一种登革病毒的抗体，至少一种抗登革病毒抗体将结合到至少一种多肽上形成混合组合物；(b)将该混合组合物与至少一种能结合抗登革病毒抗体的亲合分子接触；(c)从混合组合物中除去没有结合的亲合分子；并且(d)诊断或检测是否存在一种或多种亲合分子，其中存在一种或多种亲合分子表明样品中存在一种或多种结合至少一种登革病毒的抗体。
另外，本发明提供方法以诊断样品或检测样品中至少一种结合至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的存在，所述方法包括：(a)在一定条件下将样品与至少一种本发明的多肽接触，这样如果样品含有一种或多种能结合登革病毒的抗体，至少一种抗登革病毒抗体将结合到至少一种多肽上形成至少一种抗体-多肽复合体；并且(b)诊断或检测是否存在至少一种抗体-多肽复合体，其中存在至少一种抗体-多肽复合体表明样品中存在至少一种结合登革病毒的抗体。
本发明还提供生产上述核酸和多肽的方法。一般的，本发明多核苷酸可以方便的通过标准核酸合成技术(如聚合酶链式反应(PCR)-易化重叠核酸装配)获得。然而本发明还提供使所选本发明核酸进行递归的序列重组的方法以及适当的筛选技术以产生和识别新登革抗原编码核酸。制造本发明多肽的方法包括体外、体内或回体(ex vivo)用本发明的多肽和/或载体转染或感染细胞，外加标准的合成蛋白合成技术。
本发明提供的大量可选的、附加的和/或更加特别多核苷酸、多肽、融合蛋白、病毒、载体、细胞、细胞培养物、组合物、转基因动物、透皮碎片(transdermal patches)、使用本发明核酸和/或多肽的方法、由本发明提供的诊断和检测化验、方法和技术均将在下面阐明。
附图说明
图1为典型的pMax Vax 10.1载体的示意图。
图2图解说明了一个pMaxVax10.1载体的例子，其中含有编码含有野生型DEN-2病毒的PRM15信号肽/截短的E蛋白的融合蛋白的核酸插入片断。pMax Vax10.1载体同样也可以由编码含有WT DEN-1、DEN-3或DEN-4病毒的PRM15信号肽/截短的E蛋白的融合蛋白或其变体的核酸构建，其替代编码WT DEN-2病毒的PRM15信号肽/截短的E蛋白的核酸序列(如图2所示)。如下面所详述的，DEN-2聚蛋白(polyprotein)的截短的E蛋白所包含的多肽序列中含有DEN-2E蛋白从E蛋白N端开始按序列顺序的约90％的连续氨基酸残基。“截短的E蛋白”被缩写为“tE”或“tE蛋白”。本发明还提供pMaxVax10.1载体，其包含本发明中编码本发明的重组或合成的登革病毒抗原的核酸；该核酸在如图2所示编码DEN-2PRM15/截短的E蛋白多肽同样的位置类似的插入pMaxVax10.1载体中。
图3显示了登革病毒抗原的蛋白质印迹，每个包含PRM15信号多肽/截短的(t)E蛋白，其由转染了以下载体之一的293细胞在溶菌液(L)中表达并且分泌到培养基上清液(SN)中：pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO，pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO，pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO。硝酸纤维素膜结合蛋白与鼠腹水中对DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的抗体共同孵育。
图4包括一系列斑点印迹，其是通过FACS分析由pMaxVax10.12/7载体或pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO载体转染并且分别与小鼠抗DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的抗血清共同孵育的293细胞获得。
图5为pMaxVax10.1 DNA载体表达的本发明的重组PRM15/截短的E登革病毒抗原的蛋白印迹，与具有pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO载体所表达的野生型(wt)氨基酸序列的PRM15/截短的E抗原相比，能与DEN-1、DEN-3和DEN-4鼠抗血清和合适的第二抗体结合。从通过递归序列重组(recursive sequence recombination)所获得的重组库中的重组核酸里筛选和选择编码这些重组PRM15/截短的E登革病毒抗原的核苷酸。在图中，字母“C”表示对照载体以及代表通过用不包含登革病毒核酸的pMaxVax10.1null载体转染293细胞所获得的数据。
图6显示通过ELISA分析从鼠中获得的抗血清所得到的光密度(OD)值，每只鼠均被注射了含有用ELISA从重组核酸的库中识别的典型的重组(例如改组的)核酸序列的pMaxVax10.1载体，其由灭活的DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4包被。术语“WT”表示pMaxVax10.1载体，其包含编码野生型DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4聚蛋白各自PRM15/截短的包膜蛋白的核酸序列。对照载体包含没有任何登革病毒核酸序列的pMaxVax10.1null载体(表示为“pMV”)。
图7显示抗血清ELISA OD值的比较结果，该抗血清从注射了含有亲代登革病毒PRM15/tE核酸(编码WT DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4多肽序列)或挑选出的典型的编码重组PRM15/tE登革病毒抗原(Ag)的重组PRM15/tE核酸的pMaxVax10.1载体的鼠血中获得。还显示了使用从注射了四种pMaxVax10.1载体混合物的鼠中获得的抗血清所获得的结果，每种载体包含编码四种WT DEN-1PRM15/tE、DEN-2PRM15/tE、DEN-3PRM15/tE和DEN-4PRM15/tE抗原之一的核酸序列(例如pMaxVax10.1Den-1PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO、pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO和pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO)。对照(“pMV”)是不含亲代或重组PRM15/tE核酸的pMaxVax10.1载体。
图8A显示第76天小鼠血清的交互50％蚀斑减少中和滴度(50％ plaquereduction neutralization titer)(PRNT)的结果，该小鼠在第0天初次注射含有四种WT DEN-1PRM15/tE、DEN-2PRM15/tE、DEN-3PRM15/tE和DEN-4PRM15/tE抗原中任一种，或这四种野生型抗原混合物，或对应抗原：18E9、18D7、16G11、18H2、16B4、6E12、2G11、2/7、15D4和18H6之中一种的本发明的重组核酸序列的典型pMaxVax10.1DNA质粒载体。图8B显示第76天小鼠血清的交互50％蚀斑减少中和滴度的结果，该小鼠在第0天初次注射含有C15/全长prM/全长E抗原形式的四种WT DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4抗原中的任一种，或这四种野生型抗原混合物，或对应C15/全长prM/全长E抗原：5/21-D1、2G11-D4和6E12-D4之中一种的本发明的重组核酸序列的典型pMaxVax10.1DNA质粒载体。
图9显示本发明九种分泌重组登革病毒多肽抗原的蛋白质印迹分析，每一种由本发明的重组多核苷酸编码，其在体内诱导对至少两种登革病毒血清型的野生型登革病毒的中和抗体应答。“E”表示包膜蛋白，印迹中向右的箭头表示E蛋白在印迹上的位置。对每个重组抗原，显示了抗原诱导的抗体应答所中和的不同血清型的数量。PRNT结果显示在图8A和8B中。
图10提供通过ELISA分析从小鼠中获得的抗血清所获得的OD图，其中每个小鼠均注射了含有重组核酸序列的pMaxVax10.1载体。重组核酸序列是通过人密码子优化编码的登革病毒序列(例如SEQ ID NOS：215-218)的递归序列重组所获得的。每个上述重组核酸序列编码的重组登革病毒抗原具有以下的形式：C15信号序列/全长prM蛋白/全长E蛋白。pMaxVax10.1null载体(“pMV”)作为对照载体。
图11显示由本发明重组核酸编码的本发明典型重组PRM15/截短E登革病毒抗原的氨基酸序列的序列多样性分析(例如嵌合状态)结果，其与亲代WT DEN-1PRM15/tE、WT DEN-2PRM15/tE、WT DEN-3PRM15/tE和WTDEN-4 PRM15/tE蛋白的序列相比较。该分析证实这些重组抗原包括全部四种亲代WT蛋白序列的氨基酸碎片或片段，并因此构成了上述亲代序列的嵌合体。
图12用图表显示用本发明的重组pMaxVax10.1载体免疫后的小鼠在用DEN-2病毒激发超过28天后存活下来的比例。在该实验中，重组pMaxVax10.1载体包含本发明下述三条重组PRM/tE核酸序列中的一个以及这三条核酸序列的混合：SEQ ID NOS：235(18H6)，SEQ ID NOS：204(2G11-D4)和SEQ ID NOS：202(6E12-D4)。作为比较，部分小鼠注射了含有WT DEN-2PRM15/tE核酸序列和WT DEN-2 C15/全长prM/全长E或WT DEN-3C15/prM/全长E核酸序列，以及全部四种DEN-1-4 WT PRM15/tE和C15/全长prM/全长E的混合物的pMaxVax10.1载体。注射PBS或pMaxVax10.1null载体的小鼠作为对照小鼠。
图13A和13B显示10μl到100μl转染了本发明典型核酸(例如5/21(SEQID NO：157)、2/7(SEQ ID NO：156)、6E12(SEQ ID NO：159)和2G11(SEQ IDNO：157)的293细胞的上清液在与小鼠DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4抗血清反应时的斑点杂交。
图14为显示野生型登革病毒基因和相应编码的登革病毒结构蛋白(衣壳，prM和E蛋白)的示例图。
图15A和15B显示以C15/全长prM/全长E蛋白形式的DEN-3WT和选择本发明的重组的多肽(PRM15/截短E形式的18H6和C15/全长prM/全长E形式的16G11-25B10)通过20％-60％的蔗糖梯度离心纯化。纯化的多肽或在聚丙烯酰胺(PAA)凝胶中用考马斯蓝(15A)染色或在蛋白质印迹后转移到硝化纤维素膜(15B)上用标准技术用DEN特异性抗体染色。(参考，例如，Repley，R.and Walker，J.M.eds.，MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK(1998)，Humana Press，Inc.，Tijssen(1993)LABORATORY TECHNIQUES INBIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY-HYBRIDIZATION WITHNUCLEIC ACID PROBES[以下简称Rapley和Walker，MOLECULARBIOMETHODS HANDBOOK]。E蛋白表示“包膜”蛋白。牛血清清蛋白作为凝胶和蛋白质印迹的对照。显示的条带表明形成了DEN-3 C15/全长prM/全长E和16G11-25B10中每个的二聚多肽。
图16显示了注射编码以下本发明重组多肽抗原之一(18H6(SEQ IDNO：235)或16G11-25B10(SEQ ID NO：255))的pMaxVax10.1载体或通过明矾佐剂混合蔗糖梯度纯化的本发明多肽(18H6(SEQ ID NO：110)或16G11-25B10(SEQ ID NO：251))进行免疫的小鼠血中获得的抗血清的ELISA的OD值的比较。或者用编码下述一个本发明重组多肽抗原的pMaxVax10.1载体(如，DNA+DNA)，或用明矾(alum)中的多肽在初次用DNA(如，DNA+蛋白质)或蛋白(如，蛋白质+蛋白质)注射后以3个星期为间隔对小鼠进行2次加强免疫。“Prot.”表示“蛋白质”。
图17显示从每组6个猴子的血样中在不同的时间点(第0，28，56和112天)获得的抗血清的光密度的比较结果，每组分别在第0，28和84天注射：(1)4种pMaxVax10.1核酸载体在PBS中的混合物，每种载体中含有分别编码WT DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4 C15/全长prM/全长E多肽的四种亲代WT登革病毒C15/全长prM/全长E核酸(4WT，Mix)之一；(2)含有编码重组PRM15/tE登革病毒抗原的典型重组PRM15/tE核酸(18H6)的pMaxVax10.1载体；(3)含有典型的PRM C15/全长prM/全长E核酸(6E12-D4和2G11-D4)的pMaxVax10.1载体，其中每一均编码C15/全长prM/全长E登革病毒抗原；或(4)3种pMaxVax10.1载体在PBS中的混合物，每一载体包含对应于18H6，6E12-D4和2G11-D4(3Sh，Mix)之一的核酸。对照(“pMV ctrl”)是不含亲代或重组PRM15/tE或C15/全长prM/全长E核酸的pMaxVax10.1载体。所有的核酸载体均在PBS中作为组合物给药。
发明详述
本发明提供新的重组、合成、变异和/或分离的多肽，融合蛋白，抗体，核酸(如多核苷酸)，病毒，类病毒颗粒；含有该核酸和/或编码该多肽、融合蛋白、抗体、病毒和类病毒颗粒的载体；含有该核酸、多肽、融合蛋白、抗体、病毒、类病毒颗粒和/或载体的细胞和组合物；以及含有一种或多种前述本发明核酸、多肽、融合蛋白、抗体、病毒、类病毒颗粒、载体、细胞和组合物的疫苗。本发明进一步提供本发明所述核酸、多肽、融合蛋白、抗体、病毒、类病毒颗粒、载体细胞和组合物的制备方法与使用方法。
一方面，核酸、多肽、融合蛋白、载体、病毒、类病毒颗粒、细胞、抗体和组合物通常用于调控、促进、诱导和/或增强对一种或多种类病毒和/或一种或多种血清型，包括但不限于如登革-1、登革-2、登革-3和登革-4或其变体的一种或多种登革病毒的免疫应答，和/或分析生物样品中是否存在对至少一种黄病毒血清型的至少一种黄病毒或其变体的抗黄病毒抗体，以及特别是对至少一种DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4病毒或其变体的抗登革病毒抗体。本发明所述的核酸、多肽、融合蛋白、载体、病毒、类病毒颗粒、抗体、细胞、组合物和方法同样被认为能用于体内方法以预防性和/或治疗性的处理患有与至少一种血清型的至少一种黄病毒或其变体(包括如至少一种血清型的至少一种登革病毒或其变体)相关的疾病的动物(包括，如脊椎动物和哺乳动物)，以及从体外、试管中和/或体内诊断、检测和/或识别至少一种黄病毒或相应的变体(包括，如，至少一种血清型的至少一种登革病毒或相应的变体)。
在一方面，本发明核酸、多肽、融合蛋白、载体、病毒、类病毒颗粒、抗体、细胞、组合物和方法能特别的用于在体和/或离体的方法以诱导或增强动物对黄病毒科家族的病毒中至少一种病毒(如黄病毒科的成员如日本脑炎病毒)的免疫应答，以及用于预防性和/或治疗性处理动物(包括如脊椎动物和哺乳动物)的与至少一种属于黄病毒科家族病毒的病毒或任何该病毒相应的变体相关的疾病，该病毒家族的病毒包括黄病毒，疫病毒和肝病毒，优选所述至少一种病毒或其变体的，与至少一种血清型的至少一种登革病毒相关的病毒(包括如，但不限于黄病毒科家族的病毒，如黄病毒属的成员或其它黄病毒，包括，如黄热病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、河谷脑炎病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒和/或西罗尼脑炎病毒，和包括，例如上述FIELDS，VIROLOGY，同上，Vol.1第32和33章(4th ed)中所述的与登革病毒相关的病毒或这些病毒的任一变体)。
在另一方面，本发明的核酸、多肽、融合蛋白、载体、病毒、类病毒颗粒、抗体、细胞、组合物以及方法能用于在体外，试管中和/或体内诊断、检测，和/或识别黄病毒科家族(例如，包括三个属，黄病毒，疫病毒和肝病毒)的至少一种病毒或所述病毒的变体的方法，优选的其中所述至少一种病毒或相应变体是与至少一种登革病毒相关的病毒(包括，例如但不限于黄病毒科家族的病毒，其它黄病毒，黄热病毒，圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、河谷脑炎病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒和/或西罗尼脑炎病毒，和包括例如，FIELDS，VIROLOGY，同上，Vol.1第32和33章(4th ed)中所述的与登革病毒相关的病毒或这些病毒的任一变体)。照比本身，应当理解下面详细描述的登革病毒所代表的包括更一般的黄病毒科病毒家族，包括黄病毒，疫病毒或肝病毒的病毒，尤其是黄病毒属的成员，优选至少一种血清型的黄病毒，并且特别是密切相关于至少一种血清型的至少一种登革病毒的黄病毒，除非另外申明或与内容明显矛盾。应当理解下面详细描述的多肽，依据内容，包括融合蛋白。
本发明的多肽、融合蛋白、核酸、载体、病毒、类病毒颗粒、组合物、细胞和方法还能有效的用于在体和/或离体的方法以诱导动物体内的免疫应答，和/或在体和/或离体的方法免疫动物(包括，如脊椎动物和哺乳动物)抵抗至少一种黄病毒科家族的病毒，如黄病毒或其变体(包括如包含或涉及至少一种登革病毒血清型的至少一种登革病毒的黄病毒或相应的变体)和/或作为对黄病毒科家族至少一种病毒，如黄病毒或其变体的疫苗，和/或更加优选作为对包含或涉及至少一种登革病毒的黄病毒科家族的病毒，如黄病毒或其变体的疫苗。
优选的，本发明提供的重组、合成、突变和/或分离的多肽和/或融合蛋白含有能够调控、诱导、促进和/或增强可以检测的免疫应答的氨基酸序列，例如结合黄病毒科家族至少一种病毒，如黄病毒(如登革病毒)的抗体的产生，和/或涉及黄病毒科家族的至少一种类型的抗原，如黄病毒抗原(包括如至少一种类型的登革病毒抗原)在动物细胞(典型脊椎动物细胞和更典型和优选的，哺乳动物细胞，比如人类和非人类灵长动物细胞)在体细胞培养中和/或离体和/或受试者或组织或细胞内的产生。该多肽或融合蛋白的氨基酸序列部分能被称为本发明的“免疫原性氨基酸”和“抗原性氨基酸”或简称为“氨基酸”或“免疫原”或“抗原”。
本发明的重组、合成、变异和/或分离多肽以及相应编码该多肽的本发明的多核苷酸的一个进一步值得期待的特性为能够诱导、促进、调控和/或增强对至少一种黄病毒，包括，如至少一种血清型的至少一种登革病毒优选至少2种血清型每种至少一种登革病毒，更优选至少3种血清型每种至少一种登革病毒，更优选至少4种已知登革病毒的血清型(如DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4)每种至少一种登革病毒的免疫应答。
本发明的重组、合成、变异和/或分离的多肽以及相应编码该多肽的本发明的多核苷酸的进一步值得期待的特性为能诱导、促进、增强或调控对至少一种黄病毒，优选对至少一种血清型的至少一种登革病毒，更优选对至少两种血清型每种至少一种登革病毒，更优选对至少三种血清型每种至少一种登革病毒，最优选对至少4种已知病毒登革病毒血清型(如DEN-1、DEN-2、DEN-3和/或DEN-4)每种至少一种登革病毒的中和抗体应答。
本发明的重组、合成、变异和/或分离的多肽和/或融合蛋白，编码其和其它多肽以及融合蛋白的多核苷酸和相关细胞、抗体、载体、组合物，诊断试验和制备与使用该多肽和多核苷酸的方法的更加特别和值得期待的特性在这里详细描述。
术语“PRM 15”(或“prM 15”和有时选用“spM”)在用来表示氨基酸时通常表示一般含有约15个氨基酸残基的氨基酸序列。另外，在一些实施方案中，PRM 15氨基酸序列另外包括一个甲硫氨酸(“Met”或“M”)作为首个氨基酸残基，在该实施例中，PRM 15氨基酸序列长度约为16个氨基酸。通常，PRM15氨基酸序列包含野生型(WT)、重组、变异或合成的登革病毒prM蛋白的C末端最后15个氨基酸残基；在一些实施方案中，PRM 15氨基酸序列进一步的包含甲硫氨酸作为序列的首个氨基酸残基，这样就有大约16个氨基酸的长度。
关于核苷酸序列，“PRM 15”通常表示一般含有约15个氨基酸残基的核苷酸序列。在部分实施例中，PRM 15核苷酸序列包括编码甲硫氨酸的三个核苷酸残基，该三个残基为序列中位置最前的三个残基，其后时按序列顺序排列的编码余下约15个氨基酸的密码子。通常，PRM 15核苷酸序列包含编码WT，重组，变异或合成的登革病毒prM蛋白或其变体C端最后约15个氨基酸的核酸残基。在部分上述实施例中，PRM 15核苷酸序列进一步包括编码甲硫氨酸的三个残基，其位于核苷酸序列的起始位置；在该实施例中，核苷酸序列编码总共约16个氨基酸。
PRM 15氨基酸序列一般连接在多肽上，并且有效的作为该多肽在细胞中的转运的信号序列。通常在转运过程中PRM 15信号序列随后被从多肽上切除下来。例如，在部分实施例中，PRM 15序列连接于登革病毒包膜(“E”或“Env”)蛋白，如WT，重组，变异或合成的登革病毒E蛋白，或有抗原性或免疫原编码的片段(如截短的重组，WT或合成E蛋白)或相应的变体。
这里描述各种PRM 15氨基酸信号序列(参见，如SEQ ID NOS：52-64)。这里还描述各种PRM 15核苷酸序列(参见，如SEQ ID NOS：272-284)。通过识别prM序列C端最后大约15个氨基酸残基能够容易的在prM蛋白序列中确定PRM 15氨基酸序列。如果需要，Met残基能加到氨基酸序列的起始位置。通过识别编码具体的prM序列C端最后约15个氨基酸残基的核酸序列能类似的确定PRM 15核酸序列；如果需要，编码Met残基的密码子能类似的加为该核酸序列的首个密码子。PRM 15氨基酸和核酸序列能用本领域一般技术人员所熟知的下述的标准蛋白质和核酸合成技术合成。
在一方面，本发明包括嵌合多肽，其包含的序列有至少约90％氨基酸序列同一性于含有本发明的合成或重组的C15/全长prM/全长E或PRM 15/截短的E多肽从氨基的第16个残基到最后的氨基酸残基的氨基酸序列的多肽序列，以及编码所述嵌合多肽的核酸。
术语“tE”(或“ETRUNC”或“E-truncated”等)在用于表示氨基酸序列时表示黄病毒截短的(“t”或“trunk”)包膜(E)蛋白。该黄病毒可以是分离的野生型，重组，变异或合成的黄病毒或其变体。在一方面，黄病毒包括登革病毒和包含截短的野生型登革病毒E蛋白或其变体的截短的E蛋白，或截短的重组，变异或合成登革病毒E蛋白。与未截短的E蛋白相比，截短的E蛋白缺少未截短E蛋白C端的一个或多个氨基酸残基。当用于表示核酸序列时，术语“tE”(或“ETRUNC”或“E-truncated”等)表示对应于或编码截短的E蛋白的截短的核酸序列。编码截短的E蛋白核酸序列与未截短的核酸相比同样缺少C端的一个或多个核酸残基。
在一个实施方案中，截短的登革包膜(E)蛋白(DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4)包含的多肽序列含有各自登革E蛋白按序列顺序从各自登革E蛋白氨基酸序列N端氨基酸残基开始计算的约70％到约98％(如，约85％，86％，87％，88％，89％，90％，92％或95％)的连续氨基酸的残基。换句话说，截短的E蛋白包含登革E蛋白序列的片段，从全长登革E蛋白序列C端氨基酸残基开始计算，该片段缺少各自全长登革E蛋白序列的约2％到约30％(如，约15％，14％，13％，12％，10％，8％或5％)的氨基酸残基。编码该截短的登革E蛋白的核酸序列不包含编码从全长登革E蛋白序列C端氨基酸残基开始计算的各自全长登革E蛋白序列的C端约2％到约30％(如，约15％，14％，13％，12％，10％，8％或5％)的氨基酸残基的核苷酸残基。
在一个具体的实施方案中，截短的DEN-1E蛋白包含的多肽序列含有DEN-1E蛋白从N端氨基酸残基开始按序列顺序计算的约87％的连续氨基酸残基，并且编码该截短的DEN-1E蛋白的核酸序列不包含编码DEN-1E蛋白序列从C端氨基酸残基开始计算的C端最后约13％的氨基酸残基的核苷酸残基。
在一个具体的实施方案中，截短的DEN-2E蛋白包含的多肽序列含有DEN-2E蛋白从N端氨基酸残基开始按序列顺序计算的约90％的连续氨基酸残基，并且编码该截短的DEN-2E蛋白的核酸序列不包含编码DEN-2E蛋白序列从C端氨基酸残基开始计算的C端最后约10％的氨基酸残基的核苷酸残基。
在一个具体的实施方案中，截短的DEN-3E蛋白包含的多肽序列含有DEN-3E蛋白从N端氨基酸残基开始按序列顺序计算的约89％的连续氨基酸残基，并且编码该截短的DEN-3E蛋白的核酸序列不包含编码DEN-3E蛋白序列从C端氨基酸残基开始计算的C端最后约11％的氨基酸残基的核苷酸残基。
在一个实施方案中，截短的DEN-4E蛋白包含的多肽序列含有DEN-4E蛋白从N端氨基酸残基开始按序列顺序计算的约90％的连续氨基酸残基，并且编码该截短的DEN-4E蛋白的核酸序列不包含编码DEN-4E蛋白序列从C端氨基酸残基开始计算的C端最后约10％的氨基酸残基的核苷酸残基。
术语“CO”表示“优化密码子”或“密码子优化”的序列。当用于表示一段核酸序列的时候，该术语表示一段密码子优化的核酸序列。当用于表示一段氨基酸序列的时候，该术语表示对应于或由密码子优化的核酸序列编码的氨基酸序列。
除非另外说明，术语“多肽，”“蛋白质，”和“肽，”在此处以及在全文中都同义的表示任何由多氨基酸，至少部分，通过共价结合的多聚体形式(例如此处所用的“蛋白质”既表示通过肽键结合的氨基酸的线性聚合体(链)也表示具有二级、三级或四级结构的蛋白质，其中可包含有肽链内或肽链之间其它形式的分子内和分子间连接，例如氢键和范德华键)。除非另外说明，术语“多肽”和“蛋白”包括融合蛋白。
术语“重组”在用于表示氨基酸(如肽、多肽、蛋白质、抗原)的时候一般表示非自然形成的氨基酸(例如没有在自然界中发现)(例如非自然形成的肽、多肽、蛋白质、抗体)。“重组的多肽”包括重组核酸表达的或能够表达的任何多肽(然而重组核酸序列不需要包括所有编码或表达所必须的核苷酸序列元件)，或含有氨基酸序列的任何多肽，其中序列中每个氨基酸残基均对应于或能够被核酸序列密码子编码，该核酸序列包括重组核酸序列。
术语“重组”在用于表示核酸(如多核苷酸或其它核苷酸)的时候一般表示非自然形成的核酸。当被用于表示核酸时，术语“重组”可以表示核酸被至少一种外源(例如外源的和典型的异源的)核苷酸的引入所修饰或至少一处本身核苷酸组件的变化。“重组载体”表示非自然形成的载体，包括例如含有重组核酸序列的载体。
在一方面，“重组多核苷酸”或“重组多肽”是非自然形成的多核苷酸或多肽。重组多核苷酸或重组多肽可以包含分别从超过一种的源核酸或多肽中获得的核酸或氨基酸，其中源核酸或多肽可以是自然形成的核酸或多肽，或其本身就已经经过了突变、改变、重组或其它类型的修饰。作为不同核酸或氨基酸序列来源的源多核苷酸或多肽时常是同源的(例如有，或编码的多肽编码相同或相似的结构和/或功能)，并且经常来自于有机体的不同隔离群、血清型、菌株、物种或例如来自不同的疾病状态。
术语“重组”在用于表示细胞的时候表示细胞包含重组分子，例如重组核酸、重组多肽或重组载体(例如非自然形成的核酸、多肽或载体)。在一方面，术语“重组”在用于表示细胞的时候表示细胞复制异源的核酸或表达异源核酸编码的的肽或蛋白。重组细胞中可以含有在天然(非重组)形式的细胞中所没有发现的基因。重组细胞中还可以含有在天然形式的细胞中已经存在的基因，其中该基因通过人工方法进行了修改并且被重新引入到细胞中。术语还包括含有细胞内源核酸的细胞，其修饰不需要将核酸从细胞内移出；该修饰包括例如通过基因替换、位点特异性突变和相关技术所获得的修饰。
术语“合成”在表示分子或组件时分别表示人工或非天然形成的分子或组件。例如合成的多核苷酸时人工、非天然形成的多核苷酸。用于合成产生分子、组件或其结合，包括例如合成的多核苷酸、多肽、融合蛋白、载体、病毒、类病毒颗粒、细胞、组合物等的技术将在此做进一步的描述。
为了方便阅读，本发明的重组、合成、变异和/或变异的多肽、多核苷酸、融合蛋白、载体、细胞和抗体经常分别简单表示为“重组”多肽、多核苷酸、融合蛋白、载体、细胞和抗体。
术语“核酸”表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的多聚体。除非特别限定，该术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，该类似物与其引用的核酸有类似的结合特性并且与天然形成的核苷酸有类似代谢方式。除非另外指出，特别的核酸序列无疑还包括其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)以及互补序列和清楚指出的序列。特别的，简并密码子替换可以通过产生在一个或多个选择的密码子的第三个位置上进行混合基础的和/或脱氧肌苷残基替换的序列而实现(Batzer等.(1991)Nucleic AcidRes 19：5081；Ohtsuka等(1985)J Biol Chem 260：2605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等(1994)Mol Cell Probes 8：91-98)。术语核酸可与多核苷酸、以及(在恰当的内容中)与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
“基因衍生的核酸”表示最终以基因或其亚序列作为模板合成的核酸。这样，mRNA、从mRNA反转录的cDNA、cDNA转录的RNA，从cDNA扩增的DNA，从扩增DNA转录的RNA等都衍生自基因，并且检测上述衍生产物表明样品中存在和/或大量存在原始基因和/或基因转录物。
当其与另一段核酸序列间有功能性的联系时，核酸“可操作的连接”到另一段核酸序列。例如，启动子或增强子如果增强编码序列的转录，其将有效的连接于编码序列。有效连接表示连接的DNA序列一般是连续的，并且在必须连接两个蛋白编码区域的地方，是连续的并且在读码框内。然而，由于增强子通常在启动子相隔几个kb碱基时才行使功能，并且中间内含序列可以有多种长度，所以部分多核苷酸组件可以有效连接但不是连续的。
“分离的”多肽表示从其正常伴随的一种或多种组分中和/或环境中(例如其它肽，多肽，蛋白(包括复合体，细胞污染物，细胞组分等)，细胞等)分离的多肽。“分离的”核酸(或分离的核苷酸或分离的多核苷酸)表示从其正常伴随的一种或多种组分中和/或环境中分离的核酸(或核苷酸或多核苷酸)。典型的，分离的核酸所表示的核酸没有与一个或多个能将其与其获得和/或衍生的序列直接连续的核酸(例如在5’和/或3’端)直接连接。
一般的，组分(如多肽，多核苷酸，融合蛋白，载体，细胞)的分离致使它在组合物中，混合物或收集的组分中成为占优势的组分；例如在摩尔基础上它比组合物中任何其它单独组分都更多。例如多肽或多核苷酸的分离致使多肽或多核苷酸分别成为组合物，混合物或收集的组分中的占优势分子或种类。该“基本上纯”的多肽或多核苷酸(或其它组分)，例如，一般在重量(一般在摩尔基础上)上为特定组合物的所有大分子的至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％。令人满意的，基本上纯的多肽或多核苷酸显示基本的同质性(例如无法通过常规的检测方法检测到组合物中的污染物)。术语“纯的”一般表示通过标准分析技术标测(例如构建谱带电泳凝胶，层析洗脱物，和/或用于密度梯度离心的介质)多核苷酸或多肽中不含或至少基本上不含其它组分，并且/或者占有特定组合物中大分子的至少约80％，至少约85％，优选至少90％，以及更优选至少95％。
在此使用的术语“受试者”包括，但不限于，有机体；动物，包括哺乳动物，其中包括如人类，非人类的灵长动物(如，狒狒，猩猩，黑猩猩，猴子)，小鼠，猪，母牛，山羊，猫，兔子，大鼠，天竺鼠，仓鼠，马，猴子，绵羊或其它非人类的哺乳动物以及非哺乳动物，包括如非哺乳脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼和非哺乳类的非脊椎动物。
术语“细胞因子”包括例如白细胞介素、干扰素、趋化因子、造血生长因子、肿瘤坏死因子和转化生长因子。通常，这些小分子量蛋白调控免疫系统细胞的成熟、激活、增殖和分化。
多肽的“变体”是指与亲代或引用的多肽有一个或几个氨基酸残基存在差异的多肽，通常至少有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50、75、100或更多的氨基酸残基存在差异。
核酸的“变体”是指与亲代或引用的核酸有一个或几个核酸残基存在差异的核酸，通常至少有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、21、24、27、30、33、36、39、40、45、50、60、75、150、225、300或更多的核酸残基存在差异。
“抗原”表示能够诱导、促进、增强或调控免疫应答或免疫反应的分子。在一些例子中，免疫应答或免疫反应是体液和/或细胞应答。抗原可以在受试者在体细胞和/或受试者在体和/或受试者离体细胞或组织中诱导、促进、增殖或调控免疫应答或免疫反应。该免疫应答或反应可以包括，但不限于，诱导受试者中抗体的形成，或对抗原产生特异性的淋巴细胞群。抗原一般为来自宿主外的大分子(如蛋白或多糖)。
核酸或氨基酸的“亚序列”或“片断”表示的核酸序列或氨基酸序列中分别含有更长的核酸序列(如多核苷酸)或氨基酸序列(如多肽)，分别直到并且包括全长(完整)的核酸序列或全长氨基酸序列的任何的部分或片断。
“佐剂”表示的分子或物质能够增大或增强免疫应答，包括例如，但不限于，抗原的免疫刺激性或化合物或药物的药学效果。佐剂可以非特异性的增强免疫应答，如对抗原的免疫应答。例如，“弗氏完全佐剂”是含有免疫原、乳化剂和分枝杆菌的油和水的乳剂。另一个例子，“弗氏不完全佐剂”中不含有分枝杆菌，其它都相同。佐剂可以包含油、乳化剂、灭活细菌、氢氧化铝或磷酸钙(如以凝胶形式)或其组合。佐剂可以给药受试者(如通过肌肉或皮下注射)以有效剂量从而产生抗体。
“自然形成的”当用于物质时表示该物质能够在不是由人类人工制造的自然物中发现。生物体(包括病毒、细菌、原生动物、昆虫、植物或哺乳动物组织)中存在的多肽或多核苷酸序列可以从自然来源中分离，并且没有被人类在实验室中有意修改，其是自然形成的。非自然形成的用于描述物质时表示该物质不是自然形成的，如物质不能在自然界中发现，以和人工制造的相区别。
指定的氨基酸多聚体或核酸多聚体的编号方式“对应于”选择的氨基酸多聚物或核酸多聚物的编号方式，任何指定的多聚物组分(例如氨基酸残基、核苷酸残基)的位置被标明为同样或相当于其在选择的氨基酸或核酸多聚物中的残基位置，而不是该组分在指定的多聚物中的真实位置。这样，例如，指定多肽序列中的指定氨基酸位置的编号方式对应于同样或相对于其在用作参考序列的选择的多肽中的氨基酸的位置。
载体是用于进行细胞转导或转染核酸，或在细胞中表达核酸的组分或组合物。载体包括如质粒、粘粒、病毒、YAC、细菌、多赖氨酸等。“表达载体”或“表达盒”是核酸元件的核酸构件或序列，其可以转录核酸到宿主细胞中和/或可以有效的在与该构件或序列相容的宿主中表达核酸。表达载体或盒可以通过本领域已知的方法重组或合成。表达载体或盒可以是部分的质粒、病毒或核酸片断。表达载体或表达盒一般包括有效连接了启动子的需要转录的核酸(例如编码预期多肽的核酸)。需要转录的核酸一般在启动子的指导或控制下。表达载体或盒可选的包括转录终止信号。如下所述的，还可以应用有效表达所必须或有用的附加因子。例如，表达载体或盒中还可以包括编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列指导宿主细胞中表达蛋白的分泌。增强子和其它影响核酸表达或基因表达的核酸序列也包括在内。
“基本全长的多核苷酸序列”或“基本全长的多肽序列”表示有多核苷酸序列或多肽序列长度的至少约50％，一般至少约60％、70％或75％，通常至少约80％或85％，或一般至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多。
术语“药物组合物”表示的组合物适合于对受试者，包括动物或人类进行药学应用。药物组合物一般包含有效量的活性物质和载体，包括如药学上可接受的载体。
术语“有效量”表示分子或组合物的剂量或分量足够产生预期的结果。例如，给药受试者一定剂量或分量的特殊抗原或免疫原(或其组合物)，预期的结果可以包括可测定或可测试的对受试者免疫应答的诱导、促进、增强或调控。在一方面，给予受试者一定剂量或分量的特殊病毒抗原或免疫原(或其组合物)以足够有效的保护受试者抵抗病毒的侵袭，预期的结果可以包括可测定或可测试的对受试者免疫应答的诱导、促进、增强。在另一方面，预期的结果可以包括接受一定剂量或分量的特殊分子或组合物的受试者(例如给药了一定剂量或分量的特殊分子或组合物的受试者)客观上或主观上的改善
“预防性治疗”是给予没有表现和/或患有疾病、病理或医学紊乱的体征或症状，或是仅表现和/或患有疾病、病理或紊乱的早期体征或症状的受试者的治疗方式，该治疗方式是给药以达到减小、防止和/或减少疾病、病理或医学紊乱发展的风险。预防性治疗通过对疾病或紊乱的预防性处理起作用。“预防性活性”是因子如核酸、载体、基因、多肽、蛋白质、分子、物质或其组合物的活性，其在给药没有表现和/或患有病理、疾病或紊乱的体征或症状，或仅表现和/或患有病理、疾病或紊乱的早期体征或症状的受试者时，能够减小、预防和/或减少受试者发展该病理、疾病或紊乱的风险。“预防性有效”因子或分子(如核酸或多肽)表示能有效减小、预防、免疫防止、治疗和/或减少病理、疾病或紊乱的因子或分子。
“治疗性处理”是给予表现和/或患有病理、疾病或紊乱的体征或症状的受试者以减小、治疗和/或消除上述病理、疾病或紊乱的体征或症状的治疗方式。“治疗性活性”是指因子如核酸、载体、基因、多肽、蛋白、分子、物质或其组合物的活性，其给予表现和/或患有该体征或症状的受试者时，能够消除、治疗和/或减小病理、疾病或紊乱的体征或症状。“治疗性有效”因子或分子(如核酸或多肽)表示能有效的减少、治疗和/或消除该病理、疾病或紊乱的体征或症状的因子或分子。
术语“基因”广泛的表示任何与生物学功能相关的DNA片断。基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还包括非表达DNA核酸片断，其例如组成其它蛋白的识别序列(如启动子、增强子或其它调控区)。基因可以从大量的来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或根据已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计的具有预期参数的序列。
一般的，以下使用的术语和下述的在细胞培养、分子遗传学、分子生物学、核酸化学和蛋白化学方面的实验室工作程序是公知的并且是本领域技术人员所常用的。标准技术，例如在Sambrook等，Molecular Cloning-ALaboratory Mannul(第2版)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989(下文中“Sambrook”)以及Current Protocols in MolecularBiology，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.和Uohn Wiley & Sons，Inc.合资(1994，supplemented through 1999)(下文中“Ausubel”)中所述的，被用于重组核酸的方法、核酸合成、细胞培养的方法和强行传输到或穿过受试者皮肤或组织的转基因并入法，如电穿孔、注射、基因枪以及脂质转染法。一般的，寡核苷酸合成和纯化步骤根据说明书进行。技术和步骤一般根据本领域常规方法以及本文提到的多种常规参考书实行。其中步骤被认为是公知于本领域普通技术人员的，在此提供仅为了方便读者。
在此处所用的，“抗体”所表示的蛋白含有一种或多种基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所编码的多肽。术语抗体用来表示所有的抗体及其结合片段。确认的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilo和mu恒定区域基因以及无数免疫球蛋白可变区域基因。轻链被归类为kappa或lambda。重链被归类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，其依次分别定义免疫球蛋白的种类，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般的免疫球蛋白(如抗体)结构部件构成四聚体。每个四聚体由两对同样的多肽链组成，每对中有一个“轻”(约25KDa)和一“重”链(约50-70KDa)。每条链的N端有大约100到110或更多个氨基酸的可变区域，其主要用于抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别表示这些轻链和重链。
抗体以完整的免疫球蛋白或由多种肽酶消化产生的许多有特征的片段的形式存在。这样，例如胃蛋白酶消化抗体铰链区二硫键下方产生F(ab)’2，其为Fab的二聚体，Fab本身为通过二硫键连接VH-CH1的轻链。该F(ab)’2可以在温和条件下以打断铰链区的二硫键从而转化F(ab)’2二聚体为Fab’单体的形式降解。该Fab’单体基本上是Fab和铰链区部分。抗体分子的Fc部分很大程度上相当于免疫球蛋白重链的恒定区域，并且负责抗体的效应子功能(参见，Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)，以获得对其它抗体片段更加详细的描述)。虽然多种抗体片段是根据完整抗体的分解物定义的，本领域技术人员应该了解该Fab’片段可以通过化学的或使用重组DNA的方法重新合成。这样，在此处使用的术语抗体还包括通过修改完整抗体或用重组DNA方法重新获得的抗体片段。
抗体还包括单臂复合单克隆抗体、单链抗体、包括单链Fv(sFv)抗体，其中可变重链与可变轻链连接在一起(直接或通过肽连接子连接)从而组成连续的多肽，以及双链抗体(diabody)、三链抗体(tribody)和四链抗体(tetrabody)(Pack等(1995)J Mol Biol 246：28；Biotechnol 11：1271；和Biochemistry 31：1579)。抗体为，例如多克隆、单克隆、嵌合的、人源化的、单链的、Fab片段、由Fab表达库产生的片段等。
术语“抗原决定簇”一般表示能够特异性结合抗体的肽或多肽决定簇。抗原决定簇通常含有由分子如氨基酸或糖侧链聚合的化学活性表面基团，并且有特异性的三维结构特性以及特异性的电荷特性。构象和非构象的抗原决定簇存在着差异，当有变性溶剂存在的情况下，前者而非后者的结合消失。
抗体的“抗原结合片段”是抗体的结合或选择性结合抗原的肽或多肽片段。抗原结合位点由抗体中有助于、参与或影响与抗原结合的氨基酸组成。参见Scott，T.A.和Mercer，E.I.，Concise Encyclopedia：Biochemistry andMolecular Biology(de Gruyter，3d ed.1997)和Watson，J.D.等.，RecombinantDNA(2d ed.1992)[下文中”Watson，Recombinant DNA”]，在此引用全文作各种目的参考。
术语“筛选”通常表示识别最优的或优化的分子的过程。各自分子的一些特征能够被用于选择和筛选，包括如在测试系统内诱导期望的免疫应答的能力。选择是筛选的一种形式，其通过同时表达的选择标记进行识别和物理分离，在一些遗传环境下，表达标记的细胞能够存活而其它的细胞将死亡(或相反)。由于在体外研究初步免疫应答的限制，体内研究是特别有用的筛选方法。在一方面，筛选表示识别多肽(或编码该多肽的核酸)的过程，其中多肽诱导或能够诱导受试者或受试者的细胞对至少一种病毒血清型的至少一部分登革病毒的免疫应答，其约等于或超过对照多肽(如野生型多肽)所诱导或能够诱导的免疫应答。
两个分子如配体与受体间的“特异性结合的亲合”表示在分子混合物中一个分子与另一个的优先结合。如果结合亲合为约1×102M-1到约1×1010M-1(如约10-2M-10-10M)或更大，包括约104到106M-1、约106到107M-1或约108到109M-1或1010M-1，那么分子间的结合一般被认为是特异性的。
“亲合力”表示抗体与抗原结合的倾向。亲合力越高，抗体与抗原间的相互吸引就越强，抗体与抗原的结合就越多，抗体与抗原结合形成的抗原-抗体复合物的稳定性就越高。
术语“免疫测定”包括用抗体或免疫原结合或特异性结合抗原的试验。免疫测定可以表述为利用特殊抗体的特异性结合性质分离、定位和/或量化抗原。
本发明提供的重组、合成、变异和/或分离的多肽包含免疫原性氨基酸序列，其与SEQ ID NOS：1-49、65-116、139-148、153-155、236-253、343和345中至少一个的氨基酸序列基本同源(如至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％或89％，优选至少约90％、91％、92％、93％或94％，更优选95％(如约85％-95％)、96％、97％、98％、99％、99.5％的序列同一性)。此外，本发明提供重组、合成、变异和/或分离的编码免疫原性氨基酸序列的多核苷酸，其与SEQ ID DOS：156-218、235、254-271、285-330、342和344中至少一个的核酸序列基本同源。当用于多肽时，术语“基本同源”表示两条或更多氨基酸序列在使用如采用默认间隙权重值的GAP或BESTFIT程序、直接观察或其它任何合适的技术如这里进一步描述的序列分析和同源性算法进行最优比对时，序列间有至少约60％、一般至少约65％、通常至少约70％、经常至少约75％、通常至少约80％、至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、优选至少约90％或更多(如至少约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％或约99.5％或更多)的氨基酸序列同一性。类似的，在用于核酸时，术语基本同源或基本类似表示两条或更多核酸序列在使用如采用默认间隙权重值的BLAST、GAP或BESTFIT程序(在下文中与用于评估核酸序列同一性性水平的其它合适方法和技术一起详细介绍)或直接观察进行最优比对时，序列间有至少约60％的核酸序列同一性或序列类似，至少约70％或至少约75％的序列同一性或序列类似，更理想的至少约80％或约85％核酸序列同一性或序列类似，优选至少约90％核酸序列同一性或序列类似，更加优化的至少约95％的核酸序列同一性或序列类似(包括如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、98.5、99、99.5或更多比例的核苷酸序列同一性或序列类似)。
关于氨基酸或核苷酸序列的“同源性”(有时表示为“完全同源”-对比于“局部同源”，其在此进一步讨论)表示在两条氨基酸序列或两条核酸序列相互间进行最优比对时，两条氨基酸或核酸序列间各自同源的氨基酸残基或核酸碱基的百分比。如果在优化比对时，第一个序列某位置上的氨基酸残基或核苷酸残基与相应的第二条序列相应位置上的相同，那么序列显示关于该残基位置的同源性。两条序列间的同源性水平(或“序列同一性百分比”)测定为序列间同源位置的数量对比所分析序列的大小而得到的比例(如序列同一性百分比＝(同源位置的数量/位置的总数)×100)。
“最优比对”是提供两条比对序列间最高同源性的比对方式。为获得最优比对，可以引入间隙并且忽略一定数量的非同源序列和/或不确定的序列。优选的，如果需要插入间隙到第一个序列中以获得最优比对，同源百分比的计算仅使用与对应氨基酸序列配对的残基(例如，计算不考虑第二条序列中对应第一个序列间隙的残基)。然而，通常优选的在引入间隙或和/或忽略非同源/不确定序列的同时给予“间隙罚分”。
虽然相对较短的氨基酸或核酸序列间的同源性能够容易的通过直接观察确定，但是确定较长序列的同源性一般采用适当的算法进行分析，通常该分析是通过计算机软件来实现的。当使用序列比较算法时，测试和对照序列通常被输入计算机，如果需要可设定亚序列等同物并且设定序列算法程序的参数。而后序列比较算法将基于设定的参数计算该测试序列相对于对照序列的序列同一性百分比。已知存在许多可快速获得最优对比并且计算两条或更多序列间同源性的数学算法以及使用相应算法的软件程序。上述程序的例子包括分析氨基酸序列的MATCH-BOX、MULTAIN、GCG、FASTA和ROBUST程序以及分析核苷酸序列的SIM、GAP、NAP、LAP2、GAP2和PIPMAKER程序。优选的同时用于氨基酸和多核苷酸序列分析的软件分析程序包括ALIGN、CLUSTALW(如版本1.6及其更新的版本)和BLAST程序(如BLAST2.1、BL2SEQ及其更新的版本)。其选择实例将在下面的章节中作进一步的描述。
对于氨基酸序列分析，使用权重矩阵，如BLOSUM矩阵(如BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM62、BLOSUM80矩阵-参见如Henikoff和Henikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：10915-10919)、Gonnet矩阵(如Gonnet40、Gonnet80、Gonnet120、Gonnet160、Gonnet250和Gonnet350矩阵)或PAM矩阵(如PAM30、PAM70、PAM120、PAM160、PAM250和PAM350矩阵)来测定同源性。优选BLOSUM矩阵。一般更加优选BLOSUM50和BLOSUM62矩阵。在无法使用上述权重矩阵时(如在分析核酸序列以及使用一些氨基酸分析程序时)，使用记录残基/核苷酸匹配或不匹配的记分模式(如对匹配的+5以及对不匹配的模式-4)。
ALIGN程序通过使用修正的动态规划算法获得所选择的两条蛋白或核酸序列的最优全局(完全)比对，该算法参见Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17。优选的，如果可能，ALIGN程序使用加权末端-间隙。如果使用间隙打开和间隙延伸罚分，对于氨基酸序列对比优选分别将其设定为-5到-15和0到-3，更优选分别为约-12和-0.5到-2，对于核酸序列对比优选分别为-10到-20和-3到-5，更优选分别为约-16和-4。ALIGN程序及其依据的原理可进一步参见如Pearson等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：2444-48和Pearson等(1990)Methods Enzymol 18：63-98。
可选的，并且特别是在用于多序列分析(例如超过三条的序列间的比较)时，使用CLUSTALW程序(参见如Thompson，J.D.等(1994)Nuc Acids Res22：4673-4680)。在一方面，间隙打开和间隙延伸罚分相应的设定为10和0.05。可选的或附加的，CLUSTALW程序用“动态”(与“快速”相对)设定运行。优选的，用CLUSTALW进行核苷酸序列分析采用BESTFIT矩阵，而氨基酸序列则根据序列间的同源性水平采用可变设定的BLOSUM矩阵进行计算(例如使用可以从San Diego Supercomputer Center(SDSC)获得的CLUSTALW版本1.6的程序)。优选的，CLUSTALW的设定被设为SDSC CLUSTALW的默认设定(例如在氨基酸序列分析中关于特殊亲水间隙的罚分)。CLUSTALW程序及其运行所依据的原理可进一步参见如Higgins等CABIOS，(1992)8(2)：189-91，Thompson等(1994)Nucleic Acids Res 22：4673-80以及Jeanmougin等(1998)Trends Biochem Sci 2：403-07。
另一有效的测定同源百分比的算法是FASTA算法，该算法参见Pearson，W.R.& Lipman，D.J.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：2444。还可参见W.R.Pearson(1996)Methods Enzymol 266：227-258。优选的用FASTA比对DNA序列计算同源百分比的参数为最优的，BL50 Matrix 15：-5，k-tupe＝2；joiningpenalty＝40，optimization＝28；gap penalty -12，gap length penalty＝-2；以及width＝16。
其它优选的算法包括BLAST和BLAST2.0算法，其通过将一个选择的序列与数据库(如GenSeq)中的多条序列比对，或经过附加算法如BL2SEQ改进后在两条选择的序列间进行比对，从而分析至少两条氨基酸或核苷酸序列。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(NCBI)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供给公众。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列)的运行可使用字符长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4并且比较全部两条链。对氨基酸序列，BLASTP程序(如BLASTP 2.0.14；2000年6月29日)的运行可使用字符长度(W)为3以及期望值(E)为10。
BLAST程序分析同样的或可选的使用低复杂性过滤程序比如DUST或SEQ程序进行优选的修改，该程序优选与BLAST程序的运行整合(参见如Wootton等(1993)Comput Chem 17：149-63，Altschul等(1991)Nat Genet6：119-29，Hancock等(1991)Comput Appl Biosci 10：67-70，以及Wootton等(1996)Meth Enzymol 266：554-71)。在该方面，如果使用lambda率，优选将该率设定在0.75到0.95之间，更优选的在0.8到0.9之间。如果间隙存在值(或间隙分值)用于该方面，该间隙存在值优选设定到-5到-15之间，更优选的约-10，并且每个残基间隙值优选设定在0到-5之间，更优选在0到-3之间(如-0.5)。类似的间隙参数可用于其它的适合的程序。BLAST程序及其运行所依据的原理可进一步参见如Altschul等(1990)J Mol Biol 215：403-10，Karlin和Altschul(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：2264-68(修正于Karlin和Altschul(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：5873-77)以及Altschul等(1997)Nucl Acids Res 25：3389-3402。
另一个有效算法的例子被用于PILEUP软件。PILEUP程序通过渐进的、成对的比对从一组相关序列中创建多序列比对以显示关联和序列同一性百分比或序列相似百分比。PILEUP采用Feng&Doolittle(1987)J Mol Evol35：351-360中涉及的渐进比对方法的简化方式，其类似于Higgins&Sharp(1989)CABIOS 5：151-153中所涉及的方法。优选的PILEUP程序的参数为：默认间隙权重(3.00)，默认间隙长度权重(0.10)以及加权的末端间隙。PILEUP是GCG序列分析软件包，如版本7.0(参见如Devereaux等(1984)Nuc Acids Res 12：387-395)的一部分。
其它有效的进行同源性分析的算法包括Smith和Waterman(1981)AdvAppl Math 2：482中涉及的局部同源算法，Needleman和Wunsch(1970)J MolBiol 48：443中涉及的同源比对算法以及Pearson和Lipman(1988)Proc NatlAcad Sci USA 85：2444中涉及的类似物的搜索方法。这些算法的计算机实现程序(如GAP，BESTFIT和TFASTA)包括在Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中。
另外的几种商业软件包合并了ALIGN、BLAST和CLUSTALW程序及类似的功能，并且可能含有在设定和分析方面明显的改善。该程序的例子包括GCG包的程序和可以从DNASTAR，Inc.(Madison，WI)中获得的程序，例如Lasergene_和Protean_程序。优选的比对方法是Jotun Hein方法，其合并在MegaLineTM DNASTAR软件包(MegaLineTM版本4.03)中依据厂商的用法说明书以及程序特定的默认值使用。
由于多种算法、矩阵和程序普遍的用于分析序列，氨基酸和多核苷酸序列优选根据显示为特定同源性“附近”一定范围的同源性(例如特定同源性的+/-10％，更优选的+/-8％，更优选的+/-5％)的近似同源性进行描述。但是，准确的同源性能够通过使用上述程序中的单独一个来测定，例如此处涉及的BLAST程序或Hein方法。
在一方面，本发明提供的重组、合成和/或分离的多肽(其可以简单的表示为多肽或重组多肽)含有的氨基酸序列与SEQ IDNOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中至少一个的氨基酸序列有至少约90％的氨基酸序列同一性。理想的，重组多肽含有的序列与选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少两条序列有至少约90％的氨基酸序列同一性。较好的，重组多肽含有的序列与选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少五条序列有至少约90％的氨基酸序列同一性。有利的，重组多肽含有的序列与选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少约10条，优选至少约15条，更优选至少约20条序列有至少约90％的氨基酸序列同一性。优选的，重组多肽含有的氨基酸序列与选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的至少1条，优选至少5条，更优选至少约10条序列有至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％同源。
含有选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的氨基酸的重组多肽是优选的。多肽可以含有任何数量的合适的附加氨基酸序列，例如本文其它地方所述的附加序列(如信号序列和/或纯化促进抗原决定簇标签(如Whitehorm等Biotechnology 13：1215-19(1995))，或该多肽可以由选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的氨基酸序列完整的组成。
可选的，但更通常是附加的，重组多肽可以含有的氨基酸序列与本发明任何多肽的免疫原性氨基酸序列基本上功能型同源，这样的氨基酸序列如SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任何一个的氨基酸序列。“基本上功能性同源”表示在最优同源对比中，分析的氨基酸序列间有至少约60％，一般至少约65％，通常至少约70％，经常至少约75％，优选至少约80％，更优选至少约85％，最优选至少约90％或更多(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％或更多)的功能同源的残基。“最优功能性同源对比”是提供两条氨基酸序列间最高水平同源性的比对方式，其使用上述关于“最优比对”的原理。保守的氨基酸残基置换包括将一类氨基酸残基中的一个调换为属于同一类的残基(在计算功能性同源百分比中同源的氨基酸残基被认为在功能上同源或保守)。表1显示氨基酸的分类和这些类的成员。
表1-氨基酸残基种类
表2提供了保守氨基酸置换的可选的集合，分6个保守组详细记述。
表2-可选的氨基酸残基置换组
更多的保守置换存在于上述类中并且能够可选的实施。保守组的更多的保守置换的例子包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰氨-谷氨酰胺。另外的氨基酸群也能够用如Creighton(1984)Proteins：Structure and Molecular Properties(2d Ed.1993)，W.H.Freeman and Company中涉及的原理阐明。
一般的，与本文披露的免疫原性氨基酸序列，如SEQ ID NOS：1-49和153-155中相应的残基不同源的多肽的免疫原性氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基，通常与最相关的免疫原性氨基酸序列(如最相关的序列选自SEQID NOS：1-49和153-155)的不同之处在于保守氨基酸的置换，如用上述表1或表2中提供的多个组中的一个置换，或一般的置换是在每个上述表中单独一组内进行。这样，本文多肽或蛋白的描述，结合上述保守组，提供了涉及所述序列的所有的保守替换多肽序列的明确的列表。
一般的，多肽的免疫原性氨基酸序列还显示与本发明的免疫原性氨基酸序列，通常是SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中至少一个，基本上权重同源。理想的，免疫原性氨基酸序列与至少5条，优选至少约10条，或更多的本发明公开的免疫原性氨基酸序列(如大约5、10或更多选自任何上面涉及的序列组中序列)基本上权重同源。“基本上权重同源”表示至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约60％(如约65-85％)，或更多(如约87％、90％、92％、95％或99％)的在多肽一个位置上的非同源氨基酸残基与在本发明公开的免疫原性氨基酸序列，例如选自SEQID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345的氨基酸序列中，最同源的或功能性同源的序列中相应的氨基酸属于同一个基于权重的“弱保守组”或“强保守组”。优选强组保守。基于权重的保守取决于是否非同源对应氨基酸在一个本文所述的基于权重的矩阵(如BLOSUM50矩阵和优选PAM250矩阵)中得到正分。基于权重的强保守组包括Ser Thr Ala，Asn GluGln Lys，Asn His Gln Lys，Asn Asp glu Gln，Gln His Arg Lys，Met Ile Leu Val，Met Ile Leu Phe，His Tyr，和Phe Tyr Trp。基于权重的弱保守组包括：Cys Serala，Ala Thr Val，Ser Ala Gly，Ser Thr Asn Iys，Ser Thr Pro Ala，Ser Gly Asn Asp，Ser Asn Asp Glu Gln Lys，Asn Asp Glu Gln His Lys，Asn Glu Gln His Arg Lys，Phe Val Leu Ile Met和His Phe Tyr。CLUSTALW序列分析程序提供基于权重强保守和弱保守组作为输出的分析，并且提供优选的技术检测基于权重的保守，优选采用SDSC使用的CLUSTALW默认设定。
可选的，但一般附加于基本上同源或基本上功能性同源，多肽含有的免疫原性氨基酸序列与至少一个(优选至少5条，更优选至少10条)本文涉及的免疫原性氨基酸序列，例如选自SEQ ID NOS：1-49的氨基酸序列，具有类似的亲水特性(或显示类似的亲水性)。亲水特性可以用Kyte & Doolittle指数表示，每种天然氨基酸在指数中的分值如下：I(+4.5)，V(+4.2)，L(+3.8)，F(+2.8)，C(+2.5)，M(+1.9)；A(+1.8)，G(-0.4)，T(-0.7)，S(-0.8)，W(-0.9)，Y(-1.3)，P(-1.6)，H(-3.2)；E(-3.5)，Q(-3.5)，D(-3.5)，N(-3.5)，K(-3.9)和R(-4.5)(进一步的介绍可参见如美国专利4,554,101和Kyte & Doolittle，(1982)J Molec Biol157：105-32)。优选的，免疫原性氨基酸序列中至少约45％，优选至少约60％，更加优选至少约75％(，如至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％)的氨基酸残基与在本发明中公开的最同源或功能型同源的免疫原性氨基酸序列(相对最同源序列)，优选自SEQ ID NOS：1-49的相应残基，不同源，其在亲水性上相对于相对最同源序列的对应位置的非同源氨基酸残基显示少于+/-2的改变，优选亲水性少于+/-1的改变，更优选亲水性少于+/-0.5的改变。总的来说，相对于选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155和236-253的相对最同源序列，多肽理想的显示亲水性的总改变少于约150，更优选少于约100，更优选少于约50(如少于约30，少于约20或少于约10)。一般的保持类似或相同亲水性的氨基酸替换的例子包括精氨酸-赖氨酸替换，谷氨酸-天冬氨酸替换，丝氨酸-苏氨酸替换，谷氨酰胺-天冬酰胺替换和缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸替换。算法和软件，例如可通过SDSC获得的GREASE程序，提供了常规的方法以快速评定肽片断或肽部分的亲水结构。
该多肽理想地包含与选自SEQ ID NOS：1-49，65-116，139-148，153-155，以及236-253的至少一个序列(优选至少5条序列，更优选至少10条序列)基本上同源(例如，具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选地至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)，或至少基本上功能性同源的免疫原性氨基酸序列，其中组合物中至少约90％，优选至少约95％，更优选100％的氨基酸残基具有大于0的Kyte&Doolittle亲水值，优选至少约1。
重组的截短的E蛋白和全长E蛋白多肽
本发明还提供了包含具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选地至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多的氨基酸序列与SEQ ID NOS：1-49，以及153-155中的至少一种氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。所述多肽通常表示为重组的截短的包膜(E)蛋白多肽(或“截短的E”或“tE”多肽)。本发明还提供含有与野生型黄病毒的包膜蛋白，例如，优选登革病毒的包膜蛋白，的氨基酸序列长度相等或基本相等的(例如在85％，87％，88％，90％，92％或更多之内)序列的本发明的重组E多肽。所述多肽通常被称为重组的全长E蛋白多肽。(“全长E”，“全E”或“E”多肽)。
在另一方面，本发明提供包含基本上与SEQ ID NOS：2，3，5，25，29，以及44-46中至少一种同源的氨基酸序列的多肽。该多肽包含与SEQ IDNOS：2，3，5，25，29，以及44-46中至少一种有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选地至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多氨基酸序列同一性的氨基酸序列。理想地，该多肽含有与选自SEQ ID NOS：2，3，5，25，29，以及44-46中的3种，5种或更多序列有至少约85％，至少约90％，至少约95％，或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在优选的方面，该多肽可以含有、基本上或全部由SEQ ID NOS：2，3，5，25，29，以及44-46中的任一种的氨基酸序列组成。
在具体的一方面，本发明提供包含与SEQ ID NOS：2，5或25基本上同源的(例如，具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选地至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)免疫氨基酸序列的多肽。理想地，该氨基酸序列具有至少约85％，优选至少约90％，更优选至少约95％，或更多的(例如，97％，98％，或99.5％)序列与SEQ ID NO：5同源。本发明包括包含SEQ ID NOS：2，5，或25的多肽。
一些本发明多肽的重组的截短E多肽或者重组的全长E多肽诱导、促进或增强受试者(例如，哺乳动物)，或者受试者的细胞群对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。一些所述的多肽诱导受试者对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少两种，三种，或四种血清型中的每一种至少一种登革病毒的免疫应答。
一些所述的重组的截短E或全长E多肽诱导受试者对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，与通过每个上述至少一种登革病毒的WT截短的E蛋白诱导受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答相比，大致相当或更高，所述的WT截短的E蛋白含有与重组的或合成的多肽长度基本上相同的氨基酸序列。登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的WT截短的E蛋白分别能够包含基本上由SEQ ID NOS：338，339，340，以及341组成的氨基酸序列。
一些所述的多肽诱导受试者，或者受试者的细胞群，对至少两种或三种血清型的每一种至少一种登革病毒的免疫应答，与通过至少两种或三种血清型中的每一种至少一种登革病毒的WT截短的E蛋白所诱导的受试者或细胞分别对所述至少三种血清型的每一种的至少一种登革病毒的免疫应答相比，大致相等或更高。
优选的，重组的截短的E多肽诱导受试者或细胞的对四种血清型中的每一种的至少一种登革病毒的免疫应答，与通过SEQ ID NOS：338-341中任一种诱导的对四种血清型中的每一种的至少一种登革病毒的免疫应答相比，大致相等或更高。
一些所述的重组的截短的E或全长E多肽诱导结合至少一种登革病毒血清型的至少一种登革病毒的一种或多种抗体的产生，优选的，所述多肽诱导产生的一种或多种抗体与至少两种，更优选三种，或更优选四种血清型中每一种至少一种登革病毒相结合。在具体的一方面，重组的截短的E或全长E多肽诱导产生的与至少一，二，三，或血清型的至少一种登革病毒相结合的抗体数量，分别与通过至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型的截短的E蛋白或全长E蛋白诱导的抗体数量相比，大致相等或更多。在优选的一方面，重组的截短的E或全长E多肽诱导产生与至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，甚至更优选至少四种血清型中的每一种的至少一种登革病毒相结合的抗体数量，与通过至少一种，二种，三种或四种血清型的每一种的至少一种登革病毒的野生型截短的E蛋白或全长E蛋白诱导的抗体数量分别相比，大致相等或更多。
一些所述的重组的截短的E和全长E多肽诱导产生的一种或多种抗体，分别比通过至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型的截短的E或全长E蛋白诱导的抗体，更特异性的结合到至少一种血清型的至少一种登革病毒上。
在另一方面，一些本发明所述的重组的截短的E或全长E多肽诱导或产生针对至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，甚至更优选四种登革病毒血清型的每一种的至少一种登革病毒的中和抗体的效价。一些所述多肽诱导或产生针对至少一种血清型的至少一种登革病毒的中和抗体的效价，与通过至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型截短的E蛋白产生的抗至少一种血清型的至少一种登革病毒的中和抗体的效价相比，大致相等或更多，每个所述的野生型截短的E蛋白选自SEQ ID NOS：338-341。一些所述的多肽诱导或产生针对至少两种，至少三种或至少四种血清型中的每一种的至少一种登革病毒的中和抗体的效价，分别与通过至少两种，至少三种或至少四种血清型中的每一种的至少一种登革病毒的野生型的截短的E蛋白产生的对至少两种，至少三种或至少四种血清型中每一种至少一种登革病毒的中和抗体的效价相比，大致相等或更多，每种所述的野生型截短的E蛋白选自SEQ ID NOS：338-341。
本发明提供了含有前面所述的特征和此处所描述的特征(或所述特征的组合)的重组的截短的E多肽以及重组的全长的E蛋白，以及具有可选的或附加的本文进一步描述的性质的本发明的多肽。
本发明的多肽可以包含任何长度的免疫原性氨基酸序列(例如，大约10-1500氨基酸，更为一般的是50-1000氨基酸，以及更为一般的是大约100-800个氨基酸)。典型的，该本发明的免疫原性氨基酸序列至少约100个，更典型的至少约150，常用大约200，更常用大约250，通常至少约300，更通常至少约350，以及更通常(以及优选常用)至少约400个氨基酸(例如，长度约400-750的氨基酸，更一般的长度约425-685的氨基酸，用于重组的截短的E蛋白多肽，以及常用的约425至约450长度的氨基酸用于本发明的重组的截短的E蛋白多肽，约435至约460或约465长度的氨基酸用于本发明的重组的PRM15/截短的E多肽，以及约650至约680或约700长度的氨基酸用于本发明的C15/全长prM/全长E多肽，如上文及下文进一步所讨论的)。
信号肽序列
本发明的重组的截短的E蛋白以及重组的全长E多肽也可以或选择的包含任何合适数量以及类型的附加的氨基酸序列，例如一种或多种的肽片断。在一个具体的例子中，例如，所述的截短的E或全长E多肽更进一步地包含一组信号肽。通常，当重组的或合成的多肽被在动物细胞中表达时，信号肽指导重组地或合成地多肽到内质网。一般指导到细胞器的运输和/或至少一部分多肽在细胞中表达后的分泌的信号序列是特别优选的。所述的序列一般以多肽的不成熟的(例如，未全部完成)形式存在，并随后被细胞蛋白酶去除/降解以达到蛋白质的成熟形式。例如，截短的E或全长E多肽可以包括任何合适的信号序列或信号序列的组合以指导多肽到胞内区室，例如，序列指导多肽转运(或移位)至(尤其是蛋白被加工或从中释放)内质网或者分泌的路径(例如，ER内质网，golgi高尔基体，以及其它的分泌相关的细胞器和细胞内隔室)，细胞核，和/或指导多肽从细胞中分泌，在细胞膜易位，或从分泌蛋白的细胞分离以靶向到第2个细胞上。在这一方面，多肽可以包括细胞内靶向序列(或者“排序信号”)，该序列指导多肽进入核内体和/或溶酶体隔室或其它富含MHC II的隔室，以促进CD4+和/或CD8+T细胞递呈及应答，例如，来自溶酶体相关膜蛋白1的溶酶体/核内体靶向排序信号(例如，LAMP-1-见，例如，Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1161-75(1995)和Ravipraskash等，Virology 290：74-82(2001))，其一部分或同源体(见，例如，美国专利，US5,633,234)，或其它合适的溶酶体，核内体和/或ER内质网靶向序列(见，例如，美国专利US6,248,565)。在一些方面，细胞内靶向序列被设于多肽中靠近或邻近被证实的/被识别的抗登革病毒T-细胞抗原决定簇序列是可取的，其能够通过本领域的常规技术以及此处所涉及的技术识别，由此增加T细胞递呈含有该抗原决定簇的多肽片断的可能性。优选地，所述多肽由通过一种或多种核苷酸或病毒的核苷酸转运载体传输到宿主的重组的、合成的、突变的和/或分离的DNA或RNA所表达，该载体包括，例如，这里进一步所描述的一种或多种的基因转运载体。
优选地，多肽包含当其在哺乳动物细胞中表达时指导该多肽至内质网(ER)的信号序列(例如，促进了多肽的ER移位)。多肽可以含有任一合适的ER-靶向序列。许多ER-靶向序列是本领域所公知的。所述信号序列的例子在美国专利US5,846,540中描述。通常使用的ER/分泌信号序列包括大肠杆菌的ST II或Ipp信号序列，酵母α因子信号序列，以及如疱疹病毒gD信号序列的哺乳动物病毒的信号序列。关于信号序列的进一步的例子在，例如，美国专利US4,690,898，5,284,768，5,580,758，5,652,139以及5,932,445中描述。合适的信号序列可以采用本领域的公知技术识别。例如SignalP程序(在，例如，Nielsen等，(1997)ProteinEngineering 10：1-6中描述)，其可通过生物序列分析中心http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP公开获得，或者可以使用相似的能够识别类信号序列区域的序列分析软件。识别合适的信号肽的相关的技术在Nielsen等，ProteinEng10(1)：1-6(1997)中提供。序列可以被用于分析通常与信号序列相关的特征，例如，在欧洲专利申请0,621,337，Zheng和Nicchitta(1999)J Biol Chen 274(51)：36623-30，以及Ng等(1996)JCell Biol 134(2)：269-78中所描述的。
具有上述特征的重组的截短的多肽一般包含比登革病毒包膜蛋白短的免疫原性氨基酸序列；即，免疫原性的氨基酸序列比登革病毒包膜蛋白残基总数少一个或多个的残基。特别地，所述蛋白的免疫原性氨基酸一般为登革病毒包膜蛋白大小的约65-95％，更一般的约80-90％(由各自蛋白中残基的数量决定)，优选与ER-靶向信号序列组合，该序列通常大小与登革病毒prM序列的约5-20％相当(本发明提供的该氨基酸序列的有效片断将在本文中进一步描述)。该截短的E多肽通常缺少至少一部分的登革病毒E蛋白C-端跨膜序列或其功能和/或结构同系物。具有该特征的蛋白与含有该序列的蛋白相比显示不同的分泌质量。
本发明还提供了包含与完整或全长黄病毒包膜蛋白，优选登革病毒包膜蛋白，长度相同或相似的免疫原性氨基酸序列的重组多肽。与上述包含与黄病毒，例如登革病毒，的截短的包膜蛋白长度相同或相似的免疫原性氨基酸序列的“截短的”E序列相比，该氨基酸序列可分别称为“部分全长”和“全长”E多肽序列。此外，如下文所述，本发明还提供包含具有信号肽序列的所述全长免疫原性序列的多肽。
在一个具体的例子中，本发明的重组的截短的E多肽或全长的E多肽进一步的含有信号肽序列，该信号肽序列包含，或基本上由长度至少大约为10(例如，约8-20)个氨基酸残基的，与黄病毒prM蛋白序列的C端5-20％至少有约50％(优选至少约60％，65％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，或更多)以及更为优选的是至少约85-95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。例如，在一方面，该信号肽包含黄病毒prM蛋白序列(例如，登革prM蛋白序列)的C端最后15个氨基酸残基。任何合适的黄病毒C端prM序列可以作为信号肽的基础。黄病毒可参见例如，FIELDS VIROLOGY，同上，VIROLOGY，B.N.Fields等，Raven Press，Ltd.，New York，AcademicPress(2nd，1999)。几个黄病毒的prM序列同样是已知的(见，例如，Despres等.(1990)Virus Res 16(1)：59-75，Venugopal等.(1995)Vaccine Aug；13(11)：1000-5，国际专利申请WO01/39802，GENBANK Accession Nos.AAK97602，AAD28623，GNWVTB，BAA23792，BAA23784，BAA08221，BAA08220以及AAF34187)。这些或其它黄病毒prM信号序列或其基本同源的同系物(例如，具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％或94％，和更加优选至少约95％(如约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的C端部分可以通过标准的DNA合成技术产生(同源序列可以通过直接的诱变，递归序列重组，合理的序列设计，或其它任一合适的技术产生，其实例将在本文中进一步讨论)，并且融合到编码氨基酸序列的序列(例如，编码黄热病病毒C端至多10-20氨基酸的序列或其同源序列可以被融合到编码SEQ ID NOS：1-49以及153-155中任一个的序列)中。当在哺乳动物细胞中表达时，在该prM序列的5’端引入起始密码子一般在氨基酸序列中增加了一个N端甲硫氨酸(其它的修饰可能在细菌和/或其它的真核细胞中发生，例如在起始密码子处引入甲酰甲硫氨酸残基)。发明人关注包含或基本上由该氨基酸序列或至少其N端组成的多肽的N端甲硫氨酸序列在多方面的产生和应用。标准的核酸合成技术是本领域公知的(见，例如，Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Let 22：1859-1869(1981)，Mathers等，EMBO J.3：801-805(1984)，Saiki等，Science 239：487-491(1988)美国专利4,683,202，以及其它均在此引为参考)。
在一方面，重组的截短的E多肽或全长E多肽更进一步地包含信号肽，该信号肽包含约5-25个氨基酸的信号序列(例如约15个氨基酸，一般约10-20个氨基酸)，其具有至少约至少约50％或至少约60％，优选至少约70％，80％，或85％(例如，至少约65至约90％)，以及更优选地至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多氨基酸序列与含有选自DEN-1 prM、DEN-2 prM、DEN-3 prM和DEN-4 prM的prM蛋白的C端最后15个氨基酸的氨基酸序列，或含有甲硫氨酸残基及其后具有选自DEN-1 prM、DEN-2 prM、DEN-3 prM和DEN-4 prM(各自SEQ IDNOS：52-55)的prM蛋白的C端最后15个氨基酸的氨基酸序列同一性。包含甲硫氨酸及其后15个氨基酸残基的该氨基酸序列一般被称为“PRM 15”序列。在另一方面，信号肽包含的信号序列含有表现出与SEQ ID NOS：52-64中的至少一种有至少约55％氨基酸序列同一性的类似大小的氨基酸序列(优选至少约65％，更优选至少约75％，以及更优选至少约85％，至少约90％，至少约95％(例如，约80-99％))。在一方面，信号肽包含选自SEQ IDNOS：52-64中任一的信号序列。在重组的截短的E多肽或全长E多肽中的信号序列的位置依赖于所应用的信号序列的类型。信号序列位置通常决定于其对于蛋白残余物的功能。优选地，信号肽序列被定位在免疫原性E多肽序列的N端，特别是当信号序列为黄病毒的prM序列或其同系物时。信号肽序列可以结合多肽上任何合适的部分以使信号序列可以进行预期的靶向功能。一般的以及优选的，信号肽序列被定位到靠近(例如，在大约20个氨基酸或更少之内)重组的免疫原性氨基酸序列(例如，截短的E多肽或全长E多肽)，或者，更理想地，直接被融合到免疫原性氨基酸序列的N端。在一些例证中，其它异源区域或连接物可以定位在信号序列与免疫原性的E多肽之间。这些原件的内容将在本文其它地方作进一步的论述。
PRM 15/截短的E多肽和PRM 15/全长E多肽
含有登革病毒prM信号肽序列或其同系物(例如，SEQ ID NOS：52-64中任一的信号肽序列)的重组的E截短的多肽一般被称为信号肽/截短的E多肽，或信号肽/全长E多肽。在具体的形式，信号肽含有黄病毒(例如，登革病毒)prM蛋白15个C端氨基酸残基，包含该信号肽和本发明的重组的截短的E多肽或全长E多肽之一的重组的多肽被分别称为PRM 15/截短的E蛋白多肽(也称为“PRM 15/截短的E”多肽或“PRM 15/tE”多肽)或PRM 15/全长E蛋白多肽(也称为“PRM 15/全长E”多肽或“PRM 15/full E”多肽)。PRM 15序列一般被连接到截短的E或全长E多肽的首个氨基酸上。此外，PRM 15/tE和PRM 15/全长E多肽序列一般包含甲硫氨酸残基作为序列的首个氨基酸。
本发明的多肽包含本发明的重组的截短的E多肽或全长E多肽以及理想的包含一个氨基酸序列的信号序列，该氨基酸序列与SEQ ID NOS：65-116中至少一种有至少约65％，至少约70％，优选至少约80％，优选至少约85％，87％或89％，更优选地至少约90％，92％，93％或94％，以及更为优选地至少约95％的氨基酸序列同一性(所述地同源同时考虑prM片断或部分，例如，截短的E多肽的PRM 15片断和剩余的，免疫原性氨基酸序列)。在一具体的例子中，所述多肽包含与SEQ ID NOS：66，67，69，89，93，以及108-110中至少一种有至少约75％(例如，约80％至100％)，理想的至少约85％，较好的至少约90％，以及更为理想的约95％的氨基酸序列同一性的氨基酸。优选的，该多肽也包含选自SEQ ID NOS：65-116的氨基酸序列或与SEQ IDNOS：65-116有至少约95％，98％，99％，或更多同源的氨基酸序列。更为优选地，该多肽包含选自(或至少具有约98％，约99％，或更多同源的)SEQID NOS：66，67，69，89，93，以及108-110的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含与SEQ ID NOS：65-116中至少一种的氨基酸序列有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％，或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选地至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重组的或合成的多肽，该重组的或合成的多肽诱导受试者对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。
一些所述的PRM 15/截短的E或PRM 15/全长E多肽所诱导受试者或受试者的细胞群对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4组中至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答分别与至少一种血清型的野生型的PRM 15/截短的E或野生型的PRM 15/全长的E多肽所诱导的对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答相当或更多。在一方面，该野生型PRM15/截短的E蛋白多肽选自SEQ ID NOS：149-152。部分该PRM15/截短的E或PRM15/全长E多肽诱导的受试者或其细胞对至少两种，至少三种或优选至少四种血清型中每一种至少一种登革病毒的免疫应答分别与至少两种，至少三种或至少四种血清型的每一种的至少一种登革病毒所诱导的对至少两种，至少三种或至少四种血清型中每一种至少一种登革病毒的免疫应答相当或更多。一些所述的PRM 15/tE多肽包含具有至少90％氨基酸序列与SEQ ID NOS：66，67，69，89，93，以及108-110中至少一种序列同一性的氨基酸序列。在一具体的方面，该多肽包含选自SEQ ID NOS：66，67，69，89，93，以及108-110中的氨基酸序列。
一些所述的PRM 15/tE和全长E多肽诱导产生一种或多种与至少1，至少2，优选至少3，更优选至少4种登革病毒血清型(例，登革-1，登革-2，登革-3，和/或登革-4)的至少一种登革病毒相结合的抗体。在一方面，PRM 15/截短的E多肽产生的与至少一种血清型的至少一种登革病毒相结合的抗体的数目与至少一种血清型的WT PRM 15/截短的E蛋白(也称为“PRM 15/截短的E多肽”)诱导的抗体数目相当或更多，每种WT PRM 15/截短的E蛋白多肽选自SEQ ID NOS：149-152。
一些所述的PRM 15/tE多肽包含与SEQ ID NOS：65-116中至少一种序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其诱导产生的与至少两种或三种血清型的每一种的至少一种登革病毒结合的抗体数量与由至少两种或三种血清型的每一种的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白所诱导的大致相当或更多，所述每种所选血清型的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白选自SEQ IDNOS：149-152。对一些所述的多肽而言，所诱导的与至少四种血清型的每一种的至少一种登革病毒相结合的抗体的数量与由SEQ ID NOS：149-152之一所诱导的大致相当或更多。
此外，一些所述的PRM 15/tE多肽所诱导产生的一种或多种抗体比由至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型的PRM 15/截短的E多肽所诱导的抗体更能特异性的与至少一种血清型的至少一种登革病毒结合，其中具体的野生型PRM 15/截短的E融和蛋白选自SEQ ID NOS：149-152。
在另一方面，本发明的重组的PRM 15/tE多肽和PRM 15/全长E多肽诱导或产生针对至少一种登革病毒血清型的至少一种登革病毒，优选至少两种血清型的每一种的至少一种登革病毒，更优选至少三种血清型的每一种的至少一种登革病毒，更为优选选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4的至少四种血清型的每一种的至少一种登革病毒的中和抗体的效价。
在本发明的一方面，中和抗体的效价大约等于或高于至少一种血清型的至少一种登革病毒的PRM 15/tE或PRM 15/tE多肽所产生的中和抗体的效价，至少等于或高于由至少一种血清型的至少一种登革病毒的野生型PRM15/截短的E多肽或野生型PRM 15/全长E多肽所产生的中和抗体的效价。
在一具体的方面，对一些所述的PRM 15/tE多肽而言，诱导的对至少两种，三种或四种登革病毒血清型的每一种的至少一种登革病毒的抗体的效价与对至少一种血清型的至少一种登革病毒的相当或更高，与由至少两种，三种或四种血清型的每一种的相同的登革病毒的野生型PRM 15/截短的E多肽所诱导的至少相当或更高，其中具体的相同血清型(作比较)融和蛋白的野生型PRM 15/截短的E多肽选自SEQ ID NOS：149-152。
一些所述的PRM 15/tE多肽在哺乳动物体内诱导对至少两种，三种或四种血清型的每一种的至少一种登革病毒的至少一种中和抗体应答，其在哺乳动物与至少两种，三种或四种血清型的每一种的至少一种登革病毒相接触时，不发生抗体依赖性增强(ADE)。
在本发明的一方面，诱导对四种登革病毒血清型的中和抗体应答的重组的多肽包含与SEQ ID NOS：66，67，69，89，93，以及108-110中至少一种序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明进一步的提供重组的PRM 15/截短的E多肽，其包含序列模板Met Xaa1 Xaa2 Xaa3 Phe Ile Leu Xaa4 Met Leu Val Xaa5 Pro SerXaa6 Xaa7 Met Arg Cys Xaa8 Gly Xaa9 Xaa10 Asn Xaa11 Asp Phe Val Glu GlyXaa12 Ser Gly Xaa13 Xaa14 Trp Val Asp Xaa15 Val Leu Glu His Gly Xaa16 Cys ValThr Thr Met Ala Xaa17 Xaa18 Lys Pro Thr Leu Asp Xaa19 Glu Leu Xaa20 Lys ThrXaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Ala Xaa26 Leu Arg Xaa27 Xaa28 Cys Ile Glu AlaXaa29 Xaa30 Xaa31 Asn Xaa32 Thr Thr Xaa33 Xaa34 Arg Cys Pro Thr Gln Gly GluXaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Glu Glu Gln Asp Xaa39 Xaa40 Xaa41 Xaa42 Cys Xaa43Xaa44 Xaa45 Xaa46 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly LysGly Xaa47 Xaa48 Xaa49 Thr Cys Ala Xaa50 Phe Xaa51 Cys Xaa52 Xaa53 Xaa54 Xaa55Glu Gly Xaa56 Xaa57 Val Gln Xaa58 Glu Asn Leu Xaa59 Tyr Xaa60 Xaa61 Xaa62Xaa63 Thr Xaa64 His Xaa65 Gly Xaa66 Xaa67 His Xaa68 Val Gly Asn Xaa69 ThrXaa70 Xaa71 Xaa72 Gly Xaa73 Xaa74 Xaa75 Xaa76 Ile Thr Pro Gln Xaa77 Xaa78Xaa79 Xaa80 Glu Xaa81 Xaa82 Leu Xaa83 Xaa84 Tyr Gly Xaa85 Xaa86 Xaa87 Xaa88Xaa89 Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Xaa90 Xaa91 Xaa92 Leu Xaa93Xaa94 Met Lys Xaa95 Lys Xaa96 Trp Xaa97 Val His Xaa98 Gln Trp Xaa99 Xaa100Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Xaa101 Gly Ala Xaa102 Thr Xaa103 Xaa104 Xaa105Xaa106 Trp Asn Xaa107 Lys Glu Xaa108 Xaa109 Val Thr Phe Lys Xaa110 Xaa111 HisAla Lys Xaa112 Gln Xaa113 Val Xaa114 Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Xaa115 MetHis Xaa116 Ala Leu Xaa117 Gly Xaa118 Thr Glu Xaa119 Xaa120 Xaa121 Xaa122 Xaa123Gly Xaa124 Thr Xaa125 Xaa126 Phe Xaa127 Gly Xaa128 Leu Lys Cys Xaa129 Xaa130Xaa131 Met Xaa132 Lys Leu Xaa133 Xaa134 Lys Gly Xaa135 Ser Tyr Xaa136 Met CysThr Gly Xaa137 Phe Xaa138 Xaa139 Xaa140 Lys Glu Xaa141 Ala Glu Thr Gln His GlyThr Xaa142 Xaa143 Xaa144 Xaa145 Val Xaa146 Tyr Xaa147 Gly Xaa148 Xaa149 Xaa150Pro Cys Lys Ile Pro Xaa151 Xaa152 Xaa153 Xaa154 Asp Xaa155 Xaa156 Xaa157 Xaa158Xaa159 Xaa160 Xaa161 Gly Arg Leu Ile Thr Xaa162 Asn Pro Xaa163 Val Xaa164 Xaa165Lys Xaa166 Xaa167 Pro Val Asn Ile Glu Xaa168 Glu Pro Pro Phe Gly Xaa169 SerXaa170 Ile Xaa171 Xaa172 Gly Xaa173 Xaa174 Xaa175 Xaa176 Xaa177 Leu Xaa178Xaa179 Xaa180 Trp Xaa181 Xaa182 Lys Gly Ser Ser Ile Gly Xaa183 Met Phe GluXaa184 Thr Xaa185 Arg Gly Ala Xaa186 Arg Met Ala Ile Leu Gly Xaa187 Thr AlaTrp Asp Xaa188 Gly Ser Xaa189 Xaa190 Xaa191 Xaa192 Xaa193 Xaa194 Xaa195 Xaa196Xaa197 Xaa198 Xaa199 Xaa200 Xaa201 Xaa202 Xaa203 Xaa204 Xaa205 Xaa206 Xaa207Xaa208 Xaa209 Xaa210 Xaa211 Xaa212 Xaa213 (SEQ ID NO：51)的免疫原性氨基酸序列，其中Xaa在一具体的位置代表在该位置有任一或没有氨基酸残基(一般的及优选的，少于20个可变位置为单个残基缺失，即，表示没有氨基酸在该指示位置)。优选的，在这方面的多肽一般通过天然存在的氨基酸，优选亲水值高于0的氨基酸来描绘其特征。用于每个可变的位置(在序列模板中通过下标数字标定)的优选的氨基酸在表3中列出。表3：
如表3中所应用的，短线(-)表示在序列模板的指示位置优选为单个残基缺失(即，序列模板的特殊位置可以缺少几个氨基酸残基)，理想的，多肽具有的氨基酸序列中每个上述可变位置均为一种表2所列的优选残基(或单个残基缺失，如果适用)。
在一具体的方面，本发明提供重组的PRM 15/截短的E多肽，其包含序列模板为Met Xaa1 Xaa2 Xaa3 Phe Ile Leu Xaa4 Met Leu Val Xaa5 Pro Ser Xaa6Xaa7 Met Arg Cys Val Gly Xaa8 Gly Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Xaa9 Ser GlyXaa10 Xaa11 Trp Val Asp Xaa12 Val Leu Glu His Gly Xaa13 Cys Val Thr Thr MetAla Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Xaa14 Glu Leu Xaa15 Lys Thr Xaa16 Xaa17 Xaa18Xaa19 Xaa20 Ala Xaa21 Leu Arg Xaa22 Xaa23 Cys Ile Glu Ala Xaa24 Ile Xaa25 AsnXaa26 Thr Thr Xaa27 Xaa28 Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Xaa29 Xaa30 LeuXaa31Glu Glu Gln Asp Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Cys Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 Val AspArg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Xaa40 Xaa41 Thr CysAla Lys Phe Xaa42 Cys Xaa43 Xaa44 Xaa45 Xaa46 Glu Gly Xaa47 Xaa48 Val GlnXaa49 Glu Asn Leu Xaa50 Tyr Thr Xaa51 Xaa52 Ile Thr Xaa53 His Xaa54 Gly Xaa55Xaa56 His Xaa57 Val Gly Asn Asp Thr Xaa58 Xaa59 Xaa60 Gly Xaa61 Xaa62 Xaa63Xaa64 Ile Thr Pro Gln Xaa65 Ser Xaa66 Xaa67 Glu Ala Xaa68 Leu Xaa69 Xaa70 TyrGly Thr Xaa71 Xaa72 Xaa73 Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Xaa74Xaa75 Xaa76 Leu Leu Thr Met Lys Xaa77 Lys Xaa78 Trp Xaa79 Val His Xaa80 GlnTrp Phe Xaa81 Asp Leu Pro Leu Pro Trp Thr Xaa82 Gly Ala Xaa83 Thr Xaa84 Xaa85Xaa86 Xaa87 Trp Asn Xaa88 Lys Glu Xaa89 Xaa90 Val Thr Phe Lys Xaa91 Xaa92 HisAla Lys Xaa93 Gln Xaa94 Val Xaa95 Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met HisXaa96 Ala Leu Xaa97 Gly Ala Thr Glu Xaa98 Xaa99 Xaa100 Xaa101 Xaa102 GlyXaa103 Xaa104 Xaa105 Xaa106 Phe Xaa107 Gly His Leu Lys Cys Xaa108 Xaa109Xaa110 Met Asp Lys Leu Xaa111 Leu Lys Gly Xaa112 Ser Tyr Xaa113 Met Cys ThrGly Xaa114 Phe Xaa115 Xaa116 Xaa117 Lys Glu Xaa118 Ala Glu Thr Gln His GlyThr Xaa119 Xaa120 Xaa121 Xaa122 Val Xaa123 Tyr Xaa124 Gly Xaa125 Xaa126 Xaa127Pro Cys Lys Ile Pro Xaa128 Xaa129 Xaa130 Xaa131 Asp Xaa132 Xaa133 Xaa134 Xaa135Xaa136 Xaa137 Xaa138 Gly Arg Leu Ile Thr Xaa139 Asn Pro Xaa140 Val Xaa141 Xaa142Lys Xaa143 Xaa144 Pro Val Asn Ile Glu Xaa145 Glu Pro Pro Phe Gly Xaa146 SerXaa147 Ile Xaa148 Xaa149 Gly Xaa150 Xaa151 Xaa152 Xaa153 Xaa154 Leu Xaa155 Xaa156Xaa157 Trp Xaa158 Xaa159 Lys Gly Ser Ser Ile Gly Xaa160 Met Phe Glu Xaa161 ThrXaa162 Arg Gly Ala Xaa163 Arg Met Ala Ile Leu Gly Xaa164 Thr Ala Trp Asp PheGly Ser Xaa165 Gly Gly Xaa166 Xaa167 Thr Ser Xaa168 Gly Lys Xaa169 Xaa170 HisGln Xaa171 Phe Gly Xaa172 Xaa173 Tyr Xaa174 Xaa175 Xaa176 Xaa177 Xaa178 (SEQ IDNO：50)的免疫原性氨基酸序列。如上所述，其中Xaa代表任一氨基酸残基(通常为天然存在的氨基酸残基，优选亲水值高于0的氨基酸残基)或单个残基缺失(一般的，少于20个可变位置为残基缺失，即，表示没有氨基酸在该指示位置)。
每一可变位置(在序列模板中通过下标数字标定)的优选氨基酸在表4中列出。表4：
每一可变位置(在序列模板中通过下标数字标定)的优选氨基酸在表4中列出。理想地，所述多肽具有一免疫原性氨基酸序列，其中每一种上述可变位置均为一种表3所列的优选残基(或单个残基缺失，如果适用)。
本发明还提供重组的截短的E多肽，其诱导的对至少两种血清型的每一种的至少一种登革病毒的免疫应答与至少两种血清型的野生型PRM15/截短的E多肽所诱导的对至少两种血清型中的每一种的至少一种登革病毒的免疫应答相比，大致相当或更多，其中每个所述野生型PRM15/截短的E多肽选自SEQ ID NOS：149-152。
C15/全长prM/全长的E多肽
本发明也提供了一种重组或合成的多肽，其包含与SEQ ID NOS：139-148，236-253，343和345中至少一个的氨基酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。另一方面，还提供包含与SEQ ID NOS：139-148，236-253，343和345中至少一个的氨基酸序列有至少约70％，75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重组的或合成的多肽。本发明中这类多肽一般称作C15/全长prM/全长的E蛋白多肽(或简称“C15/full prM/full E”多肽)。
该C15/全长prM/全长的E多肽诱导受试者，如哺乳动物对登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。进一步的，一些上述的多肽诱导受试者对选自登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中至少两种，优选至少三种，更优选是至少四种血清型的每种至少一种登革病毒的免疫应答。更优选的，所诱导的对至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答要约等于或者强于由相应的至少一种血清型的WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白所诱导的对至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答，其中用于比较的同一血清型的WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白选自SEQ ID NOS：227-230。
一个特别方面，C15/全长prM/全长的E多肽诱导对选自四种血清型中每一种至少一种登革病毒所产生的免疫应答要约等于或者强于由选自SEQID NOS：227-230中任何序列所诱导的对至少一种登革病毒的免疫应答。
这种C15/全长prM/全长的E多肽诱导产生一种或多种结合至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体。优选的，这种多肽会诱导产生一种或多种的对至少两种，至少三种，优选至少四种登革病毒血清型的每种至少一种登革病毒的抗体。，
这种多肽诱导产生结合至少一种血清型中至少一种登革病毒的抗体的数量要约等于或者多于由WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白所诱导产生的结合至少一种血清型中至少一种登革病毒的抗体的数量，其中选出用于比较的每种特定血清型的WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白选自SEQ IDNOS：227-230。
一方面，重组的C15/全长prM/全长的E多肽诱导产生许多结合至少两种或至少三种血清型中每种至少一种登革病毒的抗体，其中所产生的抗体数量分别约等于或多于由选自SEQ ID NOS：227-230的对应至少两种或三种血清型的每种的WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白所诱导产生的结合至少两种或至少三种血清型中每种至少一种登革病毒的抗体的数量。在一个实施方案种，C15/全长prM/全长E多肽诱导产生的结合登革-1，登革-2，登革-3，登革-4中每种至少一种病毒的抗体的数量约等于或者多于由SEQ ID NOS：227-230中任一序列所诱导产生的结合四种血清型每种至少一种登革病毒的抗体的数量。
与同一血清型的登革病毒的相应的野生型C15/全长prM/全长的E多肽所诱导的抗体相比，该重组野生型C15/全长prM/全长的E多肽诱导的抗体能更加特异性的结合至少一种特定血清型的至少一种特定登革病毒，其中野生型C15/全长prM/全长的E多肽选自SEQ ID NOS：227-230。
本发明重组C15/全长prM/全长的E多肽的另一个特性是可以诱导产生针对至少一种血清型的至少一种登革病毒的中和抗体效价。一方面，这种多肽产生针对至少两种，或至少三种，或至少四种血清型中每种至少一种登革病毒的中和抗体效价。一些该多肽诱导受试者对至少两种、三种或四种血清型的每种至少一种登革病毒的至少一种中和抗体应答，而在将受试者分别与至少两种、三种或四种血清型每种至少一种登革病毒接触时没有出现抗体依赖性增强(ADE)现象。
这种多肽诱导受试者产生的对至少一种血清型至少一种登革病毒的中和抗体效价约等于或者大于由至少一种血清型的至少一种登革病毒的WTC15/全长prM/全长E融合蛋白所诱导的受试者对至少一种血清型的至少一种登革病毒的中和抗体的效价，这里的WT C15/全长prM/全长的E融合蛋白可以选自SEQ ID NOS：227-230。更进一步的，一些多肽产生的对至少两种、三种或四种血清型中每种至少一种登革病毒的中和抗体效价要分别约等于或者大于由至少两种、三种或四种血清型中每种至少一种登革病毒的WTC15/全长prM/全长的E融合蛋白所产生的对至少两种、三种或四种血清型中每种至少一种登革病毒的中和抗体的效价，其中的WT C15/全长prM/全长的E多肽可以选自SEQ ID NOS：227-230。
一方面，具有这些免疫原性原性和免疫刺激性的多肽包含与SEQ IDNO：140或者SEQ ID NO：141的氨基酸序列有至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。特别的，这样的多肽包含有SEQ ID NO：141。
本发明中一些该C15/全长prM/全长的E多肽诱导的对至少两种血清型中每种中至少一种登革病毒的免疫应答要约等于或者强于由至少两种血清型的每种WT C15/全长prM/全长的E多肽所诱导的对任何至少两种血清型中每种至少一种登革病毒的免疫应答，其中WT C15/全长prM/全长的E多肽可以选自SEQ ID NOS227-230。
重组C15/全长prM/全长的E多肽具有另外的生物学属性，其可以良好的诱导，促进，调控，和/或增强免疫应答，例如，在受试者细胞，包括如哺乳动物细胞中形成免疫原性病毒或者类病毒颗粒的能力。本发明提供了大量这种重组多肽，其中该多肽能够互相结合(如预期的，与其它的多肽和核酸)形成一种或更多的VLPs或病毒。
本发明还提供了本发明中所述的多肽的抗原性或免疫原性片段。这种多肽的抗原性或免疫原性片段可以包含约10个，约20个，约30个，或约50个氨基酸的氨基酸序列，其含有至少一个在相应的WT登革病毒C15，prM和E蛋白氨基酸序列中没有的T细胞抗原决定簇，其中新的抗原决定簇从上述的新的免疫原性氨基酸序列中的其中一个获得。通过例如引入另外的氨基酸残基和/或多肽或肽段(例如，信号肽序列或C端E蛋白序列，N端prM蛋白序列，或者C15/N端prM蛋白序列)从而增加多肽的长度来扩展所述多肽。该多肽通常的和优选的大小将进一步的在本申请别处进行论述。
C端E蛋白片段多肽
本发明的一个方面，本发明中所述的重组免疫原性或抗原性截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，和C15/全长prM/截短的E多肽可以进一步的包含另外的氨基酸序列，该氨基酸序列类似、基本类似、或同源于黄病毒的野生型E蛋白或黄病毒重组E蛋白(例如，更好是一种登革病毒或黄热病毒)的C端跨膜区的氨基序列段或片段(如，疏水氨基酸序列)。该氨基酸序列，可以被称作(黄病毒)E蛋白的C端氨基酸片段，C端E蛋白片段(或者简称“restof envelope”或“rest of env”序列)，通常具有大约20到大约70的氨基酸残基的长度，更一般的是大约40到大约65氨基酸残基的长度，而常常是大约40到大约65氨基酸残基的长度。这样的氨基酸片段可以包含对应E蛋白的“主干锚定区域”的氨基酸序列，其通常当E蛋白结合在病毒中时，将E蛋白的剩余部分(如，截短的E蛋白部分)锚定到细胞膜上。
一些上述的C端E蛋白片段每一个都含有一个氨基酸序列，这个序列中至少大约有45％，理想的是至少大约50％或55％(例如，大约60-99％)，优选是至少大约60％或65％，再优选是至少大约70％或75％，更优选是至少大约80％或85％，而最优选是至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的氨基酸序列与SEQ ID NOS：127-136中至少一个氨基酸序列同一性。
每一个这样的C端E蛋白片段都位于靠近(例如，大约20个氨基酸之内)或融合到以下任一个上：1)本发明中重组的截短包膜(tE)蛋白多肽的C端氨基酸(如，SEQ ID NOS 1-49和154-155)；2)本发明中重组PRM15/tE多肽的C端氨基酸(如，SEQ ID NOS 65-116)；3)本发明中重组全长的prM/tE融合蛋白的C端氨基酸；或4)本发明以上所述的重组C15/全长prM/Te蛋白多肽的C端氨基酸。该C端E蛋白片段用作延伸截短的E多肽的长度，使之达到与野生型黄病毒，优选特定血清型的登革病毒，的全长E多肽大约相等或基本相同的长度。因此，进一步含有该C端E多肽的本发明的重组截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，和C15/全长prM/截短的E多肽通常分别表示为重组全长E多肽，PRM15/全长的E多肽，和C15/全长prM/全长的E多肽。
一方面，(黄病毒)E蛋白的C端氨基酸片段的氨基酸序列包含，或者通常基本由对应下述的序列模式的氨基酸序列组成：Gly Val Ser Trp Xaa1 Xaa2Xaa3 Ile Gly Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Trp Xaa9 Xaa10 Asn Ser Xaa11 Xaa12 Thr SerXaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Gly Xaa21 Xaa22 Thr Leu GlyXaa24 Xaa25 Val Xaa26 Ala，其中Xaa代表任一氨基酸残基(见SEQ ID NO：137)。表5提供了序列模式中不同位置的优选氨基酸残基。
表5
理想的情况是，这个序列模式中每一个可变位置被表5中一个优选的残基占据。
本发明还包括编码上述和下述的全部重组多肽的多核苷酸。这些多肽和编码多肽的核苷酸有效的用于本发明所述的方法中，这些方法包括，但不限于，通过诱导，调控，增强，和/或促进哺乳动物对至少一种黄病毒血清型中的至少一种登革病毒的免疫应答进行治疗的预防性和/或治疗性方法，和/或检测或者诊断样品中结合一种或多种血清型中一种或多种登革病毒的抗体存在的方法。
N端C15/截短的prM多肽
重组PRM15/tE多肽和PRM15/全长E多肽可以进一步的包含另外的氨基酸序列，这个序列中至少大约有50％，理想的是至少大约60％(例如，大约65-100％)，优选的是至少大约70％，再优选是至少大约80％，而更优选是至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更多的氨基酸序列与SEQ ID NOS117-126中至少一个氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，该氨基酸序列至少有以下两段：(1)从衣壳蛋白序列的C端开始反向计算的黄病毒(例如，优选登革病毒)的重组或野生型衣壳(C)蛋白的最后15个氨基酸残基，和(2)从prM蛋白序列N端开始顺序计算的除了prM蛋白C端最后15个氨基酸外的黄病毒的(优选登革病毒)重组或野生型prM蛋白全部氨基酸残基。一般的，段(1)和段(2)是连接或结合的，段(1)在段(2)之前，位于N端。该氨基酸序列通常被称作C15/prM的N端氨基酸片段序列或N端C15/截短的prM多肽(或“rest of C15/PRM”，因为它包含C蛋白的15个残基和prM蛋白除去15个C端残基后的剩余残基)。该N端C15/截短的prM多肽通常有至少大约150，160，165，170，175或180个氨基酸残基的长度。一些上述多肽片段有至少大约165到大约175个氨基酸的长度。一些上述的多肽片段有至少大约167到大约171个氨基酸的长度。
N端C15/截短prM多肽位于或接近(例如，大约20个氨基酸之内)，或直接融合到本发明所述的免疫原性多肽的信号肽或免疫原性氨基酸序列(例如免疫原性截短的E多肽序列或免疫原性全长E多肽序列)的N端上，其依赖于该多肽中信号肽的位置(和存在)。例如，在一种格式中，一个N端C15/截短的prM多肽位于或接近或直接融合到本发明的重组的PRM15/tE登革病毒多肽的N端(例如SEQ ID NOS：65-116)或本发明的重组PRM15/全长E多肽的N端上(SEQ ID NOS：139-148，236-253)。另一方面，该N端C15/截短prM多肽位于或接近(例如，大约20个氨基酸之内)或直接融合到本发明所述的一个重组的截短E登革病毒多肽的N端上(例如SEQ ID NOS：1-49和153-155)或本发明的一个重组全长E多肽的N端上。
另一方面，重组PRM15/tE多肽或PRM15/全长E多肽进一步包括一个位于或接近或直接融合到PRM15/tE多肽或PRM15/全长E多肽的N端上的N端C15/截短prM多肽，其中N端C15/截短prM多肽含有对应SEQ ID NO：138中所列序列模式的氨基酸序列，其包括：Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Pro Xaa12 Xaa13 Xaa14 Ala Phe Xaa15 Leu Xaa16 Xaa17Arg Xaa18 Gly Glu Pro Xaa19 Xaa20 Ile Val Xaa21 Xaa22 Xaa23 Glu Xaa24 GlyXaa25 Xaa26 Leu Leu Phe Lys Thr Xaa27 Xaa28 Gly Xaa29 Asn Xaa30 Cys ProXaa31 Ala Xaa32 Asp Leu Gly Glu Xaa33 Cys Xaa34 Asp Tur Xaa35 Thr TyrLys Pro Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39 Xaa40 Glu Pro Xaa41 Asp Xaa42 Asp CysTrp Cys Asn Xaa43 Thr Xaa44 Xaa45 Trp Val Xaa46 Tyr Gly Thr Cys Xaa47Xaa48 Xaa49 Gly Leu Xaa50 Arg Arg Xaa51 Lys Arg Ser Val Ala Leu Xaa52 ProHis Xaa53 Gly Xaa54 Gly Leu Xaa55 Thr Arg Xaa56 Xaa57 Thr Trp Met Ser Xaa58Glu Gly Ala Trp Xaa59 Xaa60 Xaa61 Xaa62 Xaa63 Xaa64 Glu Xaa65 Trp Xaa66Leu Arg Xaa67 Pro Xaa68 Phe Xaa69 Xaa70 Xaa71 Ala Xaa72 Xaa73 Xaa74 AlaXaa75 Xaa76 Ile Gly Xaa77 Xaa78 Xaa79 Xaa80 Gln Xaa81，其中Xaa代表任意氨基酸残基。表6提供了该N端C15/截短的prM多肽序列上可变(Xaa)位置的优选氨基酸残基。
表6
理想的，上述序列模式中每一个可变位置上均是上面所列的氨基酸残基。
在某些情况，本发明中的重组PRM15/tE多肽(例如：具有与选自SEQ IDNOS：65-116的多肽序列至少85％同源的多肽)进一步包含含有选自SEQ IDNOS：117-126的序列的N端C15/截短prM多肽和/或含有选自SEQ ID NOS：127-136的序列的C端E蛋白片段。
在其它方面，本发明的多肽，例如重组截短的E多肽，PRM15/截短的E多肽，或C15/全长prM/截短的E多肽，理想的包含一个C端E蛋白片段，其含有与四种血清型之一的野生型登革病毒E蛋白的C端E蛋白片段序列(例如，SEQ ID NOS 127-130)有少于100％的序列同一性(如，大约99％，98％，97％，96％，95％，94％，90％)的氨基酸序列。本发明的多肽，例如重组PRM15/截短的E多肽或PRM15/全长E多肽还或可选的包含N端C15/截短prM多肽，其含有与野生型登革病毒prM蛋白的N端C15/截短的prM多肽序列(例如，SEQ ID NOS：117-120)有少于100％的序列同一性(如，大约99％，98％，97％，96％，95％，94％，90％)的氨基酸序列。
在某些方面，C15/全长prM/全长E多肽包含含有与野生型登革病毒E蛋白的C端E蛋白的序列有少于100％的序列同一性的C端E蛋白片段和含有与野生型登革病毒的N端C15/截短prM多肽有少于100％的序列同一性的C15/截短prM多肽，该多肽含有与选自SEQ ID NOS：139-148，236-253，343和345中至少一个序列有至少大约65％，70％，典型的是至少大约75％或80％，优选的是至少大约85％(包括例如至少大约85-99.5％)，进一步优选的是至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更多的氨基酸序列同一性的多肽序列。更优选的，该多肽含有(或至少含有大约80％，85％，88％，90％，95％，97％，98％，99％序列同一性的)选自SEQ ID NOS 139-148，236-253，343和345的多肽序列。含有与SEQ IDNO：140或SEQ ID NO：141相比至少大约80％，优选的是至少大约85％，更优选的是至少大约90％(例如大约90％，92％，93％，94％或95％)的序列同一性的多肽是本发明的特殊之处。优选的多肽含有(或至少含有大约96％，97％，98％，99％或更多序列同一性的)SEQ ID NO：141的序列。
本发明还提供了独立于上述任一多肽的本发明新的C端蛋白片段多肽和C15/截短prM多肽的应用。例如，含有或基本由至少一个该新的C端E蛋白片段多肽和/或至少一个该新的C15/截短prM多肽组成的多肽可以用来诱导或促进哺乳动物对如登革病毒的黄病毒的免疫应答；还可以用在诊断或测定生物体样品中结合一个或多个登革病毒的抗体存在的方法中；和/或用于登革病毒免疫原或抗原的构造。本发明还提供了编码C端E蛋白片段多肽和C15/截短多肽的核酸序列单独或与其它核酸序列，包括编码本发明PRM/tE多肽的核酸序列，结合后的应用。
发明人还设想了发明中(如SEQ ID NOS 56-64)新的PRM15同系物(也称作“prM15 homologs”)的应用，例如，在登革病毒免疫原或抗原的构建中，作为截短的或全长的登革病毒E蛋白抗原(例如SEQ ID NOS 1-49和153-155)的信号肽，或者作为其它病毒多肽，如黄病毒的截短或全长E蛋白，或者非病毒多肽的信号肽。本发明还提供了编码该信号肽的核酸序列(如这里描述的编码该氨基酸序列的多核苷酸部分)，单独应用或者与其它的核酸序列，如重组截短E多肽结合后的应用。一方面，还设想了该信号肽核酸序列与免疫原性核酸(如编码任一SEQ ID NOS：1-49和153-155序列的核酸)在DNA疫苗中的应用。
免疫原性多肽包括或者基本上包括一个与选自SEQ ID NOS 1-49和153-155序列基本同源的氨基酸序列(例如：至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％同源，优选的是至少大约90％，91％，92％，93％或94％同源，更优选的是至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％序列同一性)，其长度是至少大约400到500个氨基酸(更加典型的是至少440到460个氨基酸的长度)。该免疫原性氨基酸序列和相应的多肽本身的更低长度的限定通常是由该多肽所期望的用途所决定的。在一些情况下，对于用于促进对登革病毒免疫应答的免疫原性多肽，其大小类似于至少一个截短登革病毒包膜蛋白(如大约440个氨基酸)。可选的，该截短E多肽还可以延伸至本文所述的全长E蛋白多肽(具有一个至少与WT登革病毒E蛋白或WT黄病毒E蛋白长度相同的氨基酸序列)。可选的，对于用于诱导免疫应答的多肽，其含有PRM15/截短E多肽(如，具有大约435-465个氨基酸，或一个C15信号序列/全长prM/全长E多肽(如，具有大约650-680个氨基酸))。
病毒和类病毒颗粒
本发明还提供了包含一个或更多本发明中的多肽，核酸，载体的重组或合成病毒和类病毒颗粒(VLPs)。这样的可以减毒的病毒或VLPs，用于诱导，调节，增强或促进对选自上述至少一种血清型中至少一种黄病毒的免疫应答，而该黄病毒优选登革病毒。该病毒和VLPs还可以用于治疗和/或预防黄病毒的传染(如，一种或更多的登革病毒引起的传染)或保护不被黄病毒传染(如，一种或更多的登革病毒引起的传染)。这样的病毒和VLPs还可以用于疫苗来防止登革病毒传染和/或ADE。
一方面，本发明提供的病毒包括：(a)含有与选自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意核苷酸序列至少大约90％，95％或100％的序列同一性的核苷酸序列的核酸；和/或(b)含有与选自SEQ ID NOS 1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任意序列有至少大约90％，95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
还提供了嵌合病毒，其包含：(a)含有与选自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意序列有至少大约90％，95％或100％序列同一性的核苷酸序列的核酸，和至少一种选自包括黄病毒或腺病毒的其它病毒的基因组的附加核酸。黄病毒可以是一种登革病毒(如，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4)，或黄热病毒，日本脑炎病毒；马脑炎病毒；西罗尼病毒)；和/或(b)含有与选自SEQ ID NOS 1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343和345中任意序列至少大约90％，95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，和至少一种包含黄病毒的结构或非结构多肽或者包含黄病毒的结构或非结构多肽的片段的附加氨基酸，这里所述的黄病毒是一种登革病毒(如，DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4)，或非登革病毒，(例如黄热病毒，日本脑炎病毒；马脑炎病毒；西罗尼病毒)。
另一方面，本发明提供了诱导宿主对第一次黄病毒的免疫应答的方法，包括：(a)提供一种包含有与选自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中的任意序列至少大约90％，95％或100％序列同一性核苷酸序列的核酸，其中所述的核酸包含一个DNA序列；(b)由DNA序列产生传染性的RNA转录物；(c)把RNA转录物引入细胞；(d)表达细胞内的RNA转录物以产生病毒；(e)从所述细胞内收集病毒；和(g)给宿主接种该病毒。
这里所述的应用中，术语“病毒”不仅包括完整的病毒颗粒，而且包括含有一个或更多本发明所述多肽的类病毒颗粒(VLPs)。包含有上述C15/全长prM/全长E多肽和全长prM/截短E多肽之一的多肽的预期特征是通过这种多肽在哺乳动物宿主内形成类病毒颗粒(VLPs)。VLPs缺少病毒复制所必需的病毒成分，因此表现出病毒的高减毒形式。本发明中的VLP可以表现为多肽(例如，重组抗原)，其对一种或更多的黄病毒血清型，优选的一种或更多的登革病毒血清型，有保护性。VLPs可以表现为多于一种的多肽(如，重组抗原)；例如，一个VLP可以表现为而且因此用作保护性抗原的多价疫苗。在一些实施方案中，本发明的方法用来获得具有上述预期特性和属性的VLPs，这些特性和属性包括，例如，涉及增强的至少两种黄病毒血清型(更好的是至少两种登革病毒血清型)的交叉保护和/或交叉反应，分泌，和/或表达。以下几种已知病毒的病毒蛋白可以形成VLPs，包括人乳头病毒，HIV(Kang et al.，Biol.Chem.380：353-64(1999))，塞姆利基森林病毒(Notka etal.，Biol.Chem.380：341-52(1999))，人体多瘤病毒(Goldmann etal.，J.Virol.73：4465-9(1999))，轮状病毒(Jiang et al.，Vaccine 17：1005-13(1999))，细小病毒(Casal，Biotechnology and Applied Biochemistry，Vol 29，Part2，pp141-150(1999))，犬细小病毒(Hurtado et al.，J.Virol.70：5422-9(1996))，和肝炎E病毒(Li et al.，J.Virol.71：7207-13(1997))。
可以通过任何合适的技术检测到这样的VLPs的构成。检测介质中VLPs合适的已知技术包括，例如，电子显微镜技术，动态光散射(DLS)，选择性色谱分离(例如，VLPs的离子交换，疏水交互作用，和/或尺寸排除色谱分离)和密度梯度离心法。
另一方面，本发明还提供了修饰，突变，合成或重组的登革病毒。因此，本发明提供了含有至少一个本发明所述的重组登革病毒核酸或多肽的修饰的(例如，突变，合成，或重组)登革病毒。一个具体实例，本发明提供了通过在受试者细胞群中本发明所述的重组核酸的表达或翻译得到的修饰或重组登革病毒，所述的细胞例如，哺乳动物的细胞，包括例如，鼠，灵长类动物，和/或人类细胞。另外一个具体实例，本发明提供了一种包含至少一个本发明所述的重组DNA核苷酸序列的修饰或重组的登革病毒。另一个具体实例，本发明提供了通过在细胞群如哺乳动物细胞群内RNA核酸的表达或翻译得到的修饰或重组登革病毒，该RNA核酸包含一个RNA核酸序列，该序列包括本发明所述的修饰或重组的DNA核酸序列，其中这样的DNA核酸序列的每一个胸腺嘧啶核苷酸残基都被一个尿嘧啶核苷酸残基所代替；本发明还包括一个上述RNA核酸序列的互补序列。另一个优选具体实例是，本发明提供了包含RNA核苷酸序列的修饰或重组登革病毒，上述RNA核苷酸序列包含选自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中任意的分离或重组的DNA核酸序列，其中上述的DNA核苷酸序列中的胸腺嘧啶核苷酸残基都被尿嘧啶核苷酸残基所代替；本发明同样提供了所述RNA核苷酸序列的互补序列。
属性和特性
本发明中的重组，合成，突变，和/或分离的多肽显示出多种属性和特性，而且在上下文种都有效。一个方面是，这样的多肽可以用于检测和诊断生物体标本中抗黄病毒抗体，特别是前面详述的抗登革病毒抗体的方法。另一方面，本发明所述的重组，合成，突变，和/或分离的多肽的一个特性是可以促进动物或动物细胞组中对登革病毒中至少一部分(例如，登革病毒抗原，登革病毒抗原聚集物，登革病毒片段，登革病毒的VLP，或者选自一种，两种，三种甚至四种血清型中的一个灭活，减毒或加强的登革病毒)的免疫应答，细胞组优选哺乳动物，更优选人类。“促进”包括任何可察觉的提高，包括诱导免疫应答和增强已经存在的免疫应答。本发明中的多肽可以在宿主中诱导细胞毒性(或其它T细胞)的免疫应答，体液(抗体介导的)免疫应答，或(首选的)两者都有。这种多肽可以促进宿主，例如哺乳动物对至少登革病毒(如具体的登革病毒抗原)的一部分的抗体的产生。理想的，该多肽促进对登革病毒(可以由已知的IgG/IgM动力学分析技术所决定)的记忆抗体应答，而且该多肽诱导或促进对登革病毒的一种“稳固”(可记忆且无毒性的)抗体应答。
本发明中所述一种或更多的多肽的从属于给药或表达的对宿主例如哺乳动物的免疫应答还有更多的特殊特性，包括CD4+和CD8+淋巴细胞特别是CD8+淋巴细胞的引发和刺激，宿主细胞的抗登革病毒IgM和/或IgG抗体生成的促进，T细胞的活化和细胞因子的释放(包括，但不限于，例如，一个或更多肿瘤坏死因子(TNF)(例如TNF-α))，产生一个或更多的白介素(IL)(例如，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12)，产生一个或更多的干扰素(IFN)(例如，IFN-γ，IFN-α，IFN-β)，TGF(来自T细胞)，补体激活，血小板活化，增加和/或减少Th1细胞的应答，增加和/或减少Th2细胞的应答，和体液免疫的记忆。
本发明多肽的重要特性是增强受体内对选自一种或更多血清型，优选多种，中的至少一种登革病毒的免疫应答。例如，本发明提供了包含免疫原性氨基酸序列的多肽，这个序列可以在动物体内，例如哺乳动物体内，诱导一种或更多的结合选自至少两种病毒血清型每种中至少一种登革病毒的抗体。
本发明中更优选的多肽可以增强动物体，例如哺乳动物对选自至少三种病毒血清型中每种一种或更多的登革病毒的免疫应答。例如，当抗原性或免疫原性的剂量被表达到，应用到，或传递到哺乳动物内时，本发明中特有的多肽会促进对选自至少三种病毒血清型每种一种或更多的登革病毒的一种或更多的抗体产生。
本发明中多肽的一个优点是具有在在体及离体情况下(用以对比只能在细胞培养物内诱导该免疫应答的多肽)，诱导对至少一种血清型中的至少一种登革病毒的至少一部分(优选多重部分一例如多重抗原决定簇)的免疫应答的能力。本发明中的一些多肽可以诱导受试者对所有四种已知的登革血清型的抗原(包括登革病毒Ags)的一种或更多的抗体(抗体反应)(例如，包括但不限于，SEQ ID NOS 2，3，5，25，29，66，67，69，89，93，44-46，108-110，140和141)。
本发明中PRM15/tE多肽的一个优点是具有诱导或增强对一种或更多血清型中一种或更多登革病毒的免疫应答的能力，这种诱导或增强效果要大约等于或甚至超过由包含有野生型登革病毒PRM15/tE多肽的PRM15/tE多肽(例如，SEQ ID NOS 149-152)所诱导或增强的对一种或更多血清型中一种或更多登革病毒的免疫应答的效果。优选的，这种PRM15/tE多肽具有至少等于或强于一个野生型任意血清型登革病毒PRM15/tE抗原多肽(例如，多于任意选自SEQ ID NOS 149-152的序列)同样诱导或增强的对选自一种或更多血清型中一种或更多登革病毒的免疫应答的效果的能力。优选的，在诱导哺乳动物细胞对至少两种，优选的为至少三种，更优选的是至少四种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答的效果上，本发明所述的多肽的效果要分别等于或强于野生型登革病毒PRM15/tE多肽的效果。
此外，在在体或离体条件下诱导或增强受试者对选自全部四种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答的效果上，本发明所述的一些多肽的效果也要或者选择性的至少等于或强于所有四种血清型的野生型登革病毒PRM15/tE抗原多肽的结合的效果(如等于或强于SEQ ID NOS：149-152的结合)。
本发明所述的C15/全长prM/全长E多肽的一个优点是具有大约相当于或者甚至好于由野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽(如，SEQ IC NOS227-230)同样诱导或增强的对选自至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答的效果的能力。优选的，在诱导受试者对至少两种，优选的为至少三种，更优选的是至少四种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答的效果上，本发明所述的多肽的效果要分别相当于或强于野生型登革病毒C15/全长prM15/全长E多肽的效果。
一方面，一个C15/全长prM/全长E多肽的具有好于一个任意血清型的C15/全长prM/全长E抗原多肽(如，多于任意选自SEQ IC NOS 227-230的序列)所诱导或增强的对选自至少一种血清中至少一种登革病毒的免疫应答的效果的能力。
而且，一些这样的C15/全长prM/全长E PRM15/tE多肽也可以或者选择性的在受试者体内或来自受试者细胞中的离体条件下，诱导或增强对至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答，且效果要至少大约等于或强于所有四种登革病毒血清型的C15/全长prM/全长E抗原多肽的结合(例如等于或大约SEQ ID NOS：227-230的结合)对选自至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答的效果。
一些本发明所述的形成VLPs的C15/全长prM/全长E多肽诱导受试者中对至少一种血清型中至少一种登革病毒的免疫应答要大约相当于或强于一个不完全野生型登革病毒截短衣壳/全长prM/全长E VLP，一个灭活登革病毒颗粒，或两者一起所诱导的同样的免疫应答。选定的C15/全长prM/全长E多肽同样具有至少相当于或强于由减毒的WT登革病毒诱导的受试者对同样的选自至少一种血清型登革病毒中的至少一种登革病毒的免疫应答的能力。
本发明中所述截短E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽的特别的优点是，在同样增强对选自所有四种已知的血清型中至少登革病毒的免疫应答时，它们具有大约相当于或强于同源性野生型登革病毒截短E多肽或PRM15/tE多肽(如，SEQ ID NOS 149-152)或相同血清型的C15/全长prM/全长E多肽(如，SEQ ID NOS 227-230)或所有四种血清型的该野生型多肽的结合，其中任一的能力。本发明进一步提供了对选自所有四种血清型中一种或更多登革病毒的免疫应答的增强效果强于由任意血清型或其组合的野生型登革病毒PRM15/tE所诱导的免疫应答的效果(例如，强于基本上包含任意选自SEQ ID NOS 149-152中序列的多肽所诱导的免疫应答的效果)。本发明还提供了对选自所有四种血清型中一种或更多登革病毒的免疫应答的增强效果强于任意血清型或其组合的野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽所诱导的免疫应答的效果(例如，强于基本上包含任意选自SEQ ID NOS227-230中序列的多肽)。
本发明中所述多肽产生或诱导的免疫应答可以由任意合适的方法进行度量。评价体液免疫应答的合适技术的实例包括流动血细胞计数，免疫印迹法(检测薄膜缘蛋白)，包括点印迹法，免疫组织化学法(细胞或组织着色)，酶免疫测定法，免疫沉淀反应法，免疫组织化学法，RIA(放射性免疫测定)和其它EIAs(酶免疫测定)，例如ELISA(包含夹心ELISA和竞争ELISA的酶联免疫吸收实验)和ELIFA(酶联流动免疫分析)。ELISA分析包括特别的第一抗体与抗原的反应。第一抗体-抗原复合物的结果通过使用一个对第一抗体的第二抗体进行检测；第二抗体被酶标记而且一个酶介导的显色反应通过与第一抗体的反应产生。用于这些分析的合适的抗体标签包括放射性同位素；酶，例如山葵过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)；生物素；和荧光染料，例如荧光素或若丹明。在这里直接或间接的免疫测定都可以使用。HPLC和毛细管电泳法(CE)也可以用在免疫测定中来检测抗体与目标物质的复合物。这些技术的常规指导方法和相关原理介绍在例如，Harlow and Lane(1998)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York，Hampton R et al.(1990)SEROLOGICAL METHODS ALABORATORY MANUAL，APS Press，St.Paul Minn.，Stevens(1995)CLINICAL IMMUNOLOGY AND SEROLOGY：ALABORATORY PERSPECTIVE，CRC press，Bjerrum(1998)HANDBOOK OFIMMUNOBLOTTING OF PROTEINS，Vol.2，Zoa(1995)DIAGNOSTICIMMUNOPATHOLOGY：LABORATORY PRACTICE AND CLINICALAPPLICATION，Cambridge University Press，Folds(1998)CLINICALDIAGNOSTIC IMMUNOLOGY：PROTOCOLS IN QUALITY ASSURANCEAND STANDARDIZETION，Blackwell Scinec Inc.，and Maddox D E et al.(1983)J.EXP.MED.158：1211。ELISA技术和相关原理的特别介绍在例如，Reen(1994)Methods Mol Biol.32：461-6，Goldberg et al.(1993)Curr OpinImmunol 5(2)：278-81，Voller et al.(1982)Lab Res Methods Biol Med 5：59-81，Yolken et al.(1983)Ann N Y Acad Sci 420：381-90，Vaughn et al.(1999)Am JTrop Med Hyg 60(4)：693-8，and Kuno et al.J Virol Methods(1991)33(1-2)：101-13。有关Western blot的指导技术的介绍可以在以下找到，如，Ausubel et al.，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(WileyInterscience Publishers 1995).专门可以效仿的Western blot技术应用的介绍可以在以下找到，如，Churdboonchart et al.(1990)Southeast Asian J Trop MedPublic Health 21(4)：614-20和Dennis-Sykes et al.(1985)J Biol Stand 13(4)：309-14。专门的有关流式血细胞计数技术的介绍提供在，例如，Diamond(2000)IN LIVING COLOR：PROTOCOLS IN FLOW CYTOMETRY AND CELLSORTING，Springer Verlag，Jaroszeki (1998)FLOW CYTOMETRYPROTOCOLS，1st Ed.，Shapiro(1995)PRACTICAL FLOW CYTOMETRY，3rdedition，Rieseberg et al.(2001)Appl Microbiol Biotechnol 56(3-4)：350-60，Scheffold and Kern(2000)J Clin Immunol 20(6)：400-7，and McSharry(1994)Clin Microbiol Rev(4)：576-604。
简单地说，蛋白质印迹分析可以通过把重组登革热抗原，如本发明所述的重组多肽，附着到硝化纤维膜上并对吸附有染料的抗体进行染色。在使用指示酶的方法中使用有指示标签的抗体。该标签可以是一种酶，从而可以使用酶联免疫吸附分析(ELISA)。该标签同样可以是一种放射性元素，从而也可以使用放射性免疫测定(RIA)。
细胞毒性和其它T细胞免疫应答同样可以通过任何合适的技术进行检测。这样的技术实例包括ELISpot分析(尤其是，IFN-gamma ELISpot)，细胞内因子染色技术(ICC)(尤其是与FACS联合分析)，CD8+T细胞四聚体染色/FACS，标准的和修饰过的T细胞扩增分析，铬释放CTL分析，有限稀释分析法(LDA)，和CTL杀伤分析。T细胞扩增分析的指南和原理描述在，如，Plebanski and Burtles(1994)J Immunol Meth 170：15，Sprent et al.(2000)PhilosTrans R Soc Lond B Biol Sci 355(1395)：317-22，and Messele et al.(2000)ClinDiagn Lab Immunol 7(4)：687-92.。LDA描述在如，Sharrock et al.(1990)Immunol Today 11：281-286。ELISpot分析方法和相关原理描述在，如，Czerinsky et al.(1998)J Immunol Meth 247(1-2)：17-24，Ogg and McMichael(1999)Immunol Lett 66(1-3)：77-80，Schmittel et al.(2001) J Immunol Meth247(1-2)：17-24，Kurane et al.(1989)J Exp Med 170(3)：763-75，Chain et al.(1987)_J Immunol Meth 99(2)：221-8，and Czerkinsky et al.(1988)J ImmunolMeth，110：29-36，as well as U.S.Pat.Nos.5,750,356 and 6,218,132。四聚体分析描述在如，Skinner et al.(2000)J Immunol 165(2)：613-7。其它的T细胞分析技术在Hartel et al.(1999)Scand J Immunol 49(6)：649-54和Parish et al.(1983)JImmunol Meth 58(1-2)：225-37中都有描述。
T细胞的活化作用可以通过检测CTL活性或活化抗原如IL-2受体，CD69或HLA-DR分子的表达来进行分析。纯化T细胞的扩增可以在一个混合淋巴细胞培养物(MLC)分析中测量出来。MLC分析在本技术领域是已知的。简要的说，混合淋巴细胞反应(MLR)使用了作为刺激器细胞的放射性PBMC和以同种异源的PBMC作为应答器。刺激器细胞是有放射性的(2500rads)，且是和同种异源的PBMC(1×105cells/well)在96孔平底微量滴定培养皿中按照1∶1的比例共同培养了总共5天。在培养期间的最后8小时内，细胞被3H-胸腺嘧啶进行1uCi/孔的脉冲振动，而且细胞通过上述的细胞收集器收集到滤纸上。3H-胸腺嘧啶的掺入是通过标准技术进行检测。这样分析中的T细胞增殖可以通过测试孔的平均每分钟脉冲数来表示。
ELISpot分析可以测量T细胞分泌的特有细胞因子如干扰素-gamma或瘤坏死因子-alpha的数量，这种细胞因子可用做T细胞效应器的标记物。专用细胞因子ELISA仪器可以在市场上买到(例如一个IFN-gamma-专用ELISPot可以从R&D Systems，Minneapolis，MN得到)。ELISpot分析在实施例部分有进一步的描述(这些和其它的分析在例如实施例23-26中有描述)。
本发明所述的一种特有的重组多肽(如，重组截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，全长prM/全长E多肽，全长prM/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽)可以诱导对选自一种特定血清型的登革病毒的免疫应答大致相当或者强于的同源野生型登革病毒多肽(如，截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，全长prM/全长E多肽，全长prM/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽)诱导的免疫应答，这里的大致相当或强于的免疫应答通常是大致相当或更强的体液免疫应答。例如，对于病毒血清型重组多肽会产生至少大约相当或多于同源野生型登革病毒多肽(如，野生型登革病毒截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，全长prM/全长E多肽，全长prM/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽)所产生的中和抗体滴度。本发明所述的特有的重组截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，全长prM/全长E多肽，全长prM/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽在哺乳动物细胞内或体内理想的可以诱导T细胞反应，这个反应基本上相似于(例如，实际上至少大约80％，大约85％，大约90％，大约95％或大约100％)哺乳动物细胞内或体内的伴随给药或野生型登革病毒截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，全长prM/全长E多肽，全长prM/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽表达的T细胞反应。
可选的，为了在哺乳动物体内得到期望的T细胞反应，重组截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽可以通过给药或者相应的一个或多个野生型登革病毒截短E多肽或全长E多肽，PRM15/tE多肽或C15/全长prM/全长E多肽，E多肽，和/或其中片段分别的(例如，含有已知的上述多肽的T细胞抗原决定簇的氨基酸序列)表达。为了维持T细胞反应，重组多肽中可以含有一个或多多的多肽片段，这些片段来自衣壳蛋白，prM蛋白和野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4E蛋白的至少8个氨基酸长度，而且典型有大约8个到大约25个氨基酸(例如，大约10个到大约20个氨基酸)长度，这里所述的一个或多多多肽片段包含一个野生型登革病毒C蛋白，prM蛋白或E蛋白的T细胞抗原决定簇。另一个优选方案，一个重组PRM15/tE多肽包含有T细胞抗原决定簇序列，或这种T细胞抗原决定簇序列的变体或变体，这些序列可在两种或多种(例如交叉)血清型的，更好的是三种或四种血清型的野生型登革病毒PRM15多肽和/或E蛋白中观察到。另一个优选方案，一个重组C15/全长prM/全长E多肽包含有T细胞抗原决定簇序列，或这种T细胞抗原决定簇序列的变体或变体，这些序列可在两种或多(例如交叉)种血清型的，优选的是三种或四种血清的野生型登革病毒C15多肽，prM蛋白，和/或E蛋白中观察到。
本发明所述重组多肽(包括，如tE或全E多肽，PRM15/tE多肽，或C15/全长prM/全长E多肽)的一个优点是具有在受试者中诱导对登革病毒中和抗体应答的能力。中和抗体应答可以被例如蚀斑减少中和实验的方法测量出来。任意合适的PRNT分析法都可以用来检测一个多肽(或表达这种多肽的多核苷酸)是否诱导对选自一种或多种的血清型中的一种或更多种的登革病毒的一种或多种的中和抗体。一个对登革病毒的蚀斑减少中和实验的实例在Russel et al.，J Immunol(1967)99：285-290中有相应介绍，其中综合了涉及到它的全部用途。其它的PRNT方法和形式都是本技术领域众所周知的一般技术方法。这种分析的结果依赖于所选择的期望中和程度。例如，一个PRNT50，是减少至少50％血小板形成单位(p.f.u)的经检验的最高血清稀释物。典型的情况是报道出相反的PRNT数值(具体细节见实施例部分中这类分析方法的实行和分析的结果)。较好的是，如上述，选择本发明中的重组多肽(和本发明中表达这种多肽的多核苷酸)能够对受体中选自至少一组或至少两种血清的登革病毒诱导中和抗体反应。更佳的是，选择本发明中的重组多肽(和本发明中表达这种多肽的多核苷酸)能够对受体中选自至少三种血清中每组一种或更多的登革病毒诱导一个中和抗体反应。如上所述，一些本发明中所述的重组多肽能够对受试动物中例如哺乳动物体内选自已知的四组野生型登革病毒血清中每组一种或更多的登革病毒诱导中和抗体反应。
除了可以诱导中和抗体反应之外，在诱导对选自至少一组血清中至少一种登革病毒的中和抗体方面，本发明所述的重组PRM15/tE多肽也相当于或高于同源血清野生型登革病毒PRM15/tE多肽中的至少一种(例如选自SEQID NOS 149-152中的至少一种)。相比所有我们所知的四组血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽，本发明这样的多肽对选自至少一组血清中的至少一种登革病毒也可以或者选择性的诱导更高的中和抗体的滴度(例如相比分别含有基本上选自SEQ ID NOS149-152的四种多肽的组合有更高的中和抗体滴度)。另一方面，相比任意病毒血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽，本发明提供的一种PRM15/tE多肽可以对受体中选自四组血清中每一组的至少一种登革病毒诱导更高的中和抗体滴度(例如相比含有任何本质上选自SEQID NOS 149-152序列的多肽有更高的中和抗体滴度)。
对选自至少两种病毒血清中每一组至少一种登革病毒，优选的是选自至少三种病毒血清，更优选的是选自至少四种病毒血清的每一组至少一种登革病毒，本发明同样提供了PRM15/tE多肽，这种多肽能够对上述病毒诱导一个相当于或高于至少两种或至少三种或至少四种已知血清的野生型登革病毒PRM15/tE多肽(例如SEQ ID NOS149-152中的至少两种或三组或四组，或者基本上含有SEQ ID NOS149-152中任一序列的多肽)对上述病毒所诱导的中和抗体滴度。
另一方面，除了可以诱导中和抗体反应之外，在诱导产生针对选自至少一组血清中至少一种登革病毒的中和抗体方面，本发明所述的重组C15/全长prM/全长E多肽也可以产生相当于或高于同源血清野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽中的至少一种(例如选自SEQ ID NOS 227-230中的至少一种)的抗体滴度。相比所有我们所知的四组血清的野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽的组合，本发明这样的C15/全长prM/全长E多肽对选自至少一组血清中的至少一种登革病毒也可以或者选择性的诱导更高的中和抗体的滴度(例如相比分别含有本质上选自SEQ ID NOS227-230的四种多肽的组合有更高的中和抗体滴定度)。另一方面，相比任意病毒血清的野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽，本发明提供的一种C15/全长prM/全长E多肽可以对受试体中选自四组血清中每一组的至少一种登革病热毒诱导更高的中和抗体滴度(例如相比含有任何本质上选自SEQ ID NOS227-230序列的多肽有更高的中和抗体滴度)。
对选自至少两种病毒血清中每一组至少一种登革病毒，较好的是选自至少三种病毒血清，更好的是选自至少四种病毒血清的每一组至少一种登革病毒，本发明同样提供了重组的C15/全长prM/全长E多肽，这种多肽能够对上述病毒诱导一个相当于或高于至少两种或至少三种或至少四种已知血清的野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽(例如SEQ ID NOS227-230中的至少两种或三组或四组，或者本质上含有SEQ ID NOS149-152中任一序列的多肽)对上述病毒所诱导的中和抗体滴度。
本发明中一个特有的有益特征是伴随多肽有能力对受试体内所有已知的四组病毒血清的登革病毒诱导一个中和抗体反应。相比所有四组血清(例如，分别选自SEQ ID NOS 19-152和227-230)的同源野生型登革病毒多肽(例如，野生型PRM15/tE或野生型C15/全长prM/全长E多肽)或这种野生型多肽的组合，本发明所述PRM15tE和C15/全长prM/全长E多肽的一个意外的效果是能够对选自所有四组血清的一种或更多的登革病毒诱导中和抗体的一个更高水平。
本发明中所述重组多肽的一个特有的期望特性是能够对动物体内包括例如哺乳动物的脊椎动物体内的登革病毒诱导一个中和抗体反应，所述登革病毒至少是一种，较好的是选自多种血清中的至少两种，更好的是选自所有四种登革热血清中的登革病毒。因此，例如，从动物(例如哺乳动物)体中得到的血清投到本发明所述的一个重组多肽的免疫原性或抗原的总量(或投到足够表达重组多肽的免疫原性或抗原总量的本发明所述的重组多肽总量)或其中表达本发明所述多肽的免疫原性或抗原的总量，被稀释至少大约30倍，优选的是至少大约40倍或大约50倍，更优选的是至少大约60倍(例如至少大约70倍，80倍或更高)，在含有至少三种病毒血清中的登革病毒样品的50％的登革病毒的蚀班减少中和滴度检测，表现出中和抗体反应。
“抗原量(antigenic amount)”表示抗原的数量，例如一种多肽抗原或这编码种多肽抗原的多核苷酸的数量，它足够在体外细胞和/或受试者体内或受试者回体细胞或组织中诱导，提高，增强或调控免疫应答或免疫反应。可以通过例如服用或给予多肽本身的抗原量，或者服用或给予编码这种抗原多肽的多核苷酸的数量，产生出多肽的抗原量。
另一方面，本发明所述的重组多肽对哺乳动物体内选自全部四组登革病毒血清型的至少一种登革病毒诱导一个中和抗体反应，这种重组多肽在感染登革病毒的哺乳动物上没有出现抗体依赖性增强(ADE)的情况下被给药。更加详细的说，本发明提供了重组多肽，其中的血清来自动物(例如哺乳动物)，且其已经被给药，服用了至少一种这种重组多肽的抗原或免疫原性剂量，或者至少一种重组核酸，或者稀释至少大约40倍，大约50倍或60倍，优选的是至少大约70倍或大约80倍或更多的编码和/或表达本发明所述的重组多肽的抗原或免疫原性剂量的载体，这种多肽中和了包含有选自在蚀班减少中和滴度检测中四组病毒血清型中一组或更多组中至少一种登革病毒的样品的至少30％，40％，45％，50％，55％，60％或更多。
另一方面，本发明提供的多肽对选自两组或更多血清更好的是所有四组登革病毒血清型中每一组的一种或更多地登革病毒显示出一个至少大约40，50，60或大约70或更高(例如，大约40到大约100，大约40到大约80，大约60到大约80，或大约70到大约100)的PRNT50数值的倒数。另一个优选的方面，来自受试体的包含有这种水平的多肽(通过表达的或服用的)的血清，稀释至少大约20倍，40倍，60倍，70倍或80倍，可以中和在蚀班减少中和滴度检测(PRNT)中至少至少约50％的一种黄病毒的样品；另一方面，一种这样的稀释物可以中和含有PRNT分析中四组登革病毒血清型中每组一种登革病毒的样品的至少约50％。
本发明另一个方面，本发明所述多肽对选自所有四组病毒血清型至少一种登革病毒诱导中和抗体反应，理想的情况是没有显示出一种血清型登革病毒不相符的中和抗体反应程度，而对选自其它血清型的一种或更多的登革病毒的免疫应答或保护是允许的(例如通过显性免疫掩饰)。在这一方面，在对含有本发明所述至少一种重组多肽的抗原总量的受体中获得的所有四组血清中每一组一种或更多登革病毒时，PRNT50数值的倒数在理想情况下在以下一个范围内，最高的PRNT50数值的倒数少于大约4x最低的PRNT50数值的倒数(例如，少于大约3.9x，约3.8x，约3.5x，约3.4x或约3.3x最低的PRNT50数值的倒数)，少于大约3x最低PRNT50数值的倒数(例如，少于大约2.9x，约2.8x，约2.5x，约2.4x或约2.3x最低PRNT50数值的倒数)，而且更好的是少于大约2x最低PRNT50数值的倒数(例如，少于大约1.9x，约1.8x，约1.7x，约1.6x，约1.5x，约1.4x，约1.3x，约1.2x，约1.1x最低PRNT50数值的倒数)，或从大约4x或更少到大约1.5x更少的最低PRNT50数值的倒数。本发明还提供了一种包含两种或更多血清型的两个或多个的重组多肽混合物的组合物，其中所述组合物对不包括在组合物内的血清型的一种或多种登革病毒不表现出免疫显性。
本发明所述的重组多肽可以是一种分泌的或细胞膜结合(或连接)多肽。在不少例子中，这种重组多肽理想情况下是一种分泌多肽。例如，在一个例子中，一些本发明所述分泌的重组的PRM15/tE多肽令人惊奇的比至少一种病毒血清型的野生型登革病毒PRM15/tE多肽分泌的更有效(例如，比包含或实质上含有至少一个选自SEQ ID NOS 149-152的序列的多肽更有效)，而且比任意四组病毒血清型的野生型PRM15/tE多肽还要更加的有效(例如，比包含有或实质上含有任意选自SEQ ID NOS 149-152的序列的多肽更有效)。一些本发明所述分泌的重组C15/全长prM/tE多肽要比至少一组病毒血清型的WT登革病毒C15/全长prM/tE多肽分泌的有效，且比任意选自四组病毒血清型的WT C15/全长prM/tE多肽更加有效。
本发明所述分泌的重组C15/全长prM/全长多肽要比至少一组病毒血清型的WT登革病毒C15/全长prM/全长多肽分泌的有效(例如，比包含有或实质上含有至少一个选自SEQ ID NOS 227-230的序列的多肽更有效)，而且比任意选自四组病毒血清型的WT C15/全长prM/全长多肽更加有效(例如，比包含有或实质上含有任意选自SEQ ID NOS 227-230的序列的多肽更有效)。
任何合适的技术可以用来分析多肽或蛋白的分泌。例如，分泌的水平可以通过比较蛋白质印迹法/免疫印迹法的结果来测量，而蛋白质印迹法/免疫印迹法利用被编码这种多肽的多核苷酸转染的细胞的上层清液和表达同源WT登革病毒的多核苷酸转染的细胞的类似上层清液，其中这种重组和WT多肽都是通过一个本质上同源的表达盒进行表达(例如，包含或实质上含有识别启动子，增强子和多聚腺嘌呤区的表达盒。例如见下述的一个pMaxVax10.1载体。下述的实施方案提供了这种分析蛋白分泌的技术。
任何合适的技术可以用来检测本发明中重组多肽(或用于比较相应的野生型病毒多肽)的表达水平。这样的技术包括例如RNA印迹法(介绍在如McMaster et al.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 74：4835-38(1977)andSambrook，infra)，逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)(介绍在如U.S.Patent5,601,820 and Zaheer et al.(1995)Neurochem Res 20：1457-63，and in situ)，杂交技术(介绍在如U.S.Patents 5,570,340 and 5,506,098)。蛋白的定量同样可以通过Lowry分析和其它分类的蛋白定量分析(见如Bradford(1976)AnalBiochem 72：248-254 and Lowry et al.(1951)J Biol Chem 193：265)来实现。从被编码这种重组多肽的多核苷酸转染的细胞溶解产物中得到的本发明所述重组多肽，蛋白质印迹法是评定重组多肽表达水平的一种首选技术。下述的实施方案提供了这种评定重组多肽表达水平(用于比较的野生型多肽的表达水平)技术的使用。
本发明所述多肽和编码这种多肽的核酸有一个特有的有益特性，它们能够在面对至少一组血清型至少一种登革病毒的时候在受试体内例如哺乳动物(包括灵长类动物)的体内诱导保护性免疫应答。更好的是，在面对选自至少两种病毒血清型或至少三种甚至至少四种病毒血清型时，本发明所述的多肽可以在受试体内诱导一个保护性免疫应答。
产生保护性免疫应答决定于，例如，受试体被至少一组血清型中至少一种登革病毒的感染后没有出现疾病情况或症状。在小鼠模型实验中，通常是在注射登革病毒之后，保护性免疫应答的产生使小鼠免于死亡。虽然高等的灵长类动物测试是首选测试，但通常是用这样的小鼠模型实验做登革病毒疫苗测试(如见，Johnson and Roehrig，J.Virol.73(1)：783-6(1999))。在人体中，当在受到登革病毒感染后(最好是用多病毒血清型的至少一种登革病毒重复感染后)，保护性免疫应答的产生在可以检测到的减少，更佳的是DF和/或DHF完全没有发生的时候。通常情况，虽然不是必要的，但是本发明所述的保护多肽仍然会对一种或更多种登革病毒或复合血清型病毒(例如，两组，三组或四组血清型)诱导出中和抗体。
本发明所述多肽可以包含上述任意特性的合适的组合。例如，其中一种情况，本发明提供的多肽(例如重组截短E多肽)，其包含与选自SEQ ID NOS1-49和153-155中至少一个氨基酸序列有至少大约65％，优选的是至少大约75％(例如大约80-95％)同源的一个氨基酸序列，这种多肽对受试体内选自四组病毒血清型中每一组中一种或多种的登革病毒能诱导出相比相应血清型的WT截短E蛋白多肽更加有效的抗体。
另一种情况，本发明提供的一种多肽(例如重组或合成PRM15/tE多肽)，其包含与选自SEQ ID NOS 65-116中至少一个序列有至少大约65％，至少大约75％，优选的是至少大约85％，90％或95％同源的氨基酸序列，这种多肽对受试体内选自四组病毒血清型中每一组中一种或更多种的登革病毒能诱导出相比任意选自SEQ ID NOS 149-152的WT登革病毒多肽所诱导的至少一种抗体更加有效的一种或多种的抗体。
另一种情况，本发明提供的一种多肽(例如重组C15/全长prM/全长E多肽)，其包含与选自SEQ ID NOS 39-148和236-253(或选自SEQ ID NOS39-145，147-148和236-253或任意含有两种或更多这种多肽组合的序列)中至少一个氨基酸序列有至少大约65％，至少大约75％(例如大约80-95％)，和/或优选的是至少大约85％或90％同源的氨基酸序列，这种多肽对受试体内选自四组病毒血清型中每一组中一种或更多的登革病毒能诱导出相比任意选自SEQ ID NOS 227-230WT登革病毒多肽所诱导的至少一种抗体更加有效的抗体。
重组tE多肽可以与ER引导的信号氨基酸序列连接或延伸，通常其与C-末端黄病毒prM氨基酸序列基本上同源，更好的是与登革病毒PRM15序列或新的同源物(例如任意选自SEQ ID NOS 52-64的一个序列)基本同源(或选自上述序列)(如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选的是至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选的是至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)，如上所述，因此形成一个信号多肽/tE多肽，例如一个PRM15/tE多肽(例如任意选自SEQ ID NOS 1-49和153-155序列的多肽)。这样一种重组tE多肽或PRM15/tE多肽可以被上述的C端E蛋白片段多肽延长形成重组全长E多肽或PRM15/全长E多肽，其中C端E蛋白片段多肽例如可以是一个与任意选自SEQ ID NOS 127-136序列大体同源(例如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选的是至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选的是至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的序列。另外或作为选择的，一个重组PRM15/tE多肽或一个PRM15/全长多肽可以被上述的一个N端C15/截短prM多肽延长分别的形成一个重组C15/全长prM/tE或C15/全长prM/全长E多肽，其中N端C15/截短prM多肽例如可以是一个与选自SEQ ID NOS 117-126中任一序列基本同源(例如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选的是至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选的是至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的序列。如上面或下面的实施方案中所述，这样的重组多肽相比由WT DEN序列形成的prM/E融合蛋白有更高的表达和/或分泌水平。
一些这种重组tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM/全长E和C15/全长prM/tE多肽同样可以具有对受试体例如哺乳动物宿主中选自至少一组血清型的至少一种登革病毒以及更好的是选自多组血清型的一种或多种登革病毒诱导产生中和抗体反应的能力。如上所述，对选自至少一组血清型中的至少一种登革病毒的这种多肽会比至少一种同样或相似血清型和相似大小和构型的登革病毒(例如，野生型登革病毒tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM/全长E，C15/全长prM/tE)诱导更高的中和抗体滴度。一些这种重组tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM/全长E和C15/全长prM/tE多肽也具有对受试体中选自至少一组血清型的至少一种登革病毒诱导保护性免疫应答，更好的是具有对受试体中选自至少两种血清型中每组一两种登革病毒诱导保护性免疫应答。这些本发明所述的重组tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM/全长E和C15/全长prM/tE多肽也具有对受试体中选自DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4血清型中每组至少一种登革病毒诱导保护性免疫应答。理想的是，这些多肽在没有ADE发生时对选自两组或更多登革病毒血清中一种或多种病毒诱导这样的中和抗体反应和/或保护性免疫应答。
另一个优选方案，本发明提供了重组tE多肽，其中包含与至少一种选自SEQ ID NOS 1-49和153-155的氨基酸序列有至少大约65％，至少大约75％(例如大约80-95％)，优选的是至少大约85％或大约90％或大约95％氨基酸序列同一性性的氨基酸序列，这种多肽会对受试体中至少两种病毒血清型中一种或多种登革病毒诱导一个中和抗体反应。更好的是，这种多肽会对受试体中选自DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4血清型中每组一种或多种的登革病毒诱导中和抗体反应。可选择的，这种中和抗体(Ab)的产生相比一种或多种登革病毒的同源野生型截短E能产生更高的中和抗体滴度。这些多肽同样可以结合本发明所述的任意上述特性，或其中的组合物，伴随多肽(例如，ER引导序列的包涵物，至少一个C端E蛋白片段多肽和/或至少一个N端C15/截短prM多肽的包涵物，高等的分泌物，高等的表达物，和受体例如一种哺乳动物体内对多种血清型的一种或多种登革病毒在没有ADE产物时的护保性免疫应答产物)。这样的多肽表现出本发明多肽的一种或更多特性(例如，能够对一中或多种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答；相比对应WT登革热多肽，能够对一种或多种血清型的至少一种登革病毒诱导更强的免疫应答；能够对受试体中选自多种血清型的一种或多种登革病毒诱导中和抗体产物)或者其中的任意合适的组合。这些多肽均可以用于本发明所述的方法之中，包括对至少一种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答的方法，和对登革病毒诱导保护性免疫应答的方法，和/或检测样品中一种或种多血清的登革病毒的抗体存在。
本发明的另一个方面，这种多肽包含有与SEQ ID NOS 65-116其中至少一个序列基本同源的(例如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选的是至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选的是至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)氨基酸序列。更佳的多肽包含有任意选自SEQ ID NOS 65-116的一个序列。这样的多肽表现出本发明中伴随多肽的上述任意特性(例如，能够对一种或种多血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答；相比对应WT登革热多肽，能够对一种或多种血清型至少一种登革病毒诱导更强的免疫应答；能够对受试体中选自多种血清型的一种或多种登革病毒诱导中和抗体产物)或者其中的任意合适的组合，而且可以用在对至少一种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答的方法，对登革病毒诱导保护性免疫应答的方法，和/或检测或诊断样品中对一种或多种血清型的登革病毒的抗体存在的方法。
还有另外一个方面，本发明提供了一种多肽，这种多肽包含有与SEQ IDNOS 139-148，236-253，343和345或SEQ ID NOS139-145，147-148，236-253，343和345其中任意一个序列大体同源的(例如，至少大约65％氨基酸同源性，优选的是至少大约75％的氨基酸同源性，再优选的是至少大约80％或85％的氨基酸同源性，而更优选的是至少90％或至少95％氨基酸同源性)氨基酸序列。其中较佳的多肽包含有选自SEQ ID NOS139-148，236-253，343和345的其中一个序列。这样的多肽表现出本发明中伴随多肽的上述任意特性(例如，能够对一种或多种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答；相比对应的WT登革热多肽，能够对一种或多种血清型至少一种登革病毒诱导更强的免疫应答；能够对受试体中的多种血清型的一种或多种登革病毒诱导中和抗体产物)或者其中的任意合适的组合，而且可以用在对至少一种血清型中的至少一种登革病毒诱导免疫应答的方法，对登革病毒诱导保护性免疫应答的方法，和/或检测或诊断样品中的一种或种多血清型的登革病毒的抗体存在的方法。
另一方面，本发明提供了由包含多核苷酸序列编码的重组截短E多肽，所述多核苷酸序列选自：(a)具有与选自SEQ ID NOS 285-330或与其互补的多核苷酸序列中至少一种多核苷酸序列至少大约85％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸残基均被尿嘧啶核苷酸残基替代的SEQ ID NOS 285-330中的DNA序列或者与其互补RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列或与其互补的RNA多核苷酸序列具有至少大约85％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在严格条件下能与基本全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)在严格条件下能与基本全长的任意选自(a)-(d)的遗传密码简并的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意组合的多核苷酸序列。
还有另外一个方面，本发明提供了由包多核苷酸序列编码的重组PRM15/tE多肽，所述多核苷酸序列选自：(a)具有与选自SEQ ID NOS 256-200和235或与其互补的多核苷酸序列中的至少大约85％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸残基均被尿嘧啶核苷酸残基替代的SEQ ID NOS 156-200和235中DNA序列或与者互补的RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列或与其互补的RNA多核苷酸序列具有至少大约85％，90％或95％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在严格条件下能与基本上全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)在严格条件下能与基本上全长的任意选自(a)-(d)的遗传密码简并的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意组合的多核苷酸序列。这样的多肽表现出本发明中伴随多肽的任意特性而且可以用于本发明所述方法中，例如，对至少一种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答的方法，和/或检测或诊断样品中一种或种多血清型的登革病毒的抗体存在的方法。
另一方面，本发明包含由多核苷酸序列编码的重组C15/全长prM/全长E多肽，所述多核苷酸序列选自：(a)具有与选自SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344或与其互补的多核苷酸序列中至少大约85％，90％或95％序列同一性性的多核苷酸序列；(b)包含有其中所有胸腺嘧啶核苷酸残基均被尿嘧啶核苷酸残基替代的SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344中一个DNA序列或者与其互补的RNA多核苷酸序列的RNA多核苷酸序列；(c)与(b)中至少一个RNA多核苷酸序列或其互补的RNA多核苷酸序列具有至少大约85％序列同一性性的RNA多核苷酸序列；(d)在严格条件下能与基本上全长的(a)-(c)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(e)在严格条件下能与基本上全长的任意选自(a)-(d)的遗传密码简并的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列；(f)具有(a)-(e)中多核苷酸序列式任意组合的多核苷酸序列。这样的多肽表现出本发明中伴随多肽的上述任意特性而且可以用于本发明所述方法中，例如，对至少一种血清型中的至少一种登革病毒诱导免疫应答的方法，和/或检测或诊断样品中一种或多种血清型的登革病毒的抗体存在的方法。
本发明的重组多肽有利于能够持久的对受试体中选自至少两种，较好的是至少三种，而更好的是至少所有四组病毒中一种或多种登革病毒诱导免疫应答。例如，在给受试体服用或给予至少一个本发明所述的多肽的抗原或免疫原性计量之后，对选自至少一种血清中至少一种登革病毒诱导的中和抗体免疫应答可以持续至少大约30天，至少大约40天，较好的是至少大约50天，再好的是至少大约70或大约80天，更好的是至少大约100天，更久的是至少大约120天，而进一步可以持续至少大约180天(例如大约3，4，6或9个月，大约1年，2年或更久)。
另一方面，服用或给予本发明所述的至少一种多肽通过服用或给鱼合适的核酸载体(例如一个pMaxVax10.1载体)该载体含有编码至少一种抗原或免疫原性计量的至少一种多肽，在受试体中至少一种多肽的初始表达之后，对选自至少一种血清型中的至少一种登革病毒诱导的中和抗体免疫应答可以持续至少大约30天，至少大约40天，较好的是至少大约50天，再好的是至少大约70或大约80天，更好的是至少大约100天，更久的是至少大约120天，而进一步可以持续至少大约180天(例如大约9个月，大约1年，2年或更久)。
通过服用本发明所述重组多肽例如是一种重组嵌合的登革病毒PRM15/tE或C15/全长prM/全长E多肽的(或编码表达这样多肽的多核苷酸或载体，实施例中将进一步描述)获得免疫应答，理想情况可以持续长于通过服用相应的野生型登革病毒多肽(例如是一种野生型登革病毒PRM15/tE或C15/全长prM/全长E多肽)或服用编码表达这样的野生型登革病毒多肽的多核苷酸或载体得到的一个更持续的免疫应答时间。
另一方面，本发明提供了一种包含有至少大约8个氨基酸残基长度，至少大约10个氨基酸残基长度或至少大约15个氨基酸长度的至少大约3，5，6，7，8，10，15，20，25，30个或更多的氨基酸(残基)序列片段的重组或嵌合多肽，其中这样的氨基酸残基来自一个或更多的野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4prM/E氨基酸序列，而且其中的这种多肽包含有来自任意一个野生型登革病毒prM/E序列的至少大约2个(优选的是至少大约3，4，5，10，15或更多)不连续片段。这种重组或嵌合多肽也可以或选择性的可以促进或增强免疫应答，特别是在体液免疫应答的情况下，大约相当于或高于包含4个或更少的不同登革病毒和/或黄病毒氨基酸序列片段的重组或嵌合登革病毒抗原和/或黄病毒抗原。
另一个面，例如，本发明提供了包含有至少大约1O到40个氨基酸残基长度的至少大约5到20个氨基酸残基片段的重组或嵌合多肽，其中这样的氨基酸序列片段是一个或更多的野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4prM/E氨基酸序列的不连续片段。
核酸
本发明还提供了一种包含有编码本发明上述任意多肽包括重组和嵌合tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM/全长E和C15/全长prM/tE多肽的核苷酸序列的核酸。除非根据上下文正式说明或截然相反的情况外，术语“核酸”和“多核苷酸”在有关本发明所述的重组登革热抗原编码DNA，RNA或其它新的核酸分子中是同样的含义。编码本发明所述的一种重组，合成，突变和/或分离多肽的核酸可以是适于表达本发明所述多肽的核酸的任意类型(例如，单链或双链标准RNA，DNA，或它们的组合体)，还可以包括任意合适的核苷酸碱基，碱基类似物和/或主链(例如，包含或由磷脂酸盐更好的是磷酸二酯形成的主链)。对核酸的修饰特别的可以在一个编码这种多肽的mRNA密码子的第三位置上。提供了对包含在多核苷酸序列中的核苷酸修饰的例子，如the MANUAL OF PATENT EXAMININGPROCEDURE§2422(7th Revison-2000)。在文中别处有另外的和非常规的序列修饰的介绍。在一些例子中，本发明所述的核酸可以是一个分离核酸。本发明中的核酸可以被称作重组的，合成的和/或突变的核酸或多核苷酸；本发明中的重组的，合成的和/或突变的核酸或多核苷酸通常被简单的称作一“重组核酸”，“重组多核苷酸”，或甚至更简单的称作一“核酸”或“多核苷酸”。本发明的核酸可以被称作重组的或合成的编码登革抗原的核酸。
另一方面，本发明的重组核酸包括任意导致在期望宿主细胞内表达或转译本发明所述重组多肽(例如合适的产物)的核苷酸序列。本发明重组多肽的合适产物可以是本发明多肽免疫原性剂量或抗原剂量的表达。“免疫原”是诱导，促进，增强或调控免疫应答的分子(例如，在基于体外细胞的分析，或服用免疫原的受试体内，或被移植到受试体中的来自体内的细胞(例如，受试体的细胞或组织))。另一个特别的方面，“免疫原”是引起免疫应答的抗原。在某一个特别方面，免疫原是引起强免疫应答的抗原，尤其是在对至少一种病原体(例如至少一种血清型的至少一种黄病毒)的保护性免疫的情况下。“免疫原剂量”通常是分子的数量，例如，多肽或多核苷酸，它们能够诱导，促进，增强或调控体外细胞内的免疫应答，和/或受试体内或来自受试体的细胞或组织的免疫应答。另一方面，免疫原性剂量是指引起免疫应答的抗原的数量，这个免疫应答对至少一种病原体，例如一种黄病毒(例如一种或多种血清型的至少一种登革病毒)提供了至少部分或全部保护性免疫。多肽的免疫原形剂量的产生，可以通过例如对体外细胞或一定数量的受试体内或来自受试体内的细胞或组织服用或给予免疫原性剂量的多肽本身，或者通过对体外细胞或一定数量的受试体内或来自受试体内的细胞或组织服用或给予编码免疫原性剂量多肽的核苷酸。
编码本发明所述多肽的核酸具有上述的一个或更多属性。本发明所述核酸同样应用在本发明所述方法之中，包括对包含接触，服用或给予编码本发明所述多肽的核酸的受试体(或受试体的细胞群)中至少一种血清型中至少一种黄病毒(例如最好是登革病毒)诱导免疫应答的方法，对包含接触，服用或或给予编码本发明所述多肽的核酸的受试体(或其细胞群)中一种或多种血清型中至少一种黄病毒(例如最好是两种或多种血清型中的至少一种登革病毒)诱导保护性免疫应答的方法。
同样的，本发明所述核酸不局限于直接编码用于表达或本发明多肽产物的核苷酸序列。例如，这种核酸包括由本发明所述多肽通过intein-like表达得到的核苷酸序列(在例如Colson and Davis(1994)Mol Microbiol12(3)：959-63，Duan et al.(1997)Cell 89(4)：555-64，Perler(1998)Cell92(1)：1-4，Evans et al(1999)Biopolymers 51(5)：333-42，and de Grey，TrendsBiotechnol(2000)18(9)：394-99中有介绍)，或包含自剪接内含子(或其它自剪接RNA转录物)的核苷酸序列，其构成中间重组的编码多肽的序列(如U.S.Patent 6,010,884中所述)。这种多核苷酸同样包括一些序列，它们由通过得到编码所述多肽的mRNA转录物达到RNA水平或通过转录之前的反式剪接机制达到的DNA水平(关于这种机制的原理在例如Chabot，TrendsGenet(1996)12(11)：472-78，Cooper(1997)Am J Hum Genet 61(2)：259-66，and Hertel et al.(1997)Curr Opin Cell Biol 9(3)：350-57有介绍)。由于这种遗传密码子的固有简并性，一些核酸可以编码成本发明所述的任意特有多肽。因此，例如，这里所述的任意特有编码重组的登革热抗原的核酸可以通过替换一个或更多密码子为基于遗传密码子简并性的同等密码子(由这种密码子有关的氨基酸进行称呼)来进行修饰。
本发明所述多核苷酸可以通过任意合适的合成，处理和/或分离技术或它们的组合技术来获得。例如，本发明所述多核苷酸通常且较佳的通过标准核酸合成技术如本技术领域已知的固相合成技术获得。这些技术中，适于大约100个碱基的片段通常是分别合成，然后结合例如酶或化学连接的方法，或多聚酶介导的重组方法形成本质上任意期望的连续核酸序列。通过化学合成技术的使用，也可以容易(或选择性的完成)完成本发明所述核酸的合成，这些化学合成技术例如，典型的磷酰胺方法，介绍在例如Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-69，或Matthes et al.(1984)EMBO J 3：801-05，这些通常用于自动化合成方法。本发明所述多核苷酸期望通过磷酰胺技术更好的是通过自动DNA合成器所获得。其它合成核酸的技术及相关原理的介绍在，如，Itakura et al.(1984)Annu Rev Biochem 53：323，Itakura et al.(1984)Science 198：1056，and Ike et al.(1983)Nucl Acid Res 11：477。
通常，普通的成品核酸可以通过各种商业资源获得，例如The MidlandCertified Reagent Company(mcrc@oligos.com)，the Great American GeneCompany(http：//www.genco.com)，ExpressGenInc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)。同样的，普通的肽和抗体也可以通过各种资源获得，例如PeptidoGenic(pkim@ccnet.com)，HTIBioproducts，Inc.(http：//www.htibio.com)，和BMA BiomedicalsLtd.(U.K)，Bio.Synthesis，Inc。
用于修饰核酸的重组DNA技术在本技术领域是已知的(例如，限制性核酸内切酶消化，连接，逆转录法和cDNA生产法，和PCR)。有用的重组DNA技术技术和相关原理介绍在，如，Mulligan(1993)Science 260：926-932，Friedman(1991)THERAPY FOR GENETIC DISEASES，OxfordUniversity Press，Ibanez et al.(1991)EMBO J 10：2105-10，Ibanez et al.(1992)Cell 69：329-41(1992)，and U.S.Patents 4,440,859，4,530,901，4,582,800，4,677,063，4,678,751，4,704,362，4,710,463，，4,757,006，，4,766,075和4,810,648，而更多的介绍出现在Sambrook et al.(1989)MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Press，其第三版(2001)，Ausubel et al.(1994-1999)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Wiley Interscience Publishers(with GreenePublishing Associates for some editions)，Berger and Kimmel，“Guide toMolecular Cloning Techinques”in Meth Enzymol，152 Acad.Press，Inc.(SanDiego，CA)，and Watson et al.，RECOMBINANT DNA(2d ed)。
如文中所详述，本发明所述重组核酸包括：(1)编码上述任意多肽序列和其免疫原性或抗原片段(包括例如本发明所述的重组免疫原性tE，全长E，PRM15/tE，PRM15/全长E，C15/全长prM15/全长E和C15/全长prM/tE多肽)和其互补序列的多核苷酸序列；(2)与(1)(和其片段)所述多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；在严格条件下与这里定义的核酸包括任意选自(1)和(2)中多核苷酸序列和其互补序列杂交的多核苷酸；(3)包括(1)和(2)中所述的所有这种核酸序列的新的免疫原性或抗原片段，其中具有一种或更多的上述的免疫应答诱导属性，或者编码具有一种或更多上述免疫应答诱导属性的一种或更多的多肽，以及这种片段的互补序列；和(4)上述物质的变体，类似物和同源衍生物。
本发明所述多核苷酸可以是双链或单链，而且如果是单链，可以是编码链或非编码(例如反义或互补)链。除编码本发明所述多肽的核酸序列之外，本发明所述多核苷酸包括一个或更多另外的编码核酸序列使得编码例如融合蛋白，前蛋白，前蛋白原，异源跨膜结构域，引导序列(不同于信号序列)或类似物(更多的特有例子在文中有进一步介绍)，和/或包括非编码核苷酸序列，例如内含子，或对编码序列在合适的宿主内的表达起作用的5′和/或3′不翻译区。
例如，编码截短E或全长E蛋白的本发明所述多核苷酸(也就是tE-编码或全长E-编码多核苷酸)可以进一步包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码了位于靠近或融合到本发明所述tE-编码或全长E-编码免疫原性序列上的ER-引导信号序列。更佳的是，编码了信号序列的核酸序列具有上述的信号序列的首选特征(例如，一个黄病毒更好是一个登革病毒prM蛋白C端的15个氨基酸的片段，或与此基本同源的序列)。
另一方面，本发明提供了包含与选自SEQ ID NOS 272-284更佳的是SEQID NOS 272-280中至少一个序列具有基本同源的核苷酸序列(例如，至少大约65％，70％，75％，优选是至少大约80％或85％，而更优选是至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性)的编码信号序列的核酸。这种编码信号肽的多核苷酸序列用途相似而且包括了上述本发明信号肽的应用。另一方面，包含有选自SEQ ID NOS 272-284中一个序列的截短E多肽编码或全长E多肽编码核酸同样是本发明所特有的。
本发明还提供了新的核酸在重组登革病毒抗原的用途和其它应用(例如，诱导对一种或多种登革病毒的免疫应答方法中的应用，和/或治疗或预防方法如疫苗中的应用，在诊断或分类方法如核酸探针方法中的应用，在编码这种重组登革病毒抗原的较小核酸序列的扩增方法中的应用(这些应用在文中别处有介绍))。
例如，其中一个方面，本发明提供了包含与选自SEQ ID NOS 285-330中至少一个多肽序列大体序列同一性的(例如，至少大约65％，70％，75％，优选至少大约80％或85％，更优选至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性性)多核苷酸序列的核酸。另一种特殊情况，这种核酸包含选自SEQ ID NOS 285-330的序列。这种核酸编码有本发明所述的至少一种重组截短E多肽，而且通常称作编码重组tE多肽的核酸。这种核酸具有上述重组核酸的一个或更多的属性。
包含和/或基本包含例如选自SEQ ID NOS 285-330中序列的核酸编码的多肽的长度大约与本发明上述的截短E型重组登革抗原的长度相同。这种核酸通常是至少大约1300个核苷酸长度，而且通常是大约1300-1375个核苷酸长度(例如大约1340个核苷酸长度)。
本发明同样提供了包含有编码重组截短E多肽登革抗原的第一核苷酸序列和编码一个信号肽的第二核苷酸序列的核酸。例如，其中一个例子，本发明提供了包含与选自SEQ ID NOS 156-200和235种至少一个序列基本同源的(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)序列的核酸。更佳的是，这种多核苷酸包含有选自SEQ ID NOS 156-200和235中的一个序列。这种核酸通常是至少大约1350个核苷酸长度，而且更通常是大约1350-1400个核苷酸长度(例如大约1385个核苷酸长度)。这种核酸编码PRM15/tE多肽，而且通常称作编码PRM15/tE多肽得到核酸。另一种特殊情况，这种核酸包含有选自SEQ ID NOS 157-159，185，187，172，200和235中的一个序列。这种核酸具有上述的重组核酸的一个或更多属性。
本发明还提供了与选自SEQ ID NOS 211-214中至少一个多肽序列基本序列同一性的(例如，至少大约65％，70％，75％，优选至少大约80％或85％，更优选至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性性)核酸序列。另一种特殊情况，这种核酸包含有选自SEQID NOS 211-214的序列。这些核苷酸序列是分别编码DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4 PRM15/tE多肽的人类优化密码子核苷酸序列，而且通常称作人类CO编码WT PRM15/tE多肽的核酸。由这些核酸序列编码的多肽提供了优于非人类CO编码WT PRM15/tE多肽的核苷酸序列的生物学属性。这种多核苷酸在结构上明显不同而且缺少与非人类CO编码WT PRM15/tE多肽的核苷酸序列的基本同源。例如，相比由非人类CO WT登革病毒PRM15/tE序列表达的相似PRM15/tE多肽，由这些序列编码的多肽可以被表达和/或分泌更高的水平。
本发明还提供了与选自SEQ ID NOS 215-218中至少一个多肽序列大基本同源的(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)核酸序列。另一种特殊情况，这种核酸包含有选自SEQ ID NOS 215-218的一个序列。这些核酸序列是分别编码DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4 PRM15/tE多肽的人类优化密码子核苷酸序列，而且通常称作人类CO WT编码C15/全长prM/全长E多肽的核酸。由这些核酸序列编码的多肽表现出优于非人类CO WT编码C15/全长prM/全长E多肽的核酸表达的C15/全长prM/全长E多肽的生物学属性。例如，相比由非人类CO WT编码C15/全长prM/全长E多肽的核酸序列表达的相似C15/全长prM/全长E多肽，由这些序列编码的多肽可以被表达和/或分泌更高的水平。
本发明还提供了编码例如以下所述的抗原融合蛋白的重组核酸：(1)C15登革病毒信号序列(其中同样包括了作为信号序列的第一残基的蛋氨酸残基，因此形成一个16个氨基酸的信号序列)；(2)全长prM登革病毒序列；和(3)全长包膜(E)蛋白序列，其中这里的三种序列按照1，2和3的顺序融合在一起。另一方面，本发明提供了编码抗原融合蛋白的重组核酸，这些抗原融合蛋白每一个都包含由全长prM登革病毒序列融合的一个全长包膜(E)蛋白序列。
另一方面，本发明提供了核酸，该核酸包含了至少包含编码tE多肽的多核苷酸序列或编码PRM15/tE多肽的多核苷酸序列的第一个多核苷酸序列，以及编码有与选自SEQ ID NOS 127-136中序列具有至少大约55％，优选至少大约65％，更优选至少大约75％(例如至少大约80％，85％，90％，95％或更多)的氨基酸序列同一性性的多肽序列的第二个多核苷酸序列。或者，第二个多核苷酸序列与选自SEQ ID NOS 127-136中的序列具有至少大约55％，优选至少大约65％，更优选至少大约75％(例如至少大约80％，85％，90％，95％或更多)的氨基酸序列同一性性。在某些情况下，这种核酸理想的包含选自SEQ ID NOS 223-226的序列。
另一方面，本发明提供了包含与选自SEQ ID NOS 201-210，254-271，342和344中至少一个序列具有基本同源(例如至少大约65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源性)的多核苷酸序列的核酸。一些特殊情况中，这种核酸包含有选自SEQID NOS 201-210，254-271，342和344中的序列。这种核酸编码了本发明所述的重组C15/全长prM/全长E多肽，而且通常被称作编码重组C15/全长prM/全长E多肽的核酸。这种核酸具有上述重组核酸的一个或更多属性。
本发明还提供了一种核酸，其基本上核酸的全长与本发明公开和/或上述的核酸序列在至少中等的严格杂交条件下，至少严格的杂交条件下，至少更严格的杂交条件下，或优选非常严格的杂交条件下进行杂交。“核酸的大体全长”是指这个核酸序列长度的至少大约50％，普遍的是至少大约60％，至少大约70％或75％，通常是至少大约80％，至少大约85％，至少大约88％，而且典型的是至少大约90％，例如，至少大约91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多。因此，本发明提供了一种多核苷酸，其包含与核酸与相关序列(例如，文中公开的核酸序列，如，选自SEQ ID NOS156-218，235，254-271，285-330，342和344中的序列)至少大约50％，优选至少大约65％，更优选至少大约80％杂交的核酸序列(检测序列)。更佳的是，这种杂交核酸至少在严格条件下和优选至少更高的严格条件下与公开的核酸序列(例如，选自上述的SEQ ID NOS中的序列)杂交。核酸杂交实验中的中等严格，严格和更高严格杂交条件是本技术领域的已知技术。同样的，这里简要的介绍可以组合达到这些严格水准的因素的例子。
典型的中等严格条件包括在37℃下20％福尔马林(或甲酰胺)的溶液3，0.5xSSC，50Mm磷酸钠(pH7.6)，5xDenhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸盐溶液，和20mg/ml剪切降解的鲑精DNA中温育，然后通过1xSSC在大约37-50℃条件下的过滤器中清洗，或者大体类似的条件，例如Sambrook et al.，supra，和/或Ausubel，supra中介绍的中等严格条件。
核酸分析的典型的严格(或常规严格)条件包括至少大约100个包括在有1mg肝素的50％福尔马林(或甲酰胺)溶液中在42℃下培养的过夜进行杂交的核苷酸。正常严格的清洗中采用，例如，包含0.2xSSC的溶液在大约37-50℃条件下进行大约15分钟的清洗(SSC的介绍见Sambrook，supar)。正常严格清洗先于低严格清洗去除背景探针信号。低严格清洗采用，例如，包含2xSSC的溶液在大约40℃条件下进行大约15分钟的清洗。更严格清洗中采用包含0.15M Nacl的溶液在大约72℃下清洗大约15分钟。对一个例如超过100个核苷酸的葡聚糖进行低于上述的正常严格清洗的中等(正常)严格清洗的实例是，采用包含1xSSC的溶液在大约45℃条件下进行大约15分钟的清洗。对一个例如超过100个核苷酸的葡聚糖进行低严格清洗的实例是，采用包含4-6xSSC的溶液在40℃条件下进行15分钟的清洗。对短探针(例如大约10到50个核苷酸)，严格条件通常包括低于大约1.0M钠离子浓度的盐，通常是PH值在7.0到8.3的大约0.01-1.0M钠离子浓度的盐(或其它盐)，而且温度通常是至少大约30℃。严格条件同样可以包括例如甲酰胺等去稳定剂的加入。
高严格条件是所用的条件，例如，(1)用于清洗的低离子浓度和高温，例如50℃条件下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，例如42℃，PH值6.5的含有50％(v/v)甲酰胺和0.1％BSA/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)/50Mm磷酸钠缓冲器的750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，或(3)42℃条件下使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M Nacl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(Ph6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt’s溶液，声波降解鲑精DNA(50μg/mL)，0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸盐溶液，清洗条件在(i)42℃在0.2xSSC，(ii)在55℃50％甲酰胺溶液中和(iii)55℃在0.1xSSC(优选结合EDTA)。
更一般地或可选择地，高严格条件被选择用于在大约5℃确定离子浓度和pH值或低于热融点(Tm)温度条件下的特殊序列的杂交。这个Tm是50％的检测序列杂交到完全匹配试样的温度(具有确定离子浓度和pH值)。换句话说，这个Tm显示了在给定条件下这种核酸双螺旋50％变性的温度，而且它给出了这种核酸杂交物稳定性的直接测量方法。因此，Tm相当于代表螺旋转变成无规则螺旋的中间点的温度；它依赖于长度，核苷酸组成，和核苷酸长度伸展的离子浓度。通常情况，在“严格条件”下，探针将杂交到它的目标序列，而不是其它序列。“非常严格条件”被选择成同样的Tm用于具体的探针。
DNA-DNA双螺旋的Tm可以利用公式(1)进行估算：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是单价阳离子(通常是钠离子)的摩尔浓度，(％G+C)是鸟嘌呤核苷(G)和胞嘧啶(C)的百分比，(％f)是甲醛的百分比，而n是杂交体核苷酸碱基(也就是长度)的数目。见Rapley and Walker.MOLECULAR BIOMETHODS HANDBOOK supra。一个RNA-DNA双螺旋的Tm可以利用公式(2)进行估算：Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是单价阳离子(通常是钠离子)的摩尔浓度，(％G+C)是鸟嘌呤核苷(G)和胞嘧啶(C)的百分比，(％f)是甲醛的百分比，而n是杂交体核苷酸碱基(也就是长度)的数目。Id.公式1和2通常只是在杂交物双螺旋长于大约100-200个核苷酸的时候是准确的。Id.短于50个核苷酸长度核酸序列的Tm可以利用以下公式进行计算：Tm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相应核苷酸中的数目。
大多数情况，未杂交核酸物质期望通过一系列清洗被清除，其中的严格程度可以在进行杂交分析时依据期望结果来进行调整。低严格清洗条件(例如用高浓度的盐溶液和低的温度)可以增加敏感度，但是产生非特异性的杂交信号和高背景信号。更严格条件(例如使用低浓度盐溶液和接近于杂交温度的高温)降低背景信号，通常只剩下特异性信号。其它的杂交技术的介绍提供在，例如，Rapley and Walker，MOLECULAR BIOMETHODSHANDBOOK，supra(特别关于这种杂交实验的介绍在part I，chapter 2，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays”)，Elsevier，New York，也在Ausubel，supra，Sambrook et al.，supra，Wastonet al.，supra，Hames and Higgins(1995)GENE PROBES 1，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford，England，and Hames and Higgins(1995)GENE PROBES2，IRL Press at Oxford University Press，Oxfird，England。
更好的是，完全与编码重组登革抗原的序列互补的寡核苷酸序列或者其它公开的序列与编码重组登革抗原的序列在至少大约2倍(2x)(例如大约2.5倍)，优选至少大约5倍，再优选至少大约7倍，更优选至少大约10倍的条件下进行的杂交，与编码大约相同长度WT登革病毒多肽或编码同源WT登革病毒多肽的多核苷酸序列具有至少大约90％同源性的完全互补的寡核苷酸序列相比，具有更高的信噪比。例如，如果这个重组序列是编码PRM15/tE的多核苷酸序列，控制核酸可以是编码DEN-1 PRM15/tE，DEN-2PRM15/tE，DEN-3 PRM15/tE或DEN-4 PRM15/tE多肽的编码野生型PRM15/tE的多核苷酸，或者这种核酸包含有与选自任意以下核苷酸序列具有至少大约90％同源性的多核苷酸序列：SEQ ID NO 231(包含GenBank Acc.No.AB074761的核酸残基894-2285的DEN-1 PRM15/E trunc WT cDNA序列)；SEQ ID NO232(包含GenBank Acc.No.NC_001474的核酸残基892-2274的DEN-2PRM15/E trunc WT cDNA序列)；SEQ ID NO 233(包含GenBank Acc.No.M25277的核酸残基893-2263的DEN-3 PRM15/E trunc WT cDNA序列)；和SEQ ID NO 234(包含GenBank Acc.No.M14931的核酸残基894-2285的DEN-4 PRM15/E trunc WT cDNA序列)。这种条件可以认为是对特异性杂交的指示。
上述杂交条件可以被调整或改变，在杂交核酸序列的选择上达到任意期望的严格程度。例如，上述高严格杂交和清洗条件可以逐渐增强(例如，在杂交或清洗中通过增加温度，减少盐溶液的浓度，增加清洁剂浓度和/或增加例如福尔马林的有机溶剂的浓度)直到满足选择的标准设定。例如，杂交和清洗条件可以逐渐增加直到具有完全与互补的靶序列匹配的探针，获得的信噪比至少大约2.5x，而且任选地至少大约5x(例如大约10x，约20x，约50x，约100x，或甚至约500x)与非本发明所述核酸杂交得到同样高的信噪比，这种已知的核酸选自GenBank，和/或野生型登革病毒核酸序列，包括例如，编码野生型登革病毒截短E多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，PRM15/全长E多肽或C15/全长/prM全长E多肽的野生型登革病毒核酸。在杂交分析中，本发明的重组多肽通常与大约相同长度或包含相同或相似形式的野生型多肽进行比较或分析(例如，本发明的重组C15/全长prM/全长E多肽与野生型黄病毒C15/全长prM/全长E多肽进行比较)。
另一方面，本发明提供了包含至少大约900个核苷酸(包括例如至少大约900-3000个核苷酸，至少大约1000-2000个核苷酸)，优选至少大约1200个核苷酸，更优选至少大约1300个核苷酸的序列的核酸，其编码了在受试体中对登革病毒诱导免疫应答的氨基酸序列，其中这个核酸在至少中等严格条件下选择性的与至少一个选自SEQ ID NOS 156-200和235的序列杂交，用来野生型PRM15/tE编码序列(例如SEQ ID NOS 231-234)或其一部分或片段进行比较。另一方面，例如，本发明所述核酸优选与选自SEQ ID NOS156-200和235种至少一个序列杂交，并与来自DEN-3的野生型PRM15/截短E编码序列(例如GenBank Accession.No.M25277记录的核苷酸序列的核苷酸893-2263)进行比较。更好的是，这个核酸选择性的与至少一个选自SEQID NOS 156-200和235的序列杂交，并与任意已知的野生型和/或修饰的(例如减毒株)病毒包括GenBank所述黄病毒(和登革病毒)的WT PRM15/tE编码序列和/或PRM15/tE编码序列进行比较。对编码例如WT PRM15/tE蛋白，WT PRM/全长E蛋白，WT C15/全长prM/全长E蛋白的野生型黄病毒核苷酸序列或WT黄病毒基因组的这些片段的测定是本技术领域的一种常用技术。
另一方面，本发明提供了包含至少大约900个核苷酸，通常是至少大约1000个核苷酸，典型的是至少大约1100或1200个核苷酸，更优选至少大约1300个核苷酸的序列的核酸，其编码了在受试体中对登革病毒诱导免疫应答的氨基酸序列，其中这个核酸在至少中等严格条件下选择性的与至少一个选自SEQ ID NOS 211-218的序列杂交，用来与任意选自SEQ ID NOS 231-234或其它已知的PRM15/tE编码登革病毒的多核苷酸进行比较。理想的是，在高严格条件下，优选正常严格条件下，更优选在中等严格条件下，本发明的这种核酸杂交到选自SEQ ID NOS 231-234中至少一个序列的选择性要好于它杂交到任意选自SEQ ID NOS 231-234或其它已知的PRM15/tE编码登革病毒的多核苷酸。
本发明同样提供了包含不与任一本发明所述的特有核酸序列(例如选自SEQ ID NOS 156-218，235，253-271，285-330，342和344的序列)杂交的序列的核酸，但是由于核酸密码子的简并性和/或非编码序列的错位(例如，从DNA序列中剪接出的核苷酸序列形成RNA，这个RNA编码了包含与本发明所述任意重组多肽序列基本同源的序列(例如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的氨基酸序列的多肽)，将会发生杂交，从而不能影响其它杂交核酸(靶序列或检测核酸)表达多肽，该多肽的结构，功能或其它类似于至少一种本发明所述重组的多肽。这种无杂交但是相关靶序列具有至少大约60，至少大约300，优选至少大约900，再优选至少大约1200，更优选至少大约1300个核苷酸的长度。
另一方面，本发明提供了编码多肽的核酸，这种多肽包含与选自SEQ IDNOS 1-49和153-155至少一个序列基本同源(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大约400个氨基酸残基的具有免疫原性的氨基酸序列。另一个方面，本发明包括了编码多肽的核酸，这种多肽包含与选自SEQ IDNOS 65-116至少一个序列基本上同源(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大约450个氨基酸残基的具有免疫原性的氨基酸序列。更特别的是，这种核酸编码的多肽，其包含了与任意选自SEQ ID NOS 66，67，69，89，93和108-110中至少一个序列基本上同源(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大约400个氨基酸残基的具有免疫原性的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供编码多肽的核酸，这种多肽包含与选自SEQ IDNOS 139-148，236-253，343和345至少一个序列基本上同源(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大约650个氨基酸残基的具有免疫原性的氨基酸序列。更加特别的情况是，这种核酸编码了多肽，其中包含与任意选自SEQ ID NOS 140-141中的序列大体同源(例如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的至少大约650个氨基酸残基的具有免疫原性的氨基酸序列。优选的是，这种核酸编码了包含SEQ ID NOS 141或140序列的多肽。
理想情况的，本发明所述核酸可以编码在受试体内对至少一种血清型中的至少一种登革病毒诱导免疫应答的多肽。优选的，这种核酸包含这样的序列，其编码了至少一个包含了在受试体中对选自四种病毒血清型中每一3至少一种登革病毒诱导免疫应答的具有免疫原性的氨基酸序列的多肽。理想情况，由这种核酸序列编码的氨基酸对受试体中至少一种血清型中至少一种登革病毒所诱导的免疫应答要至少相当于或强于由相应野生型特有血清型的登革病毒多肽所诱导的免疫应答。理想情况，这种核酸编码了这样多肽，该多肽在对受试体中一种登革病毒优选是多种(最佳是四种)病毒血清型中的一种或多种登革病毒表现出体液和细胞免疫应答(例如，重组C15/全长prM/全长E多肽，如包含有SEQ ID NO 141中序列的多肽)，其中由这种编码的多肽促进/诱导的体液免疫应答，细胞免疫应答，或优选两种免疫应答要分别的大约相当于或强于由相应野生型登革病毒多肽(例如，一组或更多组血清的野生型登革病毒C15/全长prM/全长E多肽)诱导/促进的相应的体液免疫应答，细胞免疫应答，和/或两种免疫应答。
另一方面，这种重组多肽包含了多核苷酸序列，该序列编码了至少一个在受试体内对至少一种血清性中的至少一种登革病毒诱导产生出一种或更多中和抗体的多肽。特殊情况下，这种重组核酸编码了一种对受试体内至少两种至少三种或优选至少四种中每一种至少一种登革病毒诱导产生出中和抗体的多肽。更好的是，相比至少一种血清型的至少一种登革病毒相同或相近大小的编码野生型登革病毒抗原的野生型核酸和相同形式的野生型核酸，编码至少一种血清中至少一种登革病毒的核酸，诱导的中和抗体滴度要至少相当于或大于上述野生型核酸的诱导的滴度。例如其中一个例子，编码PRM15/tE多肽的核酸(例如SEQ ID NOS 156-200和235)对至少一种血清型中至少一种登革病毒所诱导的中和抗体的滴度，要至少相当于或大于编码野生型PRM15/tE多肽的核酸(例如SEQ ID NOS 149-152)对至少一种血清型中至少一种登革病毒所诱导的中和抗体的滴度。
更好的是，本发明所述的重组核酸包含了多核苷酸序列，这个序列编码了对受试体内四种血清型中每一种至少一种登革病毒诱导产生一种或更多中和抗体的免疫原性多肽(例如，编码了重组tE，全长E，PRM15/tE，C15全长prM/全长E或prM/全长E多肽的核酸)。由这种编码的免疫原性多肽诱导的中和抗体反应通常在哺乳动物被登革病毒感染时和/或在哺乳动物在受到这种重组核酸之前所感染的病毒血清型不同的血清型的登革病毒第二次感染时不会诱导ADE。
另一方面，本发明所述的重组核酸包含了多核苷酸序列，该序列编码了对受试体内至少一种血清型中的至少一种登革病毒诱导保性护免疫应答的多肽。另一方面，这种核酸包含多核苷酸序列，该序列编码多肽，当这个多肽在受试体中被表达时，这个多肽对选自至少两种，优选至少三种，更优选所有四种病毒血清型中每一种至少一种登革病毒诱导保护性免疫应答。
本发明进一步提供了包含有本发明所述核酸的片段，这个片段编码了对受试体内至少一种登革病毒诱导免疫应答的多肽，这个片段相比相似大小和/或形式的WT登革病毒抗原是特有的。优选的，这种核酸片段编码了在受受体内对所有四种血清型中至少一种登革病毒诱导免疫应答的多肽，而更优选的是，编码在受试体内对所有四种血清型中至少一种登革病毒诱导产生中和抗体和/或保护性免疫应答的多肽。
本发明所述的核酸可以包含除了上述编码重组登革抗原的序列之外的任意合适数目的其它序列，和/或选择性的可以包含任意合适数目的编码重组登革抗原的序列。例如，核酸可以包含两个或更多拷贝的编码登革抗原的序列和/或编码多种不同登革抗原的核苷酸序列。例如，可以包含以下的一个或更多的核酸序列：(1)编码重组C15/全长prM/全长E多肽的核苷酸序列；(2)编码重组全长prM/全长E多肽的核苷酸序列；(3)编码重组PRM15/tE多肽的核苷酸序列；(4)编码WT或重组信号肽，C15或PRM15的核苷酸序列；(5)编码重组tE多肽的核苷酸序列；和(6)编码重组全长E多肽的核苷酸序列。
另一个特有方面，该核酸包含编码佐剂和或细胞因子，共刺激分子(例如，哺乳动物的B7-1或B7-2或者具有与它们大体同源或包含其变体的氨基酸序列)，或异源抗原(例如，黄热病毒抗原，疟疾疫苗等)的第二序列。这种核酸可以包含与编码重组登革抗原的序列任意合适方式结合的这种序列的任意合适数目和拷贝。这种序列可以是表达盒的一部分，但更通常和优选的情况是包含在分离表达盒中(这种序列的例子在下面有进一步的介绍)。在某些情况下，这种编码重组登革抗原的序列和第二核酸序列(例如编码细胞因子的序列)可以被连接到分离和不同的表达控制序列，它们可以在不同的时间进行表达和/或在对不同的应答下(例如对不同的诱导物的应答)。
通常，本发明所述的任何一个核酸可以通过使用文中举例的有关上述编码登革病毒prM/E融合蛋白序列技术进行修饰以增加在特殊宿主中的表达。在一个特殊宿主中最常用的密码子被称作最佳密码子，而那些不经常被使用的被称作少数或低使用密码子(例如见Zhang，S.P.et al.(1991)Gene105：61-72)。密码子的代替可以影响宿主中优先密码子的使用，这个过程称作“密码子最佳化”或“种类密码子偏性控制”。包含一个特殊原核生物或真核宿主最佳密码子的最佳编码序列可以被用来增加转译比例或产生具有期望属性的重组RNA转录物，所述属性例如与非最佳序列产生的转录物相比具有更长的半衰期。生产最佳密码序列的技术是已知的(例如见E.et al.(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)。转译终止密码子也可以被修改来影响宿主的选择。例如，酒酵母和哺乳动物的优选终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，然后昆虫和大肠杆菌优选使用UAA作为终止密码子(例如见Dalphin，M.E.et al.(1996)Nuc Acids Res 24：216-218)。密码子的相邻排列同样可以影响核酸序列的生物学属性，而且本发明还提出了提供共同用于一个特殊宿主的密码子相邻排列的核酸的修饰方法。因此，本发明所述的核酸序列可以包含最佳密码子核苷酸序列，也就是用于特殊物种的最佳密码子频率和/或最佳密码子对(也就是相邻密码子)(例如，这种多肽可以通过在人体中由基于密码子频率或密码子对所说的“少数”人类密码子的替换得到的最佳多核苷酸序列的表达来被表达，例如使用在Buckingham et al.(1994)Biochimie 76(5)：351-54和U.S.Patents 5,082,767，5,786,464和6,114,148中所述的这些技术)。可以效仿实施例1中提供的生产最佳密码子序列的技术。
除了上述的最佳密码子核酸序列之外(例如，编码重组tE的多核苷酸序列，编码全长E的多核苷酸序列，编码PRM15/tE的多核苷酸序列，编码C15/全长prM/全长E的多核苷酸序列，等等)，本发明所述核酸通常表达多肽的表达水平要高于编码野生型登革热多肽序列的相应野生型多核苷酸序列(例如，编码WT登革病毒tE的多核苷酸序列，编码WT登革病毒全长E的多核苷酸序列，编码WT登革病毒PRM15/tE的多核苷酸序列，编码WTC15/全长prM/全长E的多核苷酸序列，等等)所表达的表达水平。因此，例如，本发明提供了编码了一个或更多本发明所述PRM15/tE多肽的核酸，在大体相同长度且在受试体的宿主例如哺乳动物宿主内通过大体上同源表达盒所表达的条件下，上述核酸中至少一个这种重组多肽被表达更加有效于包含任意选自SEQ ID NOS 231-234中一个序列至少一部分的核酸的表达。
引人注意的是，通过文中所述的编码C15/全长prM/全长E多肽的多核苷酸表达的一些重组C15/全长prM/全长E多肽相比最佳密码子C15/全长prM/全长E多肽编码序列(例如任意选自SEQ ID NOS 215-218中序列)同样具有更高的分泌水平。
这种核酸典型情况是DNA，而且通常是双螺旋DNA序列。然而，本发明同样提供了单螺旋DNA，单螺旋RNA，双螺旋RNA和包含本发明所述的核酸序列的杂交DNA/RNA核酸。其中一方面，本发明包括了包含任意本发明所述的DNA核苷酸序列中的胸腺嘧啶核苷酸被尿嘧啶核苷酸所取代的RNA序列。本发明还提供了，例如，包含与选自SEQ ID NOS 156-218，235，254-271，285-330，342和344中至少一个序列大体同源(例如具有至少大约75％，80％，85％，90％，95％或更多核酸序列同一性性)的RNA核酸序列。本发明还提供了包含有DNA序列其中所有的胸腺嘧啶核苷酸都被尿嘧啶核苷酸所取代的RNA核酸，而且RNA多核苷酸序列互补与所有这样的RNA核酸
本发明进一步提供了RNA核酸，其具有与选自SEQ ID NOS 285-330中至少一个序列大体同源(例如至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的序列同一性性)的序列。更具体的情况，本发明提供了包含任意选自SEQ ID NOS 285-330的DNA序列其中的每一个胸腺嘧啶残基都被一个尿嘧啶残基所取代的RNA核酸。这种RNA核酸通常是至少大约1000个核苷酸，大约1200个核苷酸，大约2000个核苷酸的长度。本发明还提供了至少一个编码本发明中具有免疫原性的氨基酸序列的RNA核酸的片段，而且RNA多核苷酸序列与这些片段互补。本发明还包括了在至少中等严格，优选至少正常严格，更优选至少高严格杂交条件下杂交这种RNA核酸(例如包含任意选自SEQ ID NOS 285-330且其中每一个胸腺嘧啶核苷酸均被尿嘧啶核苷酸取代的DNA序列)的RNA多核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了包含有至少一个与本发明所述重组核酸序列结合和/或通常是连的表达调控序列。一个“表达调控序列”任意一种启动，增强或调控其它核酸序列表达(典型和优选转录)的核酸序列。合适的表达调控序列包括组成型启动子，诱导型启动子，阻抑型启动子和增强子。
启动子对重组多肽表达水平发挥特别重要的影响。本发明所述核酸(例如重组DNA核酸)包含任意合适的启动子。合适的启动子的例子包括巨细胞病毒(CMV)启动子，HIV长末端重复启动子，磷酸甘油酸(PGK)启动子，鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子，例如RSV长末端重复(LTR)启动子，小鼠乳瘤病毒(MMTV)启动子，HSV启动子，例如Lap2促进剂或疱疹胸腺嘧啶核甙激酶启动子(如Wagner et al.(1981)Proc Natl Acad Sci 78：144-145中所述)，SV40或爱泼斯坦巴尔病毒衍生的启动子，腺联结病毒(AVV)启动子，例如p5启动子，金属硫蛋白启动子(例如羊金属硫蛋白促进剂或鼠金属硫蛋白启动子(例如见Palmiter et al.(1983)Science 222：809-814中所述))，人类普遍存在的C启动子，E，coil启动子，例如紫胶或色氨酸启动子，噬菌体λPL启动子，和其它已知的调控原核生物或真核生物细胞基因表达的启动子(直接在细胞内或者在感染细胞的病毒内)。启动子在哺乳动物内特别是在人体内显示出强的组成型基准表达，特别优选巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV直接早期启动子(例如在U.S.Patent 5,168,062中所述)和与这种启动子具有大体序列同一性性的启动子。同样优选具有新的或增强属性的重组启动子，例如在PCT申请Int’l Publ.No.WO02/00897中所述的启动子。
这种启动子具有任何合适的作用机理。因此，这种启动子可以是，例如，“诱导”启动子，(例如，生长激素启动子，金属硫蛋白启动子，热冲击蛋白启动子，ElB启动子，低氧诱导启动子，辐射诱导启动子，或腺病毒MLP启动子和三联前导序列)，诱导-阻抑型启动子，发育阶段相关启动子(例如珠蛋白基因启动子)，特有细胞或特有组织启动子(例如，平滑肌细胞α-肌动蛋白启动子，肌浆球蛋白轻链1A启动子，或血管内皮钙粘着蛋白启动子)。合适的诱导型启动子包括蜕化素和蜕化素相似诱导型启动子(蜕化素相似诱导型启动子可以通过Stratagene(LaJolla CA)获得)。其它合适的市场上能买到的诱导型启动子类包括诱导Tet-Off或Tet-on的启动子类(Clontech，Palo Alto，CA)。这种诱导型启动子可以是任何引起一个适当信号上调和/或下调的启动子。另外的诱导型促进剂包括阿拉伯糖诱导型启动子，类固醇诱导型启动子(例如糖皮质激素诱导型启动子)，也包括pH，压力和热诱导型启动子。
这种启动子可以是而且通常是天然宿主的启动子，或感染特殊宿主的病毒衍生的启动子(例如可以优选，人类β肌动蛋白启动子，人类EF1α启动子，或衍生于优先连接到人类AAV核酸的促启动子)，对那些不经常出现在提到的宿主中的序列的免疫学反应应当严格的回避其基因的表达。这种多核苷酸也可以或者包括一种链接到有关多样基因(编码多个融合蛋白的基因)的双向启动子体系(如U.S.Patent 5,017,478中所述)。
这种核酸也可以连接到修饰的或嵌合的启动子序列。这种启动子序列嵌合入包含至少两个核酸序列部分，这些核酸序列部分基于或由至少两种不同来源获得或衍生(例如，一个有机体基因组的两个不同区，两种不同的有机体，或合成序列的有机体的组合)。合适的启动子还包括重组，突变或递归重组(例如改组)启动子。最小的启动子单元，本质上包含一个特定TATA结合序列，可以例如单独使用或与另外的启动子单元结合使用。缺少TATA启动子在某些情况下也是合适使用的。这种启动子和/或其它表达调控序列可以包括已去除，修饰或灭活一个或多个调控单元。优选的启动子包括介绍在Int’l Patent申请WO02/00897中的启动子，其中的一个或多个可以连接到和/或与本发明所述核酸和载体共同进行使用。其它改组的和/或重组启动子也可以合并入以及与本发明所述核酸和载体共同使用，例如，方便多肽表达。
其它合适的启动子和有关这些合适启动子选择，使用和构造原理的介绍如下，例如，Werner(1999)Mamm Genome 10(2)：168-75，Walther et al.(1996)JMol Med 74(7)：379-92，Novina(1996)Trends Genet 12(9)：351-55，Hart(1996)Semin Oncol 23(1)：154-58，Gralla(1996)Curr Opin Genet Dev 6(5)：526-30，Fasseler et al.(1996)Methods Enzymol 273：3-29，Ayoubi et al(1996)，10(4)FASEB J 10(4)：453-60，Goldsteine et al.(1995)Biotechnol Annu Rev 1：105-28，Azizkhan et al(1993)Crit Rev Eukaryot Gene Expr 3(4)：229-54，Dynan(1989)Cell 58(1)：1-4，Levine(1989)Cell 59(3)：405-8，and Berk et al(1986)Annu RevGenet 20：45-79，as well as US Patent 6,194,191。其它合适的启动子可以通过使用Eukaryotic Promoter Database(release 68)(现在可以通过到访http：//www.epd.isb-sib.ch/)和其它相似的数据库例如Transcription RegulatoryRegions Database(TRRD)(version4.1)(可以通过到访http：//www.bionet.nsc.ru/trrd/)和transcription factor database(TRANSFAC)(可以通过到访http：//transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html)进行确定。
作为启动子的选择，特别是在RNA载体和构建物中，这种核酸序列和/或载体可以包含一个或更多内部核糖体进入位点(IRESs)，编码IRES的序列，或RNA序列增强子(Kozak契合序列类似物)，例如烟草花叶病病毒omega基本序列。
本发明还提供了多核苷酸(或载体)，其中也包含或选择性的包含一个上游激活序列(UAS)，例如Ga14激活序列(例如在U.S.Patent 6,133,028中所述)或其它合适的上游调控序列(例如在U.S.6,204,060中所述)。
除具有免疫原性的多核苷酸序列之外，本发明所述的多核苷酸或载体包括所有其它的表达调控序列(例如，增强子，转译终止序列，起始序列，剪接调控制序列，等)。这种多核苷酸可以包括在哺乳动物细胞内有功能的Kozak契合序列，这个序列是自然存在或修饰的序列例如US6,107,477中介绍的修修2饰Kozak契合序列。这种核酸可以包括帮助在表达载体中的一个编码序列和/或片段有效转译的特异起始信号。这些信号包括，如ATG密码子和邻位序列。在一个编码序列中，它的起始密码子和上游序列被插入适当的表达载体中，不需要其它的转译调控信号。但是，当在编码序列中(例如编码成熟蛋白编码序列)或其中的一部分被插入时，必须提供包括ATG起始密码子的外源核酸转录调控信号。此外，这种起始密码子必须是在正确的阅读框中来确保整个插入的转录。外源转录单元和起始密码子可以有不同的来源，天然的或合成的都可以。表达效果的增强可以通过细胞系统合适的增强子内涵物的使用来达到(例如见ScharfD.et al.(1994)Results Probl Cell Differ20：125-62；and Bittnet et al.(1987)Methods in Enzymol 153：516-544中所述)。合适的增强因子包括，例如，鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)增强子和U.S.Patent6,225,082中所述的RTE增强子。包括ATG起始密码子和邻位序列的起始密码子期望的被连接到多核苷酸之中。在一个多核苷酸序列中，它的起始密码子和上游序列被插入适当的表达载体中，不需要其它的转译调控信号。但是，当在编码序列中(例如编码成熟蛋白的序列)或其中的一部分被插入时，必须提供包括ATG起始密码子的外源核酸转录调控信号。这种起始密码子必须是在正确的阅读框中来确保整个插入的转录。外源转录单元和起始密码子可以有不同的来源，天然的或合成的都可以。表达效果的增强可以通过细胞系统合适的增强子内涵物的使用来达到(例如见ScharfD.et al.(1994)ResultsProbl Cell Differ 20：125-62；and Bittnet et al.(1987)Methods in Enzymol153：516-544中所述)。
本发明所述的核酸(例如DNA)也可以包含为转译起始的核糖体连接位点和转录终止区。合适的转录终止区是，例如，由DNA核酸所生产的RNA转录物的切断和聚腺苷酸化序列。任何合适的聚腺苷酸化序列都可以被使用，包括合成的优化序列，也包括BGH(牛生长激素)的聚腺苷酸化序列，人类生长激素基因，多瘤病毒，TK(胸腺嘧啶激酶)，EBV(爱泼斯坦巴尔病毒)，兔β球蛋白和乳突淋瘤病毒，包括人类乳突淋瘤病毒和BPV(牛乳突淋瘤病毒)。优选多腺苷酸转换(polyA)序列中包括SV40(人类肉瘤病毒-40)聚腺苷酸化序列和BGH polyA序列。这种polyA序列介绍在，例如，Goodwin et al.(1998)Nucleic Acids Res 26(12)：2891-8，Schek et al.(1992)Mol Cell Biol12(12)：5386-93，and van den Hoff et al.(1993)Nucleic Acids Res21(21)：4987-8。另外有关合适聚腺苷酸化序列的选择原理介绍在，例如，Levittet al.(1989)Genes Dev 19893(7)：1019-1025，Jacob et al.(1990)Crit RevEukaryot Gene Expr 1(1)：49-59，Chen et al.(1995)Nucleic AcidsRes23(14)：2614-2620，Moreira et al.(1995)EMBO J 14(15)：3809-3819，Carsellet al.(1989)Mol Cell Biol 19899(10)：4248-4258。
这种多核苷酸可以进一步包含位点特异性重组的位点，其可以被用来调控这种多核苷酸的转录，在例如U.S.Patents 4,959,317，5,801,030和6,063,627，European Patent Application 0 987 326和International Patent Application WO97/09439中有介绍。
本发明进一步提供了一种核酸，这种核酸进一步包含一个或更多具有免疫刺激的寡核苷酸序列，例如，符合序列模式N1CGN2)x的序列，其中N1是，5′到3′，任意两种嘌呤，任意的嘌呤和任意的鸟嘌呤，或者任意三种核苷酸；其中N2是，5′到3′，任意两种嘌呤，任意的鸟嘌呤和任意的嘌呤，或者任意三种核苷酸；而x是大于0或1的任意数字。免疫调笼序列在本技术领域是已知的，介绍在，例如，Wagner et al.(2000)Springer Semin Immunopathol22(1-2)：147-52，Van Uden et al.(2000)Springer Semin Immunopathol 22(1-2)：1-9，and Pisetsky(1999)Immunol Res 19(1)：35-46，as well as U.S.Patents6,207,646，6,194,388，6,008,200，6,239,116和6,218,371。这种具有免疫刺激的聚核苷酸序列可以是非甲基化的。另一方面，本发明提供了一种核酸，其包含编码本发明所述一种或更多重组多肽的多核苷酸序列，而且进一步的包含至少一个编码文中所述的至少一个具有免疫刺激序列的多核苷酸序列。选择性的，这种具有免疫刺激的寡核苷酸序列通过一个第二个多核苷酸序列表达，而这个第二个多核苷酸序列是从编码本发明所述重组多肽的第一个多核苷酸序列中分离出来的(例如，在分离或第二载体)。
另一方面，本发明提供了一种核酸，其包含了编码本发明所述一种或更多重组多肽的多核苷酸序列，而且进一步的包含至少一个编码至少一种蛋白佐剂的多核苷酸序列。选择性的，这种蛋白佐剂通过第二个多核苷酸序列表达，而这第二个多核苷酸序列是从编码本发明所述重组多肽的第一个多核苷酸序列中分离出来的(例如，在分离或第二载体)。优选的是，这种佐剂是一种促进由本发明所述免疫原性重组多肽诱导的免疫应答的细胞因子。优选的是，这种细胞因子是粒细胞巨噬细胞菌落刺激性因子(GM-CSF，例如人类GM-CSF)，干扰素(例如人类干扰素(IFN)α，IFN-β，IFN-γ)，或一种多肽其包含一个与至少一种这样的细胞因子序列大体同源(例如，具有至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％或94％，更优选至少大约95％(例如大约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％或更多的序列同一性)的核酸序列。编码这种因子的基因是已知的。人类GM-CSF序列介绍在，如，Wong et al.(1985)Science 228：810，Cantrell et al.(1985)Proc Natl Acad Sci 82：6250，and Kawasaki et al.(1985)Science 230：291。理想的，在具体例子中，这种核酸表达了可检测到的GM-CSF的数量或其功能类似物，可以刺激树状细胞(DCs)和/或T细胞的代谢和分化，增加了抗原的递呈，和/或增加了单核细胞的活性，增加了由具有免疫原性的核酸序列诱导的免疫应答。合适的干扰素基因，例如IFN-γ基因也已经是已知的(例如，见Taya et al.(1982)，Embo J 1：953-958，Cerretti et al.(1986)J Immunol 136(12)：4561，and Wang et al.(1992)Sci China B 35(1)：84-91)。理想的，IFN，例如IFN-γ是由增加具有免疫原性的氨基酸序列的免疫应答(例如增强由具有免疫原性氨基酸序列诱导的T细胞免疫应答)的量的核酸进行表达。可以和本发明所述多核苷酸和/或多肽共同表达或者共同服用的优选的IFN类似物和IFN相关分子介绍在，例如，International PatentApplications WO 01/25438和WO 01/36001中。大约5到10μg的编码GM-CSF的质粒和大约5到10μg的编码本发明所述多肽的质粒的共同服用被期望有效的在小鼠模型体中增强抗体反应。
另一方面，本发明所述的核酸包含T7 RNA聚合酶启动子，这种启动子可以连接到这种核酸序列上，促进由这种核酸序列得到的单链RNAs。T7和T7衍生序列是已知的且可以在实例中使用T7的表达体系(例如见Tabor andRichardson(1986)Proc Natl Acad Sci USA 82：1074，Studier and Moffat(1986)J Mol Biol 189：113，and Davanloo et al.(1964)Proc Natl Acad Sci USA 81：2035)。一个方面，例如，核酸包含有T7 RNA聚合酶和编码至少一种本发明所提供的多肽的多核苷酸序列。此外，本发明的核酸可以包含用于在微生物内增殖的复制起点。在哺乳动物细胞内使用的细菌复制起点(Ori)优选是一个不是反效果的基因表达。有用的复制起点序列的例子包括第一代噬菌体ori，RK2 oriV，pUC ori和pSC101 ori。优选的复制起端序列包括ColEI ori和p15(可以由plasmid PACYC177，New England Biolab，Inc.得到)，作为选择的在一些情况下另外的低拷贝的复制ori序列(相似于p15)也是可取的。这种核酸在这样的期望技术中作为穿梭载体，能够在真核或原核宿主内(例如，包含在真核生物和原核生物中均被识别的含有复制起点的载体)复制和/或表达(理想情况是两者都是-这样的能够表达的载体被称作“表达载体”)。
本发明的多核苷酸优选位于和/或服用于一个合适的传递载体(也就是载体)的组成之中。这种载体可以是任意合适的载体，包括染色体的，非染色体的和合成核酸载体(包含上述表达盒单元(表达调控和其它核酸关联序列)的核酸序列)。这样载体的例子包括SV40衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，baculo病毒，酵母菌质粒，质粒和噬菌体DNA结合物的衍生载体，和病毒核酸(RNA或DNA)载体。例如见附图1和2。
其中一方面，这种核酸被服用到一个裸DNA或RNA载体中，包括，例如，线性表达单元(如Sykes and Johnston(1997)Nat Biotech 17：355-59中所述)，紧凑核酸载体(如U.S.Patent 6,077,835和/或Intenational Patent ApplicationWO 00/70087中所述)，质粒载体例如pBR322，pUC19/18或pUC118/119，“微型”小尺寸核酸载体(如Schakowski et al.(2001)Mol Ther 3：793-800中所述)或作为沉淀核酸载体构建物，例如CaPO4沉淀构建物(如Intenational PatentApplication WO 00/46147，Benvenisty and Reshef(1986)Proc Natl Acad SciUSA 83：9551-55，Wigler et al.(1978)，Cell 14：725，and Coraro andPearson(1981)Somatic Cell Genetics 7：603中所述)。核苷酸载体及其的应用是本技术领域已知的(例如见U.S.Patents 5,589,466和5,973,972)。
这种载体可以是适于在细菌体系中表达的表达载体。任何用于细菌宿主中的载体都可以被使用。合适的载体包括，例如，指示易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体(例如多功能大肠杆菌克隆或表达载体例如BLUESCRIPT(Stratagene)，pIN载体(Van Heeke & Schuster，J Biol Chem264：5503-5509(1989))；pET载体(Novagen，Madison WI)；和类似的载体)。
这种表达载体也可以或选择性的可以是适于在酵母菌系中表达的载体。任何在酵母菌系中适于表达的载体都可以被使用。合适的载体例如，酵母属麦酒，包括例如，包含基本的或诱导型启动子例如α因子，乙醇氧化酶和PGH的载体(评论见：Ausubel，supra，Berger，supra，and Grant et al.Methods inEnzymol 153：516-544(1987))。
这种表达载体可以在宿主细胞内产生。这种宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞，酵母菌细胞或植物细胞，或者这种宿主细胞也可以是原核细胞，例如细菌细胞。这种构建物引入宿主细胞可以使用磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，电穿孔，基因或疫苗枪，注射或其它普通技术(例如见Davis et al.BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986)中关于体内的，来自体内的和体外的方法的描述)的影响。
本发明的这种核酸和核酸载体可以进一步包含非天然生成核苷酸和核苷酸序列。本发明重组核酸序列的修饰包括形成包含有硫代磷酸主链的重组核酸序列(例如编码黄病毒抗原的多核苷酸序列)至少一个部分或片断，在核酸序列中结合至少一种用来代替或除天然形成核苷酸之外的合成的核苷酸类似物，以及添加除了鸟嘌呤，腺嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶之外的基，或者在这样的序列中使用这种非常规形成的碱基。这种修饰与较长的半衰期联系在一起，而因此被优选用在本发明所述核酸载体中。因此，一个方面，本发明提供了包含有至少一个上述修饰或其中的任意组合的重组核酸和核酸载体，其中这种核酸在哺乳动物宿主内的持续时间长于没有这样的一种或几种修饰的大体同源的核酸。
这种表达载体也包含编码分泌/定位序列的核苷酸，其中目标多肽表达一个理想的细胞隔，膜或细胞器，或者其引导多肽分泌物到胞质隙或细胞培养基中。这样的序列在本技术领域是已知的，包括分泌前导或信号肽，细胞器靶序列(例如核定位序列，ER保留信号，线粒体转变序列，叶绿粒转变序列)，膜定位/锚定序列(例如，终止转移序列，GPI锚定序列)，以及类似的序列。
另外，本发明所述表达载体可选择的包含一个或更多可选择的标记基因来提供转化宿主细胞选择的显型特征，例如在真核细胞培养中的二氢叶酸还原酶抗性，新酶素抗性，嘌呤酶素抗性和/或杀稻瘟菌素抗性，或者例如在E.coli.中的四环素或氨苄青霉素抗性。
本发明另外提供了包含粘粒的核酸。任何合适的粘粒载体可以用来复制，转移和表达本发明中的核酸序列。通常情况，粘粒包含细菌oriV，抗生素选择标记，克隆位点，和一个或者两个噬菌体λ衍生的cos位点。这种粘粒可以是穿梭粘粒或哺乳动物粘粒，包含SV40 oriV和理想情况的合适的哺乳动物选择标记。粘粒载体在例如Hohn et al.(1998)Biotechnology 10：113-27中进一步的介绍。
本发明还提供了包含一个或更多核酸序列的重组构建物，如上面大量内容所述的，这些核酸序列包含编码重组黄病毒抗原的多核苷酸序列(例如，编码重组登革病毒抗原的多核苷酸序列)。这种构建物包含载体，例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒，细菌人造染色体(BAC)，酵母菌人造染色体(YAC)，和类似的，在向前或相反的起始点插入的本发明中的核酸序列。
本发明的一个方面，本发明所述的重组DNA序列(例如编码重组黄病毒抗原的DNA序列)的服用通过裸DNA质粒或结合有一个或更多转染增强剂的质粒来完成，文中对此有进一步介绍。这种质粒DNA载体可以具有任意合适式的组合。在某些情况下，优选的质粒DNA载体包含强的启动子/增强子区(例如人类CMV，RSV，SV40，SL3-3，MMTV或HIV LTR启动子)，有效poly(A)端序列，大肠杆菌中质粒物的复制起点，作为可选择性标记的抗生素抗性基因，和适宜的克隆位点(例如多位点接头)。用于本发明核酸服用的特殊质粒载体是载体pMaxVax10.1，其结构和特征在实施例1(附图1和2)中有介绍。选择性的，这样的质粒载体包括至少一个免疫刺激序列(ISS)和/或至少一个编码合适细胞因子的基因(例如，GM-CSF序列)，文中别处有进一步介绍。
另一方面，本发明所述序列的核酸通过病毒载体被安置和/或传送到宿主细胞或宿主动物中。任何合适的病毒载体可以在这种情况下被使用，而且其中的一些是本领域已知的。病毒载体可以包含任意数目的病毒多核苷酸，这些病毒多核苷酸可以单独使用或与一种或更多病毒蛋白结合使用，这种载体便于在期望的宿主细胞的转化，复制和/或表达本发明所述的核酸。这种病毒载体可以是多核苷酸，这种多核苷酸包含有病毒染色体组，病毒蛋白/核酸结合物，类病毒样颗粒(VLP)，类似于那些U.S.Patent 5.849,586和InternationalPatent Application WO97/04748中所述的载体的全部或部分，或者包含有本发明所述病毒核酸和核酸的完整病毒样颗粒。病毒样颗粒病毒载体(也就是重组病毒)可以包含野生型病毒样颗粒或一种修饰的病毒样颗粒，特别是下文所要介绍的例子。
这种病毒载体需要另外一种用于复制和/或表达的载体或野生型病毒(也就是辅助依赖病毒)的存在，例如腺病毒载体扩增器(amplicon)。通常情况，这种病毒载体本质上含有野生型病毒样颗粒，或修饰的病毒样颗粒，这种修饰的病毒样颗粒是在它的蛋白和/或核酸内含物中进行的，用于增加转基因容量或辅助这种核酸的转染和/或表达(这种载体的例子包括疱疹病毒/AVV扩增器)。
优选，虽然不是必要的，这种病毒载体颗粒衍生于，基于，包含或含有一病毒，该病毒通常的感染动物，优选脊椎动物，例如哺乳动物尤其是人类。这方面合适的病毒载体颗粒包括，例如，腺病毒载体颗粒(包括任何腺病毒科病毒或其衍生的病毒)，腺伴随病毒载体(adeno-associated viral vector)颗粒(AVV载体颗粒)或其它细小病毒和细小病毒的载体颗粒，乳突淋瘤病毒载体(palillomaviral vector)颗粒，黄病毒载体，甲病毒属载体(alphaviral vector)，疱疹病毒载体，痘病毒载体，逆转录酶病毒载体，包括慢病毒载体。这些病毒和病毒载体的例子在，如FIELDS VIROLOGY，supra，Fields et al.Eds.，VIROLOGY Raven Press，Ltd.，New York(3rd ed.，1996 and 4th ed.，2001)，ENCYCLOPEDIA OF VIROLOGY，R.G.Webester et al.，eds.，AcademicPress(2nd ed.，1999)，FUNDAMENTAL VIROLOGY，Fields et al.，eds.，Lippincott Raven(3rd ed.，1995)，Levine，“Viruses，”Scientific American LibraryNo.37(1992)，MEDICAL VIROLOGY，D.O.White et al.，eds.，Acad.Press(2nded.，1994)，INTRODUCTION TO MODERN VIROLOGY，Dimock，N.J.etal.，eds.，Blackwell Scientific Publications，Ltd.(1994).
可以和本发明所述的多核苷酸以及方法一起使用的病毒载体包括腺病毒和腺伴随病毒载体，例如，在Carter(1992)Curr Opinion Biotech 3：533-539(1992)and Muzcyzka(1992)Curr Top Microbiol Immunol158：97-129(1992)中所述。AVV载体另外的类型和例子介绍在如，Buschacheret al.，Blood，5(8)，2499-504，Carter，Contrib.Microbiol.4：85-86(2000)，Smith-Arica，Curr.Cardiol.Rep.3(1)：41-49(2001)，Taj，J.Biomed.Sci.7(4)：279-91(2000)，Vigna et al.，J.Gene Med.2(5)：308-16(2000)，Klimatcheva etal.，Front.Biosci.4：D481-96(1999)，Lever et al.，Biochem.Soc.Trans.27(6)：841-47(1999)，Snyder，J.Gene Med.1(3)：166-75(1999)，Gerich et al.，Knee Surg.Sports Traumatol.Arthrosc.5(2)：118-23(1998)，andDuring，Adv.Drug Deliv.Review 27(1)：83-94(1997)，and U.S.Patents 4,797,368，5,139,941，5,173,414，5,614,404，5,658,785，5,858,775，and 5,994,136，以及文中别处其它相关介绍。腺伴随病毒载体可以通过使用由例如U.S.Patent4,797,368 and Laughlin et al.，Gene 23：65-73(1983)提到的方法进行构建和/或纯化。
和本发明所述的多核苷酸以及方法一起使用的病毒载体的另一种类型是一种乳头瘤病毒载体(palillomaviral vector)。合适的乳头瘤病毒载体在本技术领域是已知的且介绍在，如Hewson(1999)Mol Med Today 5(1)：8，Stephens(1987)Biochem J 248(1)：1-11，and U.S.Patent 5,719,054中。特别优选的乳头瘤病毒载体提供在如International Patent Application WO 99/21979中。
甲病毒在其它的情况下可以是基因传递载体。甲病毒在本技术领域是已知的而且介绍在，如Carter(1992)Curr Opinion Biotech 3：533-539，Muzcyzka(1992)Curr Top Microbiol Immunol.158：97-129，Schlesinger Expert Opin BiolTher.2001 Mar；1(2)：177-91，Polo et al.Dev Biol(Basel).2000；104：181-5，Wahlfors et al.Gene Ther.2000 Mar；7(6)：472-80，Colombage et al.Virology.1998 Oct 10；250(1)：151-63，and International Patent Application WO 01/81609，WO 00/39318，WO 01/81553，WO 95/07994，and WO 92/10578。
另外一组可用的病毒载体是疱疹病毒载体。疱疹病毒载体的例子介绍在，如Lachmann et al.，Curr Opin Mol Ther 1999 Oct；1(5)：622-32，Fraefel et al.，Adv Virus Res.2000；55：425-51，Huard et al.，Neuromuscul Disord.1997 Jul；7(5)：299-313，Glorioso et al.，Annu Rev Microbiol.1995；49 675-710，Latchman，Mol Biotechnol.1994 Oct；2(2)：179-95，and Frenkel et al.，Gene Ther.1994；1Suppl 1：S40-6，as well as U.S.Patents 6,261,552 and 5,599,691。
逆转录病毒载体，包括慢病毒载体，在有些特殊情况下也可以是可用的基因传递载体。许多的逆转录病毒载体是本技术领域已知的。这些逆转录载体的例子介绍在，如Miller，Curr Top Microbiol Immunol(1992)158：1-24；Salmons and Gunzburg(1993)Human Gene Therapy 4：129-141；Miller etal.(1994)Methods in Enzymology 217：581-599，Weber et al.，Curr Opin MolTher.2001 Oct；3(5)：439-53，Hu et al.，Pharmacol Rev.2000 Dec；52(4)：493-511，Kim et al.，Adv Virus Res.2000；55：545-63，Palu et al.，Rev Med Virol.2000 May-Jun；10(3)；185-202，and Takeuchi et al.，Adv Exp Med Biol.2000；465：23-35，as well as U.S.Patents 6,326,195，5,888,502，and 5,672,510。
腺病毒载体也可以是用于基因转移的合适病毒载体。腺病毒载体是本技术领域已知的而且介绍在，如Graham et al(1995)Mol Biotechnol 33(3)：207-220，Stephenson(1998)Clin Diagn Virol 10(2-3)：187-94，Jacobs(1993)Clin Sci(Lond).85(2)：117-22，US Pat.5,922,576，5,965,358 and 6,168,941 andInt’l Patent Appns WO 98/22588，WO 98/56937，WO 99/15686，WO 99/54441，and WO 00/32754。用于本发明实验的腺病毒载体，疱疹病毒载体和Sindbis病毒载体介绍在如Jolly(1994)Cancer Gene Therapy 1：51-64，Latchman(1994)Molec Biotechnol 2：179-195，and Johanning et al.(1995)Nucl Acids Res 23：1495-1501。
其它合适的病毒载体包括痘病毒载体。这样的载体的例子介绍在如Berencsi et al.，J Infect Dis(2001)183(8)：1171-9；Rosenwirth et al.，Vaccine2001 Feb 8；19(13-14)：1661-70；Kittlesen et al.，J Immunol(2000)164(8)：4204-11；Brown et al.Gene Ther 20007(19)：1680-9；Kanesa-thasan et al.，Vaccine(2000)19(4-5)：483-91；Sten(2000)Drug 60(2)：249-71。牛痘病毒载体是优选的痘病毒载体。这种载体和其使用的例子提供在，如Venugopal et al.(1994)Res Vet Sci 57(2)：188-193，Moss(1994)Dev Biol Stand 82：55-63(1994)，Weisz et al.(1994)Mol Cell Biol 43：137-159，Mahr and Payne(1992)Immunobiology 184(2-3)：126-146，Hruby(1990)Clin Microbiol Rev 3(2)：153-170，and International Patent Applications WO 92/07944，WO 98/13500，andWO 89/08716。
本发明的另一方面是包含有至少一个本发明所述重组核酸序列(例如，重组PRM15或C15信号肽，编码重组tE多肽的核酸，编码全长E多肽的核酸，编码PRM15/tE多肽的核酸，C编码15/全长prM/全长E多肽的核酸，编码C15/全长prM/tE多肽的核酸)的黄病毒载体。这种核酸可以位于黄病毒基因组的任意合适的部位。例如，这种核酸可以被插入或用于取代这种基因组的核苷酸序列片段，通常情况是与所述核酸相同的编码了相似于或等同多肽的核苷酸序列。例如，重组编码C15/全长prM/全长E多肽的核酸可以取代黄病毒基因组的编码野生型C15/全长prM/全长E的序列的全部或部分。因此，本发明的重组多肽可以被放置在这种黄病毒包膜多肽的片段中。
在这种情况下，一种或更多本发明所述的核酸可以被结合入任意合适的黄病毒载体。这些合适的载体的例子介绍在，如Bonaldo et al.，Mem InstOswaldo Cruz.2000；95 Suppl 1：215-23，Caufour et al.Virus Res.2001 Nov5；79(1-2)：1-14，Guirakhoo et al.J Virol.2001 Aug；75(16)：7290-304，Pletnev etal.Virology.2000 Aug 15；274(1)：26-31，Guirakhoo et al.J Virol.2000 Jun；74(12)：5477-85，and International Patent Applications WO 93/06214 and WO01/53467。构建重组病毒载体和/或修饰已知的或重组病毒载体的技术公开在Sambrook(出处同上)和文中提到的其它出处中。复制缺损(RD)黄病毒(包括例如RD登革热和黄热病毒)也可以用作载体或用于传递载体。包含在内的复制缺损黄病毒(例如RD登革热或YF病毒)包含有至少一个本发明所述多肽用于代替或增加天然黄病毒(例如登革热或YF病毒)包膜蛋白或天然黄病毒(例如登革热或YF病毒)prM蛋白和包膜蛋白。同样期望具有一种复制缺损黄病毒，其包含有至少一种本发明所述核酸用于代替或增加编码了黄病毒包膜蛋白或黄病毒prM蛋白和包膜蛋白的WT黄病毒基因组的一个核酸片段。
在蚊子宿主内复制缺损以及可以与本发明所述多肽结合作为一种疫苗的登革病毒介绍在International Patent Application WO 00/14245中。一种或更多病毒和/或黄病毒组的病毒载体，包括，例如但不限于一种黄热病毒或运载本发明所述的至少一种核酸和/或至少一种多肽的黄热病毒载体(例如见Guirakhoo et al.，J.Virol.75(16)：7290-304(2001))，它们的使用被相信是有利的。
另一方面，本发明提供了包含有黄病毒组中一种病毒(例如黄热病毒，所述黄热病毒例如黄热17D病毒以及类似的病毒)的嵌合病毒，其中编码黄病毒组病毒的完全E蛋白的核酸序列或其中的片段(例如核酸序列编码的tE蛋白)被本发明所述的相应的编码重组E蛋白的核酸序列(或编码重组tE多肽的核酸)所代替。这种嵌合病毒可以是黄病毒组中的减毒病毒(例如减毒黄热病毒)。本发明还提供了黄病毒组中的嵌合病毒(例如黄热病毒)，其中黄病毒组病毒(例如黄热病毒)的编码E蛋白的基因(或编码截短E蛋白的基因)被本发明所述的编码重组E蛋白的核苷酸(或编码重组tE多肽的核苷酸)所代替。通常情况，本发明的代替重组核苷酸的核苷酸长度大体等于被替代的病毒核苷酸序列的长度。编码截短E蛋白的核酸序列通常包含相当于编码了E蛋白的基因缺少编码了E蛋白至少大约8％，10％或12％的C末端氨基酸残基的核苷酸残基的核苷酸片段。
本发明也提供了包含有黄病毒组中一种病毒的基因组(例如黄热病毒基因组或登革病毒基因组)的核酸，其中编码E蛋白的基因组的核苷酸序列被编码重组全长E蛋白或重组截短E多肽的本发明所述的重组核苷酸序列所代替。包含在内的是替代核酸(由病毒分离的)和由所有这样的核酸编码的多肽。
相似的，本发明提供了包含有黄病毒组中(例如黄热病毒，所述黄热病毒例如黄热17D病毒或登革病毒例如DEN-2，DEN-3)的嵌合病毒，其中黄病毒组病毒(例如黄热病毒)的编码PRM15/截短E多肽的核酸序列被本发明所述的编码重组PRM15/截短E多肽的核酸序列所代替。本发明还提供黄病毒组中的嵌合病毒(例如黄热病毒)，其中黄病毒组病毒(例如黄热病毒)的编码C15/全长prM/全长E多肽的核酸序列被本发明所述的编码重组C15/全长prM/全长E多肽的核酸序列所代替。在所有的这些具体的例子中，这种嵌合病毒可以是黄病毒组中的减毒病毒(例如减毒黄热病毒)。这种代替重组核苷酸的核苷酸长度大体等于被替代的病毒核苷酸序列的长度。同样包含在内的是这样的替代核酸(病毒所分离的)和由所有这样的核酸编码的多肽。
本发明包括了含有黄病毒组中病毒和一种或更多合成或重组的本发明所述的多肽或核酸的嵌合复制缺损或减毒病毒。这样的嵌和病毒可以通过一种或更多合成或重组的本发明所述的多肽或核酸的结合变为复制缺损或减毒。通过WT黄病毒基因组的替代部分和上述的合成或重组核酸生产复制缺损或减毒病毒的方法包括在内。
同样包括在内的是包含全长嵌合黄病毒基因组的基因组的嵌合病毒，这种全长嵌合黄病毒基因组包含有一种包含至少一个本发明所述的第一个核酸的核苷酸序列，上书的至少一种第一个核酸编码至少一种本发明所述重组或合成登革病毒结构蛋白，其中上述至少一种第一个核酸被连结到至少一种第二个核酸编码至少一种第二黄病毒的非结构蛋白，其中这种第二黄病毒不是登革病毒，而且其中这种嵌和黄病毒被定义为具有基因组大约11-kp正链RNA病毒，这个基因组编码用于开放阅读框的三种结构蛋白，capsid(C)，premembrane(prM)和envelope(E)，以及随后的七种非结构蛋白，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。
任何黄病毒可以通过至少一种本发明所述核酸，优选在核酸水平，使用标准分子生物学技术，来进行修饰。通常的，在这些情况中，这种特殊编码天然prM/E的核酸序列(例如编码tE，全长E，PRM15/tE或C15/全长prM/全长E多肽的天然序列)的至少一部分被去除而且由本发明所述重组核酸取代/代替，这样的重组多肽被编码而且这种黄病毒包含本发明所述重组多肽替代或增加的编码天然prM/E的序列(例如编码天然序列的tE，全长E，PRM15/tE或C15/全长prM/全长E多肽)。一个方面，这种技术由非减毒黄病毒通过例如用至少一种本发明所述重组多肽取代这种天然黄病毒基因组(例如编码tE，全长E，PRM15/tE或C15/全长prM/全长E多肽的天然序列)的至少一个核苷酸片段或部分来进行。这样的结合可以生产出减毒嵌合病毒。另一方面，这种技术由已经灭活或已经包证明是减毒病毒基因组的黄病毒进行。在一些具体的例子中，这种减毒黄病毒是减毒登革病毒，例如PDK53，这样的例子介绍在，如Bhhamarapravati et al.，Vaccine 18：44-47(2000)，Men et al.，J.Virol.70(6)：3930-37(1996)，Kanesa-thasan，Kanesa-thasan et al.，Vaccine 19：3179-88(2001)和International Patent Applications WO 00/57910，WO 00/57909，WO 00/57908和WO 00/57904。由登革热-2病毒族衍生的低致病性和/或低副作用减毒登革病毒可以在那些使用的病毒之列。一个方面，这样的重组(例如减毒)黄病毒载体或病毒的大约50或大约1×102血小板形成单位(pfu)或转化灶形成单位(ffu)到大约6×1010pfu或到大约7×1010pfu(例如大约3.5×1010pfu或到大约4.5×1010pfu)的剂量提供了有效量用来在合适的受试体内(例如动物例如包括人类的哺乳动物)对至少一种黄病毒(例如至少一种血清型中的登革病毒)诱导免疫应答。这样的剂量通过文中所述的任意途径(例如皮下注射)给药到受试体中。另一个方面，这样重组(例如减毒)黄病毒载体或病毒的大约1×102到大约5×104pfu，大约1×102pfu到大约1.5×104pfu，大约1×102到大约1×103pfu，或者大约1×103到大约1×106pfu或大约1×108pfu的剂量可以有效的对至少一种黄病毒(例如给药到受试体中的至少一种血清型中的至少一种登革病毒)诱导免疫应答。选择性的，最小致死量(MLD50)等于任意上述的可以被给药到受试体中的pfu剂量。
包括本发明所述重组分子的载体或病毒的毒性和治疗功效可以在细胞培养或实验动物中使用标准药学步骤来测定。其中一个就是使用文中所述步骤和那些本技术领域已知的其它技术测定MLD50(总量50％的最小致死量)和/或ED50(总量50％中有效治疗的剂量)。同样见S.Plotkin and W.Orenstein，VACCINES(W.B.Saunders Co.1999 3d ed.)所述用于已知的黄病毒疫苗，包括黄热病毒17D疫苗。核酸，多肽，蛋白，融合蛋白，转换细胞和本发明所述的其它形式可以被给药在可测定的量上，例如，通过这些形式的MLD50，和它们在不同浓度下的副作用，应用于病人大部分和整体的健康状态下。因此，例如，本发明提供了诱导免疫应答的方法，这个免疫应答通过给药在等于或大于药学上可接受的化合物的ED50的量，这种化合物包含有本发明所述的重组多肽或核酸的重组黄热病毒颗粒(例如17D疫苗变体)的数量。给药可以通过一次给药或分开给药(要么通过共同给药，连续给药或其中的组合)来完成。使用方法和说明的描述，如Plotkin(Vaccines)和其它参考文献一并引入本文。在相关的方面，关于评估核酸，多肽，载体和细胞有效成分增强免疫力的剂量的描述，如欧洲专利申请E.P.115633和其它参考文献一并引入本文。
在一些方面，优选的病毒载体会在宿主细胞或宿主中是减毒的或复制缺损的。AAV载体，在补充腺病毒或至少腺病毒基因产物(由比如有帮助的病毒，质粒或者有互补关系的细胞产生)缺乏时是复制缺损。所谓的“复制缺损”是指病毒载体包含缺少至少一种必要复制基因的功能的基因组。上述的基因、基因功能、或者基因或基因组区域的缺损定义为因病毒基因组的必要遗传物质的缺损而减毒或删除了核酸序列被全部或者部分删除的基因的功能。必要复制基因的功能正是那些复制缺损的病毒载体复制(也就是增殖)所需要的。而病毒载体颗粒的功能是否由于病毒载体颗粒的种类而不同则有争论。复制缺损病毒载体颗粒的例子的描述，可参见Marconi等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(21)，11319-20，Johoson和Friedmann，Methods CellBiol.，43(pt.A)，211-30(1994)，Timiryasova等，J GeneMed.，3(5)，468-77(2001)，Burton等，Stem Cells，19(5)，358-77(2001)，Kim等，Virology，282(1)，154-67(2001)，Jones等，Virology，278(1)，137-50(2000)，Gill等，J.Med.Virol.，62(2)，127-39(2000)，Chen和Engleman，J.Virol.，74(17)，8188-93(2000)，Marconi等，Gene Ther.，6(5)，904-12(1999)，Krisky等.，Gene Ther.，5(11)，1517-30(1998)，Bieniasz等Virology，235(1)，65-72(1997)，Strayer等，Biotechniques，22(3)，447-50(1997)，Wyatt等，Vaccine，14(15)，1451-8(1996)，和Penciolelli等，J.Virol.，61(2)，579-83(1987)。其它复制缺损以简单MuLV载体为基础。参见如Miller等(1990)Mol Cell Biol10：4239(1990)；Kolberg(1992)J NIH Res 4：43，和Cornetta等(1991)Hum GeneTher 2：215)。
重组的病毒载体的基本构造在本文可以很好的理解，通过使用分子生物学技术，比如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A Laboratorymanual(Cold Spring Harbor Press 1989)and third edition thereof(2001)，Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley IntersciencePublishers 1995)，和Watson等，RECOMBINANT DNA，(2d ed.)，和本文提到的其它几篇文献一并引入本文作为参考。比如腺病毒载体颗粒可以通过已知的方法构建或者纯化，比如Graham等，Mol.Biotechnol.，33(3)，207-220(1995)，U.S 5,965,358，Donthine等，Gene Ther.，7(20)，1707-14(2000)，和其它的描述文献。腺结合病毒载体可以通过已知的方法构建或者纯化，例如U.S.4,797,368和Laughin等，Gene，23，65-73(1983)。关于其它的病毒载体的类似技术也是已知的，特别是疱疹病毒载体(见例如，Lachman等，Curr.Opin.Mol.Ther.，1(5)，622-32(1999))，透镜状病毒载体，和其它反向病毒载体。一般的，病毒载体包含核酸的嵌入物(例如，野生型腺病毒载体可包含高达3KB的未删除嵌入物)，或者更典型的，包含一种或多种病毒基因组的删除物可望调节核酸和其它核酸的嵌入物并阻止在宿主细胞内的复制。
一方面，可用的病毒载体是靶向病毒载体，与类似的野生型病毒载体颗粒相比，包含一种限定或者扩展的取向。典型的靶向作用可以通过病毒颗粒的衣壳和/或包膜蛋白的修饰来完成。靶向病毒载体的实例和涉及的原理可参见，如国际专利申请WO92/06180，WO94/10323，WO9738723，和WO00/11201，Engelstadter等，Gene Ther.，8(15)，1202-6(2001)，van Beusechem等，Gene Ther.，7(22)，1940-6(2000)，Boerger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(17)，9867-72(1999)，Bartlett等，Nat.Biotechnol.，17(2)，181-6(1999)，Girod等，Nat.Med.，5(9)，第1052-56页(作为Nat.Med.，5(12)，第1428页的修正)(1999)，J GeneMed.1999 Sep-Oct；1(5)：300-11，Karavanas等，Crit Rev Oncol Hematol.1998Jun；28(1)：7-30，Wickham等，J.Virol.，71(10)，7663-9(1997)，Cripe等，CancerRes.，61(7)，2953-60(2001)，Van Deutekom等，J.GeneMed.，1(6)，393-9(1999)，McDonald等，J.Gene Med.，1(2)，第103-10页(1999)，Peng，Curr Opin Biotechnol，1999 Oct；10(50)：454-7，Staba等Cancer Gene Ther.，7(1)13-9(2000)，Kibbe等，Arch.Surg.，135(2)，191-7(2000)，Harari等，GeneTher.，6(5)，第801-7页(2000)，和Bouri等，Hum Gene Ther.，10(10)，第1633-40页(1999)，和Laquerre等，J.Virol.，72(12)，9683-97(1997)，Buchholz，Curr Opin MolTher.1999 Oct；1(5)：613-21，U.S.6,261,554，5,962,274，5,695,991，和6,251,654，和欧洲专利申请E.P.1002119和1 038 967。特别地，靶向载体和制造这些载体的技术可见国际专利申请WO99/23107。
病毒载体颗粒可以是一种嵌合的病毒载体颗粒。嵌合病毒颗粒载体的实例被描述在，Reynolds等Mol.Med.Today，5(1)，25-31(1999)，Boursnell等，Gene，13，311-317(1991)，Dobbe等，Virology，288(2)，283-94(2001)，Grene等AIDS Res.Human.Retroviruses，13(1)，41-51(1997)，Reimanm等，J.Virol.，70(10)，6922-8(1996)，Li等，J.Virol.，67(11)，第6599-66页(1993)，Dong等，J.Virol.，66(12)，7374-82，Wahlfors，Hum Gene Ther，1999 May 1；10(7)：1197-206，Reynolds等Mol.Med.Today，5(1)，25-31(1999)，Boursnell等，Gene，13，311-317(1991)，和US5,877,011，6,183,753，6,146,643和6,025,341。
本发明的非病毒载体也能与运送该载体到达宿主的特定区域的分子相交结合(比如，特定器官、组织、和/或细胞类型)。比如核酸可以与目标蛋白结合，如病毒蛋白，其与受体或与特定目标受体的结合蛋白结合(比如，通过，Wu and Wu，J.Biol.Chem.，263(29)，14621-24(1988)的技术修饰)。目标阳离子油脂组合物也是本领域所公知的(见例如，U.S，6,120,799)。其它的目标基因构建的技术可见国际专利申请WO99/41402。
在进一步的实施方案中，本发明提供包含本发明的一种或多种上述核酸、载体、多肽，抗体，融合蛋白，或其它构建物或者上述物质的一种或多种的任意组合的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，酵母细胞，或者植物细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，比如细菌细胞。构建物引入宿主细胞可以使用磷酸钙转染，DEAE-右旋核苷介导的转染，电穿孔法，基因或疫苗枪，注射或者其它常用的技术(见如，Davis，L.，Dibner，M.，和Battey，I.(1986)BASIC METHODS IN MOLECMLAR BIOLOGY)用于体内，来自体内，和体外的方法。
宿主细胞菌株可以根据其在所需方式中调恐插入序列的表达或加工表达蛋白的能力任意选择。这种蛋白的修饰包括，但不仅限于，乙酰化作用，羧化作用，糖基化作用，磷酸化作用，酯化作用和酰化作用。切开“前蛋白(pre)”或“前原蛋白(prepro)”的形式的转录后加工对于正确的插入，折叠和/或功能是很重要的。不同的宿主细胞比如大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母或者哺乳动物的细胞比如CHO，HeLa，BHK，MDCK，HEK293，WI38等对转录后活性具有特殊的细胞机械性和机制特性，可以选择确保正确的修饰和引入外部蛋白的过程。
本发明的核酸可以插入适当的宿主蛋白(在培养物或宿主生物体内)来允许宿主表达蛋白。任意适当的宿主细胞都可以通过本发明所述的核酸用于转化/转导。适当的宿主表达的实例包括：细菌细胞，比如大肠杆菌，链霉菌属(Streptomyces)，芽孢杆菌和鼠伤寒沙门(氏)菌(Salmonella typhimurium)；真菌细胞，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Pichia pastoris，和Neurospora crassa；昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)和Spodopterafrugiperda；哺乳动物细胞，例如Vero细胞，HeLa细胞，COS细胞，WI38细胞，NIH-3T3细胞(和其它纤维原细胞，例如MRC-5细胞)，MDCK细胞，KB细胞，SW-13细胞，MCF7细胞，BHK细胞，HEK-293细胞，弓形黑素瘤细胞(Bowes melanoma cell)，和植物细胞等。可以理解，不是所有的细胞或细胞系都需要有能力去生成具有完全功能的多肽或片段；比如，多肽的抗原片段可以在细菌或其它表达系统中生成。其它适当细胞的实例可参见如US5,994,106和国际专利申请WO95/34671。
本发明也涉及用本发明所述的载体转导，转化或者转染的宿主细胞。本发明的载体一般可包含本发明所述的核酸(例如，编码重组的PRM15或者C15信号肽的核酸，编码tE多肽的核酸，编码全长E多肽的核酸，编码的PRM15/tE多肽的核酸，编码C15/全长prM/全长E的核酸)。宿主细胞用本发明的载体遗传工程产生(如，转导，转化或者转染)，载体可以是，例如，克隆载体或者表达载体。载体可以是例如以质粒，病毒颗粒，噬菌体等形式。用于产生本发明的多肽和/或复制本发明的病毒载体的适合于转导和/或用本发明的病毒载体感染所述的适当细胞，包含上面所述的细胞。已经被证明可以作为适当的包裹病毒载体颗粒的细胞在下面文献中描述，例，Inoue等，JVirol.，72(9)，7024-31(1998)，Polo等，Proc Natl.Acad.Sci.，96(8)，4598-603(1999)，Farson等J.Gene Med.，1(3)，195-209(1999)，Sheridan等，Mol.Ther.，2(3)，262-75(2000)，Chen等，Gene Ther.，8(9)，697-703(2001)，和Pizzaro等，Gene Ther.，8(10)，737-745(2001)。对于复制缺损的病毒载体，例如AAV载体，补充细胞系，或经辅助病毒转化的细胞系，或者编码基本基因的质粒转化的细胞系对于病毒载体的复制是必需的。
工程宿主细胞可以在常规的营养介质中培养，该媒体可作为合适的活性助长剂，选择性转化剂，或者有兴趣基因的扩增来进行修饰。培养环境例如温度，PH，和其它对于宿主细胞的选择性表达是有益的，并且对本领域来说是已知的技术，参考文献可包括，例如，ANIMAL CELL TECHNOLOGY，Rhiel等，(Kluwer Academic Publishers 1999)，Chaubard等，Genetic Eng.News，，20(18)(2000)，Hu等，ASM News，59，65-68(1993)，Hu等，Biotechnl.Prog.，1，209-215(1985)，Martin等，Biotechnol.，(1987)，Freshney，CMLTURE OFANIMAL CELLS：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE，4thED.，(Wiley，2000)，Mather，I NTRIDUCTION TO CELL AND TISSUE CMLTURE：THEORY ANDTECHNIQUE，(Plenum Press，1998)，Freshney，CMLTURE OF IMMRTALIZEDCELL，3rdED.，(John Wiley & Sons，1996)，CELL CMLIURE：ESSENIALTECHNIQUES，Doyle等，(John Wiley&Sons 1998)，和GENERALTECHNIQLUES OF CELL CMLTURE，Harrison等，(Cambridge Univ.Press1997)。核酸也可以在植物细胞中包含，复制，和/或表达。植物细胞的培养技术的描述，可参下如下文献，例如，Payne等，(1992)PLANT CELL ANDTISSUE CMLTURE IN LIQUID SYSTEMS John Wiley&Sons，Inc，NewYork，NY；Gamborg和Phillips(1995)，PLANT CELL，TIS SUE ANDORGANCMLTURE：FUNDAMENTAL METHODS Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelbe New York)和PLANT MOLECMLARBIOLOGY(1993)R.RD Croy Bios scientific Publishers，oxford，U.K.ISBN 0 12198370 6。常规的细胞培养环境可见Atlas和Parks，THE HANDBOOK OFMICROBIOLOGICAL MEDIA(1993)CRC Press，Boca Ratn，FL。
对于重组蛋白产品的长期高产，稳定的表达可以被应用。例如，稳定表达本发明的多肽的细胞系可以用表达载体转导，该表达载体包含病毒复制起点或者内部表达元件和可选择的标记基因。随着载体的引入，细胞可以在它们转到选择性的介质之前在养分丰富的介质中生长1-2天。选择性标记的目的是给予抗性来进行选择，它的出现允许成功表达引入序列的细胞生长和复原。比如，对于细胞不同类型使用适当的组织培养技术可以使稳定的转化细胞抗性增殖。
用表达载体和/或多核苷酸在合适的环境下转化的宿主细胞任意的被培养来进行表达和在细胞培养中恢复编码蛋白。通过这样的重组细胞产生的多肽或者片段可能是分泌的，膜结合的，或者包含在细胞内的，取决于所用的序列和/或载体。包含本发明的编码了成熟多肽的多核苷酸的表达载体可以由通过原核或者真核细胞膜直接分泌成熟多肽的信号序列来达到。有关这些信号序列原理的讨论可见于本文其它地方。
非细胞转录/翻译系统也可以用来产生由本发明所述的DNA和/或RNA或者片段产生的本发明所述的重组多肽或者片段。一些所述系统是商业上可用的。常规的离体复制和翻译指南可见于Tymns(1995)，IN VITROTRANSCRIPTION AND TRANSLATION PROTOCOL：MENTHODS INMOLECMLAR BIOLOGY，Volumn 37，Garland Publishing，NY。
本发明进一步提供包含至少一种本发明所述的多肽，至少一种本发明所述的载体，至少一种本发明所述的核酸，至少一种本发明所述的细胞，至少一种本发明所述的抗体，或者它们的任意组合和一种载体，赋形剂，或者稀释剂的组合物。这些组合物可以任意包含任意量的适当数量的多肽，融合蛋白，核酸，载体，和/或本发明所述的细胞。而且提供药物组合物，包含至少一种本发明所述的多肽，载体，核酸，细胞，抗体或者他们的组合和药学可接受的载体，赋形剂，或者稀释剂。
例如，在具体实施中，本发明提供了含有赋形剂或者载体和大多数的本发明的多种重组多肽(比如，二，三，四，或者更多重组多肽)的组合物，该组合物诱导体细胞和/或T细胞对抗至少一种血清型(比如，至少一种血清型登革热的登革病毒)黄病毒，例如哺乳动物的免疫应答。同时也提供包含药学可接受的赋形剂或者载体的相应的药物组合物。
另一方面，本发明提供的组合物(包括药物组合物)，包含赋形剂或者载体(或者药学可接受的赋形剂或者载体)和较大量的更多登革抗原(比如，二，三，四，或者更多抗原)，其中至少一种抗原是本发明所述的重组多肽，该组合物诱导体细胞和/或T细胞对至少一种血清型的至少一种登革病毒，例如哺乳动物的免疫应答。更适宜的，该联合登革抗原组合物诱导受试者保护性的免疫应答对抗一种或多种至少二，三，或共四种血清型的登革病毒。
另一方面，本发明提供的组合物(包括药物组合物)，其包含：(1)赋形剂或者载体(或者药学可接受的赋形剂或者载体)；(2)多核苷酸包含受试体(比如，哺乳动物)内表达的核酸序列，产生本发明所述的重组多肽；(3)至少一种另外的核酸序列其编码WT或者重组的登革病毒抗原和/或者至少一种WT或者重组的登革病毒抗原多肽。这些重组的或者WT登革病毒抗原可以是如下的形式，例如，WT或者重组tE多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，C15/全长prM/全长E多肽，PRM15/全长E多肽，或者C15/全长prM/tE多肽。这些组合物诱导体细胞和/或T细胞反应，和更适宜的，诱导机体内一保护性免疫应答对抗一种或多种血清型登革病毒，在组合物中编码本发明所述多肽的核酸和编码至少一种另外的登革病毒抗原的核酸序列可以是同样的多核苷酸，或者两种或者更多不同的或者独立的多核苷酸，如果需要，不同种类的多核苷酸序列可以由一种或多种适当的载体分离或定位。在组合物中，与本发明所述的重组多肽联合应用或者联合表达的至少一种登革抗原可以是本发明的重组多肽，自然产生的WT登革病毒抗原，或者已知的不同的自然产生的登革抗原(如，a hybid DEN-2/DEN-3 envelope as described inBielefeldt-Ohmann等，J.Gen Virol，78(11)：2723-2733(1997))。一方面，至少一种另外的登革抗原包含至少一个自然产生的抗原决定簇(比如，T细胞抗原决定簇，其中组合物诱导免疫应答(比如，T细胞反应)，该反应与由同样或相似形式的相应WT登革病毒抗原诱导的免疫应答(比如，T细胞反应)本质上是等同的(如，WT tE多肽，全长E多肽，PRM15/tE多肽，C15/全长prM/全长E多肽，PRM15/全长E多肽，或者C15/全长prM/tE多肽)。通常的，在所述的所有分析和适当的比较中，由重组的登革病毒抗原与具有同样的或者充分相似的形式和/或大小的WT登革病毒抗原相比较(比如，重组的PRM15/tE多肽与WT PRM15/tE多肽相比较)。相似地，特别形式和/或大小的核酸编码的重组登革病毒抗原与具有相同或者充分相似的形式或者大小的WT登革病毒抗原相比较。
在一个方面，本发明的组合物包含由第一核酸序列编码的多肽的多核苷酸，该多肽诱导中和抗体反应对抗至少一种至少两种登革病毒血清型(更适宜的，对抗全部四种血清型中的一种或更多登革病毒)的至少一种登革病毒，和较大量的另外的核酸编码多肽，包含已知的病毒抗原决定簇(比如，T细胞抗原决定簇)，选自DEN-1，DEN-2，DEN-3和/或DEN-4。
另外的或者可选择的，该组合物可以包含一种或多种本发明所述的多肽，以保持至少一种已知的野生型登革抗原决定簇(如，T细胞抗原决定簇)。这些野生型的登革抗原决定簇是本领域已知的，文献包括，比如，the regionsof the DEN-2 envelope protein comprising from about amino acid residues 35-50，59-78，135-157，145-169，240-250，270-298，295-307，335-354，and/or356-376(见Rothman等，J.Virol 70(1O)：6540-6546(1996)，Leclerc等，MolImmunol 30(7)：613-625(1993)，和Roehrig等，Virology 191(1)：31-38(1994))。另外的，登革热E和prM蛋白内的抗原决定簇(如，T细胞抗原决定簇)可以通过抗原决定簇分析(如，T细胞抗原决定簇分析)识别，该识别通过本领域已知的普通的程序和计算来完成，这些例子将会进一步描述。可以通过后续序列比较来识别本发明所述的多肽，该多肽保持这类抗原决定簇并加入组合物。
可望的，本发明所述的药学组合物包含药学可接受的赋形剂或者载体和抗原或免疫原，至少一种本发明所述的重组多肽，多核苷酸，载体(或者它们的任意组合)，其足够诱导发生在受试体内的至少一种血清型的至少一种黄病毒(如，登革病毒)的免疫应答。该药学组合物可以用体内或者体外方法。另一个特别的方面，在药物组合物施用时，本发明所述的药物组合物中重组的多肽，多核苷酸，或者载体的最少量应当足够诱导机体内的保护性免疫应答。也就是说，剂量应当足够以对抗至少一种血清型的黄病毒感染。另一方面，药物组合物包含一种药学可接受的赋形剂或载体和抗原或免疫原，至少含一种本发明所述的重组多肽，多核苷酸，或者载体(或它们的任意组合)，其剂量足够诱导机体内的免疫应答。该组合物特别对抗至少两种，三种或者四种血清型的至少一种登革病毒。
组合物(或药学组合物)可以是任何无毒性成分，该成分不会干扰至少一种本发明所述的多肽，多核苷酸，或载体的免疫原性。组合物包含一种或多种赋形剂或载体，同时药学组合物包含一种或多种药学可接受的载体。广泛的可接受的载体，稀释剂和赋形剂是本领域已知的。本发明的组合物和药学组合物具有广泛的适合的成分组成。例如，使用水作为载体等，缓冲盐，比如磷酸缓冲盐(PBS)以及对于本发明所述的多肽，多核苷酸，和/或载体的注射有利的类似物。这些溶液是已消毒的和一般的不与其它物质反应的。组合物可以按常规的，熟知的消毒技术进行消毒。组合物可以包含药学可接受的辅料，该辅料是按照生理学的情况估计的需求加入的，比如，PH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂和类似物，比如，醋酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠及类似物。任何适当的载体都可以用于本发明所述的多肽，多核苷酸，和/或载体，治疗蛋白的几种载体用法也是本领域已知的。
组合物，药学组合物和/或药学可接受的载体也包含稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，洗涤剂(比如非离子洗涤剂，如吐温-80)，稳定剂，稳定剂(如糖或非蛋白氨基酸)，防腐剂，组织固定剂，增溶剂，和/或药学组合物中的其它适合的辅料。在这方面，药学组合物的适合物质的实例可见于Berge等，J.Pharm.Sci.，66(1)，第-19(1977)，Wang和Hanson，J.Parenteral.Sci.Tech.，42，S4-S6(1988)，U.S.专利6,165,779和6,225,289及其它。药学组合物也可以包含防腐剂，抗氧剂，或别的本领域技术人员已知的辅料。另外的药物可接受的载体也是本领域已知的。另外的合适载体的例子的描述，可见于Urquhart等，Lancet.，16，367(1980)，Lieberman等，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS(2nd ed.vol.3，1998)，Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRMG DELIVERYSYSTEMS(7th ed.2000)，Martindale，THE EXTRA PHARMACOPEIA(31stedition)，Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES(16th-20thedition)，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，Goodman和Gilman(9th ed.-1996)，WILSON AND GISVOLDS TEXTBOOK OFORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY，Dolgado和Remers等(10th ed.-1998)和U.S.5,708,025和5,994,106。药学可接受的组合物的成分可见于，如，Platt，Clin.Lab Med.，7，289-99(1987)，Aμlton，PHARMACEUTICS：THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESIGN，ChurchillLivigstone(New York)(1988)，EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGEPREPARATIONS，CSHP(1998)，和“Drug Dosage”，J.Kans.Med.Soc.，70(1)，30-32(1969)。另外的药学可接受载体，尤其是适合的载体用法可见于，如，国际专利申请WO98/32859。
本发明的组合物或药学组合物可以包含或是脂质体形式。合适的脂质体成分包括但不限于，甘油酸酯，甘油二酸酯，硫脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂素，胆酸以及相似物。这些脂质体成分的制备可见于美国专利4,837,028和4,737,323。
组合物或药学组合物的组成可以是规定的，至少是部分规定的，由多肽，多核苷酸，细胞，和/或感兴趣的载体。因为具有几种可能的服用途径，药学组合物和/或组成是可变化的。例如，采用粘膜吸收和经皮吸收用法时，组合物中渗透剂应该适当，可以渗透过屏障。这类渗透剂是本领域的常规已知的，包括，例如用于粘膜吸收用法，洗涤剂，胆酸盐，和梭链孢酸衍生物。相反的，粘膜吸收用法也可采用鼻喷雾或栓剂。
本发明的多肽和/或多核苷酸组合物，包括药学组合物的普通用法可以是注射。注射可接受的组分包括一种或更多适宜的液体载体，例如水，石油，生理盐水，灭菌水，Cremophor ELTM(BASF，PARSIPPANY，NJ)，磷酸缓冲盐(PBS)，或油。液体药学成分可以进一步包括生理盐水溶液，葡萄糖(或其它糖类溶液)，多羟基化合物，或乙二醇，例如乙烯乙二醇，丙烯乙二醇，PEG，改善流动性的包衣材料，例如，卵磷脂，等张剂，例如甘油硬脂酸酯铝和凝胶。适宜的，注射成分应当是无热源物质，稳定和水溶液的形式。适宜的，注射水溶液包含等张剂，例如氯化钠，Ringer氏注射液，葡萄糖，乳酸Ringer氏注射液，或者等同的传输媒介(例如，氯化钠/葡萄糖注射液)。注射剂可以是关节内(在连接处)注射，静脉内注射，肌肉注射，真皮注射，次真皮注射，腹膜内注射和皮下注射，包括水和非水，无菌等张注射液，可以包括抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和溶剂，其补偿由公式计算出来的预期容纳血液的等张力(比如，PBS和/或盐水，如0.1M NaCl)，和灭菌水与非水，包括悬浮剂，增溶剂，增强剂，稳定剂和防腐剂。
本发明的多肽，多核苷酸或载体的用法可以由任意适合的辅料作为传输系统来促进。适合的产生非生物降解物质的辅料包括hydroxapatite，生物玻璃，铝酸盐，或其它陶瓷类物质。在一些申请中，螯合剂如羟甲基纤维素(CMC)，甲基纤维素，或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，可以把多肽，多核苷酸，或载体连接起来进行局部传输。
在另一方面，本发明所述的多核苷酸或载体由泊洛沙姆，聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，或其它表面活性剂或类皂类亲脂物质在体内，体外或离体系统中能够传输到受试体内大量细胞或组织或皮肤。可见于US6,149,922，6,086,899和5,990,241，一并引入本文作为参考。
本发明的载体和多核苷酸可以与一种或多种转染促进剂联合使用。在一些实例中，本发明的核酸和/或核酸载体可任意的与稳定促进盐类，载体(如PEG)，和/或靶向转染物质(如，磷酸盐，右旋糖酐载体，氧化铁载体，或biolistic传输(“基因枪”)载体，例如金珠或粉末载体)(见US4,945,050)。其它的转染促进剂包括可与核酸/核酸载体交联的滤过性毒菌的颗粒，磷酸钙沉淀剂，蛋白酶，脂肪酶，Bipuvicaine溶液，皂角苷，脂质(尤其是有电荷的脂质)，脂质体(尤其是阳离子脂质体，其实例可见于别处)，转染促进肽或蛋白质复合物，(如聚乙烯亚胺，聚赖氨酸，或病毒的蛋白-核酸复合物)，病毒颗粒(virosome)，或修饰细胞或类细胞结构(如融合细胞)。
本发明的核酸也可以通过体内或体外电穿孔方法，可见于US6,110,161和6,261,281和Widera等，J.of Immunol.164：4635-4640(2000)，在这里一并引入本文作为参考文献。本发明的至少一种多肽，多核苷酸，和/或载体的经皮吸收可以由包含至少一种多肽，多核苷酸，和/或载体的任何适当的组合物和任何形式的经皮吸收片段来促进。本发明提供经皮吸收片段发明物。例如至少一种多肽，多核苷酸，和/或载体可以包括在药物储藏片段中的液体储藏物，或者，可选择的，在简单的整体经皮吸收片段物中，多肽和/或多核苷酸可以通过适宜的分散材料分散穿透。任意的，该片段包括免疫抗原或抗原量的多肽。这些片段也是本领域已知的。该片段至少可以被动或通过离子电渗传输多肽，多核苷酸，和/或载体到达受试体的皮肤或组织。增强机体对于至少一种血清型的登革病毒的免疫性包括使用透皮吸收片段到受试体皮肤一段时间，并处于足够增强受试体对于登革病毒免疫性的条件下。
该组合物，特别是药物组合物，可望包含至少一种多肽，多核苷酸，和/或载体的剂量，施用时应当足够诱导机体尤其是人体的免疫应答。该组合物可以包含任何合适剂量的多肽，多核苷酸，和/或载体。适当的剂量可以由任何的适宜的技术来确定。在简单的剂量试验中，低剂量的组合物被施用于试验机体或系统(如，动物模型，非细胞系统，或者整个细胞分析系统)。对于免疫多肽，多核苷酸，和/或载体组合物(相应于通过病毒载体基因传输)的剂量的探讨业是本领域已知的。简言之，剂量通常是由多肽，多核苷酸，和/或载体的效力，病人的条件，和体重和/或治疗病人的目标决定的。剂量的大小也是由病人所在的环境，自然条件，与这类特别的多肽，多核苷酸，载体，组成，组合物，转导细胞，细胞类型或类似物质的副作用决定的。所涉及的治疗剂和预防剂的剂量确定原则，可见于，如，Platt，Clin.LabMed.，7，289-99(1987)，，″Drμg Dosage″，J.Kans.Med.Soc.，70(1)，30-32(1969)，和其它上面所述的参考文献(如前面提到的，Remington′s，).
通常，核酸组合物包含至少约1μg到大约10mg的核酸，包括约1μg到大约15mg，包括约1μg到大约10mg，大约500μg到大约10mg，大约500μg到大约5mg，大约1mg到大约5mg，大约2mg到大约5mg，大约1μg到大约2mg，包括大约1μg到大约1mg，大约1μg到大约500μg，1μg到大约100μg，1μg到大约50μg，和1μg到大约10μg的核酸。包含核酸的载体，也可以相同剂量使用。一方面，给予施药对象的组合物包含大约1，2，5，或10mg的核酸或载体。本发明所述的两种或更多核酸的混合物(或两种或更多编码核酸的载体的混合物)也可以相同剂量使用。核酸中载体和稀释剂的量取决于施用的核酸的量。例如，2mg核酸与1mL的载体或稀释剂一起使用。组合物中核酸的量取决于其使用的个体，核酸的性质(如由编码肽，优化密码子，和/或启动子决定的基因表达水平)，和使用形式。例如，由大约1μg的核酸分散进或分散到适宜的颗粒上的biolisic或“基因枪”传输方法，就可以介入甚至大型动物机体，如人体的免疫应答中。在一些例子中，5μg，甚至最少1μg或更多的核酸的biolistic传输方法是合适的。核酸的biolistic传输方法将进一步讨论。
当核酸组合物采用注射方法时，需要大剂量。一般的，注射用的核酸组合物至少是大约1μg，优选约5μg核酸，更优选至少大约25μg核酸或至少大约30μg，50μg，通常至少大约75μg或至少大约80μg核酸，更适宜的是至少大约100μg或者至少大约150μg核酸，更适宜的是至少大约500μg，至少大约1mg，至少大约2mg，至少大约5mg，或者更多。在一些实施方案中，注射用核酸组合物包含大约0.25-5mg核酸，有代表性的稀释剂，载体或者赋形剂的量是大约0.5-1mL。一般的，核酸注射液包含大约0.5mg，大约1mg，大约1.5mg，甚至大约2mg核酸，通常体积为大约0.25mL，大约0.5mL，0.75mL，或大约1mL。一方面，2mg核酸应该与1mL的载体，稀释剂或赋形剂(如，PBS或盐)一起使用。但是，在一些实施方案中，低剂量核酸的注射液(如少于约5μg，比如约4μg，约3μg，约2μg，或约1μg)与上述的高剂量相比，对于抗体反应具有等同或者更强的效力。
本发明所述的病毒载体可以包含任何适宜数量的病毒载体颗粒。病毒载体颗粒或病毒载体颗粒编码的核酸的剂量取决于与其产生相关的病毒载体类型(如该载体是否是甲病毒载体，乳头瘤病毒载体，HSV病毒载体，和/或AAV病毒)，该病毒载体是否是基因转移载体或重组肽显示载体，施用个体，或别的上面讨论过的因素。一般的，关于基因转移载体，药学可接受的组合物包括在大约1mL体积中包含大约1×102的病毒载体颗粒(如，1mL中至少1×102到大约1×108的颗粒)。更高的剂量也是适宜的(如，至少约1×106，约1×108，约1×109，约1×1010，或更多颗粒/mL)。
本发明的核酸组合物可以包含另外的核酸。如，核酸可以与第二免疫刺激序列或第二细胞因子/编码佐剂的序列(如，编码IFN-γ和/GM-CSF的序列)合用。这些序列的例子已在前文描述。本发明进一步提供一种包含较大量如重组C15/全长prM/全长E多肽或全长prM/全长E多肽形式的VLPs(至少一种类型)。合乎需要的，组合物包含的VLPs的剂量足够诱导机体内，如哺乳动物宿主的保护性免疫应答。VLPs的剂量的选择与前文提到的病毒载体颗粒及本发明所述的其它组合物相类似。
本发明也提供一种包含两种或更多种本发明所述的多肽的集合体。此外，本发明提供包含大量的一种或更多交联(multimeric)多肽。特别的，本发明的重组登革抗原在一定条件下可以形成二聚物(在一些实施方案中是三聚物)，可以在机体内保持交联(multimeric)状态，如下面实施例所显示的哺乳动物个体。
本发明进一步提供一种制备和使用本发明所述的多肽，多核苷酸，载体和细胞的方法。一方面，本发明提供一种制备重组多肽的方法，通过引导核苷酸进入大量处于培养介质中的细胞，在介质中培养细胞(保持一段时间和处于适宜基因表达的环境)来产生多肽，从细胞，培养介质或两者中，分离多肽。多肽可以通过离心过滤器(Amicon)的先浓缩与细胞溶解产物，和/或细胞培养介质分离开，可选择的，用硫酸铵或聚乙烯乙二醇冲洗，然后在PBS或其它适宜的缓冲液中再悬浮。多肽随后可以用大小排阻层析在聚丙烯酰胺葡聚糖S-400上纯化，如Hjorth，R.和J.Moreno-Lopez.1982.，J.Virol.Methods 5：151-158中所述的，或另外的亲和层析法，或通过20-60％蔗糖梯度离心过滤，见Konish，E.，S.等，1992，Virology 188：714-720(见Figs.15A-15B).包含所需多肽的部分可以通过蛋白银着色和免疫印迹法和其后的ELISA或SDS-PAGE来修饰。所需的片段可以是共有和进一步浓缩的。梯度离心过滤片段中的蔗糖可以用PD-10(Amersham Biosciences)凝胶过滤分离。其它的纯化技术包括疏水作用层析法(Diogo，M.M，等，2001.，J GeneMed.3：577-584)或其它本领域已知的适宜方法.。多种多肽的纯化方法也是本领域已知的，包括如，Sandana(1997)BIOSEPARATION OF PROTEINS，Academic Press，Inc.，Bollag等1.(1996)PROTEIN METHODS，2 EditionWiley-Liss，NY，Walker(1996)THE PROTEIN PROTOCOLS HANDBOOKHumana Press，NJ，Harris和Angal(1990)PROTEIN PURIFICATIONAPPLICATIONS：A PRACTICAL APPROACH IRL Press at Oxford，Oxford，England，Scopes(1993)PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES ANDPRACTICE 3rd Edition Springer Verlag，NY，Janson和Ryden(1998)PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES，HIGH RESOLUTION METHODSAND APPLICATIONS，Second Edition Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press，NJ。适宜多肽产生的细胞也是本领域已知的，其讨论可见于别处(如，维洛细胞，293细胞，BHK，CHO，和COS细胞都是适宜的)。细胞可以通过任何适宜的技术溶解，如超声法，微流化，物理切应力，弗氏细胞压碎器溶解或使用降解剂溶解。本发明提供一种包括将载体插入细胞的多肽的制备方法，在合适的环境下培养细胞以在载体中进行核酸表达，和在细胞，培养环境，或两者中分离多肽。细胞的选择以所需的多肽和载体为基础(如，优选大肠杆菌细胞作为细菌质粒，反之哺乳动物穿梭质粒和/或腺病毒，尤其是缺乏EI的腺病毒，优选293细胞)。
除重组产物外，多肽也可由固相法直接肽合成(见如，Stewart等.(1969)SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS，WH Freeman Co，San Francisco andMerrifield J.(1963)JAm Chem Soc 85：2149-2154)。肽合成可以由手动或自动完成。自动合成可以完成，如用using Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)的技术和制造商的技术说明。例如，序列可以单独以化学方法综合和用化学方法产生多肽或片段。可选择的，综合多肽也可来自专业生产多肽的任何公司。最常见的，本发明的多肽由如前文所述的表达编码核酸和再生多肽产生。
另一方面，本发明提供一种制备多肽的方法，包括诱导核酸，载体或其组合物引入受试体，典型和优选是引入哺乳动物(如，鼠，非人类灵长类，蝙蝠，小猿，猪或者猴子)，其中多肽可以在受试体内表达，并与动物或受试体副产物分离开来。多肽与受试体如动物或动物副产物的分离，可以使用任何适宜的技术，取决于受试体和回收策略。例如，表达多肽可以由老鼠、猴子或猪的血清中回收。本发明也提供含有本发明所述的核酸的转基因动物(优选哺乳动物，例如前面所述的哺乳动物)。该转基因动物可以将核酸整合进入宿主染色体(如由AAV载体，慢病毒载体，用于整合促进序列的biolistic技术等)或将核酸处于表面染色体中(如非整合质粒载体或非整合病毒载体的插入物)。表面染色体载体可以设计为比整合载体有更多短暂的基因表达。RNA基础的载体在这方面有特殊的优点。
本发明也提供制备至少一种与登革病毒结合的抗体的方法。本发明进一步提供制备至少一种与血清型登革病毒结合的抗体，优选与两种或三种的，更优选全部四种血清型的(每个型的)一种或多种登革病毒，其包含有效量(如抗原或免疫原性剂量的)的至少一种重组多肽或抗原或免疫性原片段。或有效量的载体或编码至少一种多肽的核酸，或包含有效量的至少一种多肽或核酸或编码多肽，施用于适宜的动物宿主或宿主细胞。宿主细胞是培养的或动物宿主是在抗原-抗体复合物形成的条件下维持。其后制备的抗体是从细胞培养，动物或动物的副产品回收的(例如，哺乳动物的血浆)。抗体的制备可以有本发明的至少一种多肽，或肽或多肽片段，包含至少大约10个氨基酸，优选至少大约15个氨基酸(如，约20个氨基酸)，更优选至少大约25个氨基酸(如，约30个氨基酸或更多)。可以选择的，培养了足够时间和处于适宜转基因表达的周期的核酸或载体可以插入适当的细胞，其中通过核酸序列的表达就可以制备抗体，该抗体可与由核酸序列编码的重组抗原结合。获得的抗体可以用于诊断和/或预防。抗体和包含抗体的组合物，药物组合物(其原理同前文所述的组合物和药物组合物)是本发明的特点。
对应答至少一种多肽，其片段，或表达该多肽的载体和/或多核苷酸所制备的抗体可以是任何适宜的形式。本发明制备的抗体包括，如多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，抗原结合片段和由抗原结合片段表达文库产生的片段。制备多克隆抗体，单克隆抗体的方法是本领域已知的，许多抗体都是有用的，见如，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，John Colligan等，eds.，Vols.I-IV(John Wiley & Sons，Inc.，NY，1991 and 2001 Supplement)，and Harlow and Lane(1989)ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Press，NY，Stites等.(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMLINOLOGY(4th ed.)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，和其它参考文献，，Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY，及Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497。其它适宜的抗体制备方法包括选自噬菌体或相似载体中的重组基因文库抗体，见如Huse等(1989)Science 246：1275-1281；和Ward等.(1989)Nature 341：544-546。特异的多克隆和单克隆抗体及抗血清经常以至少约0.1μM，优选至少约0.01μM或更好，至少约0.001μM或更好的KD结合。
制备嵌合体(人源化的)抗体的详细方法可参见美国专利U.S.5,482,856.其它的关于人源化和其它抗体制备和工程可参见Borrebaeck(ed.)(1995)ANTIBODY ENGINEERING，2nd Ed.Freeman and Co.，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)ANTIBODY ENGINEERING，APRACTICAL APPROACH IRL at Oxford Press，Oxford，England(McCafferty)，和Paμl(1995)ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS Humana Press，Towata，NJ(Paul)。
人源化抗体是应用时所尤其希望的。应用时，抗体作为治疗剂/或预防剂施用于哺乳动物体内或体外的细胞或组织，该抗体传输或移植进入哺乳动物(如人)。人源化抗体包含特有的人源免疫球蛋白序列。本发明所述的人源化抗体可以应用许多技术来制备(见，如Larrick等，U.S.Pat.No.5,001,065，和上面已经提及的Borrebaeck Mc Cafferty and Paμl)。在一个实施方案中，人源化抗体最初在三源杂交瘤(triomas)中产生。基因编码的抗体然后克隆和在别的细胞中表达，如非人类哺乳动物细胞。由三源杂交瘤制备人源化抗体的一般方法，可见Ostberg等(1983)，Hybridoma 2：361-367，Ostberg的美国专利U.S.4,634,664，和Engelman等的美国专利U.S.4,634,666。抗体制备的细菌株的获得方法之所以叫三源杂交瘤，是因为三个细胞，两个来自人类，一个来自小鼠。三源杂交瘤制备抗体要比一般的用人类细胞的方法更稳定。
其它的有用的制备抗体的技术可见，如Gavilodono等，Biotechniques，29(1)：128-32，134-6，and 138(2000)，Nelson等，Mol.PathoL，53(3)：111-7(2000)，Laurino等，Ann.Clin.Lab.-Sci.，29(3)：158-66(1999)，Rapley，Mol.Biotechnol.3(2)：139-54(1995)，Zaccolo等，Int.J.Clin.Lab.Res.23(4)：192-8(1993)，Morrison，Annu.Rev.Immunol.10：239-65(1992)，″Antibodies，Annigene，and MolecμlarMimiery″，Meth.Enzymd.178(J.J.Langone，Ed.1989)，Moore，Clin.Chem.，35(9)：1849-53(1989)，Rosalki等，Clin.Chim.Acta 183(1)：45-58(1989)，和Tami等，Am.J Hosp.Pharm.43(11)：2816-25(1986)，以及U.S.4,022,878，4,350,683，和4,022,878。具有高粘合性的抗体的制备技术可见于Border等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 97(20)：10701-05(2000)。
本发明进一步提供一种促进，诱导，增强或调恐哺乳动物对至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答的方法，包括给受试体使用免疫原性剂量的至少一种多肽，如人或非人类的灵长类动物，以使哺乳动物受试体对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答可以被促进，诱导，增强或调控。优选的，多肽包含在药学组合物中，并含有上述药学可接受的载体或赋形剂。通常，可注射的药学组合物包含适宜的、药学可接受的载体(如，PBS)，免疫原性剂量的多肽由肌内，腹膜，皮下，经皮，皮下或皮内注射入受试体内。可选择的，biolistic蛋白传输技术(疫苗枪传输)也可应用(将在别处讨论)。任何其它适宜的技术也可应用。多肽给药也可由脂质体促进(以下将进一步讨论)。
本发明也包括一种通过使用抗原或免疫原性剂量的至少一种核酸和/或至少一种核酸载体(NAV)增强受试体对登革病毒的免疫应答的方法，优选的对受试体施用在药学组合物中包含药学可接受的载体和使用抗原或免疫原性剂量的至少一种核酸和/或核酸载体。
接下来讨论核酸，可以理解也同样(确实，更)适用于本发明所述的核酸载体。该核酸组合物可以通过任何适宜的给予途径施用或传输给受试体。在本发明的一方面，核酸是胃肠外(如，皮下，肌内，或皮内)，局部，或经皮吸收的。核酸可以通过使用针或者类似装置注射直接进入组织，如，肌肉。可见于Nabel等，(1990)，如前；Wolf等，(1990)Science，247：1465-1468)，Robbins(1996)GENE THERAPY PROTOCOLS，Humana Press，NJ，和Joyner(1993)GENE TARGETING：A PRACTICAL APPROACH，IRLPress，Oxford，England，和U.S.5,580,859和5,589,466。其它方法如“biolistic'或颗粒介导的转化(见，U.S.4,945,050，U.S.5,036,006，Sanford等，J.Particμlate Sci.Tech.，5，27-37(1987)，Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，9568-72(1990)，和Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2726-30。本发明的核酸的适宜介导物可见于，如，U.S.5,591,601，5,593,972，5,679,647，5,697,901，5,698,436，5,739,118，5,770,580，5,792,751，5,804,566，5,811,406，5,817,637，5,830,876，5,830,877，5,846,949，5,849,719，5,880,103，5,922,687，5,981,505，6,087,341，6,107,095，6,110,898，和国际专利申请WO98/06863，WO 98/55495，和WO 99/57275，这些文献一并引入本文作为参考。
使用标准基因枪传送，感兴趣的载体或核酸沉淀到微金属珠的表面。用震荡波或膨胀的氦气加速这些微粒，穿透组织到几个细胞层的深度。例如。由Agacetus公司制造的AccelTM基因传送装置。Middleton WI适合用在这方面。核酸或载体可以使用如下的技术传送，例如，肌肉注射，皮内注射，皮下注射，和/或腹膜内注射。其它的关于biolistic传送的装置和技术在国际专利申请WO99/2796，WO99/08689，WO99/04009，和WO98/10750，和美国专利5,525,510，5,630,796，5,865,796，和6,010,478有描述。
所述的核酸可以和易转染剂一起传送，上述例子中已有描述。所述核酸通常可以由和/或液体颗粒传送(相对与固体biolistic传送而言)。这样的核酸传送技术，合成物，和增加的构建物的例子适合用于本发明所述的核酸的传送载体，例如，美国专利5,525,601，5,593,972，5,679,647，5,697,901，5,698,436，5,739,448，5,770,580，5,792,751，5,804,566，5,811,406，5,817,637，5,830,876，5,830,877，5,846,949，5,849,719，5,880,103，5,922,687，5,981,505，6,087,341，6,107,095，6,110,898，和国际专利申请WO98/06863，WO98/55495，和WO99/57275，引用其全部内容这里的每一个引用其全部内容的申请可以用于所有的目的。
抗原的传输技术和形式的选择能够影响用药后观测到的免疫应答的类型。比如，许多抗原的基因枪传送与Th2-偏向的反应相关(通过较高的IgG1抗体滴度和相对低的IgG2a滴度标记)。有利地，至少一些本发明所述的VLPs有望克服伴随使用登革病毒抗原的这种Th2偏向。特异性的免疫应答的偏向使医师或技术人员能引导通过使用本发明所述的多肽和/或多核酸所产生的免疫应答。
可选的，核酸可以通过基于脂质体的基因传输被呈递给宿主。与基于脂质体的基因传输相关的技术和原理可见于，如Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino和Goμld-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；Rose U.S.5,279,833；Brigham(1991)WO 91/06309；Brigham等.(1989)Am JMed Sci 298：278-281；Nabel等(1990)Science 249：1285-1288；Hazinski等.(1991)Am J Cell Molec Biol 4：206-209；及Wang和Huang(1987)Proc NatlAcad Sci USA 84：7851-7855)，Felgner等.(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA84：7413-7414，以上一并引入本文作为参考。用于运送核酸的药学可接受的脂质体组合物在别处将进一步被描述。
任何免疫原性含量的核酸量可以应用。有代表性地，核酸由注射给予，大约50μg-5mg，通常地大约100μg-大约2.5mg，典型地大约500μg-大约2mg或大约800μg-1.5mg，经常为2mg或1mg被施用。
用于这些通过基因枪给药的方法中的DNA质粒的含量，如，代表性地，比直接注射给药量少100-1000倍。例如，相应于上面第一个范围，用基因枪传输DNA质粒的给药量大约为50×10-8-5×10-5g(少100倍)或从大约50×10-9-大约5×10-6g。不管灵敏度，优选至少大约1μg的核酸被用于这种biolistic传输技术。
编码重组登革抗原的核酸序列的表达，可以与任何适宜的如前文所述的启动子和/或其它表达控制序列可操作地连接。比如，多核苷酸构建体的表达可以通过采用可诱导的开启和关闭基因表达的系统来诱导。这种开启和关闭基因表达系统的例子分别包括Test-One基因表达系统和Test-Off基因表达系统(见，如，Clontech Catalog 2000，110-111对每个系统的详细描述)。
本发明的病毒载体的呈递还能在机体中诱导产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。任何适宜的病毒载体，以任何适宜的浓度被用于诱导免疫应答。对宿主机体给予大量的逆转录病毒载体(实例可见，如，Buchscher等(1992)J.Virol.66(5)2731-2739，Johann等(1992)J Virol.66(5)：1635-1640(1992)，Sommerfelt等，(1990)Virol.176：58-59，Wilson等.(1989)R Virol.63：2374-2378，Miller等，J Virol.65：2220-2224(1991)，Wong-Staal等1PCT/US94/05700，Rosenburg和Fauci(1993)inFUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，THIRD EDITION Paμl(编辑)Raven Press，Ltd.，New York和其它参考文献)，AAV载体(如，West等(1987)Virology160：38-47，Kotin(1994)Human Gene Therapy 5：793-801，Muzyczka(1994)J.Clin.Invst.94：1351，Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.5(11)：3251-3260，US4,797,368和5,173,414，和国际专利申请WO 93/24641)，或腺病毒载体(如Berns等.(1995)Ann.NY Acad.Sci.772：95-104；Ali等.(1994)Gene Ther.1：367-384；和Haddada等.(1995)Curr.Top.Microbiol.Emmunol.199(Pt3)：297-306)，使得从而在体内产生载体内这类核酸的表达的免疫原性水平，导致所希望的免疫应答。其它适宜的病毒载体将在别处描述(包括可选择的适宜的逆转录病毒，AAV，和腺病毒载体的可替代例子)。
这些和提取类型的病毒载体颗粒的适宜注射条件被描述在，如，Bachrach等，J.Virol.，74(18)，8480-6(2000)，Mackay等，J.Virol.，19(2)，620-36(1976)，和FIELDS VIROLOGY，同上文。其它用于病毒载体制备和应用的技术可见于，如，″Practical Molecμlar Virology：Viral Vectors for GeneExpression″inMETHODS IN MOLECMLAR BIOLOGY，vol.8，Collins，M.编辑，(HumanaPress 1991)，VIRAL VECTORS：BASIC SCIENCE AND GENE THERAPY，第一次编辑(Cid-Arregui等，编辑)(Eaton Publishing 2000)，″Viral ExpressionVectors，″in CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY，Oldstone等，编辑(Springer-Verlag，NY，1992)，和″Viral Vectors″inCURRENT COMMUNICATIONS IN BIOTECHNOLOGY，Gluzman和Hμghes，编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。
本发明提供的包括重组分子的载体的毒性和治疗效果可以在细胞培养和动物实验中采用标准药学实验来测定。例如，本领域技术人员可以用本文提供的技术或本领域技术人员已知的其它技术测定LD50(半数致死量)和ED50(半数有效量)。核酸，多肽，蛋白质，融合蛋白，转导细胞和本发明的其它制剂的给药应当是遵循已决定的量，如制剂的ED50和各种浓度下的副作用，病人的健康情况和一般状况。给药可以是一次或分开几次完成。
病毒载体可以定向到特定的组织，细胞，和/或器官。这些载体的例子在前文被描述。如，病毒载体，或核酸载体可以用于选择性的把核酸序列运送到单核细胞，树突细胞，与树突细胞交联的细胞(如，与Langerhans细胞交联的角化细胞)，T细胞，和/或B细胞。该病毒载体可以是复制缺陷的病毒载体。病毒载体颗粒也可以通过修饰来减少宿主对病毒载体的免疫应答，以实现持久的基因表达。这些“秘密行动”(“stealth”)载体的描述可见于，如，Martin，Exp.Mol.Pathol.，66(1)：3-7(1999)，Croyle等，J.Virol.，75(10)：4792-801(2001)，Rollins等，Hum.GeneTher.，7(5)，619-26(1996)，Ikeda等，J.Virol.，74(10)：4765-75(2000)，Halbert等，J.ViroL，74(3)，1524-32(2000)，和国际专利申请WO 98/40509。可选择的或另外的，病毒载体颗粒也可以通过一种被选择来减少机体对于病毒载体颗粒的免疫应答的策略来施用。用于在对宿主给药时降低对病毒载体颗粒的免疫应答的策略可见于，如，Maione等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(11)，5986-91(2001)，Morral等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(22)，2816-21(1999)，Pastore等，Hum.Gene Ther.，10(11)，1773-81(1999)，Morsy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(14)，7866-71(1998)，Joos等，Hum.Gene Ther.，7(13)，1555-66(1996)，Kass-Eisler等，Gene Ther.，3(2)，154-62(1996)，US6,093,699，6,211,160，6,225,113，US2001-0066947A1.
任何适宜的病毒载体颗粒的种群和浓度(剂量)可以用于诱导宿主机体的免疫应答。在本发明的一些方面，代表性的使用至少大约1×102颗粒(如，该方法包括使用在大约1-2mL注射液和药学可接受的溶液中的适宜病毒载体颗粒，该病毒载体颗粒的量为至少大约1×102颗粒/mL到大约1×109颗粒/mL)。当传输到宿主时，病毒载体颗粒的数量使得感染复数(MOI)期望地为至少大约1-100，优选为至少大约1-100，更优选为至少大约5-30。病毒载体颗粒剂量的讨论将在别处描述。
术语“接触抗原”(“prime”)一般指将本发明的多肽(如，重组登革病毒抗原)或编码这种多肽的多核苷酸体外给予和传输给细胞培养物或细胞或细胞群体，或体内给予和传输给患者或者离体给予和传输给患者组织或细胞的。首次给予和传输(主要接触)可能不足以诱导或促进可测量反应(如，抗体反应)，但对诱导记忆应答或增强二次应答是足够的。术语“攻击”一般指诱导，促进，或调节免疫应答的过程。
优选的，首次将本发明的多肽或多核苷酸体外传输或给予给细胞或细胞培养物，或者体内或离体传输或给予患者的组织或细胞，接着进行一次或多次的二次(通常是重复的)给予多核苷酸和/或多肽。例如，在进行多肽组分的首次给药后，通常至少在首次多肽给予后约7天(更加典型地在首次多肽给予后约14-35天或大约2，4，6，12或24个月)，进行第一次重复给予(“接触抗原加强”)基本相同(如果不相同的话)剂量的多肽，代表性的与第一次给药相似的剂量(如，在1-2mL注射剂和药学可接受溶液中有约5μg到约1mg，或约5μg-0.1的多肽)。优选的，第二次重复给药(或“二次加强”)如果不相同的话，以相似的多肽组分剂量，在初次给药后的约2-9，3-6，9-18，或约12-24个月。
任何施用本发明的多肽的技术也可以包括共同施用一种或多种适宜的辅料。适宜辅料的例子包括Freund氏乳化油(完全的和不完全的)，铝盐(氢氧化铝和/或磷酸铝)，脂多糖(如，细菌LPS)，脂质体(包括干燥脂质体和包含细胞因子(如含有IFN-Y和/或GM-CSF的)的脂质体)，内毒素，磷酸钙和钙化合物微粒(见，如国际专利申请WO00/46147)，分枝菌佐剂，山梨醇单油脂，液状石蜡，乳化花生油佐剂(佐剂65)，百日咳杆菌产物/毒素，霍乱毒素，非离子阻断聚合表面活性剂，粒状棒状杆菌衍生物P40，脂肪酸，脂肪族胺，石蜡和植物油，铍，和免疫刺激复合物(免疫刺激复合物如Hglund等″ISCOMs and immunostimμlation with viral antigens″in SUBCELLMLARBIOCHEMISTRY(Harris，J.R.编辑)Plenum，纽约，1989，39-68，Morein等，″The ISCOM-an approach to subunit vaccines″in RECOMBINANT DNAVACCINES：RATIONALE AND STRATEGY(Isaacson，R.E.编辑)MarcelDekker，纽约，1992，369-386，和Morein等，Clin Immunotherapeutics 3：461-75(1995))。近来，单磷酰脂质A，氟草胺-A的免疫刺激复合物，和包含苏氨酰肌衍生物和胞壁酰二肽的兴泰克辅料组分(SAFs)也可用于人体疫苗。适合连用或连续使用一种或多种本发明的多肽的不同类型的辅料是本领域已知的。这些辅料的例子可见于如，Vogel等，A COMPENDIUM OF VACCINEADJUVANTS AND EXCIPIENTS(第二次编辑)(http：//www.niaid.nih.gov/aidsvaccine/pdf/compendium.pdf-accessed January 24，2002)，Bennet等，J.Immun Meth 153：31-40(1992)，Bessler等，Res Immunol.143(5)：519-25(1992)，Woodard，Lab Animal Sci 39(3)：222-5(19R9)，Vogel，AIDS Res andHuman Retroviruses 11(10)：1277-1278(1995)，Leenaars等，VetImmunolImmunopath 40：225-41(1995)，Linblak等，Scandinavian J LabAnimal Sci 14：1-13(1987)，Buiting等Res Immunol 143(5)：541-548(1992)，Gupta and Siber，Vaccine(14)：1263-1276(1996)，和美国专利US 6,340,464，6,328,965，6,299,884，6,083,505，6,080,725，6,060,068，5,961,970，5,814,321，5,747,024，5,690,942，5,679,356，5,650,155，5,585,099，4,395,394，和4,370,265。
施用本发明的核酸代表性地和优选地进行加强(至少一次追加给药，优选至少一次和二次加强)。一次追加典型是首次免疫接种。首次核酸施用后，进行重复施用核酸在首次给药后的至少大约7天，优选约14-35天，或2，4，6，9，或12个月。重复给药的剂量通常和首次给药的剂量大致相当(如果不相同的话)，(如，在1-2mL注射剂和药学可接受溶液中有约50μg到约15或约20mg，约1mg到约10mg，或约2-5mg)。
可选择的，核酸的首次给药后可以追加免疫原性量的多肽的给药。优选的，二次加强还优选用核酸和/或多肽进行，其剂量与第一次追加给药和/或首次给药的剂量相当，并在多肽首次给药的大约2-9，3-6，9-18或12-24个月之后。任意次的核酸和/或多肽的追加给药都是允许的。
多肽，核酸和/或载体可用于促进对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的任何免疫应答。例如，至少一种重组多肽，核酸和/或载体可以免疫原性的或抗原性的量作为预防剂被施用给未感染特定血清型登革病毒的哺乳动物(优选为人)。有利地，至少一种重组多肽，核酸，和/或载体的给药可诱导抵抗至少一种血清型的至少一种登革病毒的攻击的保护性免疫应答，也可认为是抵抗由所述至少一种血清型的至少一种登革病毒引起的登革病毒感染的“疫苗”。优选的，施用至少一种重组多肽，核酸，和/或载体诱导抵抗至少两种，三种，更优选四种血清型的至少一种一种登革病毒攻击的保护性免疫应答，，这样，也可分别被认为是抵抗至少两种，三种，更优选四种血清型登革病毒引起的病毒感染的“疫苗”。
一个有利方面，至少本发明的重组多肽，核酸，和/或载体被给予已被至少一种特定血清型登革病毒感染的哺乳动物，尤其是人，以诱导哺乳动物(人)体内抵抗一种或多种其它血清型登革病毒的保护性免疫应答(比如，中和抗体免疫应答)，更优选在施用至少一种重组多肽，核酸，和/或载体，以及在用血清型不同于先前感染哺乳动物的登革病毒血清型的一种或多种血清型登革病毒攻击时，不出现ADE。至少一种重组多肽，核酸，和/或载体也可被施用于用至少一种登革病毒血清型活跃感染的哺乳动物，，帮助抵抗登革病毒进一步感染的免疫应答的产生。更优选的，重组多肽，核酸，和/或载体以足够在受登革病毒感染威胁(或特别受DF和/或DHF的威胁)的人体中诱导产生保护性免疫应答的剂量被施用，或人正在或已经用至少一种血清型登革病毒感染，来避免二次感染时的DHF，优选不存在ADE。
本发明所述的多核苷酸和载体可以由体外传输到细胞、组织或器官。另外，本发明提供一种增强对于登革病毒的免疫应答的方法，包括把至少本发明的一种核酸和/或本发明的载体插入大量的细胞并将细胞植入哺乳动物中。体外给药策略是本领域已知的(见，如美国专利申请U.S.5,399,346和Crystal等，Cancer Chemother.Pharmaco1.，436S(副刊).S90-S99(1999))。细胞和组织可以在体外通过注射针或基因枪注射或植入哺乳动物中。简言之，在体外技术中，提供了细胞培养物(如，器官细胞，皮肤、肌肉细胞等)或靶组织，或优选从宿主获得，然后将它们与载体或多核苷酸组合物接触，然后再植入宿主(如，使用前面描述的技术或相关技术)。核酸的体外给药也可以用于避开非希望的核酸整合和进行核酸或载体的定向传输。这些技术也可用培养的组织或合成生产的组织来进行。可选择的，细胞可以被提供或从宿主获取，与免疫原性量的本发明的多肽接触(如一起培养)，当细胞被植入或再植入宿主时，该免疫原性量足以预防性地诱导对于登革病毒的免疫应答(优选保护性免疫应答，如，保护性中和抗体反应)。被接触细胞然后传输或返回到患者中获取这些细胞的位置，或被治疗的患者中所关心的其它位置(如包括前面定义的位置)。希望得到的，可采用标准和已知的移植技术把接触细胞移植到患者中所关心的组织，器官或系统(包括上面所述的)或如，采用标准的传输或输入技术传输到血液和淋巴系统。这些技术可以用任何适宜的细胞种类完成。例如，一方面，激活的T细胞可以通过从机体(如哺乳动物，比如人)获得T细胞来提供，对T细胞施用足够量的一种或多种本发明的多肽来有效激活T细胞(或施用足够量的一种或多种具有启动子的本发明的核酸，使得一个或多个T细胞摄入核酸并足够表达以产生有效量的多肽来激活所述的T细胞)。活化的T细胞然后返回机体。T细胞可以由许多本领域的已知技术从机体中获得或分离，包括，如机体的外周血得到T细胞或由机体的肿瘤直接得到T细胞。其它体外方法的优选细胞包括扩增的淋巴细胞，特别是B细胞，抗原递呈细胞(APCs)，如树突细胞，或更优选的表皮黑素细胞，单核细胞，巨噬细胞，骨髓抽吸物，或万能供血干细胞。多肽或多核苷酸载体的体外给药的优选方面是能确保在传输或摄取细胞到机体前多核苷酸不会被整合到细胞的基因组中。可望的，细胞可采用本领域已知的标准技术来从已经摄取了多核苷酸或载体，而未发生整合的细胞中选择。
本发明包括诱导机体对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，包括：(a)提供大量的B细胞，树突细胞，或两者；(b)用至少一种本发明的核酸转化细胞，以使核酸不会被整合到细胞的基因组中，和(c)传输有效量的细胞到机体，其中在传输后该细胞表达至少一种核酸和在机体中诱导对至少一种登革病毒的免疫应答。采用这些方法，在用核酸转化细胞之前从机体获得该细胞，并在用至少一种核酸转化后，细胞被传输到相同的机体。一些这种进一步包含将以下物质传输到机体：1)包含GM-CSF或干扰素(IFN)的多肽，2)编码GM-CSF或干扰素的核酸，和3)编码GM-CSF和干扰素的核酸。
另一方面，本发明提供一种使用大量的本发明的重组VLPs或减毒病毒来诱导免疫应答的方法，它们由包括本发明的重组C15/全长prM/全长E多肽，或全长prM/全长E多肽的多肽群体形成。VLPs或减毒病毒的给药采用前文所述的施用多肽和病毒载体相似的方法进行(如，VLPs优选以药学可接受的注射液注入或透过皮肤，或肌内或腹膜内给药)。通过适宜的技术施用多肽，载体和多核苷酸时，皮肤和肌肉是优选的给药目标。因此，传输多肽，多核苷酸或载体进入或穿过机体，如哺乳动物(优选人)的皮肤是本发明的一个特点。这些给药可以通过经皮吸收装置来实现，或更优选的，多肽，多核苷酸和/或载体的biolistic传输进入或穿过机体的皮肤，或进入机体的暴露肌肉。本发明提供的经皮吸收装置已在本文别处描述，例如，可以应用于宿主的皮肤一段适宜的时间，足够将多核苷酸和/或载体传输到哺乳动物，由此产生针对至少一种登革病毒的免疫应答。通过注射包含本发明的多肽，多核苷酸，或载体的液体溶液的肌肉是尤其便捷的肌肉施用。可有利地定向的特殊细胞包括树突细胞，其它APCs，B细胞，单核细胞，T细胞(包括T辅助细胞)，和与该免疫系统细胞相关的细胞(如角化细胞或其它与表皮黑素细胞相关的皮肤细胞)。本发明的载体和核酸的靶向作用将在别处讨论。靶向给药可以由包含可操作地连接到细胞和/或组织特异性启动子的核酸的核酸和载体完成，其实例是本领域已知的。
本发明的多核苷酸可以通过任何适宜的传输系统给药，以使机体发生对登革病毒的免疫应答的多肽重组的表达。例如，有效量的包括本发明的核酸的细菌细胞群体被施用给机体，导致本发明的重组多肽核酸的表达，并在机体中诱导对登革病毒的免疫应答。被开发用于哺乳动物基因送递的细菌细胞是本领域已知的。另一方面，将电穿孔技术应用于有效数量的细胞或有效靶向组织，方便了本发明的多核苷酸或载体(优选多核苷酸载体)的给药，使得核酸和/或载体被细胞摄取，并在其中被表达，导致了生成本发明的重组多肽和随后在哺乳动物中诱导对登革病毒的免疫应答。
一方面，核酸，多肽，和/或载体可以与其它核酸或其它核酸载体联用，该载体包括可以在施用本发明的核酸、多肽和/或载体时增强对登革病毒免疫应答的其它核酸。优选地，该第二核酸包含编码GM-CSF，干扰素(如IFN-γ)，或两者的序列，其实例将在别处讨论。可选择的，该第二条核酸包括在本文别处描述的免疫刺激(CpG)序列。GM-CSF，IFN-γ或其它多肽辅剂可以与多肽、核酸，和/或载体联用。联合使用可以是在施用本发明的多肽，核酸，和/或载体之前，同时，或之后使用，可在任意时间使用，只要可以增强对于登革病毒的免疫应答就可。
登革病毒可以通过伊蚊叮咬传播，对在热带生活或旅行的人们构成很大威胁。登革病毒感染的临床表现大部分是登革热型发烧，是一种自限性(self-limited)纤维病。死亡率在1-5％的致命的登革热出血/登革热休克综合症(DHF/DSS)经常与续发性感染相关。
多种登革病毒血清型可以在一局部地区流行的，因此检测同时抵抗多种血清型的患者的血清样本是很重要的，尤其是在患者生活的地区流行的那些血清型。在一个所有四种登革病毒血清型可能都流行的地区中，检测同时抵抗所有四种血清型的患者的血清是重要的。为了治疗，确定感染登革病毒病人的特定血清型并不总是必要的；然而，将特定感染病毒与其它导致出血热的病毒区分开是重要的。在培养环境中培养登革病毒是冗长的，并且得到的病毒样本的质量通常变化很大，这是由于不同病毒的生长能力和稳定性差异。这使得难以在ELISA平板的每个孔中产生恒定的多种(如二种，三种，尤其是四种)血清型的抗原含量。另外，由于难以获得灭活病毒，这种分析平板非常昂贵，不能在贫穷国家里进行大规模的临床检测。
本发明提供使用至少一种重组登革病毒抗原嵌合多肽的新的诊断测定法，该多肽显示四种登革病毒血清型的一种或多种的一种或多种构象表位和/或确定抵抗一种，两种，三种或四种血清型登革病毒的一种或多种抗体。这些重组多肽可以被特异性抗血清确定。本发明的重组登革病毒抗原作为诊断工具，对于获取抵抗一种，两种，三种和优选全部四种登革病毒血清型的抗体是有用的。具体的，本发明提供一种使用至少一种本发明的重组或合成多肽的诊断分析法，该多肽显示两种，三种或四种登革病毒血清型(DEN-1，DEN-2，DEN-3，和/或DEN-4)的一种或多种构象表位和/或确定抵抗一种，两种，三种或四种血清型登革病毒的一类或多种抗体(如，多价抗原)。
更优先的，本发明提供一种诊断分析法，使用至少一种本发明的重组或合成的多肽，该多肽显示四种登革病毒血清型每种的一种或多种构象表位和/或确定抵抗四种血清型的每种的至少一种登革病毒的抗体。正如下面实施例中详细描述的，这些四价抗原多肽诱导机体内的抗体反应因此可作为疫苗的候选。
例如，四种重组PRM15/tE多肽(2/7E，5/21，2G11，和6E12)作为诊断抗原被选用(见实施例19)。可选的，“全长”克隆(2/7E-D1，5/217E-D1，2G11E-D4，和6E12-D4)也可应用。已经证明对于TBE，以及别的黄病毒来说，病毒性prM和100％的E基因的表达导致病毒样颗粒(VLP)的形成，即物理的和抗原性的组装病毒颗粒。据信，本发明的重组C15/全长prM/全长E(如2/7E-D1，5/21-D1，2G11-D4和6E12-D4)或全长prM/全长E克隆构成VLPs。在人293细胞被表达，VLP样抗原被分泌到培养液中，可以容易地分离抗原。
图13A的Western印迹图显示的是由特异类型抗血清确定四种四价克隆体(2/7E，5/21，2G11，和6E12)和人293细胞中表达和分泌抗原。为了诊断，该抗原可用于斑点印迹测定法，ELISA，或测验片ELA。从制备，储存和处理方面考虑，斑点印迹测定法是有利的测定法。作为诊断工具的重组多价抗原的使用可以由实施例19中的斑点印迹测定法证明。每种重组多价多肽都被完全分泌，可以由四种特异性的抗登革病毒抗血清识别，这样就可以用于检测抵抗任意四种登革病毒血清型的血清抗体，该抗体得自动物，包括人的生物样本。该诊断测定法有利地可以同时检测机体血清样本和抵抗所有四种血清型的抗体。
本发明进一步提供诊断或筛选组合物的方法，优选来自机体(如脊椎动物，如哺乳动物)的生物试样，如血液或血清，来检查是否存在或缺乏一种或多种病毒血清型的一种或多种抗黄病毒的抗体，包括一种或多种抵抗一种或多种与登革病毒相关的黄病毒或其变体的抗体，特别是抗登革病毒的抗体(包括，如抵抗一种或多种登革病毒或其变体的抗体)。在这方面，本发明提供诊断或筛选样本中是否存在一种或多种与至少一种血清型的至少一种登革病毒结合的抗体(或在组合物中检测是否存在一种或多种抗体)。该方法包括在一定条件下将样本与本发明的多肽接触，使得如果样本包含与至少一种血清型登革病毒结合的抗体和与至少一种抗登革病毒抗体结合的抗体，该抗体结合到该多肽上形成混合物，将混合物与连接抗登革病毒抗体的亲和分子接触，从混合物中移除未结合的亲和分子，检测组合物中存在或不存在的亲和分子。其中，亲和分子的存在表明在样本中存在结合到至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体。
另一方面，本发明提供一种诊断，检测，鉴别，选择，或筛选样本中存在的连接或特异连接到(与之反应)至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的方法。一方面，这些方法包括在一定条件下将样本与本发明的多肽接触，如果样本包含结合至少一种登革病毒的抗体，至少一种抗登革病毒的抗体结合到该多肽上来形成抗体-多肽复合物，并检测抗体-多肽复合物的存在与否，其中，抗体-多肽复合物的存在可预示连接到登革病毒的抗体的存在。在一些这种方法中，该方法包括筛选，检测，选择或诊断样本中是否存在抗体，该抗体特异性连接或特异性结合一种或多种血清型登革病毒。优选地，该样本是生物样本，优选由哺乳动物中获得，该哺乳动物可疑和/或倾向于感染一种或多种登革病毒。任何的适宜的生物样本(如果存在的话，其包括足够的用于分析的抗体)都是可用的。代表性的和优选的，可以从哺乳动物，尤其是人中获得血清并用于分析。可选择的，抗体浓度高的组织，如淋巴组织，可被用来分析。
本发明也包括用于至少一种登革病毒抗体的免疫测定法，含使用本发明的多肽作为检测样本。上述的方法可以进一步修饰来构成任意适合的免疫测定，其实例已在上面描述。优选的免疫测定法包括斑点印迹法测定，ELISA测定(如竞争性ELISA测定)，和测验片EIAs。在该方法的准备中，多肽结合(或联合)到固体或半固体基质上，促进抗原-抗体复合物的形成。采用适宜于显影的反应物可以方便抗原-抗体复合物的检测，例如，在本文别处描述的ELISA和FACS测定中应用的染料。本发明也提供包含这些元件的组合物。例如，本发明提供包含至少一种连接到固体基质的至少一种本发明的多肽的组合物，和可选择地包括使连接到多肽的抗体显影的反应剂。
本发明也提供一种用于免疫测定法的试剂盒，包括结合到固态基质的本发明的多肽的组合物，结合适合在将基质与怀疑包含抗登革病毒抗体的生物样本培养后来显影抗原-抗体复合物的反应剂。
用于进行免疫测定来检测样本组合物中的一种或多种抗登革病毒的抗体适宜基质通过获得无细胞培养液来提供，从用本发明的多核苷酸(包含核酸载体)转化的细胞培养物中吸取。细胞至少部分地分泌多肽到细胞培养液中，使得被吸取的培养液(上清液)包括足够用于免疫测定的量的多肽。值得注意的是，大约10μl的细胞上清液可作为敏感免疫测定的基质，其能测定对于复合血清型登革病毒的抗体的存在，更优选的，对于所有四种病毒血清型的抗体，优选的，得自哺乳动物(如，人)宿主的血清样本。发明者考察了使用较大量的这种上清液(如约20μl，约50μl，约100μl或更多)，和用本发明的核酸(或核酸载体)转染的细胞，以及用本发明的病毒载体感染的细胞的细胞溶解产物。上清液可与基质连用来完成EIAs(如，ELISA测定的ELISA平板或用于班点印迹测定的适宜薄膜)或直接应用于免疫沉淀作用，或其它直接测定的免疫组织化学的技术。可以按照本发明的多肽改进的类似技术可见美国专利US 5,939,254和本文引用的其它文献。
本发明还包括检测来自机体，如哺乳动物，的生物样本是否存在抵抗黄病毒的抗体的方法，包含在一定条件下将至少一种本发明的多肽(或包含至少一种多肽和载体或固体基质的组合物)与得自机体的生物样本接触，使得生物学样本中能够结合黄病毒的抗体与该多肽结合，形成抗体-多肽复合物；通过检测生物样本中抗体-多肽复合物的存在，就可以指示出生物样本(如，血液或血清)中抗体的存在。
两种或多种本发明的多肽的集合或文库也可用于诊断技术。可选择的，本发明的多肽可加到其它分子集合中(如，多肽集合，如病毒抗原的集合)。包含两种或多种本发明的多肽的文库是本发明的一个特点。本发明的另外一个特点是本发明的多肽的文库(如，本发明的多肽的片段的集合或本质相同的本发明的多肽的集合)。本发明的多肽可以被用于这些文库中来实施诊断技术(如病毒感染和/或其它病症诊断的多重诊断技术)。例如，在伴随发热的致病体(或其它病症)中致病性抗原文库，包含至少一种本发明的多肽，可用于哺乳动物，优选人的感染的诊断。以发生在样本和库中至少一种组分之间的可探测生物样本反应的方式进行哺乳动物生物样本与该文库的反应，从而指示哺乳动物感染的类型。在用于诊断技术的诊断芯片(蛋白质芯片)中结合一种或多种本发明的多肽是本发明的一个特点。
另一方面，本发明提供通过递归序列重组(recursive sequencerecombination)(如，DNA改组和合适的筛选/选择方法)获得的多肽，其通过本发明的核酸序列(尤其是本发明的多种核苷酸序列和/或多种野生型黄病毒，优选登革病毒，抗原编码序列)执行。例如，本发明提供通过递归序列重组方法得到的多肽，其包含选自SEQ ID NO：169-174序列的至少一种的第一核酸和选自SEQ ID NO：169-174和215-218的第二核酸，以产生重组或合成核酸文库，筛选重组或合成核酸文库来鉴别编码重组多肽的优化核酸，该核酸编码在机体中诱导对至少一种血清型的至少部分登革病毒的免疫反应的重组多肽，这种免疫反应与由第一核酸编码的多肽，第二核酸编码的多肽或其组合诱导的免疫反应相当或更大。特有地，选自第一群和第二群的多重核酸可用于核酸文库的产生或制备。
在一些实施方案中，本发明提供一种重组或合成多肽，由如下方法制备，该方法包含：(a)至少一种包含选自SEQ ID NO：211-214的多核苷酸序列的第一核酸和至少一种第二核酸的组合，其中第一核酸和第二核酸在两种或多种核酸上是不同的，以制备重组或合成核酸文库；(b)选择或筛选重组或合成核酸文库来鉴别至少一种重组或合成核酸，该核酸编码至少一种诱导机体产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答的重组或合成多肽，该免疫应答与由第一或第二核酸或其组合编码的多肽诱导的对所述至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答类似或更大；和(c)表达至少一种重组或合成核酸以获得重组或合成多肽。
在另一些实施方案中，本发明提供一种重组或合成多肽，由如下方法制备，该方法包含：(a)至少一种选自包含SEQ ID NO：211-214的多核苷酸序列的第一核酸和至少一种第二核酸的组合，其中第一核酸和第二核酸在两种或多种核酸上是不同的，以制备重组或合成核酸文库；(b)选择或筛选重组或合成核酸文库来鉴别至少一种重组或合成核酸，该核酸编码至少一种诱导机体产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答的重组或合成多肽，该免疫应答与由至少第一核酸或至少第二核酸编码的多肽诱导的对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答类似或更大；(c)合用包含选自SEQ ID NO：211-214序列的第三核酸的重组或合成核酸，以制备第二个重组或合成核酸文库；(d)选择或筛选第二个重组或合成核酸文库来鉴别至少一种进一步重组或合成核酸，该核酸编码至少一种诱导机体产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答的进一步重组或合成多肽，该免疫应答与由至少第一核酸，至少第二核酸或至少第三种核酸或它们的任意组合编码的多肽诱导的对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答类似或更大；和(e)表达至少一种进一步重组或合成的核酸以获得进一步重组或合成的多肽。上述两个实施方案中，一些这种重组或合成多肽在机体中诱导抵抗第一核酸编码的多肽和抵抗第二核酸编码的多肽的免疫应答。进一步的，上述两个实施方案中，一些这种重组或合成的多肽在机体中诱导抵抗登革病毒-1，登革病毒-2，登革病毒-3，登革病毒-4血清型病毒的免疫应答，该免疫应答与由至少第一核酸编码的多肽或由第二核酸编码的多肽或由第三核酸编码的多肽或它们的任意组合诱导的免疫应答类似或更大
在另一些具体实例中，本发明提供一种重组或合成多肽，由如下方法制备，该方法包含：(a)至少一种包含选自SEQ ID NO：215-218的多核苷酸序列的第一核酸和至少一种第二核酸的组合，其中第一核酸和第二核酸在两种或多种核酸是不同的，以制备重组或合成核酸文库；(b)选择或筛选重组或合成核酸文库来鉴别至少一种重组或合成核酸，该核酸编码至少一种诱导机体产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答的重组或合成多肽，该免疫应答与由至少由第一核酸或至少第二核酸或两者编码的多肽诱导的对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答类似或更大；和(c)表达至少一种重组或合成核酸以获得至少一种重组或合成多肽。
更普遍的，除在所列举的标准克隆化方法，如，Ausubel，Berger，和Sambrook中应用外，本发明的多核苷酸和其片段可作为任何不同的重组和递归序列重组反应的基质，来制备编码具有所需性质的重组登革病毒抗原的其它多核苷酸或其片段。许多这类的反应的也是已知的，由发明者和他们的合作者所开发的。
许多用于分生或鉴别具有一种或多种所述性质的本发明的分子的不同生成方法是可获得的并在本领域被描述的。这些操作可单独使用，和/或联合用于制备一种或多种核酸变异体或核酸组合以及被编码的蛋白质变异体。个别地和全体地，这些操作提供有效的、广泛的生成多种有用核酸和核酸组合(包括如，核酸文库)的途经，这些核酸和核酸组合可用于如具有新的或改良性质的核酸，蛋白质，途经，细胞和/或有机体的加工或快速演变。在确保清楚地讨论进行区别和分类，可以预期这些技术并不总是互相排斥的。实际上，各种方法可以单独地或联合地，并联或串联使用，来获得不同序列的变异体。
本文所描述的任何产生多样性的操作的结果可以是由一种或多种核酸的产生，这些核酸可以从具有或赋予期望特性的核酸，或编码具有或赋予期望特性的蛋白质的核酸中选择或筛选。在使用一种或多种本文的方法或本领域技术人员可以获得的其它方法产生多样性后，从任何制备的核酸选择具有所需活性或性质的核酸，如能够诱导，促进，增强或调整抵抗至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，或T细胞增殖和/或激活，细胞因子产生(如，(如产生白细胞介素-3和/或IFN-Y)，在机体中产生与至少一种血清型，优选两种，三种，或四种血清型的黄病毒(如登革病毒)结合的抗体，和/或在机体中产生抵抗至少一种黄病毒(如登革病毒)和抵抗至少一种，两种，三种或四种血清型黄病毒的中和抗体。例如，所需的性质可以是能够在机体中诱导，促进，调整或增强中和抗体的产生，该中和抗体抵抗机体内至少一种登革病毒-1，登革病毒-2，登革病毒-3和登革病毒-4血清型的登革病毒。其包括鉴定能被检测到的任何活性，例如，本领域的任意测定法的自动化或可自动的形式，如在本文中讨论的和在下面实施例部分的实施方案中例举的测定法。多种相关的(或甚至不相关)的性质可以在医生慎重的判断下连续或平行地评价。
对用于生成本文描述的编码本发明的多肽的修饰核酸序列的各种产生多样性操作的描述可以在以下的公开出版物及其引用的文献中看到：Soong，N.等(2000)″Molecμlar breeding of viruses″Nat Genet 25(4)：436-439；Stemmer，等(1999)″Molecμlar breeding of viruses for targeting and otherclinical properties″Tumor Targeting 4：1-4；Ness等(1999)″DNA Shufflingof subgenomic sequences of subtilisin″Nature Biotechnology 17：893-896；Chang等(1999)″Evolution of a cytokine using DNA family shuffling″NatureBiotechnology 17：793-797；Minshμll and Stemmer(1999)″Protein evolution bymolecμlar breeding″Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians等(1999)″Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylationusing DNA family shuffling″Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri等(1998)″DNA shuffling of a family of genes from diverse species acceleratesdirectedevolution″Nature 391：288-291；Crameri等(1997)″Molecμlarevolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling，″NatureBiotechnology 15：436-438；Zhang等(1997)″Directed evolution of an effectivefucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening″ Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten等(1997)″Applications of DNAShuffling to Pharmaceuticals and Vaccines″Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri等(1996)″Construction and evolution of antibody-phagelibraries by DNA shuffling″Nature Medicine 2：100-103；Crameri等(1996)″Improved green fluorescent protein by molecμlar evolution using DNAshuffling″Nature Biotechnology 14：315-319；Gates等(1996)″Affinityselective isolation of ligands from peptide libraries throμgh display on a lacrepressor′headpiecedimer″Journal of Molecμlar Biology 255：373-386；Stemmer(1996)″Sexual PCR and AssemblyPCR″In：The Encyclopedia of MolecμlarBiolo.VCH Publishers，纽约.447-457；Crameri and Stemmer(1995)″Combinatorial mμltiple cassette mutagenesis creates all the permutations ofmutant and wildtypecassettes″BioTechniques 18：194-195；Stemmer等，(1995)″Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbersofoligodeoxy-ribonucleotides″Gene，164：49-53；Stemmer(1995)″TheEvolution of MolecμlarComputation″Science 270：1510；Stemmer(1995)″Searching SequenceSpace″Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)″Rapid evolution of a protein in vivro by DNA shuffling″Nature 370：389-391；and Stemmer(1994)″DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vivro recombination for molecμlar evolution.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751.
术语“改组”用于此来指不同序列之间的重组，一些实施方案中，改组也可包括经由同源重组或非同源重组的交换，例如经由cre/lox和/或flp/frt系统。改组以由多种不同形式执行，包括如体外和体内改组形式，计算机模拟改组形式，利用双链或单链模板的改组形式，基于引物的改组形式，基于核酸片断改组形式，和寡核苷酸介导的改组形式，所有这些形式都是基于不同序列之间的重组事件，其更详细的描述或参考将在下文提到，以及其它类似的以重组为基础的形式。
产生多样性的突变方法包括，例如，定点突变(Ling等.(1997)″Approaches to DNA mutagenesis：an overview″Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale等.(1996)″Oligonucleotide-directed random mutagenesis usingthe phosphorothioate method″Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)″invivro mutagenesis″Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein & Shortle(1985)″Strategies and applications of in vivro mutagenesis″Science 229：1193-1201；Carter(1986)″Site-directed mutagenesis″Biochem.J.237：1-7；和Kunkel(1987)″The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis″in Nucleic Acids& Molecμlar Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；采用包含尿嘧啶的模板的突变(Kunkel(1985)″Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypicselection″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等.(1987)″Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypicselection″Methods in Enzmol 154，367-382；和Bass等.(1988)″Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities″Science 242：240-245)；寡核苷酸指导的突变(Methods inEnzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller & Smith(1982)″Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：anefficient and general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment″Nucleic Acids Res.10：6487-6500；Zoller & Smith(1983)″Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors″Methods in Enzymol.100：468-500；and Zoller & Smith(1987)″Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template″Methods inEnzymol.154：329-350)；磷硫酰修饰的DNA突变(Taylor等.(1985)″The useof phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA″Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor等.(1985)″The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA″Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye & Eckstein(1986)″Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis″Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers等(1988)″Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis″Nucl.Acids Res.16：791-802；和Sayers等.(1988)″Strandspecific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide″Nucl.Acids Res.16：803-814)；采用缺口二联体DNA的突变(Kramer等(1984)″The gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction″Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer & Fritz(1987)Methods in Enzymol.″Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA″154：350-367；Kramer等.(1988)″Improved enzymatic in vivro reactionsin the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction ofmutations″Nucl.Acids Res.16：7207；和Fritz等.(1988)″Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vivro″Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。
其它适宜的产生多样性的方法包括点错配修复(Kramer等(1984)″PointMismatch Repair″Cell 38：879-887)，利用修复缺陷的宿主菌株的突变(Carter等(1985)″Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis usingM13vectors″Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)″Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors″Methods in Enzvmol.154：382-403)，缺失突变(Eghtedarzadeh & Henikoff(1986)″Use ofoligonucleotides to generate large deletions″Nucl.Acids Res.14：5115)，限定-选择和限定-纯化(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation instabilizing the transition stateof subtilisin″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，总基因合成突变(Nambiar等(1984)″Total synthesis and cloning ofa gene coding for the ribonuclease S protein″Science 223：1299-1301；Sakamarand Khorana(1988)″Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)″Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等(1985)″Cassette mutagenesis：an efficientmethod for generation of mμltiple mutations at defined sites″Gene 34：315-323；和Grundstrm等(1985)″Oligonucleotide-directed mutagenesls bymicroscale′shot-gun′gene synthesis″Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(Mandecki(1986)″Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181；和Arnold(1993)″Protein engineering forunusualenvironments″Current Opinion in Biotechnology 4：450-455).许多以上方法的其它详细内容可以见Methods in Enzymology Volume 154，其也记载了对各种突变方法中的故障检查问题的有效控制。
另外的点突变技术的描述可见于，如，Edelman等，DNA，2，183(1983)，Zoller等，Nucl.Acids Res.，10，6487-5400(1982)，和Veira等，Meth.Enzymol.，153，3(1987))。其它有用的突变技术包括丙氨酸扫描，或随机突变，例如，由易错PCR诱导的重复随机点突变，化学突变剂暴露，或在突变基因细胞中多核苷酸表达(见，如Bornscheueret等，Biotechnol.Bioeng，58，554-59(1998)，Cadwell和Joyce，PCR Methods Appl.，3(6)，S136-140(1994)，Kunkel等，Methods Enzymol.，204，125-39(1991).Low等，J.Mol.Biol.，260，359-68(1996)，Taguchi等，Appl.Environ.Microbiol.，64(2)，492-95(1998)，和Zhao等，Nat.Biotech.，16，258-61(1998)对于这些技术的讨论)。适宜的用于PCR定点突变或类似技术的引物可以由在如Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，5765(1978)中描述的方法来制备。
其它适宜的促进序列多样性的有用技术包括PCR突变技术(如被描述在如Kirsch等，Nucl.Acids Res.，26(7)，1848-50(1998)，Seraphin等，Nucl.Acidsres.，24(16)，3276-7(1996)，Caldwell等，PCR Methods Appl.，2(1)，28-33(1992)，Rice等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(12)，5467-71(1992)和U.S.5,512,463)，基于Wells等，Gene，34，315(1985)描述的方法的盒式诱变技术，噬菌粒展示技术(如描述在如Soumillion等，Appl.Biochem.Biotechnol.，47，175-89(1994)，O’Neil等，Curr.Opin.Struct.Biol.，5(4)，443-49(1995)，Dunn，Curr.Opin.Biotechnol.，7(5)，547-53(1996)，和Koivunen等，J.Nucl.Med.，40(5)，883-88(1999))，反向翻译进化(见，如U.S.6,194,550)，饱和突变，见如U.S.6,171,820)，PCR合成改组(见如U.S.5,965,408)和递归总体突变(REM)(如被描述在，如Arkin和Yourvan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，7811-15(1992)和Delgrave等，Protein Eng.，6(3)，327-331(1993))。用于将多样性导入同源序列文库的技术也在US6.159,687和6,228,639中提供。
对各种产生多样性的方法的进一步详细描述可以在下面的美国专利，PCT公开和申请，欧洲公开文本中找到：Stemmer等的US5,605,793(1997.2.25，)″Methods for in Vitro Recombination；″Stemmer等的US5,811,238(1998.9.22)，″Methods for Generating Polynucleotides havingDesired Characteristics by Iterative Selection and Recombination；″Stemmer等的U.S.5,830,721(1998.11.3)，″DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly；″Stemmer等的US5,834,252(1998.11.10)，″End-ComplementaryPolymerase Reation；”Minshμll等的US5,837,458(1998.11.17)，″Methods andVompositions for Cellμlar and Metabolic Engineering；″Stemmer和Crameri的WO95/22625，″Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly；″Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，″End Compleplementary PolymeraseChain Reaction；″Stemmer和Crameri的WO97/20078，″Mothods for GeneratingPolynucleotides having Dedired Characteristics by Iterative Selection andRecombination；″Minshμll和Stemmer的WO97/35966，″Methods andCompositohs for Cellμlar and Metabolic Engieering；″Punnonen等的WO99/41402，″Antigen Library Immunization；″Punnonen等的WO99/41369，″Genetic Vaccine Vector Engineering；″Punnonen等的WO99/41368，″Optimization of Immunomodμlatory Properies of Genetic Vaccines；″Stemmer和Crameri的E.P.752008，″DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly；″Stemmer的E.P.0932670，″Evolving Cellμlar DNA Uptake byRecursive Sequence recombination；″Stemmer等的WO99/23107，″Modificationof Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling；″Apt等的WO99/21979，″Human Papillomavirus Vectors；″del Cardayre等的WO98/27230，″Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive SequenceRecombination；″Patten和Stemmer的WO98/27230，″Methods and Compositionsfor Polypeptide Engineering；″Stemmer等的WO98/27230，″Methods forOptimization of Gene Therqpy by Recursive Sequence Shuffling and Selection″，WO 00/00632，″Methods for Generating Highly Diverse Libraries″，WO00/09679，″Methods for Obtaining in vivro Recombined PolynucleotideSequence Banks and Resμlting Sequences″，Arnold等的WO98/42832，″Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random orDefined Primers″，Arnold等的WO 99/29902，″Method for CreatingPolynucleotide and Polypeptide Sequences″，Vind的WO 98/41653，″An invivro Method for Construction of a DNALibrary，″Borchert等的WO98/41622，″Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling，″和Pati和Zafling的WO 98/42727，″Sequence Alterations using HomologousRecombination″；Patten等的WO 00/18906，″Shuffling of Codon-AlteredGenes；″del Cardayre等的WO 00/04190，″Evolution of Whole Cells andOrganisms by Recursive Recombination″；Crameri等的WO 00/42 561，″Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination″；Selifonov和Stemmer的WO 00/42559，″Methods of Popμlating Data Structures for Use inEvolutionary Simμlations；″Selifonov等的WO 00/42560，″Methods fr MakingCharacter Strings，Polynucleotides & Polypeptides Having DesiredCharacteristics；″Welch等的PCT/US00/26708，″Use of Codon-VariedOligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling；″和Affholter的PCT/US01/06775″Single-Stranded Nucleic Acid Template-MediatedRecombination and Nucleic Acid Fragment Isolation″.
几种不同序列修饰方法的一般种类，包括突变，重组等，都可以用于本发明并且被列举，如在上下文所引用的文献中。下面将举例说明本发明的用于产生多样性的优选形式，包括，如一些基于多样性产生形式的重组。
核酸可以用上面的参考文献中所述的任何不同技术在体外重组，包括，如，DNA酶消化将被重组的核酸后，通过连接和/或PCR再组装核酸。例如，可以采用性染色体的PCR突变，其中DNA分子的随机(或假随机，或甚至非随机)片段体外重组，基于序列相似性，在具有不同但是相关DNA序列的DNA分子之间发生重组，接着在聚合酶链式反应中通过延伸将交换固定。这个过程和许多可变的过程可以参见上面所述的参考文献，如Stemmer(1994)Proc.Natl.acad.USA 91：10741-10751。
类似的，核酸可以在体外递归地重组，如，通过允许在细胞的核酸之间发生重组。许多这样的体外重组形式在上文标记的参考文献中公开。这些形式任意地在感兴趣的核酸之间的直接重组，或在包含在感兴趣核酸的载体，病毒，质粒等之间的重组，和其它形式。这些方法的详细内容可在上文标记的参考文献中找到。还可以采用完整基因组重组方法，其中细胞或其它有机体的完整基因组发生重组，任意地，包含在基因组重组混合物中加入期望的文库成分(如相应于本发明所述途径的基因)。这些方法具有很多应用，包括用于鉴别未知的靶向基因。这些方法的详细描述，可见于，如del Cardayre等的WO98/31837，″Evolution of Whole Cell and Organisms by RecursiveSequence Recombination；″和如del Cardayre等的PCT/US99/15972，其题目也是″Evolution of Whole Cell and Organisms by Recursive SequenceRecombination″。
还可以采用合成重组的方法，其中对应于目标靶点的寡核苷酸被合成和在PCR或连接反应中被再组装，其包括相应于一种以上亲本核酸的寡核苷酸，这样就产生了新的重组核酸。寡核苷酸可以由标准的核苷酸加入法制备，或可由如三核苷酸途径制备。这些途径的详细描述可在上文标记的参考文献中找到，包括如Crameri等的WO00/42561，″Oligonucleotide mediated NucleicAcid Recombination；″Welch等的PCT/US00/26708，″Use of Codon-VariedOligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling；″Selifonov等的WO00/42560，″Methods for Making Character Strings，Polynucleotides andPolypeptides Having Desired Characteristics；″和Selifonov和Stemmer的WO0042559，″Methods of Popμlating Data Structures for Use in EvolutionarySimμlations.″
计算机模拟重组方法是有效的，其中使用遗传算法来计算相应于同源(或甚至非同源的)核酸的重组序列链。产生的重组序列链可以通过合成相应于重组序列的核酸转化为核酸，如，与寡核苷酸合成/基因再组装技术一起使用。这种途径可以产生随机的，部分随机的或设计的变异体。许多关于计算机模拟(in silico)重组的详细描述，包括在电脑系统中采用遗传算法，基因操作及类似，与生成相应的核酸(和/或蛋白)组合，以及结合设计的核酸和/或蛋白(如以交换位点选择为基础)以及设计的，假随机或随机重组方法的描述可见于Selifonov等的WO 00/42560，″Methods for Making Character Strings，Polynucleotides and Polypeptides Having Desired Characteristics″和Selifonov和Stemmer的WO 00/42559″Methods of Popμlating Data Structures for Use inEvolutionary Simμlations″.对于计算机模拟重组方法的更加详细描述可以在这些申请中找到。这些方法通常适用于本发明的核酸序列多肽序列。
许多评价自然多样性方法可以被使用，如，通过不同核酸或核酸片段杂交到单链样板，接着通过聚合和/或连接来再生全长序列，典型地，接着降解模板和回收生成的改进的核酸。在利用单链模板的方法中，由基因组文库得到的片段总体用部分的或常常是相应于互补链的近似全长ssDNA或RNA来退火。从该总体中组装复杂的嵌合基因，然后由核酸酶基础去除非杂交片段末端来调节，然后通过聚合作用填充片段之间的缺口，接着进行单链连接。亲本多核苷酸链可以通过消化(如，RNA或尿嘧啶包含物)，变性条件下的磁性分离(如，有助于分离的标记方法)和其它可选的分离/纯化方法来去除。可选的，亲本链可以任意的与嵌合链共同纯化和在后来的筛选和加工过程中除去。其它关于此类方法的详细描述可见于，由Affholter申请的PCT/US01/06775，″Single-Stranded Nucleic Acid Template-MediatedRecombination and Nucleic Acid FragmentIsolation″。
在另一种方法中，单链分子被转化为双链DNA(dsDNA)，dsDNA则由配基介导的方式结合到固体载体上。分离为结合的DNA之后，被选择DNA分子从载体上释放并被导入适宜的宿主细胞中来产生富含序列文库，并该序列杂交到探针上。这种方法产生的文库提供采用任何本文所描述的操作进一步多样化所需的底物。
任意前述的常规重组形式可以反复实行(如，一次或多次循环突变/重组或其它产生多样性的方法，可选择地接着采用一种或多种选择方法)来产生更加多样的重组核酸组。
采用多核苷酸连终止方法的突变已经被提出(见如，US 5,965,408，″Method of DNA reassembly by interrupting synthesis″to Short，和上述的参考文献)，可以应用于本发明。在这种方法中，对应于一种或多种基因的具有序列相似的区域的双链DNA可以被结合和变性，无论特异于基因的引物存在与否。然后单链多核苷酸复性，并在聚合酶和链终止剂(如，紫外线，γ或X射线照射；溴乙锭或其它插入分子；DNA结合蛋白，如单链结合蛋白，转录活化因子，或组蛋白；多环芳烃；三价铬或三价铬盐；或快速热循环介导的缩短聚合作用；及其类似物)的存在条件下培养，结果产生了部分双链的分子。部分双链的分子，如包含部分的伸展链然后在复制或部分复制的循环中变性和再复性，最终产生具有不同程度的序列相似性的和相对于开始的DNA分子变异的多核苷酸。任意的，该产物，或该产物的部分群体可以在过程中在一个或多个阶段被扩增。如上所述，由以上链终止方法制备的多核苷酸，对于所述的任何重组形式都是适宜的底物。
多样性可以由核酸或大量核酸产生，其使用的方法为被称为“产生杂交酶增加截断”(“ITCHY”)，见Ostermeier等(1999)″A combinatorial approachto hybrid enzymes independent of DNA Biotech 17：1205。这种途径也可用于产生变异体的起始文库，其可任意的作为一种或多种种体外或体内重组方法的底物。见，Ostermeier等(1999)″Combinatorial Protein Engineering byIncremental Truncation″Proc.Acad.Sci.USA，96：3562-67；Ostermeier等(1999)，″Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering ofNovelBiocatalysts，″Biological and Medicinal Chemistry，7：2139-44。
导致单个核苷酸或连续或非连续核苷酸组发生改变的突变方法，可有利地用于诱导核苷酸变异。许多突变的方法可以在上述引用的参考文献中找到；下面是关于突变方法的其它详细描述，这些方法也是可以用于本发明。例如，易错聚合酶链式反应可以产生核酸变异体。使用该技术，PCR是在DNA聚合酶的复制忠实性低的情况下进行，这样就在PCR产物的全长上都获得了高几率的点突变。这些技术可参见上面的参考文献和，如Leung等(1989)Technique 1：11-15和Caldwell等(1992)PCR Methods Applic.2：28-33。类似的，装配PCR可以应用于包括由小DNA片段的混合物的发生的PCR产物的装配的过程。大量不同的PCR反应可以在相同的反应混合物中同时发生，一个反应的产物会启动另一个反应的生产。
寡核苷酸定向突变可以用于在目标核酸序列上诱导点特异突变。这些技术的实例可见于上述参考文件，如Reidhaar-Olson等(1988)Science，241：53-57。盒式诱变可用于以不同于自然序列的合成寡核苷酸表达盒置换双链DNA分子的小区域的过程。寡核苷酸可包括，如完全和/或部分的随机自然序列。
递归总体突变作用是一个在其中蛋白质变异算法被用于产生表型相关变体的不同群体的过程，该群体成员的氨基酸序列不同。该方法采用反馈机制来监控重组盒式诱变的连续循环。该方法的例子可见Arkin & Youvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815。指数总体突变作用可用于产生包含具有高比例特异和功能变异的组合文库。所关心序列中的小组残基可随机地同时在各个改变后的位置鉴别产生功能性蛋白质的氨基酸。这些过程的例子可见Delegrave & Youvan(1993)Biotechnology Research 11：1548-1552。
体内突变作用可用于通过DNA增殖在任意被克隆的目标DNA中产生随机突变，如，在具有一种或多种DNA修复途径突变的大肠杆菌中。“突变子”(“mutator”)菌株比野生亲本菌株具有更高的随机突变率。在这些菌株中增殖DNA将最终会在DNA内产生随机突变。这些技术在上述的参考文献中都有描述。可选的，体内重组技术可以被应用。例如，多种共享部分序列相似性的单体多聚核苷酸的多样性可以被转化到宿主中，并通过宿主细胞体内重组。细胞分裂的后续循环也可用于产生文库，其成员包括单一的同源群体，或单体多核苷酸的集合。可选择的，单体核酸可以通过标准技术回收，如，PCR和/或克隆，和以任意重组形式被重组，包括上述的递归重组形式。其它可用于体内重组和序列变异的技术可见US5,756,316。
产生多物种表达文库的方法已经有描述(除了上面指出的参考文献外，参见如，Peterson等.(1998)US5,783,431″METHODS FOR GENERATINGAND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS″和Thompson等(1998)U.S.5,824,485 METHODS FOR GENERATING AND SCREENINGNOVEL METABOLIC PATHWAYS)，以及它们用于鉴别蛋白质活性的用途也被提出(除上述参考文献外，见Short(1999)U.S.5,958,672″PROTEINACTIVITY SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROMUNCMLTIVATED MICROORGANISMS″)。多物种表达文库包括，一般而言，包含大量来自物种或菌株的cDNA或基因组序列的文库，这些序列在表达盒中被可操作地连接到适当的调节序列上。cDNA或基因组序列可任意地被随机地连接来进一步增强多样性。该载体可以是适合在多种宿主生物体中转化和表达的穿梭载体，如细菌，真核细胞。在一些例子中，该文库偏向于预先选择编码目标蛋白质或杂交到目标核酸的序列。任何这种文库可以作为底物用于任意如上所述的方法中。
本发明所述的多核苷酸序列可以通过标准技术进行加工来产生其它修饰，例如插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变pegylation模式，基于宿主细胞密码子优化的序列修饰，导入重组酶位点和和导入剪接位点。
在一些应用中，在多样化之前，期望预选或预先筛选文库(如，扩增文库，基因组文库，互补DNA文库，标准化文库等)或底物核酸，如，通过基于重组的突变操作，或将底物偏移到编码功能性产物的核酸。该文库也可以偏向于具有特定特性的核酸，如与被选择的核酸探针杂交。
生成核酸和多肽的“非随机(Non-Stochastic)”方法也称为“非随机(Non-Stochastic)产生遗传疫苗和酶”WO 00/46344。这类方法，包括被提出的非随机(Non-Stochastic)多核苷酸再组装和位点饱和突变方法，也可以用于本发明。利用混合或简并寡核苷酸随机或半随机突变法也被描述在，如Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets ofamino acids for semi-random mutagenesis″Biotechnology 10：297-300；Reidhaar-Olson等(1991)″Random mutagenesis of protein sequences usingoligonucleotide cassettes″Methods Enzymol.208：564-86；Lim和Sauer(1991)″The role of internal packing interactions in determining the structure andstability of a protein″.Mol.Biol.219：359-76；Breyer和Sauer(1989)″Mutational analysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 5IF to lambda repressor″J.Biol.Chem.264：13355-60)；和″Walk-ThroμghMutagenesis″(U.S.5,830,650和5,798,208，和欧洲专利EP0 527 809).
容易理解地，任何上述的适合于在多样化之前丰富文库的方法也能用于筛选由产生多样性的方法制备产物，或产物的文库。
用于突变，文库构建和其它产生多样性的方法的试剂盒也是商业上可获得的。例如，试剂盒可以来自Stratagene(如QuickChangeTM定位突变试剂盒；和ChameleonTM双链，定位突变试剂盒)，Bio/Can Scientific，Bio-Rad(使用上述的Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.，Clonetech Laboratories，DNA Technologies，Epicentre Technologies(如5引物3引物试剂盒)，GenpakInc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs，Pharmacia Biotech，Promega Corp.，Quantum Biotechnologies，AmershamInternational plc(如，使用上述的Eckstein法)，和Anglian Biotechnology Ltd(如使用上述的Carter/Winter)。
上述参考文献提供了许多突变形式，包括重组，递归重组，递归突变和组合或具有其它突变形式的重组，以及这些形式的改进。无论采用任何产生多样性的形式，本发明的核酸可以被重组(互相，或与相关(或甚至无关)的序列)来产生重组核酸的不同组合，包括，如同源核酸组合，以及相应的多肽。
重组核酸可由本发明的一种或多种多种多聚核酸序列和一种或多种其它核酸来制备，单独地或联合使用上述的形式，构成本发明的一部分。一种或多种其它核酸可以包括本发明的其它多核苷酸；任意地，可选择地或另外地，一种或多种另外的核酸可包括，如编码自然存在的登革病毒prM的核酸和/或E蛋白的编码序列，其它黄病毒的prM和/或E序列，或，如其它的同源或非同源核酸或其片断(上述的特定重组形式，特别是那些合成地或计算机模拟地完成的，不需要具有有效重组的同源性)
可望地，得自上述重组方法的重组多肽是功能性嵌合多肽。例如，上述方法之一制备的多肽常常和可望用于在机体中诱导抵抗第一核酸编码的多肽和抵抗由第二核酸编码的多肽的免疫反应。由于多种，优选至少三种，或更优选的为至少四种或多种的核酸被用于本发明的递归序列重组技术，从重组反应的核酸产物获得的多肽一般包含两种或更不同于亲本序列编码的多肽的多肽片段或肽部分。每个这样的肽片段和肽部分是一种或多种的连续氨基酸的氨基酸序列，一般地，长度至少10个，15个，20个或至少30个或更多个氨基酸。这些肽片段或肽部分，可以由序列分析技术鉴别。具有这些序列变异(或复合的嵌合物)的本发明的肽的例子将在以下的实施方案部分描述。这类相对于亲本序列编码的特殊肽的独特肽片段或肽部分可以通过肽片段或片断相互分离开，分别相应于其它亲本核酸编码的肽。亲本的肽片段或片断可以是任意适宜的大小。典型地，一个亲本肽片段或片断，其长度包含至少10，至少15，至少20和至少大约30或更多个氨基酸。多种肽片断或肽部分应当包含存在于由亲本核酸编码的肽中的表位。这一方面，由本发明的核苷酸序列表达的重组多肽应当包含至少大约一，二，或更多T细胞表位和/或在至少一种，优选每一种的亲本核酸编码的多肽中存在的抗原序列。当然，重组也能导致不在任何的亲本核酸序列中出现的新的编码序列，这样的话，产生在任何的亲本核酸序列中被存在的新表位。
由以上所述的重组，突变和标准核苷酸合成技术制备的多核苷酸可以用于筛选适宜的特性，例如，具有本发明的新登革病毒抗原的任何想要性质的重组多肽的表达，将在别处详细讨论。由这些技术制备和具有这些特性的多肽是本发明的一个重要特点。例如，本发明提供一种由重组多核苷酸编码的重组多肽，该多核苷酸是由任何本发明的核酸序列通过递归序列重组制备的，该核酸序列诱导机体对于至少一种，两种，三种或优选四种病毒血清型的至少一种或多种登革病毒的免疫应答。优选的，该由这种多肽的服用或表达诱导的机体的免疫应答是和由第一核酸编码的多肽，第二核酸编码的多肽，或它们的组合诱导的免疫基本相当或更强。
本发明的多肽可以包含任意适宜数量的非登革病毒抗原肽片段。相应的，本发明的多核苷酸可以包含任意适宜数量的编码这类非登革病毒抗原肽片段的核酸片段。这些肽片段典型的连接到本发明的多肽的C或N末端，正如所希望的，形成融合蛋白。这类融合蛋白是本发明的一个重要特点。一般地，本发明提供一种具有任何上述本发明特征的多肽，进一步包含异源的融合配体(非登革抗原编码的肽片段或肽部分)，显示至少一种生物学活性，可以从机体内剩余的多肽中独立地找到。数量众多的异源融合配体可以加入到除本发明上述的免疫抗原氨基酸序列(和任意的信号序列)之外的多肽上。
特别有用的融合配体是方便多肽纯化的肽片段或肽部分(“多肽纯化次序列”)。适宜的多肽纯化次序列也是本领域已知的。这类融合配合体的例子包括多组氨酸序列，允许在固化材料上纯化的组氨酸-色氨酸模块，例如六组氨酸肽。编码这种标记的序列被加入到pQE载体，其来自QIAGEN，Inc.(Chatsworth，California)，连接谷胱甘肽的序列(如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST))，血凝素(HA)标记(相应的，得自流行性感冒血凝素蛋白；Wilson，I.等(1984)Cell 37：767)，麦芽糖结合蛋白序列，可用于FLAG扩展/亲和纯化法体系(Immunex Corp，Seattle，WA)的FLAG表位—商业上可获得的FLAG表位还可以从Kodak获得(New Haven，Connecticut)，硫氧还蛋白(TRX)，卵白素，及类似物。纯化域和免疫抗原氨基酸序列或免疫抗原氨基酸序列/多肽的信号序列部分之间的可蛋白酶裂解的多肽连接序列的内含物可用于方便融合蛋白的免疫抗原片段的纯化。组氨酸残基便于在IMIAC(固定化金属离子亲和层析，见Porath等(1992)Protein Expression and Purification 3：263-281)纯化，而肠激酶切位点提供一种从融合蛋白中分离多肽的方法。PGEX载体(Promega；Madison，WI)也可方便表达作为具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。这些序列的其它例子和用于蛋白纯化可见于，如国际专利申请WO 00/15823。多肽表达后和由这些融合配体或其它(如上所述)分离后，可以利用蛋白质重折叠步骤，正如所希望的那样，完成成熟多肽的构型。
本发明的融合蛋白也可包括一种或多种促进融合蛋白检测的其它肽片段或肽部分。例如，报道肽片段或肽部分(如，绿色荧光蛋白(GFP)，半乳糖苷酶或其可检测的结构域)可被结合到融合蛋白中，可以被结合到本发明的多肽的其它标记分子包括放射性核素，酶，荧光团，小分子配基，及类似物。
本发明的多肽可进一步由至少一种修饰氨基酸的内含物修饰。一种或多种修饰氨基酸的内含物可以是有益地，例如，(a)增加多肽的血清半衰期，(b)减少多肽抗原性，或(c)增强多肽的保存稳定性。氨基酸被修饰是，例如，在重组产物的翻译过程中或翻译后(如，在哺乳动物细胞中表达中的N-X-S/T基序的N-联糖基化作用)或由合成方法修饰。修饰氨基酸的非限制例子包括糖基化氨基酸，硫酸化氨基酸，异戊二烯化(prenlyated)(如法尼基化，香叶基香叶基化(geranylgeranylated))氨基酸，乙酰化氨基酸，酰化氨基酸，PEG化氨基酸，生物素酰化氨基酸，羧酸化氨基酸，磷酸化氨基酸，及其类似物。足以指导本领域技术人员进行氨基酸修饰的参考文献充分贯穿于本文始终。其实例可见于Walker(1998)PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM HumanaPress，Towata，NJ。优选的，修饰的氨基酸选白糖基化氨基酸，PEG化氨基酸，法尼基化氨基酸，乙酰化氨基酸，生物素酰化氨基酸，氨基酸/连接到油脂成分，和连接到有机衍生剂的氨基酸。
本发明的另一个特点是包含上述免疫原性氨基酸序列的多肽，并进一步包含定向序列，其与信号序列不同。例如，多肽可以包含定向到特异细胞种类上的受体的序列(如，单核细胞，树突细胞，或相关细胞)，以使多肽的定向传送到细胞和/或相关的组织。信号序列在上面被描述，包括膜定位/锚序列(如，翻译停止序列，糖基磷脂酰肌醇锚序列)和类似物。
另一方面，多肽可包含促进多肽稳定、多肽分泌(不是通过信号指引)或两者的融合配偶体。例如，多肽可包含免疫球蛋白(Ig)域，如含有Fc链，CH2域，和CH3域的IgG多肽，可促进多肽的稳定性和/或分泌。
本发明的融合蛋白进一步包含另外的免疫氨基酸序列。例如，融合蛋白可包含与黄病毒衣壳蛋白，优选登革病毒衣壳蛋白(如，DEN-2或DEN-4)的序列片段或部分实质同源的(如，至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)氨基酸，其长度最少为大约20个氨基酸。例如，多肽可包含本发明的免疫氨基酸序列的融合蛋白和黄热病病毒或腺病毒被膜，衣壳或其它蛋白。可选择的或另外的，本发明的多肽(或编码本发明的多肽的多核苷酸)可和一种或多种登革病毒衣壳蛋白，或该蛋白的片断或部分合用，例如包含T细胞表位的登革病毒壳体的片段或部分(这些表位的例子是本领域已知的，(见，如Gagnon等J Virol，70(1)：141-147(1996))，或一种或多种编码多肽或肽的核酸。多肽也或可选择的包含或与一种或多种登革病毒非结构蛋白或一种或多种编码蛋白或本质同源的肽(如，具有至少75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少90％，91％，92％，93％，或94％，更优选至少约95％(如，约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)的核酸。例如，添加非结构蛋白(如，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和/或NS5)可以增加T细胞反应，如果其包括一种或多种其它的T细胞表位。本发明包括与WT NS登革病毒蛋白具有至少约80％，85％，90％或更高的序列同一性的多肽以及这种多肽的如本文描述的用途。联合传送包括非结构蛋白B细胞和/或T细胞表位(其可在N1(和相关的NS-1或NS1)，N3(NS-3或NS3)，或N5(NS-5或NS5)中见到，如Mathew等J Clin Invest，98(7)：1684-1692(1996)，Okamoto等JGen Virol79：697-704(1998)，Green等，Virology 234(2)：383-386(1997)，and Garcia等Am JTrop Med Hyg 56(4)：466-70(1997))，或共同表达编码这种多肽的序列，可以改进多价免疫应答反应，该免疫反应由在机体内，如哺乳动物中传送和/或表达重组多肽来诱导。
融合蛋白的肽片断或肽部分可以任意适宜方式结合。典型地和优选地，第一和第二肽片段或部分是共价结合的(如，通过肽键和双硫键)。肽片段或部分可直接融合(如，免疫氨基酸序列的羧酸端可融合到纯化序列或异源免疫原性序列的氨基端)。融合蛋白可以包含适宜数量的修饰键，如，肽部分中或之间的电子等排体。可选择的，融合蛋白可以包括肽片段或部分之间的肽接头，该片段或部分包括一种或多种未形成生物活性肽部分的氨基酸序列。任意适宜的肽接头都是可用的。接头可以是任意适宜的大小。典型地，该接头是少于大约30个的氨基酸残基，优选少于约20个氨基酸残基，更优选的是约10个或少于10个氨基酸残基。典型地，该接头主要包含或包括中性氨基酸残基。适宜的接头的一般描述可见于，如US5,990,275，6,010,883，6,197,946，和欧洲专利申请EP0 035 384。如果肽片段或肽部分的分离是可行的，促进分离的接头也是可用的。这类接头的例子可见于US4,719,326。包含甘氨酸和/或丝氨酸残基的“柔韧”(″Flexible″)接头也是有益的。这类接头的例子可见于，如McCafferty等，Nature，348，552-554(1990)，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883(1988)，Glockshuber等，Biochemistry，29，1362-1367(1990)，and Cheadle等，Molecμlar Immunol.，29，21-30(1992)，Huston etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883(1988)，Bird等，Science，242，423-26(1988)，和U.S.5,672,683，6,165,476，和6,132,992.
接头的使用可以减少不需要的对于由两种肽片段或肽部分形成的融合蛋白的免疫应答，这样可以导致在融合蛋白中意外地出现了MHC I和/或MHC II表位。除了使用接头外，鉴别不需要表位序列或邻近序列可以PEG化(例如，由赖氨酸残基插入来促进PEG连接)来保护鉴别表位不被暴露。其它用于降低本发明的融合蛋白的免疫原性的技术可以在融合蛋白给药时一并使用，包括US6,093,699中的技术。
本发明的重组多肽希望不含无关的表位(即非登革病毒相关表位)或表位的结合点。这些技术也可以用于防止无关表位或表位结合点的出现。分析表位的技术将在实施例部分进一步提供，可以用于有利地设计不具有此类无关和/或不希望表位的重组抗原。
本发明的多肽片段在促进机体对于登革病毒的免疫应答中也是有用的。本发明提供这些片段和使用的方法。例如，本发明提供一种长度为至少75个氨基酸的多肽片段，其与野生型衣壳蛋白或野生型的DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4的prM/E蛋白是不同的，该片段诱导机体产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答。在机体给药和适当表达的时候，特异的多肽片段诱导对于多重血清型(如两种，三种或所有已知的四种)的一种或多种登革病毒的免疫应答，包括对于两种，三种或四种血清型每种中的一种或多种登革病毒的中和抗体反应，优选诱导对于两种，三种或四种血清型每种中的一种或多种登革病毒的保护性免疫应答。
除编码和表达本发明的重组免疫多肽外，核酸也对于表达的有义(sense)和反义抑制(如控制组织中的表达水平偏离被施用的核酸或载体的期望表达水平)也是有用的。多种有义(sense)和反义抑制是本领域已知的，见，如Lichtenstein & Nellen(1997)ANTISENSE TECHNOLOGY：A PRACTICALAPPROACH IRL Press at Oxford University，Oxford，England，Agrawal(1996)ANTISENSE THERAPEUTICS Humana Press，NJ，以及其中引用的文献。
本发明进一步提供包含作为实质互补序列(也就是，包含补充至少约90％，优选至少约95％的序列)核酸序列的核酸，更优选的是任意的上述核酸序列的互补序列。这些补充的核酸序列可用于探针，制备本发明核酸序列，和作为反义核酸杂交到本发明的核酸。短的寡聚核酸序列包含互补核酸的序列，如，约15，20，30或50个基质(优选至少约12个基质)，在高度严格的条件下杂交到本发明所述的核酸的可作为探针(如，检测在特异细胞或组织中是否存在本发明的核酸和/或方便本发明的核酸的纯化)。包含互补序列的多核苷酸可作为引物来扩增本发明的核酸。
本发明进一步提供包含编码选自SEQ ID NOS：1-49和153-155的多肽的独特次序列的序列的本发明的核酸的片段，这些独特序列相对于SEQ IDNOS：338-341任何之一而言。也提供包含编码选自SEQ ID NOS：65-166的多肽的独特次序列的序列的本发明的核酸的片段，这些独特序列相对于SEQID NO：149-152而言。同时提供包含编码选自SEQ ID NO：139-148，236-253，343，345多肽的独特次序列的序列的本发明的核酸的片段，这些独特序列相对于SEQ ID NO：227-230而言。
本发明同时提供包含至少约300个核酸的独特序列的本发明的核酸的片段，优选至少约400个，更优选至少约600个，希望的是至少约900个，更优选的是至少约1200个来自选自任何SEQ ID NO：285-330序列的核酸，作为比较的是选自SEQ ID NO：338-341的野生型病毒tE多肽编码序列和类似的已知登革病毒截断E多肽编码核酸序列，包含在GenBank中可获得的序列，更优选的是，与任意已知的野生型黄病毒截断E多肽编码核酸序列比较。给药时，这些片断诱导机体产生抵抗至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，其中可以用于在机体和其细胞中诱导抵抗至少一种登革病毒的免疫应答的方法(如，对抗至少一种登革病毒血清型的中和Ab反应)。
另一方面，本发明提供包含至少约300个核酸的单一序列的核酸片段，优选至少约400个，更优选至少约600个，希望的是至少约900个，更优选的是至少约1200个选自SEQ ID NO：156-200和235序列的核酸，作为比较的是选自SEQ ID NO：149-152的野生型登革病毒PRM15/tE-多肽编码序列和类似的已知登革病毒PRM15/tE多肽编码核酸序列，包含在GenBank中可获得的，更优选的是，与任意已知的野生型黄病毒PRM15/tE-多肽编码序列比较。给药时，这些片断诱导机体产生抵抗至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，其中可以用于在机体或机体细胞群体中诱导抵抗至少一种登革病毒d的免疫应答的方法(如，抵抗至少一种登革病毒血清型的中和Ab反应)。
另一方面，本发明提供一种包含至少约300个核酸的核酸单一序列的片断，优选至少约400个，更优选至少约600个，希望的是至少约900个，和更希望的是约1200个选自SEQ 1D NO：201-210，211-218，254-271，342，和344任何之一的核苷酸，作为比较的是，选自SEQ ID NO：227-230的任何之一的非密码子优化WT C15/全长prM/全长E-多肽编码序列和已知的登革病毒C15/全长prM/全长E序列多肽编码的核酸序列，包括在GenBank中可以获得的，和更加优选与任何已知的野生型黄病毒C15/全长prM/全长E-多肽编码序列比较。这些片断在机体或其细胞群体中诱导对于至少一种血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，并且可用于其中包括在该机体或细胞诱导产生对于至少一种血清型的至少一种登革病毒免疫应答的方法(如抵抗一种或多种血清型的中和Ab反应)。
本发明也提供一种选择性结合到至少一种SEQ ID NO：285-330的核酸或其互补序列。作为比较的是，选自SEQ ID NO：338-341野生型的登革病毒tE多肽编码序列和已知的登革病毒截断E多肽编码核酸序列，包括在GenBank中可以获得的，更优选的，作为比较的是，任意已知的野生型黄病毒截断E多肽编码核酸序列，或其互补序列，用于应用。
本发明也提供选择性结合到至少一种SEQ ID NO：156-200，211-214，和235，或其互补序列的核酸，作为比较的是，野生型的选自SEQ ID NO：149-152的登革病毒PRM15/tE多肽编码序列或相似的已知登革病毒PRM15/tE多肽编码序列，包含在GenBnak中可获得的，更优选的，作为比较的是，已知的野生型的黄病毒PRM15/tE多肽编码核酸序列，或其互补序列可以应用。
本发明进一步包含选择性杂交到至少一种SEQ ID NO：201-210，215-218，254-271，342，和344的核酸，或其互补序列，作为比较的是选自SEQ ID NO：227-230的无密码子优化野生型登革病毒C15/全长prM/全长E-多肽编码序列和已知登革病毒C15/全长prM/全长E多肽编码核酸序列，包括GenBank中可后代的，更优选的，作为比较的是任何已知的野生型黄病毒C15/全长prM/全长E多肽编码的核酸序列。
本发明进一步提供由裂解本发明的核酸获得的组合物和/或核酸，该核酸可以由机械的，化学的，或酶学的裂解方法来分裂。核酸的分裂技术是本领域已知的。酶学裂解方法的分裂，优选核酸内切酶，核酸外切酶，核糖核酸酶，或DNA酶(如，benzon核酸酶，如Benzonase_)消化核酸。组合物也包括由上述技术完成的多种核酸的分裂产物。
本发明能够进一步提供通过一种方法制备的组合物和/或核酸，该方法包括在三磷酸核酸(NTPs，优选dNTPs)和核酸聚合酶存在时培养本发明的核酸。典型的和优选的，该聚合酶是热稳定的聚合酶，如Taq聚合酶。
另一方面，本发明提供不同的本发明的核酸文库或集合和/或包含至少一种本发明的核酸的核酸文库。例如，本发明提供包含至少一种与至少一种选自SEQ ID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，and 344的多核苷酸序列本质同源(如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％，或94％，更优选至少大约95％(如约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)的核酸的核酸文库
另一方面，本发明也提供不相同的核酸文库，该核酸与至少一种选自选自SEQ ID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，和344的序列具有实质的同一性(如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％，或94％，更优选至少大约95％(如至少大约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)。例如，在任何情况下，该文库都是由前面所述的递归序列重组序列获得的文库。
因此，例如，本发明提供一种包含通过一种方法获得的核酸文库的组合物，该方法包含重组至少包含选自SEQ ID NO：211-214和/或215-218序列的第一核酸和至少第二核酸，其中第一核酸和第二核酸在两个或更多核酸中互不相同，来制备重组的或合成的核酸的文库。本发明也提供采用本发明的任意核酸通过类似重组反应来制备的核酸。
本发明也提供包含将至少一种本发明的核酸序列通过递归序列重组到至少一种其它核酸上的重组方法。不管该基因文库或基因集合是如何制备的，该基因文库或集合可以包含任何适当数量的核酸种类。例如，该文库可以包含至少大约2，5，10，50或更多本发明的不相同的核酸。该文库可以被插入一种或多种细胞中，如，通过文库转染技术。这样的一种细胞群体也被包括。
本发明也提供一种包含该文库的组合物。例如，如上面所述的核酸文库可用于基因表达的诊断(如，通过本领域熟知的“基因芯片”技术)。该文库可以进行表达，杂交，或其它任何用于任何适宜的诊断目的的检验的形式。
本发明也提供一种制备修饰核酸的方法，包括突变本发明的核酸(如，选自SEQ ID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸)。本发明进一步提供一种使用该方法制备的修饰核酸。突变本发明的核酸的方法将在别处描述。
本发明的多核苷酸可以用适体的形式(被描述在如，Famμlok andMayer-http：//www.chemie.uni-bonn.de/oc/ak-fa/publications/CTMI-paper.pdf)，能够与适合的靶点结合。本发明的核酸也可用于形成三联的抑制核酸。该核酸也可连接到DNA结合功能域上，使不期望的基因的表达沉默(如，作为基因诱饵)。
本发明同时提供本发明的多肽的蛋白质模拟物。肽模拟物的描述可见，如US5,668,110和其引用的参考文献。此外，融合蛋白可以通过在融合蛋白的一个或多个氨基酸的侧链添加保护基来进行修饰。这些保护基可以促进融合肽传送通过膜，如果需要或通过特定组织，例如，通过降低肽的亲水性和增加肽的亲脂性。适宜的保护基例子包括酯保护基，胺保护基，酰基保护基和羧酸保护基，都是本领域已知的(见，如US6,121,236)。本发明的合成溶解蛋白可以采用任何形式。例如，融合蛋白可以从其天然构象进行结构修饰来形成环肽或其它结构修饰肽。本发明的多肽也可被连接到一种或多种非蛋白质高分子材料上，典型的是亲水性合成高分子，如，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧乙烯，这被描述在如US4,179,337，4,301,144，4,496,689，4,640,835，4,670,417，和4,791,192，或类似的高分子材料，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如上面讨论的，多肽可以经过常规蛋白质修饰，例如羧化作用，糖基化作用，羟化作用，油脂或油脂衍生化，甲基化作用，十四烷基化，磷酸化作用和硫酸化。其它翻译后修饰包括乙酰化作用，酰化作用，ADP-核糖基化作用，黄素共价结合，亚铁血红素共价结合，核酸或衍生物共价结合，磷脂酰肌醇共价结合，交联，成环作用，二硫键形成作用，脱甲基作用，甲酰化作用，糖基磷脂酰肌醇锚，碘化作用，氧化作用，蛋白酶解加工，异戊烯化，消旋作用，硒化，精胺酰化，和遍在蛋白化作用。其它常见的蛋白质修饰可见于，如，Creighton，Seifteretal.(1990)MethEnzymol 18：626-646，和Rattan等(1992)Ann NY Acad Sci 663：48-62。这类修饰通常是本发明的重组多肽(可选择的，这些修饰可以综合地实行)翻译后修饰的结果。从宿主细胞中的核酸表达的多肽的翻译后修饰根据表达多肽的宿主或宿主细胞类型而变化。例如，与哺乳动物细胞系统相比，糖基化作用在细菌如大肠杆菌通常不发生，而在杆状病毒体系中显著变化。相应的，如果需要糖基化作用，多肽应当在糖基化宿主中表达(产生)，一般为真核细胞(如哺乳动物细胞或昆虫细胞)。另外的和特别优选的蛋白质修饰将在别处讨论。多肽的修饰可以由任何适宜技术来验证，包括，如X射线衍射，磁共振成像，质谱法，和/或色谱仪(如，反相色谱法，亲和色谱法，或气-液色谱法)。
多肽也可含有或选择性含有适宜量的非天然氨基酸(如P氨基酸)和/或可选择氨基酸(如硒代半胱氨酸)，或氨基酸类似物，如列于Manual of PatentExamining Procedure 2422(7th Revision-2000)上的物质，其可通过蛋白合成被结合，如固相蛋白合成(如，Merrifield(1969)Adv Enzvmol 32：221-296和其它文献)。
近年来，包括蛋白酶传染因子决定域的融合蛋白的制备方法也被用于制备可非孟德尔式遗传到后代细胞的蛋白质载体(见如，Li等，J.Mol.Biol.，301(3)，567-73(2000))。在包含免疫抗原氨基酸序列的融合蛋白中包含这种蛋白酶传染因子决定序列，理想地提供了包含不需要改变宿主基因组的融合蛋白的可遗传蛋白载体。
本发明同时提供包含长度至少为约45个氨基酸的氨基酸序列的多肽，优选长度为至少约55个氨基酸，更优选的是至少约80个氨基酸，对应于任意的SEQ ID NO：139-148，236-253，343，和345的多肽片段，与由SEQ IDNO：215-217编码的多肽和已知的登革病毒C15/全长prM/全长E多肽相比较，上述的氨基酸序列是唯一的。另外，本发明提供包含长度为至少约45个氨基酸的，氨基酸序列的多肽，优选长度为至少约55个氨基酸，更优选的是至少约80个氨基酸的氨基酸序列的多肽，对应于任意的SEQ ID NO：156-200和235的多肽片段，与由SEQ ID NOS：211-214编码的多肽和已知的登革病毒PRM15/tE多肽相比较，上述的氨基酸序列是唯一的
另外，本发明也提供被多克隆抗血清特异结合的多肽，该血清在抵抗至少一种抗原，至少一种包含选自SEQ ID NO：1-49和153-155的氨基酸序列，或其抗原性或免疫原性片段中产生，其中，所述抗原性或免疫原性多肽片段诱导机体产生抵抗至少一种病毒血清型的至少一种登革病毒的免疫应答，该免疫反应与由至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗原性或免疫原性片段诱导的哺乳动物细胞中的免疫应答相当或更大；其中多克隆抗血清去除了至少一种(1)选自SEQ ID NO：338-341的截断被膜蛋白和(2)包含已知登革病毒截断E多肽的氨基酸序列片段的截断被膜蛋白，其中，所述的氨基酸序列片段与任意的SEQ ID NO：338-341截断的E蛋白具有长度本质相同(如，至少有大约75％，80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％97％，98％，99％，99.5％的序列同一性)。
本发明也包含与多肽特异结合的抗体或抗血清，该多肽包含选自SEQID NO：1-49和153-155的氨基酸序列，其中抗体或抗血清不与包含SEQ IDNO：338-341的多肽和已知的登革病毒截断E蛋白的一种或多种的多肽特异结合。
进一步提供一种被抵抗对抗至少一种抗原时产生的多克隆抗血清特异结合的重组或合成多肽，该抗原包括选自SEQ ID NO：65-116的氨基酸序列或其片段，其中抗血清扣除由SEQ ID NO：149-152编码的多肽和已知的登革病毒PRM15/tE多肽。
进一步提供被抵抗至少一种抗原时产生的多克隆抗血清特异结合的重组或合成多肽，该抗原包括选自SEQ ID NO：139-148，236-253，343，和345的氨基酸序列或其片段，同时，该抗血清扣除由SEQ ID NO：227-230编码的多肽和已知的登革病毒C15/全长prM/全长E多肽中。
一般而言，本发明的多肽提供可被如免疫测定法确定的结构特征。包括至少一种与本发明的多肽特异结合的(对于至少一种抗原的)抗体的抗血清的制备物，以及被该抗血清结合的多肽是本发明的一个特点。包括所述抗体的结合剂可以结合本发明的登革病毒抗原多肽和/或其片段，其亲和力为大约1×102M-1到大约1×1010M-1(即，大约1×10-2-1×10-10M)或更多；包括大约104到106M-1，大约106到107M-1，或大约108M-1到109M-1或1010M-1。传统杂交瘤技术可用于制备亲和力高达大约109M-1的抗体。然而，新技术，包括噬菌体展示和转基因鼠可用于达到更高的亲和力(如，高达至少大约1012M-1)。一般的，更高的亲和力是有益的。
为了制备用于免疫测定法中的抗血清时，至少一种本发明的免疫多肽(或编码多肽的多核苷酸)以上述的方法制备和纯化。例如，重组多肽可以在哺乳动物细胞系中制备。可选择的，近交系小鼠可用免疫蛋白结合标准佐剂免疫，例如弗氏佐剂或铝，和标准小鼠免疫方法(见Harlow和Lane，同上文，可用于抗体产生，免疫测定形式和可用于决定特异免疫反应性的条件的标准说明)。可选择的，得自至少一种本文所述的多肽或由多核苷酸序列表达的至少一种合成或重组多肽可与载体蛋白连接，作为制备抗血清的免疫原。多克隆抗血清在免疫测定中收集和滴定抵抗免疫多肽的浓度，例如，包含固化在固体载体中的一种或多种免疫蛋白的固相免疫测定法。上述方法中，制备出了新的抗体和抗血清。用效价为106或更高的多肽(或多核苷酸和/或载体)给药产生的抗血清通常被选择、收集，并扣除对照共刺激的多肽，制备已扣除了的、收集的、滴定的多克隆抗血清。
抗体的交叉反应能力可以使用标准的方法来测定，比如竞争性结合免疫测定，和/或平行结合试验，用于确定交叉反应能力的百分比的的标准计算。通常地，当试验多肽的交叉反应的百分比至少为5-10x时，该试验多肽被认为特异地结合收集的扣除的抗血清和抗体。
由免疫抗原产生或引起的抗血清可以与相关抗原结合(如交叉反应)。在这种情况下，交叉反应的抗原包含相同或本质等同的抗原表位或包含外形足够相似来结合抗体的表位。
本发明同时提供多核苷酸共有序列，其得自本文描述的两种或多种的多核苷酸序列的比较(如，从两种或多种选自SEQ ID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，和344的序列的比较中获得的共有序列)。优选的，核酸提供一种非自然产生或重组多核苷酸，其包含从得自这种共有序列核酸中选择的序列。本发明也提供多核苷酸共有序列，得自至少两种本发明的多核苷酸的相似分析(如任意选自SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的两种氨基酸的比较)。本发明进一步提供包含根据由共有序列分析得到的序列模式(方式)的序列的多肽。这些方式的例子在本文被描述，例如由多肽的标准比对得到。
本发明也提供包含与本文特定公开的序列之一具有本质的局部序列同一性的序列的多肽和/或多核苷酸，不同于总体/全部序列同一性(这里首先讨论的)。局部序列同一性可以使用局部序列排列软件确定，如，上述的BLAST程序，LFASTA程序，或更优选的LALIGN程序。优选的，使用BLOSUM50矩阵分析的LALIGN程序可用于氨基酸序列分析，+5匹配/-4错配分析可用于多核苷酸序列分析。缺口伸展(Gap extension)和开口罚分(openingpenalties)优选与上述采用LALIGN的分析相同。在使用k-tup值设定(又称“k-tuple”或ktup值)的LAGIGN(或其它程序)分析中，优选ktup值设定为蛋白质0-3和核酸序列0-10(如约6)。一方面本发明提供如一种多核苷酸的序列，其包括与本发明的核酸的免疫抗原氨基酸编码部分在超过至少约300，优选至少约450，更优选至少约600，优选至少约900和更优选的为至少约1200核酸序列上具有本质部分同源(也就是本质同一性序列的百分比相似)(如，有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，更优选的至少约95％(如，约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％序列同一性)。尽管其由于缺口罚分和/或分析序列长度的差别，导致缺乏本质的同一性。类似的，本发明提供包含至少约10个氨基酸序列的多肽，优选至少约20个，更优选至少约50个，有利地至少约100个，更有利的至少约200个，或多种(如，至少大约300，350，或375)氨基酸残基，其与重组多肽的免疫抗原氨基酸序列(如，重组tE序列，全长E序列，PRM15/tE序列，C15/全长prM/tE序列，C15/全长prM/全长E序列)具有本质局部同一性。
虽然不必要，希望本发明的重组多肽和野生型登革病毒多肽，或至少与重组多肽长度相似片断具有一级的，二级的和/或三级的结构相似性。例如，重组的tE，全长E，PRM15/tE，C15/全长prM/tE，或C15/全长prM/全长E多肽可分别与野生型登革病毒病病毒tE，全长E，PRM15/tE，C15/全长prM/tE，或C15/全长prM/全长E多肽具有一级，一级和/或三级的结构相似性。结构相似性可以由任何适宜技术确定，优选使用适宜的软件程序进行评价。这些程序的例子包括MAPS程序和TOP程序(如，Lu，Protein DataBank QuarterlyNewsletter，&num；78，10-11(1996)，和Lu，J.Appl.Cryst.，33，176-183(2000))。多肽和/或prM/E蛋白质显示拓扑学多样性(如，局部差异少于大约20，优选少于15，更优选少于10)，或两者的组合。然而，具有高度结构差异多肽是适宜的和甚至是优选的。这些不同的功能性的肽可以由上述的递归序列重组技术得到。可选择的，蛋白质的结构可以由PROCHECK程序比较(见，如Laskowski，J.Appl.Cryst.，26，283-291(1993))，MODELLER程序，或具有上述特征的商业可用的程序。可选择的，结构预测可以由使用如PredictProteinserver程序(得自http：//dodo.cpmc.columbia.Edu/predictprotein/)的序列比较方法进行比较。可用于确定结构相似性的蛋白结构分析的其它技术可见于，如Yang和Honig，J.Mol.Biol.，301(3p，665-78(2000)，Aronson等，Protein Sci.，3(10)，1706-11(1994)，Marti-Remon等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，29，291-325(2000)，Halaby等，Protein Eng，12(7)，563-71(1999)，Basham，Science，283，1132(1999)，Johnston等，Crit.Rev.Biochem MolW Biol.，2961，1-68(1994)，Moμlt，Curr.Opin.Biotechnol.，10(6)，583-6(1999)，Benner等，Science，274，1448-49(1996)，和Benner等，Science，273，426-8(1996)，以及国际专利申请WO00/45334。
本发明的试剂盒任意包括至少以下一种：(1)上述的装置，系统，系统组件，或装置组件；(2)至少一种试剂盒组分，其包含至少一种本发明的多肽，多核苷酸(或两者的片段)，载体，抗体，和/或细胞；一种或多种包含至少一种本发明的多肽，多核苷酸载体和/或抗体的细胞；一种表达本发明的多肽的细胞；组合物，药学组合物，或疫苗组合物(适合作为哺乳动物疫苗的组合物)，包含至少一种上述任意的至少一种发明物(如，多肽，多核苷酸，载体，抗体，和/或细胞)或它们的任何组合；(3)执行任何所述方法的说明书，包括诱导免疫应答的方法，免疫方法，检测或诊断生物样本中至少一种血清型的至少一种登革病毒的抗体的存在的方法，治疗或预防方法，使用任意在(2)中指出的组分或疫苗或任意这种组分的组合物的说明书；和/或操作上述任何装置，系统或组件的说明书；(4)装载上述至少一种组分或组合物的容器和(5)包装材料。进一步的，本发明提供使用上述任意装置，组分，组合物，或试剂盒执行上述方法或测定，和/或使用任意装置，组分，组合物，或试剂盒执行上述方法或测定。
本发明提供电脑，电脑可读介质，和包含多肽和核苷酸序列信息字符串的集成系统，包括，如，本文所列举的序列和各种沉默取代和保守取代。本领域已知的各种方法和遗传算法(GAs)可用于检测不同字符串的同源性或相似性，或用于执行其它希望的函数到控制输出命令，提供包括序列或相似物的信息的扫描图像的基质。实例包括上述的BLAST。
各种严紧性和长度的不同连续的同源性和相似性可以在本文的集成系统中检测和确定。如，许多同源性的测定方法已经被设计来比较分析生物多聚体序列，文字处理的拼写检查，和不同数据库的数据检索。基于天然多核苷酸中的4种基本核碱基的双螺旋配对互补作用，模拟互补同源多核酸链的退火的模型可作为尤其是对应于所述序列的字符串进行的序列对比或其它操作应用(如，文字处理操作，包含序列或次序列字符串的图形构造，输出表等)。具有用于计算序列相似性的GAs的软件包的例子是BLAST，其可通过输入对应于该序列的字符串来应用于本发明。
相似地，标准的桌面应用软件如文字处理软件(如Microsoft Word或Corel WordPerfect)和数据库软件(如表格程序，如Microsoft Excel，CorelQuattro Pro或数据库程序如Microsoft Access或Paradoxm))可以通过输入相应于本发明的多肽或多核苷酸或两者，或两者的片段的字符串适用于本发明。例如，集成系统可以包括含有合适的字符串信息，如结合用户界面(如，标准操作系统的用户界面，如Windows，Macintosh或LINUX系统)来处理字符串。专门的排列程序如BLAST也可合并进该系统用于核酸或蛋白质(或相应的字符串)的排列。
在本发明中用于分析的集成系统任意包括具有用于排列序列的GA软件的数码电脑，另外还有进入包含上述任何序列的软件系统的数据集。电脑可以是，如一台PC(Intel x86或Pentium chip-compatible DOS，OS2TMWINDOWSTM WINDOWS NTTM，WINDOWS95TM，WINDOWS98LINUX基础的机器，一台MACINTOSHTM，Power PC，或UNIX(e.g.，SUNTM工作站)基础的机器)或其它该领域已知的商业通用的电脑。用于排列或处理序列的软件是可获得的，或很容易由技术人员采用标准程序语言，如Visualbasic，Fortran，Basic，Java，或其它相似的语言编写。
控制器或电脑任意地包括监视器，其一般是阴极射线管显示器(“CRT”)，平板显示器(如，活性液晶显示器，液晶显示器)或其它。电脑电路一般放置在包含在集成电路片的机箱里，如微处理器，内存，接口电路，和其它装置。机箱里也任意有硬盘驱动器，软磁盘驱动器，高容量可移动的驱动器，如可写入CD-ROM，和其它常见的周边设备。输入设备，如键盘或鼠标也任意提供给用户输入和用于用户选择比较序列或相关的电脑系统的其它操作。
电脑可以包括适当的软件以用户输出到系统参数的方式来接收用户的指令，如图形用户接口(GUI)，或以预编程序指令的方式，如，预编的多种不同的特别操作。然后软件把这些指令转换成适当的语言，来指令流体方向的操作和传输到控制器，来执行所需的操作。该软件也包括输出元件，来控制核酸合成物(如以序列或序列比对为基础)，或发生在比对后的其它操作，或利用与序列相当的字符串完成的其它操作
在本发明的这种实施方案的的特别方面，本发明提供一种电脑或电脑可读介质，其包含序列记录的数据库，该序列记录包含一种或多种与选自SEQ ID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸，或选自SEQID NO：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的多肽序列的字符串。
本发明也提供一种包含有序列记录的数据库的电脑或电脑可读介质的集成系统，每个序列记录包含至少一个对应于选自SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345的核酸或蛋白序列的字符串，该集成系统进一步允许用户观看一种或多种序列记录的用户输入界面。对于这种集成系统，电脑或电脑可读介质包含比对指令系统，其将字符串与至少一个对应于核酸或蛋白质序列的其它字符串比对。该指令系统包括一个或多个：局部同源性比较测定，同源性比对测定，确定相似性的检索和BLAST确定。这些系统也包含用户可读的输出元件，可显示比对指令系统产生的比对。一方面，电脑或电脑可读介质进一步包含把至少一个选自SEQID NO：156-218，235，254-271，285-330，342，和344的核酸序列翻译为氨基酸序列的指令系统。另一方面，电脑和电脑可读介质进一步包含把至少一个选自SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-155，236-253，343，和345的核酸序列逆向翻译为氨基酸序列的指令系统。在一些系统中，指令系统选择由提供密码子选择系统或与测试核酸序列同一性的决定序列来选择核酸。
同时提供使用电脑系统保存信息的方法，该信息与数据库中储存的大量序列纪录中的至少一个相关，所述的序列纪录每个都包含相应于SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345中的至少一个或多个字符串。该方法包括确定相应于一种或多种上面所述的SEQ IDNOS或其亚序列的字符串列表；确定该列表中的一个和多个字符串被用户选定；显示被选择的字符串，或将该被选择的字符串与其它字符串比对。这些方法包含显示被选择的字符串与其它字符串的比对和/或显示列表。
进一步的，本发明提供一种产生和/或选择多肽变异体的方法，包含采用对应于SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345的字符串，优选结合其它生物学功能信息(如，抵抗一种或多种登革病毒血清型的中和抗体效价)进行计算，优选使用电脑介质来提供便利，其分析结果产生一种或多种氨基酸序列，序列特征的图形，序列变化(突变)，和/或显示有相似或生物学性质改善的多肽的结构。这种方法可以包括将字符串用于任何适宜的本领域已知的遗传建模或计算中，包括，如，统计分析技术，Markov建模，主成分分析，神经网络分析，随机重组建模方法，和物理重组方法。这些技术的例子可见于，如，国际专利申请WO01/83559，WO99/49893，和WO 01/61344，和U.S.6,269,312。另外的技术和原理可见于如国际专利申请WO00/42561，WO 01/51663，和WO01/90197以及Norton等，Virus Res 55(1)：37-48(1998)，，Rappuoli，Curr Opin Microbiol 3(5)：445-450(2000)，Petersen等，Scand J.Immunol 53(4)：357-364(2001)，和NakaiJ.StructBiol 134(2-3)：103-116(2001)。具有利用与SEQ ID NO：1-49，65-116，139-148，153-218，235-253，254-271，285-330，342-345相当的字符串的计算机模拟建模产生的非野生型序列的氨基酸和核酸序列是本发明的一个特点。
除非另有说明或有上下文可以清楚地反驳，本发明所述的多肽，多核苷酸，载体，细胞，组合物和方法的特征可以由任何适当的方式结合。
本发明所述的任何分子，包括核酸，多肽，蛋白质，融合蛋白，或任何载体，细胞或包含上述组分的组合物都可被用于任何所述本发明的方法和应用中。一方面，本发明提供任意这类分子，包括核酸，多肽，蛋白质，缩氨酸，或融合蛋白，或任意载体，细胞，或包含所述的任意分子的组合物的用途，作为药剂，药物，治疗剂或预防剂，或疫苗来治疗或预防疾病或紊乱，包括那些本文所述的疾病或紊乱(如与登革病毒感染相关的)或相似病症。另外一方面，本发明提供任意分子(如，核酸，多肽，蛋白质，融合蛋白质，或缩氨酸)或任何载体、细胞，或包含任何分子的组合物的用途，用于生产药剂，预防性的或治疗性的物质，药物，或疫苗，它们用于任何可应用于治疗或预防疾病和紊乱包括此处所描述的(例如，那些与登革病毒感染相关的)的治疗性或预防性的方法中。
实施例
下述实施例更进一步的举例说明本发明，但是无论如何不被理解为限定保护范围。
实施例1
本实施例举例说明制备和确定新型核酸，其编码重组、合成或者突变的登革病毒抗原，包含这种登革病毒抗原的多肽，转运这种核酸到哺乳动物细胞的典型DNA载体的构建，通过用这种载体转染哺乳动物细胞以表达这种核酸，使得编码的登革抗原高水平的表达和分泌。
A.编码新型登革抗原的核苷酸序列的合成
分析四种WT DEN-1，DEN-2，DEN-3，DEN-4病毒中每一种的多种蛋白的氨基酸序列以确定四种WT登革病毒血清型中的每一种的聚蛋白的下述区域：(1)相当于prM蛋白的C端15个氨基酸的登革聚蛋白序列的氨基酸片段或片断(“PRM15”)，所述的prM蛋白的15个氨基酸片段用于作为登革包膜蛋白(E蛋白)的信号序列；(2)包含登革病毒聚蛋白序列的全长E蛋白序列的绝大部分的氨基酸，即不包含对应于E蛋白序列的C端区域的大约5％到约12％氨基酸残基，其编码部分疏水性区域)。因此，氨基酸序列从四种WT登革病毒血清型中的每一种的聚蛋白序列中被确定；每一个这种氨基酸序列包括包含prM蛋白的C端15个氨基酸残基(例如，M蛋白的15个氨基酸残基)和大约90％-95％的E蛋白的N端氨基酸残基的融合蛋白(因此，称为“截短的”E蛋白)。见图14。这些从每个野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4聚蛋白中确定的氨基酸序列分别被称为Den-1PRM15/trunc E(或者Den-1PRM15/tE)(SEQ ID NO：149)，Den-2PRM15/trunc E(或者Den-2PRM15/tE)(SEQ ID NO：150)，Den-3PRM15/trunc E(或者Den-3PRM15/tE)(SEQ ID NO：151)，Den-4PRM15/trunk E(或者Den-4PRM15/tE)(SEQ ID NO：152)登革抗原融合蛋白，这些序列被共同称为“截短的”亲本多肽。这些融合蛋白可以通过质粒载体的表达制得，例如大肠杆菌载体，病毒载体，杆状病毒载体，或其它质粒载体，并且通过本领域公知的和这里所描述的标准技术在昆虫细胞，大肠杆菌细胞，或者哺乳动物培养物中制备得到。此外，蛋白可通过由本领域公知的和本文前面所提及的标准蛋白合成技术制得的蛋白片段或肽片段组装而成。
这四种被确定的氨基酸序列中的每一种被反翻译回核苷酸序列，通过标准的人类密码子频率表(http：//www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？Species＝Homo+sapiens+[gbpri])，获得人类密码子优化DNA序列。
对四种登革病毒血清型中的每一种，用标准技术合成包含每种被确定的人类密码子优化PRM15和截短的E融合蛋白编码序列的重叠部分的DNA寡核苷酸。对四种登革病毒血清型中的每一种而言，共同构成PRM15/E截短的蛋白的编码序列的重叠的寡核苷酸部分可以进行杂交。对应优化密码子序列的DNA序列可以用被杂交的寡聚部分为模板通过标准PCR基因合成制得。对于每种PCR基因合成反应而言，采用含有与PRM15序列重叠的核苷酸序列，附加的BamHI位点和5’-ACC-3’Kozak共有序列(Cell15：1109-23(1978))的5’正向引物，以及包含与截短的E基因重叠的核苷酸序列和EcoRI限制位点的3’反向引物，使得这些位点和共有序列被加入到生成的编码PRM15/截短的E编码PCR产物中。生成的人类密码子优化的PRM15/截短的E编码DNA序列分别被称为Den-1PRM15/truncE CO(或者Den-1PRM15/tE CO)(SEQ ID NO：211)，Den-2PRM15/trunc E CO(或者Den-2PRM15/tE CO)(SEQ ID NO：212)，Den-3PRM15/trunc E CO(或者Den-3PRM15/tE CO)(SEQ ID NO：213)和Den-4PRM15/trunk E CO(或者Den-4PRM15/tE CO)(SEQ ID NO：214)，“PRM15”表示包含编码prM的C端的15个氨基酸的信号核苷酸序列(即PRM15)和一般地附加甲硫氨酸残基(在15个氨基酸序列之前的第一个氨基酸残基)，“trunc”E或者“tE”表示编码了截短的E蛋白的核苷酸序列，而“CO”表示优化密码子。相同的是，它们都被用做这里所描述的递归序列重组方法中的亲本核酸，所以这些核苷酸序列被称为截短的亲本核苷酸序列。
用相似的程序确定和制备多肽序列，其包括具体的WT登革病毒血清型(例如，Den-1，Den-2，Den-3，Den-4)聚蛋白的衣壳蛋白(C蛋白)的15个氨基酸残基，对应上述WT登革病毒聚蛋白的全长prM蛋白的氨基酸序列，以及对应上述WT登革病毒聚蛋白的全长的E蛋白的氨基酸序列。所述步骤是通过采用四种WT登革病毒聚蛋白的每一种来实施的，合成的多肽序列分别被称为Den-1 C15/全长prM/全长E(或者Den-1 C15/prM/E)(SEQ IDNO：227)，Den-2 C15/全长prM/全长E(或者Den-2 C15/prM/E)(SEQ IDNO：228)，Den-3 C15/全长prM/全长E(或者Den-3 C15/prM/E)(SEQ IDNO：229)，Den-4 C15/全长prM/全长E(或者Den-4 C15/prM/E)(SEQ IDNO：230)登革抗原融合蛋白。
编码这四种登革抗原融合蛋白中每一种的人类密码子优化序列是如前面所描述那样确定与制得的，合成的核苷酸序列分别被称为Den-1 C15/全长prM/全长E CO(或者Den-1 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO：231)，Den-2 C15/全长prM/全长E CO(或者Den-2 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO：232)，Den-3 C15/全长prM/全长E CO(或者Den-3 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO：233)，Den-4C15/全长prM/全长E CO(或者Den-4 C15/prM/E CO)(SEQ ID NO：234)登革抗原核苷酸序列。
B、pMax Vax10.1的构建
典型的哺乳动物表达载体被称为“pMax Vax10.1”(见图1)，其除其它物质外还包含：(1)启动哺乳动物细胞中的转基因(或其它核苷酸序列)表达的启动子(包括但不限制于，例如，CMV启动子或其变体，和被改组的、合成的，或者重组的启动子，包括在国际公开号为WO02/00897的PCT申请中所描述的那些；(2)用于克隆一个或多个转基因(或者其它核苷酸序列)的多聚接头；(3)聚腺苷酸信号(例如，polyA序列)；以及(4)在E.coli中用于扩增的原核复制起点和抗生素抗性基因。载体的构建在这里简要地描述，尽管个别的合适的可供选择的技术可以用于生产这种DNA载体(例如，应用本文别处所描述的原理)。
在一个实施方案中，最小质粒Col/Kana包含复制起点ColE1和卡那霉素抗性基因(Kana’)。复制起点ColE1(ori)介导高拷贝数量的质粒扩增。
在一个实施方案中，ColE1 ori通过应用标准PCR技术从PUC19载体(New England Biolabs，Inc.)中分离。将ColE1起点与Kana’基因连接，将NgoMIV(或者“NgoMI”)和DraIII识别序列分别加入到5’和3’PCR引物中。NgoMIV和DraIII在pMax Vax10.1中是独有的克隆位点。接下来克隆哺乳动物转录单元，所设计的5’正向引物中还包含在NgoMIV位点下游的附加限制位点Nhel和3’反向引物DraIII位点上游的EcoRV和BsrGI克隆位点。所有的引物均包含附加6-8个碱基对的突出端用于优化限制酶切消化。特定地，5’正向引物的序列(“pMax Vax引物1”)为acacatagcgccggcgctagctgagcaaaaggccagcaaaaggcca(SEQ ID NO：331)，3’反向引物(“pMax Vax引物2”)的序列为aactctgtgagacaacagtcataaatgtacagatatcagaccaagtttactcatatatac(SEQ ID NO：332)。
一般而言，ColE1 PCR反应是在生产厂商推荐的相同的条件下用校对聚合酶执行，例如Tth(PE Applied Biosystem)，Pfu，Pfu Turbo以及Herculase(Stratagene)或者Pwo(Roche)。作为说明，一般的Herculase聚合酶PCR反应每50μl的反应中含有1μl模板质粒DNA(1-10ng/μl)，5μl 10x缓冲液，1μl的各种10mM dNTPs(脱氧核苷三磷酸盐)，1μl正向引物(20μM)，1μl反向引物(20μM)，40μl去离子的无菌水以及0.5μl Herculase聚合酶。所述PCR反应每个循环在94℃时反应30秒，在55℃时反应30秒，以及在72℃时反应30秒，总共25个循环。
所得ColE1 PCR产物在使用Phase lock GelTMTube(Eppendorf)通过苯酚/氯仿纯化后，进行标准乙醇沉淀。纯化的ColE1 PCR产物按照生产商的推荐用限制酶NgoMIV和DraIII(New England Biolabs，Inc.)消化和按照生产商的介绍用QiaEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。
在这个实施方案中，卡那霉素抗性基因(转座子Tn903)通过标准PCR技术从质粒pACYC 177(New England Biolabs，Inc.)上分离。特别地，包含与5’卡那霉素基因同源的序列和AscI位点上游的附加DraIII位点的5’PCR引物(“pMax Vax引物3”)，ggcttctcacagagtggcgcgccgtgtctcaaaatctct(SEQ IDNO：333)，和包含与3’卡那霉素基因同源的序列和NgoMIV克隆位点的3’引物(“pMax Vax引物4”)，ttgctcagctagcgccggcgccgtcccgtcaagtcagcgt(SEQ IDNO：334)被用于扩增PACYC177中的Kana’基因。PCR反应、产物纯化以及通过DraIII和NgoMIV的消化按照上文所描述的进行。能够得到Kana’PCR产物和ColE1 PCR产物大约各20ng，并在含有2μl 10x缓冲液和1U连接酶(Roche)中的20μl反应中进行连接。大肠杆菌的扩增是通过用上述Sambrook所描述的标准工艺程序来进行的。按照生产商的推荐，用QiaPrep-spinMiniprep kit(Qiagen)来纯化质粒，并通过BsrG1和DraIII消化来随后连接哺乳动物转录单元(启动子和polyA)。
在一种实施方式中，pMax Vax10.1载体包含通过标准PCR方法从CMV病毒Towne菌株的DNA分离的CMV立即早期增强子启动子(CMV IE)。克隆位点EcoRI和BamHI被插入到PCR的正向和反向引物中。被EcoRI和BamHI消化的CMV IE PCR片段通过克隆到PUC 19中，用于扩增。通过用BamHI和BsrG1限制消化，从扩增的PUC 19质粒中分离CMV启动子。BsrG1位点被定位在CMV启动子的5’末端下游168bp处，产生一个1596bp的片段，其通过标准凝胶纯化技术分离来用于随后的连接。
在一种实施方式中，一种牛生长激素(BGH)基因中的多腺苷酸信号被应用。其它的多腺苷酸信号(例如SV40PolyA序列)也可以被采用。在这个例子中，BGH核苷酸序列通过标准PCR技术从pCDNA3.1载体(Invitrogen)分离。简要地说，包含能够形成p.Max Vax10.1载体多聚接头部分的限制性酶PmeI和Bgl II的识别位点的5’正向引物(“pMax Vax引物5”)，agatctgtttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttc(SEQ ID NO：335)，以及包含被克隆到最小质粒的Col/Kana中的DraIII位点的3’反向引物(“pMax Vax引物6”)，acctctaaccactctgtgagaagccatagagcccaccgca(SEQ ID NO：336)，均通过标准技术制得，用于扩增BGH PolyA PCR产物。BGH PolyA PCR产物以1∶100被稀释。1μl被稀释的BGH PolyA PCR产物被用于作为第二次PCR扩增的模板，第二次PCR扩增是用同一种3’反向引物和与所述模板的5’末端重叠20bp并含有另一个40bp的包含BamHI、KpnI、XbaI、EcoRI和NotI限制位点的5’序列的另一种5’引物(“pMax Vax引物7”)，ggatccggtacctctagagaattcggcggccgcaga tctgtttaaaccgctga(SEQ ID NO：337)，以在p.Max Vax10.1载体的多聚接头中包含这些位点。
形成pMax Vax10.1的最后连接反应是在含有5μl 10x缓冲液和2U连接酶中(Roche)的50μl反应中通过大约各20ng每种BsrG1和BamHI消化的CMV IE PCR产物、BamHI和DraIII消化的多聚接头和BGH PolyA PCR产物以及DraIII和BsrG1消化的最小质粒Col/Kana而完成的。连接、扩增以及质粒的纯化是通过上文中所描述的那样完成的。质粒通过标准克隆技术被转染到大肠杆菌中。
C.pMax Vax10.1登革病毒抗原表达载体的构建
在一方面，BamHI和EcoRI消化和凝胶纯化的Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO核酸(上文中所描述的)分别被克隆到pMax Vax10.1载体中，通过采用标准技术用BamHI和EcoRI消化所述载体，凝胶纯化线性化载体，以及连接各自的登革抗原编码序列(各自在4种不同的连接反应中被连接到载体上，形成4种质粒载体构建体，每一种包含编码Den-1PRM15/tE，Den-2PRM15/tE，Den-3PRM15/tE或Den-4PRM15/tE融合蛋白抗原的密码子优化的核酸(见图2)。这些载体一般分别被命名为pMax Vax10.1Den-1PRM15/tE CO，pMaxVax10.1Den-2PRM15/tE CO，pMax Vax10.1Den-3PRM15/tE CO以及pMaxVax10.1Den-4PRM15/tE CO。图2显示了包含与Den-2PRM15/tE CO对应的核苷酸序列的典型的pMax Vax10.1表达载体。这些编码登革抗原融合蛋白的表达载体通过标准技术在大肠杆菌中繁殖从而为转染实验获得了大量的质粒。
相似的程序被用于构建pMax Vax10.1表达载体，所述载体包含上述每一种核苷酸序列：Den-1 C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：231)，Den-2C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：232)，Den-3 C15/全长prM/全长ECO(SEQ ID NO：233)，Den-4 C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：234)。
D.Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO的登革抗原表达和分泌的分析
由野生型登革病毒核酸(或其中的一部分或片段)编码的登革抗原一般很少被表达和分泌。为了评估由上述pMax Vax10.1表达载体所表达的登革抗原的表达和/或分泌，进行了下述实验。
大量的人类293-HEK细胞是通过标准条件下在组织培养中生长的，每一部分由包含上述核酸序列之一：Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO的pMax Vax10.1表达载体进行转染。转染是通过市场上能够买到的转染试剂，一般如Effectene(Qiagen)和FuGene(Boehringer/Roche)，按照厂商的说明(例如，关于用于转染的质粒的量)来执行的。每群被转染的293细胞均在允许转基因表达的条件下培养大约48-72小时。
被转染的293细胞培养物中每一种制备成两套样品。第一套样品通过收获每群被4种表达质粒中的一种转染的细胞的上层清液并通过标准方法浓缩10-20倍的体积(例如，用Ultrafree-4离心过滤器，Millipore，MA，离心)制得。蛋白分泌水平通过蛋白质印迹分析测定。在另一套样品中，得到每群被4种表达质粒中的一种转染的细胞，进行细胞溶解，收集得到的溶解产物并进行蛋白质印迹分析决定表达水平。
对于蛋白印迹分析，分别从细胞溶解产物和细胞上层清液中得到的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳各自分开，并印迹到硝化纤维素膜上，用厂商所描述的技术(分别为NuPageTM和Invitrogen)。在单一聚丙烯酰胺凝胶上，细胞溶解产物在一泳道进行电泳(记为“L”)，细胞上层清液在另一泳道上进行电泳(记为“SN”)(例如，p.Max Vax10.1Den-2PRM15/tE CO转染的细胞溶解产物和上层清液在单一凝胶上进行电泳)，来检测每种核酸。
多克隆的抗-DEN-1小鼠抗血清和抗-DEN-3小鼠抗血清从ATCC获得，多克隆的抗-DEN-4小鼠抗血清从WHO抗体保藏中心获得，单克隆抗-DEN-2抗体从美国Biological(Swampscott MA-USA)获得(多克隆抗-DEN-2小鼠抗血清在滤膜一直不能结合到变性的野生型DEN-2抗原上，因此，不被使用)。
滤膜与转染样品的核酸编码的登革抗体类型相应的登革病毒血清型特异的抗体进行培养(例如，抗-DEN-2 mAb被用于用p.Max Vax10.1Den-2PRM15/tE>转染细胞的溶解产物和上层清液印迹的滤膜)。抗体-抗原的培养在室温下进行1小时，用PBS缓冲液和0.01％的Tween 20冲洗滤膜5次25分钟，滤膜还更进一步的与第二种酶交联的(或为辣根过氧化酶(HRP)交联的或为碱性磷酸酶交联的)抗小鼠抗体培养。在室温下培养1个小时后，洗涤滤膜并且与酶底物培养以进行比色法检测。通过这个实验获得的蛋白质印迹在图3中显示。
图3中所示的蛋白质印迹证明了由Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tECO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO编码的抗原在被转染的293细胞中得到很好的表达。然而，只有包含Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE的pMax Vax10.1载体中表达的抗原从转染细胞中被分泌。相反地，由野生型登革病毒核苷酸序列表达的截短包膜抗原在哺乳动物细胞中极少被表达与分泌。
这些实验证明了包含Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO序列的核酸序列在转染细胞中能够达到高水平的登革抗原表达。此外，这些实验的结果证实选择本发明的核酸序列可以用于有效地表达作为分泌蛋白质的登革病毒抗原。
相似的方法被用于评估包含以下在上文中被描述的核苷酸序列：Den-1C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：231)，Den-2 C15/全长prM/全长ECO(SEQ ID NO：232)，Den-3 C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：233)以及Den-4 C15/全长prM/全长E CO(SEQ ID NO：234)的pMax Vax10.1表达载体的表达和/或分泌。
实施例2
本实施例举例说明产生编码重组登革抗原的核酸文库和从这些文库中筛选和选择以确定在哺乳动物中编码重组的登革抗原的重组核酸的方法。
重组核酸序列文库是通过采用纯化的Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO例如作为亲本的核苷酸序列，通过递归序列重组程序来产生。递归序列重组方法的实施是如前面所描述的，例如，Stemmer(1994)Nature 370：389-391以及Crameri，A等(1998)Nature 391：288-91，美国专利5,897,458以及其它在描述递归序列重组部分所引用的参考文献，其所有目的的全部内容均被引入作为参考。
简要地说，每种包含Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO或Den-4PRM15/tE CO核苷酸序列的pMaxVax 10.1表达载体通过与PRM15/tE CO核苷酸序列侧面相连接的限制性酶裂解，每种得到的核苷酸片断通过标准凝胶纯化方法分离，并进行递归序列重组。重组的核酸产物接下来通过位于5’BamHI和3’EcoRI克隆位点上游的拯救引物用PCR扩增，然后用BamHI和EcoRI消化，并用标准技术凝胶纯化。分离的重组的核酸按照生产厂商的说明被连接到pMaxVax 10.1载体(例如，如实施例1中所描述，形成重组DNA质粒载体的重组文库，其随后用标准文库转染技术(见上述Sambrook)被克隆到大肠杆菌中。
被转化的细胞放置过夜，收集个体菌落，质粒DNA通过标准纯化方法(Qiagen)获得。pMaxVax 10.1表达文库的质粒DNA按照生产厂商的说明用Superfect试剂被转染到培养中的HEK-293细胞中。几种这样生产的文库接下来用从小鼠腹水中获得的抗登革病毒抗体通过流式细胞术(荧光激活细胞分类器-FACS分析)分析登革抗原表达。
特别地，执行FACS分析，大约1×105被转染的293细胞用溶解在包含2％胎牛血清(FCS)的PBS缓冲液中的小鼠抗登革病毒抗体(如上文所述)混合物培养。优化抗体稀释度是通过根据每种抗体为基础逐一的评估。一般来讲，使用1∶500，1∶000和1∶2000的系列测试稀释。细胞在冰上染色30分钟并且在用适当的第二抗体培养前用PBS洗涤3次，抗体与荧光检测试剂结合(羊抗小鼠藻红蛋白结合，ClaTag Lab)。确定每种标记抗体产生最大的平均荧光强度(MFI)和最小的背景信号的染色浓度(例如，优选的染色浓度为每105细胞的浓度)。在冰上培养30分钟后，细胞用PBS洗涤3次并用FACS分析。特别地，细胞用FACSCalibur流式细胞器和CellQuest软件(BDIS，San Jose，CA)分析。
重组核酸的第一轮文库根据该方法制备。编码登革病毒PRM15/tE融合蛋白的重组核酸被克隆到pMaxVax载体，其中该核酸文库-转染细胞用人类登革病毒抗血清培养，被转染到人293细胞培养物并且通过标准FACS分析，如上文所述，用能够产生阳性细胞数量与荧光强度的图形化输出的程序(选择软件设置和染料以使死亡细胞在聚集成细胞群时被排除在输出信号之外)。重组核酸通过下列登革病毒抗原优化密码子的亲本核苷酸序列之间的递归重组生产：Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO以及Den-4PRM15/tE CO。每个重组PRM15/tE编码的登革病毒核酸的文库包含至少一种编码重组的PRM15/tE登革病毒多肽重组核酸，该多肽被一个或多个小鼠的抗登革病毒抗体结合。实验还包括用缺少登革病毒核酸插入的pMaxVax 10.1null载体(被称为“空载体”)转染的293细胞群(图1)，该载体作为对照(C)(数据未显示)。
相类似的实验用从用登革病毒(未知病毒血清型)(数据未显示)感染的人类患者(Immunology Consultants Laboratory Inc.-Sherwood，Oregon)中获得的登革病毒抗血清进行重复。每个重组PRM15/tE登革病毒核酸的文库还包含至少一种编码了PRM15/tE登革病毒多肽的重组登革病毒核酸，该多肽被一种或多种人类抗登革病毒抗血清结合。
为了分离该个别重组核酸，单个大肠杆菌单克隆被从平板文库中挑选出来并且接种到含有1.2ml Terrific Broth-amp(50μg/ml)的96孔板中。96孔平板培养物在37℃下培养20个小时，用Biorobot(Qiagen，Valencia，CA)纯化质粒DNA。HEK-293细胞在转染前一天用每孔2×104细胞的密度放入96孔平板。细胞用分别包含重组的登革病毒核酸的各个重组pMaxVax 10.1载体转染，并且用pMaxVax 10.1null“空载体”作为对照(其缺少编码重组或WT登革病毒PRM15/tE的核酸)，用按照生产厂商说明使用Superfect(Qiagen)转染系统。经过在允许转基因表达的条件下培养48个小时后，根据在细胞上要进行的分析的类型，使用标准技术获得或溶解转染的293细胞，或吸取无细胞的培养基(上层清液)(比如，是否细胞被用于FACS或者蛋白质印迹分析，如下文所述)。
该技术被用于在用上述方法生产的重组的多核苷酸文库中进行筛选或选择，以确定包含编码特异地与登革病毒抗体反应的多肽的核酸的细胞。简要地说，每孔通过FACS用得自小鼠腹水的抗全部四种病毒血清型的抗登革病毒抗体进行分析，如上所述。阳性细胞在FL2-H管计数和图形绘制。从这些实验获得的图形输出与用对照载体(空载体)做的类似实验所获得的输出相比较。显示至少大约102的强度的细胞被认为是重组的PRM15/tE登革病毒Ag表达阳性(数据未显示)。
对应于在96孔高通量筛选实验中确定的阳性克隆的pMaxVax 10.1DNA载体的质粒DNA被再次转染入293细胞，收获这些细胞并且分析抗四种血清型特异性抗体的四价抗原的表达，如下文所述(实施例3)。
这些实施方案的结果显示递归序列重组和适当设计的选择/筛选方法能够被用于Den-1，Den-2，Den-3或Den-4PRM15/tE CO(优化编码)抗原编码核酸以生成新的重组核酸的文库并且从此确定特异性的含有编码与小鼠和/或人登革病毒抗体反应的重组登革抗原的核苷酸序列的重组核酸。
实施例3
本实施例描述了用递归序列重组方法和选定的选择/筛选操作来制备和确定编码多价登革抗原的重组核酸。
在通过FACS分析被确定为表达重组登革抗原阳性之后，克隆2/7从包含按照实施例2生产的重组核酸的克隆的文库中被选择。克隆2/7的核酸序列包含在SEQ ID NO：156中显示的重组的PRM15/trunE序列。(只含有重组的trunE核苷酸片断的克隆2/7的核酸序列显示在SEQ ID NO：285。)
293细胞通过标准技术并按照生产厂商的说明用pMaxVax 10.12/7和pMaxVax 10.1 Den-3PRM15/tE CO进行转染，如上文中所描述的那样。转染细胞在允许核苷酸(例如，转基因)表达的条件下培养大约48小时，收获并分成四份来分别进行染色反应。血清型特异的小鼠DEN-1、DEN-2、DEN-3以及DEN-4多克隆抗血清被加入到pMaxVax 10.12/7或pMaxVax 10.1 Den-3PRM15/tE CO转染细胞中，接着与适当标记的第二抗体共同培养，细胞进行FACS分析，如实施例2中所述。显示在图4中的这些实验的结果证明，编码了在哺乳动物细胞表面表达的重组抗原(SEQ ID NO：65)的大肠杆菌克隆2/7(克隆2/7--SEQ ID NO：156)的克隆重组核酸与所有4种登革病毒血清型的抗体(即为四价的)均可以反应。
作为比较，Den-3PRM15/tE CO表达了含有WT Den-3 PRM15/截短的E融合蛋白序列(SEQ ID NO：151)的抗原只与抗DEN-3的抗体反应并且也和抗-DEN-1抗体有交叉反应。
这些实验的数据证明通过本发明的一种创造性的方法制备了细胞表面重组抗原，其与所有4种登革病毒血清型都具有交叉反应活性。更进一步地，实验举例说明了从按照本文所述的方法生产的重组核酸文库中确定编码多价抗原的重组核酸的有效技术。
实施例4
本实施例举例说明了通过蛋白质印迹分析鉴定按照本文所述方法生产的重组的多价登革抗原。
通过实施例2中所描述的方法确定为表达重组的登革抗原表达阳性的六个代表性“PMR15/tE”克隆(命名为2/7，5/21，2G11，6E12，6A11，以及6D8)被选择。对应于这6种克隆的每一种的含有重组核酸的pMaxVax 10.1载体通过上文所描述的方法被分离。制得十一种293细胞培养物。六种培养物分别用六种包含重组登革病毒PRM15/tE核苷酸序列的pMaxVax 10.1载体中的一种转染。剩下的五种培养物的每一种分别用包含重组登革病毒PRM15/tE CO亲本核苷酸序列-pMaxVax 10.1Den-1PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1Den-2PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1Den-3PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1Den-4PRM15/tE CO，(共同被称为“亲本(parental)序列”或“亲本(parent)序列”)，pMaxVax 10.1null(载体对照；不加入抗原编码序列)的pMaxVax 10.1载体中的一种在同等条件下进行转染。所有的转染均是通过与生产厂商说明中相一致的标准技术实施的。
在培养48个小时后，在允许核苷酸(例如，转基因)表达的条件下，收获转染的293细胞，溶解然后分别用小鼠DEN-1、DEN-2、DEN-3以及DEN-4抗血清(分别被记为α-DEN-1，α-DEN-2，α-DEN-3以及α-DEN-4)与适当标记的第二抗体进行聚丙酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析，采取实施例1中所描述的技术。这些实验的结果显示在图5中。
图5显示了每一种挑选出来的重组核酸编码了分泌的重组抗原，这些抗原与DEN-1、DEN-3以及DEN-4的抗体反应。最好的情况是，只有一些亲本核酸序列编码的抗原与这样的抗体有极小的交叉反应，所述的抗体是除所述抗原通常与其结合(参与，例如，Den-1 PRM15/tE CO编码的抗原与DEN-3抗体的反应)的抗体之外的那些抗体，导致了与在六种重组登革病毒抗原观测到一向清楚的条带相比浅的条带的蛋白质印迹。序列分析确定2/7和6A11由相同的核酸序列编码，对这些抗原的观察同样显示5/21和6D8具有非常相似的条带模式。
这些实验的结果证明一种生产和鉴定(例如，筛选/选择)重组的分泌的登革抗原(包括重组的PRM15/tE融合蛋白或缺少PRM15序列的相关的重组的截短的E蛋白)的创造性的方法，所述抗原与哺乳动物细胞中抗多种(例如，至少二价，或至少三价)登革病毒血清型的登革病毒抗原的抗体发生交叉反应(或结合或特异性的结合)。
类似方法被用于生产和确定包括例如，重组的C15/全长prM/全长E融合蛋白(或相关的缺少C15序列和起始Met残基的重组全长prM/全长E融合蛋白)的重组的分泌的登革抗原，其与抗机体中的多种登革病毒血清型的抗登革病毒抗原的抗体发生交叉反应(或结合或特异性的结合)。
实施例5
本实施例描述了用于生产和确定(例如，筛选/选择)在体内诱导多种的病毒血清型的登革病毒的抗体产生的重组登革抗原的方法。
包括重组的聚核苷酸序列的核酸文库是用所述递归序列重组技术生产的，例如，在实施例2中。构建包含重组核酸序列(编码PRM15/trunE登革病毒抗原融合蛋白的)文库的成员的pMaxVax 10.1质粒载体。在一方面，与16克隆相对应的至少十六种重组抗原被通过实施例2种所描述的FACS技术确定为四价的登革抗原(例如，与所有抗所有四种血清型的抗体反应的登革抗原)表达阳性。用于克隆转化的pMaxVax 10.1质粒载体被用上文所描述的DNA免疫试验的技术分离和纯化，然后用于下述小鼠的免疫接种。
给近交系小鼠(BALB/c)分别注射包括十六种重组核酸之一或Den-3PRM15/tE CO的无内毒素的纯化(Qiagen)pMaxVax 10.1载体。给三只小鼠在腿部肌肉处注射50μg特定质粒类型的一种质粒DNA。三只小鼠接受同样剂量的对照载体，pMaxVax 10.1null。所有被免疫的小鼠在初次免疫后的第14天接受与初次DNA免疫同样剂量的加强免疫。
在初次质粒DNA注射后28天从每只被免疫的小鼠中收集40μl血清，并在ELISA试验中分析抗体诱导。按照生产商的说明采用标准技术，在4℃下ELISA平板(Nunc Immuno Maxisorp(Roskilde-Denmark))用测试抗原(Immunology Consultants Laboratory Inc.-Sherwood，Oregon提供的每种血清型——Den-1，Den-2，Den-3或Den-4灭活的登革病毒)包被过夜。平板用包含0.1％的Tween 20的PBS缓冲液冲洗3次，用3％BSA/PBS/0.1％Tween 20在37C下封闭1个小时以减少非特异性的结合。平板用PBS/0.1％Tween 20冲洗3次并在37C下与抗登革病毒测试血清的1∶100稀释液培养1小时，然后在附加清洗3次后在37℃下与第二抗体(羊抗小鼠HRP结合，Amersham)的1∶3000稀释液培养1小时。平板最后用PBS/0.1％Tween 20冲洗5次并与TMB过氧化酶底物(四价联苯胺，Pierce)培养。显色反应用2M H2SO4停止，每个样品的光密度(吸光率)在ELISA平板阅读器的450纳米(nm)处进行光谱光度分析。此外，ELISA试验能够用其它标准试验形式执行，包括，例如，Raviprakash等，J.Geh.Virology 81：1659-1667(2000)中所描述的，在此全文引用作为参考)。
十六种被检测的重组PRM15/tE登革病毒抗原编码核酸中的至少七种-即-2G11(SEQ ID NO：157)，2/7(也称为“6A11”)(SEQ ID N0：156)，6E12(SEQID NO：159)，6C6(SEQ ID NO：160)，5/21(也称为“6D8”)(SEQ IDNO：158)，6F4(SEQ ID NO：161)，以及7A9(SEQ ID NO：162)被确定为编码了七种各自重组抗原(例如，2G11(SEQ ID NO：66)，2/7(6A11)(SEQ ID NO：65)，6E12(SEQ ID NO：69)，6C6(SEQ ID NO：68)，5/21(6D8)(SEQ IDNO：67)，6F4(SEQ ID NO：70)，以及7A9(SEQ ID NO：71)，在体内表达时，生产出通过标准ELISA分析测试出的抗DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4的抗体。信号肽序列一般在传送tE蛋白到ER中后裂解。
所检测的每种血清型特异性ELISA平板的这七种四价的抗原中每一种的平均光密度(OD)值被计算。这些数值以及在每种登革病毒血清型-特异的ELISA平板上观测到的注射pMaxVax 10.1DEN-3PRM15/tE CO和pMaxVax 10.1null的小鼠的平均OD值一起用于绘制曲线(数据未显示)。四种重组的四价抗原，2G11，2/7，6E12，5/21)的典型数据显示在图6(实施例6)中，在这个图中，pMV表示pMaxVax 10.1null。
在每只小鼠体内注射大量的(a population of)pMaxVax 10.1DNA质粒表达载体，每种所述大量的载体包括一种所述重组登革抗原编码核苷酸序列，导致产生能够在标准ELISA中与多种血清型-特异性的登革抗原反应的抗体。例如，从免疫的小鼠中获得的抗血清，每种所述小鼠被注射大量的pMaxVax 10.1载体，每种所述载体包含下列重组DNA序列中的一种：2G11DNA，2/7(6A11)DNA或6E12DNA，产生的OD水平比从被注射了大量pMaxVax 10.1DEN-1PRM15/tE CO表达载体的小鼠中获得的抗血清OD水平高，在覆盖了灭活的DEN-1病毒的ELISA平板上测试。很明显，从用这七种质粒中的任何一种免疫的小鼠中获得的血清具有较高的OD水平，每一种质粒包含七种重组抗原编码DNA序列的一种，当在用灭活的DEN-2病毒覆盖的ELISA平板中进行分析时，该OD水平高于从用pMaxVax 10.1DEN-2PRM15/tE CO免疫的小鼠中获得的血清。更进一步地，从用pMaxVax 10.12/7DNA，pMaxVax 10.15/21DNA，pMaxVax 10.12G11DNA，pMaxVax 10.16E12DNA免疫的小鼠中获得的血清的OD水平也比那些从用pMaxVax 10.1DEN-3PRM15/tE CO免疫的小鼠的血清的OD水平高，在用灭活的DEN-3病毒覆盖的ELISA平板上进行分析。在用的灭活的DEN-4病毒覆盖的ELISA平板上分析时，包含编码抗原的改组DNA的质粒pMaxVax 10.12G11DNA和pMaxVax 10.16E12DNA的OD水平至少与那些注射了pMaxVax 10.1DEN-4PRM15/tE的小鼠的OD水平具有可比性。
这个实验的结果表明递归序列重组和适合的筛选/选择测试在制备和确定编码重组(PRM15/tE)登革抗原的核酸中的作用，该核酸在体内表达诱导或促进能够与登革病毒多种血清型的登革病毒抗原反应(或结合或特异性结合)的抗体的产生。这些结果还证明了本发明的重组核酸(以及从中编码的重组抗原)在诱导或促进与机体，包括哺乳动物内的多种登革病毒血清型的登革病毒抗原反应(或结合或特异性的结合)的抗体产生中是十分有用和有效的。
实施例6
本实施例举例说明了通过第二轮的递归序列重组产生重组的核酸的文库的过程，以及从文库中确定和/或分离编码重组登革抗原的重组核酸，该核酸在体内表达时诱导或增强抗多种登革病毒血清型的登革病毒的抗体产生。
实施例5中被确定为编码四价抗原(PRM15/trunE形式)的七种核酸被分离、纯化，并进行第二轮递归序列重组(例如，DNA改组和适当定义的选择/筛选)来生产首个第二轮重组核酸的文库(PRM15/trunE形式)，所有均被克隆到大肠杆菌中。
在一个示例性分析实例中，通过在如实施例1-3所述相关实验的相似的条件下进行FACS分析，采用血清型特异的抗登革病毒1-4抗血清测试抗体-抗原结合，在生成的文库中至少21个重组核酸(PRM15/trunE形式)被确定为编码与至少3种登革病毒血清型登革病毒抗体反应的重组多肽。21个重组核酸序列被分离、纯化、连接入pMaxVax 10.1载体中，与实施例1(例如，见表2)中所应用的技术相一致。重组的pMaxVax 10.1质粒中被克隆到大肠杆菌中以产生以下DNA免疫实验所应用的质粒。
三只小鼠一组被注射100μg来自被确定的21个包含一个改组的DNA序列的pMaxVax 10.1载体中的每一个的质粒DNA，或对照载体pMaxVax10.1null。按照实施例5中所描述的方法，每只小鼠均在第14天用与初始免疫同样剂量、同样载体进行加强免疫，然后在第28天被采血以获得血清。从免疫的小鼠中获得的血清的抗体诱导通过分别以1∶100 PBS稀释在覆盖DEN-1、DEN-2、DEN-3以及DEN-4灭活病毒的ELISA平板上进行ELISA分析。至少十二种核酸序列(PRM15/trunE形式)，11B1 DNA(SEQ ID NO：173)，11B8 DNA(SEQ ID NO：174)，11C11 DNA(SEQ ID NO：176)，11E2 DNA(SEQID NO：163)，12E3 DNA(SEQ ID NO：164)，12H4 DNA(SEQ ID NO：177)，13E2DNA(SEQ ID NO：165)，13E11 DNA(SEQ ID NO：167)，13F11 DNA(SEQ IDNO：178)，14B1 DNA(SEQ ID NO：179)，14E9 DNA(SEQ ID NO：166)以及14H2DNA(SEQ ID NO：181)通过ELISA被确定所编码的重组抗原，11B1(SEQ IDNO：72)，11B8(SEQ ID NO：73)，11C11(SEQ ID NO：75)，11E2(SEQ IDNO：76)，12E3(SEQ ID NO：77)，12H4(SEQ ID NO：78)，13E2(SEQ ID NO：79)，13E11(SEQ ID NO：80)，13F11(SEQ ID NO：81)，14B1(SEQ ID NO：82)，14E9(SEQ ID NO：83)以及14H2(SEQ ID NO：85)在体内诱导产生的与四种病毒血清型-Den-1，Den-2，Den-3以及Den-4的登革病毒抗原反应的抗体-其水平明显高于在对照载体中所观测到的水平。
在更进一步的轮次的实验中，小鼠分别被注射100μg的下述一种质粒DNA：(1)十种有代表性的质粒(每一种包含11B1，11B8，11C11，11E2，12E3，12H4，13E2，13E11，13F11，14B1，14E9以及14H2核苷酸序列中的一种)，(2)实施例1中所描述的包含四种亲本核苷酸序列(例如，pMaxVax 10.1DEN-1>，pMaxVax 10.1DEN-2PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1DEN-3PRM15/tE CO以及pMaxVax 10.1DEN-4PRM15/tE CO)的质粒，(3)包含四种选择核酸(2G11(SEQ IDNO：157)，6E12(SEQ ID NO：159)，5/21(SEQ ID NO：158)以及2/7(SEQ IDNO：156))的质粒，或(4)pMaxVax 10.1null质粒载体。进行免疫实验时，通过加强免疫平行三份进行试验，并且如实施例5所述采血。从免疫小鼠中获得的血清分别在覆盖DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4灭活病毒的ELISA平板上进行ELISA试验来分析抗体的诱导，如实施例5中所述。从几组小鼠中获得的血清的平均OD值被确定并绘制成图，其中每个组包含3只小鼠，它们用对应于每种类型的ELISA平板的一种类型的质粒免疫。这些计算的结果在图6中显示。在这个图中，每个图X轴上的“pMV”标点表示pMaxVax10.1null，X轴上“D-1”，“D-2”，“Den-3”以及“Den-4E”标点相应地表示pMaxVax10.1DEN-1PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1DEN-2PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1DEN-3PRM15/tE CO以及pMaxVax 10.1DEN-4PRM15/tE CO)。
这些实验的结果，如图6中显示，表明了所有被选择的核酸均表达抗原，该抗原在小鼠中能够诱导抗体，该抗体在ELISA实验中与全部四种灭活的WT登革病毒(Den-1，Den-2，Den-3以及Den-4)强烈的反应。从注射了包含选择的第二轮文库核酸序列的质粒的小鼠中获得的血清在DEN-1，DEN-2和DEN-3ELISA平板中显示出了比最相关的亲本序列更高的平均OD值；例如，从用第二轮重组的核酸免疫的小鼠中获得的血清在DEN-1平板上的平均OD值比从用pMaxVax 10.1DEN-1PRM15/tE CO免疫的小鼠中获得的小鼠血清的平均OD值高(在图6中标记为D-1)。更进一步地，从注射包含了至少4种首个第二轮核酸-11C1编码DNA，11B1 DNA，11B8 DNA以及14B1 DNA的pMaxVax 10.1质粒DNA的小鼠中获得的血清-还有从注射了至少pMaxVax10.16E12DNA的小鼠中获得的血清，显示出与那些从注射了pMaxVax 10.1DEN-4 PRM15/tE CO的小鼠中获得的血清在DEN-4特异性的ELISA平板上分析时观测到的水平相当的OD水平。
这些实验的结果进一步显示了编码重组的(PRM15/tE)登革抗原的重组核酸的产生和确定，该抗原在体内诱导或增强了抗体的产生，该抗体与多种登革病毒血清型反应(或结合或特异性的结合)(如本文中所述的通过选择筛选方法确定)。这些实验的结果也证实了本发明所述的核酸和质粒载体(以及由其编码产生的重组多肽)对体内诱导和增强受试者，包括哺乳动物的所述免疫反应是很有用的。
实施例7
本实施例举例说明了本发明所述的选择重组抗原的复杂嵌合体(例如，序列多样性)，其中所述重组抗原的核酸序列与相应的WT登革病毒抗原的氨基酸相比较。
对应实施例5中第一轮重组核酸文库中作为代表被确定和选择出来的7个克隆的重组核苷酸序列的抗原(即2/7(也称为“6A11”)，5/21(也称为“6D8”)，2G11，6E12，6C6，6F4以及7A9)和对应实施例6中首次第二轮重组核苷酸文库中所确定和选择出来12个克隆的重组核苷酸序列的抗原(11B1，11B8，11C11，11E2，12E3，12H4，13E2，13E11，13F11，14B1，14E9以及14H2)用标准技术测序，并且与4种登革病毒血清型的每一种野生型登革抗原的相应序列区域的多肽序列(例如，PRM15和截短的E蛋白(如大约90％E蛋白的N端))相比较以确定重组抗原与野生型抗原之间相同的氨基酸序列区域。通过所述的分析，确定到重组的抗原包括，例如，从4中WT登革病毒血清型中的每一种野生型PRM15/truncated衣壳蛋白多肽序列中获得的各种氨基酸区域，片段或者区段。在重组抗原中与野生型抗原氨基酸序列相近似的氨基酸区域，片段或者区段被绘制成图形以统计重组抗原的嵌合体(数据未显示)(然而，可见图11中显示的典型图形)。此外，应当指出随着其它递归重组的增加，比如，通过DNA改组结合适当的筛选或选择程序，多样性增加。
上述氨基酸序列分析举例说明了至少许多本发明的重组抗原和编码它们的核酸的复杂的嵌合特性(序列多样性)。更进一步地，该序列分析的结果显示更大的多样性(更加复杂的嵌合)在重组抗原中产生，该重组抗原由多轮递归序列重组结合适当的筛选/选择步骤所产生和确定的DNA编码。
实施例8
本实施例描述了重组核酸文库通过递归序列重组地产生，选择重组核酸采用合适的筛选/选择程序在所述文库中确定，以及从文库中将编码重组登革病毒抗原的核酸选择出并分离，该核酸在体内表达时诱导或增强与多种病毒血清型的登革病毒反应的抗体的产生。
如实施例5所述的来自首轮文库克隆2G11，6E12，2/7(6A11)和5/21(6D8)的代表性的重组登革抗原编码核酸序列用标准技术分离并纯化，并且结合实施例1中描述的4个亲本登革序列用于通过对应实施例2和整个说明书中所描述和/或参考的技术的递归序列重组制备新的重组核酸文库。
根据实施例5种描述和引用的技术，从这个重组核酸的文库中，通过流式细胞计(FACS)选择二十五种重组核苷酸序列(以PRM15/tE形式)，用于小鼠的免疫和使用四种血清型特异的灭活登革病毒覆盖的ELISA平板的血清ELISA分析。所有25种重组的核苷酸序列被这样分析，并且被发现能诱导或增强抗所有4种DEN血清型的交叉反应抗体的产生，如下文种所讨论的。
特别地，二十五种重组DNA序列(以PRM15/tE形式)-15C2 DNA(SEQ IDNO：182)，15D4 DNA(SEQ ID NO：183)，15H4 DNA(SEQ ID NO：184)，16B4DNA(SEQ ID NO：185)，16E8 DNA(SEQ ID NO：168)，16E10 DNA(SEQ IDNO：169)，16F2 DNA(SEQ ID NO：186)，16G11 DNA(SEQ ID NO：187)，17A12DNA(SEQ ID NO：188)，17D5 DNA(SEQ ID NO：189)，17D11 DNA(SEQ IDNO：190)，17F5 DNA(SEQ ID NO：191)，17F11 DNA(SEQ ID NO：192)，17G5DNA(SEQ ID NO：193)，17H3 DNA(SEQ ID NO：194)，17H10 DNA(SEQ IDNO：195)，17H12 DNA(SEQ ID NO：196)，18A9 DNA(SEQ ID NO：197)，18B7DNA(SEQ ID NO：198)，18D7 DNA(SEQ ID NO：199)，18E9 DNA(SEQ IDNO：170)，18E10 DNA(SEQ ID NO：171)，18E11 DNA(SEQ ID NO：172)，18H2DNA(SEQ ID NO：200)，以及18H6 DNA(SEQ ID NO：235)-采用实施例1-7中所描述的技术从重组核酸的新文库中被分离。如上所述，制备包含各种该重组的DNA序列的pMaxVax 10.1质粒载体。
小鼠被分为每组三只。三只小鼠分别被注射下述DNA构建体中的一种来免疫：(1)100μg的包含上述25种重组序列中的一种的pMaxVax 10.1质粒DNA载体；(2)100μg包含与在首个第二轮文库(见实施例5)中确定的克隆11C4(SEQ ID NO：175)相一致的重组DNA序列的pMaxVax 10.1质粒载体；(3)100μg包含与首个第二轮文库(见实施例5)中确定的克隆14G10(SEQ IDNO：180)相一致的重组DNA序列的pMaxVax 10.1质粒载体；(4)100μgpMaxVax 10.1null载体(对照组)。每只小鼠在初次免疫(第0天)之后的第14、29和56天注射与初次免疫同样剂量的同样质粒载体进行加强。在第28、55和76天从小鼠中收集血清。收集到的血清被用来分析体内的抗体诱导，该分析通过在实施例5中所描述的条件下在以1∶100的稀释度在DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4灭活病毒覆盖的ELISA平板上进行ELISA试验得到的。
小鼠的血清的ELISA试验显示所有27种质粒(每种包含上述PRM15/tE重组核苷酸序列中的一种)导致抗原的体内表达，该抗原诱导在注射后的第28和55天产生在ELISA试验中与所有4种病毒血清型的灭活的登革病毒反应的抗体。对于每种血清型特异的ELISA平板测试，计算从每只注射该质粒的小鼠获得的血清的每种所述重组质粒载体编码的重组PRM15/tE抗原的平均光密度(OD)，与使用pMaxVax 10.1null所获得的值相比较(数据未显示)。该25种重组PRM15/tE多肽抗原由新文库中确定的重组核苷酸序列编码，该文库包括：(15C2(SEQ ID NO：86)，15D4(SEQ ID NO：87)，15H4(SEQ IDNO：88)，16B4(SEQ ID NO：89)，16E8(SEQ ID NO：90)，16E10(SEQ IDNO：91)，16F12(SEQ ID NO：92)，16G11(SEQ ID NO：93)，17A12(SEQ IDNO：94)，17D5(SEQ ID NO：95)，17D11(SEQ ID NO：96)，17F5(SEQ IDNO：97)，17F11(SEQ ID NO：98)，17G5(SEQ ID NO：99)，17H3(SEQ IDNO：100)，17H10(SEQ ID NO：101)，17H12(SEQ ID NO：102)，18A9(SEQ IDNO：103)，18B7(SEQ ID NO：104)，18D7(SEQ ID NO：105)，18E9(SEQ IDNO：106)，18E10(SEQ ID NO：107)，18E11(SEQ ID NO：108)，18H2(SEQ IDNO：109)以及18H6(SEQ ID NO：110)。
进一步的体内分析通过给在同样条件下每组5只小鼠注射100μg(50μg/一只腿)的pMaxVax 10.1null或者100μg pMaxVax 10.1DNA载体来执行的，所述载体包含下列核苷酸序列中的一种：16B4(SEQ ID NO：185)，16G11(SEQID NO：187)，18H2(SEQ ID NO：200)，18H6(SEQ ID NO：235)，Den-1PRM15/tE CO(SEQ ID NO：211)，Den-2PRM15/tE CO(SEQ ID NO：212)，Den-3PRM15/tE CO)(SEQ ID NO：213，Den-4PRM15/tE CO(SEQ ID NO：214)。给另一组的5只小鼠的每只在与另一接受每种上述质粒DNA载体中的每个单独注射的小鼠所述同样次数和同样条件下注射100μg(50μg/一只腿)的pMaxVax 10.1DEN-1PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1DEN-2PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1DEN-3>以及pMaxVax 10.1DEN-4PRM15/tE CO的混合物。每只小鼠在初次免疫(第0天)之后的第14、29和56天进行与初次免疫相同剂量的相同质粒载体的加强免疫。血清在第28、55、76、120和180天从小鼠中被收集，试验第55天获得的血清的平均OD值显示在图7中。
这些进一步ELISA试验的结果显示了由选择的重组核苷酸(16B4(SEQID NO：185)，16G11(SEQ ID NO：187)，18H2(SEQ ID NO：200)，18H6(SEQ IDNO：235))编码的重组的PRM15/tE抗原(16B4(SEQ ID NO：89)，16G11(SEQID NO：93)，18H2(SEQ ID NO：109)，18H6(SEQ 1D NO：110))诱导与所有4种WT登革病毒血清型的登革病毒反应的抗体的产生。在用DEN-1，DEN-2和DEN-3覆盖的ELISA平板上，从注射了这些选择的重组克隆的小鼠中获得的抗血清所显示的OD水平显著高于由单独或组合的如下抗原产生的OD水平，所述抗原是由任何一种亲本核酸序列Den-1PRM15/tE CO(SEQ IDNO：211)，Den-2PRM15/tE CO(SEQ ID NO：212)，Den-3PRM15/tE CO)(SEQ IDNO：213，Den-4PRM15/tE CO(SEQ ID NO：214)编码的Den-1PRM15/tE(SEQID NO：149)，Den-2PRM15/tE(SEQ ID NO：150)，Den-3PRM15/tE(SEQ IDNO：151)，Den-4PRM15/tE(SEQ ID NO：152)。从注射了包含这些重组抗原编码序列的质粒的小鼠中获得的抗血清也至少具有与这些对应DEN-4的亲本抗原编码序列相同的OD水平(单独注射或组合注射)(在这种平板上由从注射了pMax Vax 10.1DEN-3PRM15/tE CO的小鼠中获得的血清显示的高OD水平表明在试验的这部分使用该ELISA平板是一个缺陷)。
这些试验的结果进一步表明了本发明所述的重组抗原和/或本发明所述编码重组抗原的重组核酸，能够诱导或增强体内产生与所有四种血清型的登革病毒反应(或结合或特殊结合)的抗体。本发明的重组抗原性多肽序列，以及本发明的编码重组抗原性多肽的重组核苷酸序列，是十分有用的，例如，用于诱导，调控，和/或增强与所有四种血清型的登革病毒反应(或结合或特殊结合)的抗体的产生的本发明方法中，和/或检测在生物样品中存在抗1、2、3、4登革病毒血清型的抗体的诊断分析。
实施例9
本实施例描述了本发明所述的重组抗原体内产生、调控，和/或促进抗多种登革病毒血清型的登革病毒的中和抗体反应的能力。
按照实施例8中陈述的方法，小鼠被分别注射包含与下述-18E9(SEQ IDNO：170)，18D7(SEQ ID NO：199)，16G11(SEQ ID NO：187)，18H6(SEQ IDNO：235)，15D4(SEQ ID NO：183)，18H2(SEQ ID NO：159)，6E12(SEQ IDNO：159)，2/7(SEQ ID NO：156)，2G11(SEQ ID NO：157)以及16B4(SEQ IDNO：185)中的一种相一致的重组DNA序列的pMaxVax 10.1质粒载体。这些DNA序列编码下述重组的PRM15/tE抗原，分别为-18E9(SEQ ID NO：106)，18D7(SEQ ID NO：105)，16G11(SEQ ID NO：93)，18H6(SEQ ID NO：110)，15D4(SEQ ID NO：87)，18H2(SEQ ID NO：109)，6E12(SEQ ID NO：69)，2/7(SEQ ID NO：65)，2G11(SEQ ID NO：66)以及16B4(SEQ ID NO：89)。在一个相似的试验中，DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4野生型序列，编码DEN-1-4野生型PRM15/tE抗原，以及这四种野生型抗原的等量混合物被用于注射，以两周间隔，对所有小鼠用相同质粒DNA进行3次加强注射。
小鼠分别被注射一种包含与下述之一相一致的重组DNA序列的pMaxVax 10.1质粒载体-5/21-D1(SEQ ID NO：201)，2G11-D4(SEQ IDNO：204)，以及6E12-D4(SEQ ID NO：202)。这些DNA序列分别编码下述重组的全长C15/全长prM/全长E抗原：5/21-D1(SEQ ID NO：140)，2G11-D4(SEQID NO：139)，以及6E12-D4(SEQ ID NO：141)。在相似实验中，编码野生型C15/全长prM/全长E抗原的DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4野生型序列，以及这四种野生型抗原的等量混合物被用于注射。以2周间隔，用同样的质粒DNA给所有小鼠进行3次加强注射。
在初始DNA注射后的76天后从小鼠中获得的抗血清被通过标准的噬斑减少中和滴定(PRNT)试验进行分析，这些是本领域公知的常规技术(见，例如，Russell等，J Immunol(1967)99：285-290；Simmons等，Am.J.Trop.Med.Hyg(2001)65：420-426)，每个均全部在此引用作为参考。
简单的说，该PRNT50试验一般如下进行：猴肾细胞的细胞培养物(LLC-MK2)被接种在6孔培养平板中，并且在CO2培养箱中在37℃进行培养。每一种从注射9种质粒载体之一的小鼠中获得的抗血清被稀释成1∶20，1∶40和1∶80的连续的稀释液。每种细胞培养物被用(i)4种登革病毒血清型中的每一种的登革病毒和(ii)抗血清的1∶20，1∶40和1∶80的连续的稀释液的混合物培养2-3个小时。
在培养2-3个小时后，登革病毒和稀释的抗血清的接种物混合物被从LLC-MK2猴肾细胞培养物中去除，并且琼脂糖层(SeaPlaque琼脂糖，FMCBioproducts)被加入到细胞培养物中。通过释放的病毒后代形成的噬斑点在第7天通过用0.02％的中性红/Hanks平衡盐溶液染色观测到。每一所述细胞培养物中计数出的噬斑点与从不含任何血清的同样的登革病毒的混合物培养的LLC-MK2细胞中计数出的噬斑点相比较。采用Probit分析软件(SSPS，Inc.Chicago，IL)，使用标准技术并按照厂商说明，便于特定确定培养物的50％噬斑减少中和效价(PRNT50)。50％有效剂量(ED50)是引起噬斑点数量50％减少的血清稀释量。中和50％由特定病毒攻击剂量产生的传染性病毒颗粒所需抗血清(例如，从含有用特殊免疫原免疫产生的特定抗体的受试者中获得的血清)的量直接与抗血清的效价相关。Russell等，同上，286。
图8A显示了通过PRNT50分析这10种重组的PRM15/tE抗原的编码DNA序列(例如，克隆18E9，18D7，16G11，18H6，15D4，18H2，6E12，2/7，2G11以及16B4)的，单独的四种野生型PRM15/tE抗原(DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4)，以及这四种DEN野生型的等量混合物的结果。图8B显示了通过PRNT50分析这三种的重组的全长C15/全长prM/全长E抗原的编码DNA序列(例如，克隆-5/21-D1，2G11-D4)，单独的四种DEN野生型C15/全长prM/全长E抗原，以及这四种DEN野生型的等量混合物的结果。PRNT50效价的倒数大于20在体外中和实验中被看作对抗特定的登革病毒血清型中和抗体的产生十分有用。对图8A和8B中的PRNT50效价应用这个标准，这些重组的质粒载体中所有13种诱导产生抗至少2种登革病毒(例如，抗至少DEN-1，DEN-2，DEN-3和/或DEN-4中的两种)的中和抗体。例如，给小鼠注射pMaxVax 10.118E9，诱导抗至少DEN-1和DEN-2的中和抗体。给小鼠注射pMaxVax 10.118D7，pMaxVax 10.115D4，和pMaxVax 10.16E12，诱导抗至少DEN-1，DEN-2以及DEN-3的中和抗体。给小鼠注射pMaxVax 10.12/7，pMaxVax 10.12G11，pMaxVax 10.116G11，pMaxVax 10.118H6，pMaxVax 10.118H2，和pMaxVax 10.116B4，pMaxVax 10.15/21-D1，pMaxVax 10.12G11-D4，和pMaxVax10.16E12-D4，诱导产生抗所有四种登革病毒血清型DEN-1，DEN-2，DEN-3以及DEN-4的中和抗体。在另一方面，只有编码为重组的全长C15/全长prM/全长E抗原的野生型DEN-1，DEN-2，DEN-3以及DEN-4的混合物，诱导产生抗所有四种登革病毒血清型DEN-1，DEN-2，DEN-3以及DEN-4的中和抗体。两种DEN野生型PRM15/tE抗原DEN-1和DEN-2，还有四种DEN野生型PRM15/tE抗原(DEN-1，DEN-2，DEN-3以及DEN-4)的混合物，以及两种DEN野生型全长C15/全长prM/全长E DEN-1和DEN-2抗原并不诱导中和抗体。两种DEN野生型PRM15/tE抗原DEN-3以及DEN-4仅仅诱导抗同源DEN病毒(DEN-1和DEN-2，分别地)的中和抗体，而两种DEN野生型全长C15/全长prM/全长E抗原，DEN-3以及DEN-4，诱导抗至少3种Den病毒(DEN-2，DEN-3以及DEN-4)的中和抗体。
ELISA试验也可通过用从注射了100μg包含与13种克隆(克隆18E9，18D7，16G11，18H6，15D4，18H2，6E12，2/7，2G11，16B4，5/21-D1，2G11-D4以及6E12-D4)中的每一种的一种相一致的重组核苷酸序列pMaxVax 10.1质粒载体的小鼠中获得的血清以及从注射了pMaxVax 10.1null的小鼠中获得的血清来进行，按照实施例8中所描述的方法，采用DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4覆盖的ELISA平板以及DNA免疫技术。得到的ELISA数据证明了所有13种这些重组的克隆均诱导体内产生在体外与所有四种登革病毒血清型反应的抗体(数据未显示)。
实验的结果证明本发明的重组的核苷酸序列编码的重组登革抗原(以PRM15/tE的形式以及C15/全长prM/全长E的形式)，和/或本发明重组的登革抗原(以PRM15/tE的形式以及C15/全长prM/全长E的形式)在体内被表达时诱导，增强，促进，和/或调控产生至少2，3，或甚至4种登革病毒血清型的中和抗体。本发明所述的重组抗原性多肽，以及本发明所述的编码重组抗原性多肽的重组核酸序列，是有用的，例如本发明的预防和/或治疗方法，用于在该重组抗原多肽在体内表达时诱导，调控，和/或增强产生抗至少2，3，或甚至4种登革病毒血清型的中和抗体。
实施例10
该实施例举例说明了重组登革抗原的分泌特征，该抗原被确定可诱导，增强，促进，和/或调控体内抗至少2种血清型的登革病毒的中和抗体的产生。
与包含克隆18D7，18E11，16G11，18H6，18H2，16B4，14G10，18E9，以及18E10中每一种的重组核苷酸序列的pMaxVax 10.1载体相一致的质粒DNA被通过标准技术分离和纯化，并且用于如前面以及实施例1和2中所描述转染293细胞。被转染的细胞培养72个小时，用15μl的未浓缩的无细胞培养基的上清液进行聚丙酰胺凝胶电泳和膜印迹。硝化纤维膜用从小鼠腹水中获得的抗DEN-1，DEN-3和DEN-4抗体和酶结合的第二抗体培养，以用于上述以及实施例1中所描述的技术制备蛋白质印迹。图9是通过该技术获得蛋白质印迹显示；如实施例9中所讨论的，被各个重组克隆中和的野生型登革病毒血清型的数量(N)显示在蛋白质印迹的底部。
如图9中所显示，重组克隆中的5种(18E9，18E10，18E11，18H2，以及18H6)表达和分泌在蛋白质印迹上产生暗带的重组抗原，三种重组抗原(14G10，16B4，18D7)被很好的分泌，但是不被抗体强烈的结合，产生较浅的带。一种重组的克隆(16G11)在未浓缩的上清液中没有检测到分泌。被每种重组抗原中和的WT登革病毒血清型种类与其分泌物模式的比较显示，在重组抗原分泌与被通过各自重组抗原诱导的抗体中和的WT登革病毒血清型种类之间没有直接的联系。例如，未被可检测地分泌的重组抗原(16G11)产生抗所有四种WT登革病毒血清型的中和抗体。产生暗带的较好被表达和分泌的重组抗原(18E9，18E10，18E11，18H12，以及18H6)分别产生抗两种，两种，四种，四种，以及四种野生型登革病毒血清型的中和抗体。产生较浅的带的重组抗原(14G10，16B4，18D7)分别产生中和两种，四种，以及三种2WT登革病毒血清型的抗体。
这些实验的结果证明本发明的分泌的和细胞膜结合的重组抗原(以及编码该重组抗原的重组核苷酸序列)在诱导，增强，促进，和/或调控体内抗一种或多种WT登革病毒血清型的中和抗体的产生中十分有效。
实施例11
该实施例举例说明了通过体内注射包含编码本发明的重组抗原的本发明重组的核苷酸序列的质粒所诱导的对重组登革病毒抗原的抗体应答的持久性。
对传染性物质的免疫应答(如，保护性免疫应答)优选是长效的。为了测试注射一次或多次本发明的诱导对至少2种登革病毒血清型的中和Ab应答的重组登革抗原的编码DNA质粒的受试者(如，哺乳动物)中抗体免疫应答的持久性，进行了下述实验。
三组小鼠在设定的时间间隔各自注射pMaxVax 10.1 DNA质粒载体，其中每种载体编码对应于下述八种重组克隆的每种之一的重组抗原——16B4(SEQ ID NO：89)，16G11(SEQ ID NO：93)，18D7(SEQ ID NO：105)，18E9(SEQ ID NO：106)，18E10(SEQ ID NO：107)，18E11(SEQ ID NO：108)，18H2(SEQ ID NO：109)，或18H6(SEQ ID NO：110)。(可选地，每个小鼠注射pMaxVax 10.1 DNA质粒载体，其中每个载体含有核酸序列对应于下述八种重组克隆的每种之一16B4(SEQ ID NO：185)，16G11(SEQ ID NO：187)，18D7(SEQ ID NO：199)，18E9(SEQ ID NO：170)，18E10(SEQ ID NO：171)，18E11(SEQ ID NO：172)，18H2(SEQ ID NO：200)，或18H6(SEQ ID NO：235)。使用上述技术从小鼠中获取抗血清(如，实施例5)。在注射这些重组的pMaxVax 10.1质粒载体进行初次DNA免疫(第0天)后，分别在第55天和第120天取血清，该血清被用于ELISA分析，如上所述，使用如灭活DEN-2病毒覆盖的ELISA平板(所有的这些重组克隆以前已经被证明在类似的体内DNA质粒注射实验中诱导四价抗体应答)。注射每种质粒的小鼠的血清的平均OD值在测试的每个阶段被计算。由每个被检测的重组克隆诱导的抗体应答在用相应的重组的pMaxVax 10.1质粒载体(含有编码重组的抗原的重组的核酸)初次注射后55天依然很高。值得注意的，注射这些重组pMaxVax 10.1载体所诱导的抗体应答在初次pMaxVax 10.1载体注射后120天与初次注射pMaxVax 10.1载体后55天相比基本上不变。例如，注射这些重组载体所诱导的抗体应答在初次pMaxVax 10.1载体注射后120天与初次注射pMaxVax10.1载体后55天相比在从大约0.5％，约1％，约2％，约5％，约7％，约10％，约12％，或约14％的范围内增加或减少。
这些实验的结果显示本发明的重组抗原或编码该抗原的重组核酸能够在持续的时间内，包括，如，超过至少约55或120天诱导和/或促进对多种WT登革病毒血清型的体内抗体应答。
该抗体应答可以被诱导和/或促进，如，通过：(1)体内或离体给予受试者有效剂量的含有编码本发明重组抗原的核苷酸序列的DNA重组质粒载体(或者含有本发明重组核酸序列的重组DNA质粒载体)以足够或有效的诱导或促进该预期的抗体应答；或(2)通过体内或离体给予受试者或受试者细胞有效量本发明的重组抗原(或编码该抗原的核酸序列)，或本发明的嵌合病毒或VLP以诱导或促进所述预期的抗体应答。该抗体应答在用从该受试者中获得的抗血清的体内或离体实验中也可以观察到。预期的Ab应答可以是，如，足够预防性和/或治疗性治疗疾病或紊乱的抗体应答(包括，如，对登革感染或登革热的预防性药物或疫苗)。施用该重组DNA质粒或重组抗原性多肽给受试者可以使用任何传输或施用核酸或多肽(或其药物组合物)到受试者的体内或离体方法，如此处所述和本说明书中所述的，包括，但不限于，如，注射或基因枪传输，和包括此处所述的剂量和/或组合物，其依赖于具体的应用或相关的治疗方法。
实施例12
该实施例举例说明重组登革病毒抗原和编码重组登革抗原的重组核酸的制备，其在体内诱导对多种登革病毒血清型的中和抗体的产生，其中每种该重组登革病毒抗原包含的氨基酸序列具有与融合蛋白相同、基本相同(例如，在长度上具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选至少约95％(例如，约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的同一性)，相等，或基本相等(例如，在长度上至少约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或更多的同一性)的长度，该融合蛋白包含融合到特定血清型的登革病毒包膜(E)蛋白的全长序列上的全长prM蛋白序列，或由其组成。在另一方面，每个该重组登革病毒抗原由核苷酸序列编码，该核苷酸序列长度上等于或基本等于(例如，具有至少约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或更多的长度同一性)编码包含或由特定登革病毒血清型的全长prM蛋白序列融合全长E蛋白序列组成的融合蛋白的核酸序列的长度。
如上所述，对于所选的递归序列重组方法，下面的密码子优化的登革核苷酸序列被用作亲本序列：Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO或Den-4PRM15/tE CO。对于每个登革病毒血清型，每个该亲本核苷酸序列含有密码子优化的核苷酸序列，其编码野生型登革融合蛋白，包括：1)“PRM15多肽”(如，含有起始甲硫氨酸(Met)残基和特定血清型如，DEN-1的WT登革病毒的prM蛋白的C端的最后15个氨基酸的多肽序列)；和2)截短的E蛋白，其中截短的E蛋白含有至少约86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，或95％或更多同样(WT)登革病毒血清型的全长E蛋白序列的连续氨基酸残基，被计算或开始于E蛋白序列的约N端氨基酸残基。也就是说，截短的E蛋白含有至少约86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，或95％或更多同样(WT)登革病毒血清型的全长E蛋白序列的连续氨基酸残基的连续氨基酸残基的序列，其计算或开始于E蛋白序列的约N端氨基酸残基。
对四种血清型中一种的每个野生型登革病毒，制备编码含有该血清型的全长prM蛋白和全长E蛋白的融合蛋白的密码子优化核苷酸序列。在一方面，每个该密码子优化核苷酸序列分别通过核苷酸延伸截短的亲本Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO或Den-4PRM15/tE CO核苷酸序列获得。为了通过每个密码子优化的截短的亲本核苷酸序列(例如，Den-1PRM15/tE CO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO或Den-4PRM15/tE CO)的核苷酸延伸产生编码含有全长prM蛋白连接到全长E蛋白的融合蛋白的核苷酸序列(如产生包含全长prM核苷酸序列/全长E核苷酸序列的核苷酸序列)，根据实施例1所描述的方法确定每种登革病毒血清型(Den-1，Den-2，Den-3，Den-4)的编码全长prM蛋白序列和全长E蛋白序列(例如，E蛋白C端氨基酸残基需要加到相应的特定登革病毒血清型的截短的E蛋白以获得全长E蛋白)的密码子优化核苷酸序列。分析每个密码子优化的截短的亲本核苷酸序列(例如，Den-1PRM15/tECO，Den-2PRM15/tE CO，Den-3PRM15/tE CO或Den-4PRM15/tE CO核苷酸序列)的E基因核酸序列5’和3’端的唯一限制性位点。
通过进行该分析，发现所有四种登革病毒血清型的密码子优化E基因在每个特定病毒的E基因的大约位置57上包含唯一的BsrBI限制性位点。该BsrBI限制性位点在各个克隆5/21，2/7，2G11和6E12的编码重组的登革抗原的核酸序列中被发现，便于在5’端用其它核酸残基延伸该核苷酸序列，该残基是获得特定血清型的相应全长(完全)prM基因序列所必须的，如下文中进一步所描述的。
对于4种登革病毒血清型的每个登革病毒，还产生全长prM基因和编码包括Met作为首个氨基酸残基和具体的登革病毒血清型的衣壳(C)基因的C端(最后)15个氨基酸残基的16个氨基酸序列的核苷酸序列的密码子优化核苷酸序列。该16-氨基酸序列作为信号序列。4种血清型的登革病毒的密码子优化prM基因，包括编码该16个氨基酸信号序列的核苷酸序列，和包括重叠了BsrB1位点的E基因5’序列，通过寡核苷酸组装合成，如实施例1中所述。
序列分析还能够确定位于各种登革E基因3’端附近的唯一限制性位点。特别地，唯一的BsrBI位点被确定于密码子优化的DEN-1prM/E基因序列的位置1793；唯一的SexAI位点被确定于密码子优化的DEN-2 prM/E基因序列的位置1793；唯一的BglII位点被确定于密码子优化的DEN-3 prM/E基因序列的位置1863；唯一的BsrGI位点被确定于密码子优化的DEN-4 prM/E基因序列的位置1884。
例如，为了延伸Den-4PRM15/tE CO的核酸序列到长度等于或基本等于全长C15/全长prM/全长E蛋白融合蛋白的长度，对应于编码“C端延伸”的DEN-4E基因3’端的人密码子优化核苷酸序列(如，含有需要加到截短的E基因以延伸截短的E基因成为全长E基因的核苷酸残基的CO序列)也通过标准核苷酸合成技术合成。合成的密码子优化的Den-4 C15/prM片段(含有16个氨基酸的序列-C蛋白C端的15个氨基酸和首个Met-以及用于延伸特定血清型的PRM15编码核苷酸序列以获得全长CO C15/全长prM核苷酸序列的其它N端核苷酸残基)用BsrBI消化，合成的DEN-4E基因的3’端(编码该密码子优化的C端延伸的核苷酸序列)用BsrGI消化，Den-4PRM15/tE CO核苷酸序列按照生产商的说明用BsrBI和BsrGI消化。三个获得的片段通过标准技术连接以延伸PRM15和截短的E基因序列来形成密码子优化的Den-4全长C15/全长prM/全长E核苷酸序列，定义为“Den-4 C15/prM/E”。通过使用上述的特定的唯一限制性位点，同样的方法用于合成分别对应于Den-1，Den-2，和Den-3中每个的密码子优化的C15信号序列/全长prM/全长E核苷酸序列。术语“C15信号序列”一般表示16个氨基酸的序列，其包括编码Met残基的首个密码子和之后编码四种血清型的一种的登革病毒的衣壳蛋白C端15个氨基酸的密码子。获得的“全长”密码子优化的C15/全长prM/全长E核苷酸序列编码每个亲本的Den-1 C15/全长prM/全长E，Den-2C15/全长prM/全长E，和Den-3 C15/全长prM/全长E多肽，并且分别被称为Den-1 C15/全长prM/全长E，Den-2 C15/全长prM/全长E，和Den-3 C15/全长prM/全长E核苷酸。在这种情况下，根据内容，术语“C15信号序列”表示16个氨基酸的序列，其包括编码Met残基的首个密码子和之后编码衣壳蛋白C端15个氨基酸的密码子，“prM”或“全长prM”表示全长的prM多肽或核酸序列，术语“E”或“全长E”表示全长的E蛋白或核酸序列。
使用亲本Den-1 C15/全长prM/全长E密码子优化的核苷酸序列，用合适的限制性酶(基本上如上文对亲本基因所描述的)消化从而延伸克隆2/7的核苷酸序列(PRM15/tE形式；SEQ ID NO：156)以编码含有Met残基作为首个氨基酸连接在DEN-1 C蛋白C端最后15个连续的氨基酸的16氨基酸序列的密码子优化的核苷酸序列，DEN-1 prM蛋白的N端部分，和编码DEN-1E蛋白的C端部分的密码子优化的核苷酸序列，在正确的连接到该2/7核苷酸序列的基础上足以产生包含C15/全长prM/全长E形式的核酸序列的重组的核苷酸序列，被称为延伸的“2/7-D1”(SEQ ID NO：203)。重组的“延伸的”密码子优化的核苷酸2/7(SEQ ID NO：203)编码重组的2/7-D1(C15/全长prM/全长E形式)多肽(SEQ ID NO：147)。
克隆5/21的核酸序列(PRM15/tE形式；SEQ ID NO：158)类似的用DEN-1C蛋白，DEN-1 prM蛋白，以及DEN-1E蛋白的核苷酸序列片段延伸，以产生重组的延伸的密码子优化的核苷酸序列5/21-D1(用野生型Den-1 C端E蛋白片段的编码核酸和野生型Den-1 N端C15/截短的prM多肽的编码核酸延伸PRM15/tE多肽的编码多核苷酸形式的克隆5/21为C15/全长prM/全长E多肽的编码多核苷酸形式的5/21-D1)(SEQ ID NO：201)，其编码重组的5/21-D1(C15/全长prM/全长E形式)多肽(SEQ ID NO：201)。
类似的，亲本DEN-4 C15/全长prM/全长E密码子优化核酸序列被用于延伸2G11(SEQ ID NO：157)和6E12(SEQ ID NO：159)的核苷酸序列，以产生C15/全长prM/全长E核苷酸序列形式的“延伸的”2G11-D4和6E12-D4核苷酸序列(分别为，SEQ ID NOS：204和202)，其编码重组的2G11-D4和6E12-D4(C15/prM/E形式)多肽(分别为，SEQ ID NOS：139和141)。如上所述所有上述获得的C15核酸/全长prM核酸/全长E核酸序列形式的重组核酸被扩增并克隆到pMaxVax 10.1载体。C15核酸/全长prM核酸/全长E核酸形式简称为“C15/prM/E”或“C15/全长prM/全长E”形式。
用实施例9所述的技术，注射pMaxVax 10.16E12-D4和pMaxVax 10.15/21-D1质粒载体到小鼠，然后在初次DNA质粒载体注射后76天从中收集抗血清。未延伸克隆的pMaxVax 10.16E12和pMaxVax 10.12G11也在类似的条件下注射于小鼠。这些小鼠的抗血清也在初次DNA质粒载体注射后76天进行收集。从这些小鼠中获得的抗血清被用于实施例9所述的噬斑减少中和滴定实验，计算该实验的PRNT50效价的倒数，并且与实施例9所述实验的结果相比较。在两组实验中观察到的组合的PRNT50效价的倒数被列在图8A和8B中。
如图8A和8B中所示，该技术产生的对应于“延伸的”克隆5/21-D1和6E12-D4(C15/全长prM/全长E形式)的全部延伸的核苷酸序列编码重组的抗原，根据实施例9所提供的PRNT实验标准(＞20；血清的稀释度(倒数))，该抗原在体内诱导对所有四种登革血清型的中和抗体。对应于对每种血清型产生PRNT50效价的倒数大于80的6E12-D4的核苷酸序列(C15核酸/全长prM核酸/全长E核酸序列形式)，克隆6E12的核苷酸序列(PRM15/截短的E基因形式)产生对Den-1，Den-2，Den-3和Den-4的PRNT50效价的倒数分别为35，＞80，70和20(如，与克隆6E12-D4相比，除了Den-2，克隆6E12所观察到的对Den-1，Den-3和Den-4的PRNT50值的倒数均更低)。对应于克隆2G11的核苷酸序列也诱导对所有四种登革病毒血清型的中和抗体。
这些实验显示了产生重组的登革抗原编码核苷酸序列的方法，其中每个编码在长度上与野生型登革病毒“C15/全长prM蛋白/全长E蛋白”融合蛋白相同或基本相同(例如，具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选至少约95％(例如，87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的长度同一性)的融合蛋白。该重组的核苷酸序列编码重组的“C15/全长prM蛋白/全长E蛋白”融合蛋白。噬斑减少中和实验分析该重组融合蛋白显示用合适的野生型序列片段延伸重组的PRM15/trunE登革抗原来产生延伸的C15/全长prM/全长E登革抗原，可以增加登革病毒血清型的数目，该延伸的重组抗原诱导的抗体在体内有中和作用，并且该中和抗体应答的PRNT效价的倒数与重组的PRM15/truncE登革抗原有关。
如前所述，对于蜱传脑炎病毒(TBE)，另一类的黄病毒，表达TBE的病毒prM蛋白基因和100％的E基因可以导致病毒多肽组成病毒样(空)颗粒(VLP)，其物理和抗原性质基本类似或等同于完整病毒的性质。由于一般不含有能够产生活病毒的病毒遗传物质，所以VLP不是感染性颗粒。
本发明还包括了登革病毒样颗粒(viral-like particle)(VLPs)，其每种包含本发明的登革多肽序列，包括如，但不限于：(1)含有重组的C15信号肽/全长prM蛋白/全长E蛋白的融合蛋白；(2)含有重组的全长prM蛋白/全长E蛋白的融合蛋白(如此本文所述，有或没有任何信号序列，包括任何黄病毒信号肽)；(3)含有重组的全长M蛋白/全长E蛋白的融合蛋白(如本文所述，有或没有任何pr部分或pr部分的片断)和(4)重组的全长E蛋白(如本文所述，有或没有任何信号序列，包括任何prM或其片断)。
在本实例中，本发明的重组的VLPs能够通过如下所述制备。细胞(如293细胞)被用含有编码本发明重组蛋白或融合蛋白重组核酸的质粒载体转染(如包括任何上面(1)到(4)所述的蛋白。转染的DNA序列分别被翻译为相应的重组蛋白或融合蛋白；在一些实例中，产生了重组融合蛋白，该融合蛋白在细胞中被蛋白酶进一步剪切为其组分，产生如全长prM蛋白和全长E蛋白；C15信号肽；M蛋白和E蛋白；以及pr片段(一般的分解)。一个上述表达的蛋白/肽与至少一个其它的上述蛋白/肽相结合或组装，组成低聚物并且该低聚物在细胞中组装形成重组的VLPs。成熟的颗粒通过胞外分泌从细胞中释放到培养基中。在一些实施方案中，获得的VLPs可以进一步包含，结合或组装细胞膜材料。在一些实例中，获得的重组VLP不含有信号肽序列。在表达和组装后，本发明的VLPs可以通过如梯度离心或其它本领域已知的方法进行分离。本发明的这种重组VLPs能够有效的用于预防性和/或治疗性治疗本文所述疾病或紊乱的方法或本文所述的同时检测或诊断样品中对两种或多种(如两种，三种，四种)血清型的登革病毒的抗体的诊断实验，例如来自受试者的生物样品，如有登革病毒感染风险的人类患者。
实施例13
该实施例进一步显示了本发明重组登革病毒抗原的改良的表达和/或分泌。
准备293细胞并且用pMaxVax 10.12G11，pMaxVax 10.118H6，pMaxVax10.1Den-3PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1Den-4PRM15/tE CO和pMaxVax 10.1null质粒载体转染。被转染的细胞在适合转基因表达(或异源核苷酸表达)和分泌的条件下培养72个小时。不含登革病毒核苷酸序列的对照载体(pMaxVax 10.1null载体)同样包括在内以进行比较。获取每个所述培养的无细胞培养基，用于标准的聚丙烯酰胺电泳和膜印迹，并且按照实施例1中涉及的技术将膜温育于小鼠腹水中获得的抗DEN-1，DEN-3和DEN-4的抗体以及酶交联第二抗体的混合物中以产生蛋白质印迹。对应于pMaxVax 10.12G11和pMaxVax 10.118H6表达的重组2G11和18H6登革抗原的泳道中含有明显更多的登革E蛋白，表现出来的是显示为分别比对应pMaxVax 10.1Den-3PRM15/tE CO，pMaxVax 10.1Den-4PRM15/tE CO所表达野生型Den-3PRM15/tE和Den-4PRM15/tE登革抗原的条带更黑、更宽的带(数据未给出)。该结果表明分别由pMaxVax 10.12G11和pMaxVax 10.118H6表达的重组2G11和18H6登革抗原有更高水平的表达和/或分泌。该结果证明本发明的重组登革病毒抗原有更好的分泌和/表达。
实施例14
该实施例显示使用递归序列重组方法生产重组的C15/全长prM/全长ECO登革核苷酸序列和其编码的重组融合蛋白。还生成了含有该重组核苷酸的文库。
Den-1Prm15/tE CO，Den-2Prm15/tE CO，Den-3Prm15/tE CO和Den-4Prm15/tE CO核苷酸序列用实施例12的技术延伸以分别获得Den-1C15/全长prM/全长E CO，Den-2 C15/全长prM/全长E CO，Den-3 C15/全长prM/全长E CO和Den-4 C15/全长prM/全长E CO登革核苷酸序列。从大肠杆菌的扩增中分离上述4种延伸的编码抗原的序列中每种的质粒DNA，纯化，并将其作为实施例1中所述的递归序列重组的起始序列材料。重组核酸用合适的拯救引物分离并且连接到pMaxVax 10.1载体中。大肠杆菌的文库转染按实施例2所述的方案进行。
实施例15
该实施例显示本发明的包含重组融合蛋白的重组登革病毒抗原在体内和/或离体诱导、增强或调控产生与多种血清型的登革病毒反应(或结合或特异性结合)的抗体方面的能力，重组融合蛋白包括重组C15信号肽/全长prM蛋白/全长E蛋白、重组全长prM蛋白/全长E蛋白或重组全长M/全长E蛋白。
分别通过用四种编码WT Den-1，Den-2，Den-3和Den-4多肽的人密码子优化的登革病毒核苷酸序列作为亲本序列进行递归序列重组从而获得重组核酸序列文库。每个该亲本核苷酸序列含有：编码甲硫氨酸的核酸，编码各WT登革病毒的衣壳(C)蛋白的C端最后15个氨基酸残基的核苷酸序列(作为信号序列)，编码各WT登革病毒的全长prM序列的核苷酸序列，以及编码所述各WT登革病毒的全长E蛋白的核酸序列。每个该亲本编码的重组融合蛋白含有在N端的Met残基，15个氨基酸残基的重组氨基酸序列作为信号序列，重组的全长prM蛋白和重组的E蛋白。
点印迹分析细胞培养基上清液，其中每个上清液从用特定的pMaxVax10.1载体转染的293细胞中获得，该载体含有通过改组C15/全长prM/全长包膜登革病毒亲本人密码子优化核苷酸序列而获得的具体的改组核苷酸序列。分析表明下述的重组C15/全长prM/全长E登革抗原克隆被表达，分泌和被DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4小鼠抗体的混合物识别：21C1(SEQID NO：142)，23C12(SEQ ID NO：143)，23D5(SEQ ID NO：144)，23F5(SEQ IDNO：145)，23G3(SEQ ID NO：146)，23H7(SEQ ID NO：148)，25B6(SEQ IDNO：236)，25B10(SEQ ID NO：237)，25D4(SEQ ID NO：238)，25E11(SEQ IDNO：239)，25H4(SEQ ID NO：240)，27A11(SEQ ID NO：241)，27G6(SEQ IDNO：242)，28A11(SEQ ID NO：243)，28C1(SEQ ID NO：244)，28C11(SEQ IDNO：245)，28E12(SEQ ID NO：246)，28F9(SEQ ID NO：247)，28113(SEQ IDNO：248)，28H9(SEQ ID NO：249)。包含克隆21C1，23C12，23D5，23F5，23G3和23H7的改组C15/全长prM/全长E蛋白核苷酸序列的pMaxVax 10.1DNA质粒载体被分离、纯化，并且在如实施例5所述的DNA注射方案之后，连同pMaxVax 10.1null一起被注射到小鼠中。一式三份的进行实验(即每种所述质粒在3只小鼠中重复注射)。小鼠的血清在合适的时间点提取(如初次DNA注射(第0天)后28，55和76天)，并且如上所述的用DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4病毒覆盖的ELISA平板以进行ELISA分析。计算每个测试的DNA载体在ELISA实验中观测到的平均OD值。76天(“d76”)的抗血清的计算的结果公开于图10中。
图10显示所有的这些重组全长prM/全长E登革抗原(Ag)(与C15信号肽一起表达)在体内诱导产生在体外与所有4种DEN血清型反应的抗体群。在ELISA实验中获得的pMaxVax 10.123G3，pMaxVax 10.123H7OD值是最高的而且在4种登革病毒血清型的所有4个实验中一样强。C15/全长prM/全长E登革抗原的信号序列一般被切除，并且该类似的或相等的免疫应答和免疫刺激结果被认为是由全长prM/全长E登革抗原多肽产生的。
该实验的结果表明在本发明的体内、回体和/或体外的方法中，本发明含有重组C15/全长prM/全长E蛋白序列的重组抗原能够诱导、增强和/或调控与一种、两种、三种或4种登革病毒血清型反应(或结合或特异性结合)的抗体的产生。
实施例16
该实施例显示本发明的重组登革病毒抗原的分泌和/或表达特征，如蛋白质印迹分析所测定，该抗原含有重组的融合蛋白，包括如重组的C15信号肽/全长prM/全长E蛋白序列。本发明还包括重组的全长prM/全长E蛋白序列和重组的全长M/全长E蛋白序列，其分别通过从C15信号肽/全长prM/全长E蛋白序列上酶切除C15信号肽和从全长prM/全长E蛋白序列上酶切除“pr”片段而产生。
单个293细胞培养物每个用含有对应下面八种典型的的重组克隆中一种的核苷酸序列的pMaxVax 10.1载体转染：23H7，23G3，23F5，23D5，23C12，23A11，21C1和21B4。每个该克隆的核酸序列通过递归序列重组(参见如实施例15)和选择性筛选实验产生和确定。克隆23A11和21B4在用实施例1和15描述的技术进行ELISA分析时结果为阴性的。ELISA分析表明余下的六个克隆分泌和/或表达重组抗原，该抗原在体内诱导产生与全部四种血清型反应的抗体(图10)。在适合转基因表达的条件下经过一段适当的培养阶段后，收集转染的293细胞培养物中未浓缩的上清液(培养基的无细胞部分)，用聚丙烯酰胺电泳分离，印迹到适合实施例1所述的蛋白质印迹分析的膜上，其采用从小鼠腹水中获得的抗DEN-1，DEN-3和DEN-4的抗体。与硝化纤维膜结合的蛋白与从小鼠腹水中获得的对DEN-1，DEN-3和DEN-4的抗体共同培养。能够在体内产生多价抗体应答(如23H7，23G3，23F5，23D5，23C12，21C1)的重组抗原(通过用编码C15/全长prM/全长E蛋白的核苷酸序列形式进行DNA改组和合适的筛选/选择过程而产生)与蛋白质印迹中至少一个可见的带有关(数据未给出)，然而不能诱导该抗体应答的克隆(如23A11和21B4)与蛋白质印迹中任何明显的带无关，这表明与重组抗原23H7，23G3，23F5，23D5，23C12，21C1相比，由23A11和21B4克隆编码的蛋白极少被表达和/或分泌。
另外，对应于多聚物(如全长E蛋白二聚物，三聚物和/或其它多聚物和/或错误折叠的蛋白复合物)的带可以在蛋白质印迹中观测到(数据未给出)。由于野生型E蛋白被认为组成病毒体表面的同源二聚体杆(homodimericrod)(FIELDS VIROLOGY，同上)，蛋白质印迹上显示的对应于E蛋白二聚体大小的带表明主要的重组包膜蛋白正确折叠了。本发明其它多肽的多聚体包括，但不限于，如C15/全长prM/全长E蛋白多聚物；全长prM/全长E蛋白多聚物；全长M/全长E蛋白多聚物；PRM15/全长E蛋白多聚物；PRM15/截短的E蛋白多聚物)。
这些实验的结果显示，本发明的选择的核酸序列能够有效的表达重组登革抗原为分泌蛋白。
实施例17
本实施例显示本发明各种核酸与相应的野生型序列相比的序列多样性。
16B4、16G11、18H2、18H6、18E11、18E10、18E9、14G10和18D7的氨基酸序列，每种含有PRM15/截短的E形式，被检测并且与每种WT亲本多肽，DEN-1 PRM/截短的E，DEN-2 PRM/截短的E，DEN-3 PRM/截短的E和DEN-4 PRM/截短的E的氨基酸序列相比较。分析的结果在图11中给出。如该图所示，本发明的重组的PRM15/截短的E蛋白抗原显示复杂的序列多样性，含有多重(multiple)氨基酸片段或片断，每个该片段或片断含有四种亲本WT PRM15/tE蛋白登革病毒抗原序列的一个或多个氨基酸残基。
对应于克隆23G3，23H7，23F5，23C12，23D5，21C1，21B4，23A11，5/21-D1和6E12-D4的重组多肽抗原，其每种含有C15/全长prM/全长E蛋白形式，被类似地测序，并且与对应每种DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4的C15/全长prMV/全长E融合蛋白的氨基酸序列进行比较。这些抗原类似地具有复杂的序列多样性，含有多重氨基酸片断或片段，每个所述片断或片段包含四种亲本WT C15/全长prM/全长E蛋白登革病毒抗原序列的一个或多个氨基酸残基(数据未给出)。
实施例18
该实施例表明，除了其它的以外，本发明的重组登革病毒抗原在受试者体内，离体给药到受试者的组织或细胞，和/或在体外细胞群中诱导或促进保护性免疫应答的能力。在该实施例中，该免疫应答由含有编码上述抗原的核苷酸序列的质粒载体表达的本发明的重组登革病毒抗原所诱导或促进。给药质粒载体的剂量足以产生免疫原性量(immunogenic amount)的重组抗原。保护性免疫应答可以通过在体内，回体，和/或在体外给药受试者以免疫原性剂量的含有该重组登革病毒抗原的多肽类似地诱导或促进。
登革病毒一般不在成年小鼠中诱导临床症状。然而，将登革病毒注射到幼年小鼠(如约3-6个星期大)的小脑，会导致瘫痪，脑炎并且死亡。该小鼠模型能够这样被用于评估用本发明重组多肽或编码该重组多肽的核酸进行免疫的小鼠产生的血清的体内保护性功效。
小鼠用100μg的下述一种载体的质粒DNA进行免疫：pMaxVax10.118H6，pMaxVax10.12G11-D4，pMaxVax10.16E12-D4，pMaxVax10.118H6/pMaxVax10.12G11-D4/pMaxVax10.16E12-D4混合物，pMaxVax10.1Den-2PRM15/E CO，pMaxVax10.1Den-2 C15/fullprM/full E，pMaxVax10.1Den-3 C15/fullprM/full EP，四种WTDEN-1-4PRM15/tE CO的混合物，四种DEN-1-4C15/fullprM/full E的混合物和pMaxVax10.1null(在图12中称为“对照载体”)；一组小鼠仅用PBS缓冲液进行免疫。对应克隆18H6，2G11-D4和6E12-D4核酸序列相应为SEQ IDNOS：235，204和202；该序列用PRM15/tE(对应18H6)和C15/全长prM/全长E(对应2G11-D4和6E12-D4)亲本核苷酸序列产生。在首次DNA注射10天后重复注射。首次DNA注射后21天，通过在大脑内注射100LD50的DEN-2病毒颗粒攻击小鼠。每种测试载体或对照的注射和感染实验在5只不同的小鼠中重复进行。
攻击后28天，观察小鼠的瘫痪、脑炎和/或死亡情况。图12给出了在攻击后最初的28天存活率的图表。图12给出的结果显示注射编码18H6和WT DEN-2多肽抗原(每个以PRM15/tE形式)或6E12-D4和WT DEN-2(每个以C15/全长prM/全长E形式)的质粒，以及三种重组抗原(18H6，2G11-D4和6E12-4)在PBS中的组合物或混合物能够在体内诱导、增强或促进对DEN-2病毒激发的保护性免疫应答。在DEN-2病毒攻击后28天，所有用上面所列重组克隆免疫的小鼠是正常的，因而被保护。在DEN-2病毒攻击后28天观察，用任何WT DEN-2多肽(或PRM15/tE或C15/全长prM/全长E形式)免疫的小鼠也被保护。相反，在DEN-2病毒攻击后28天观察，注射PRM/tE或C15/全长prM/全长E形式的四种WT DEN-1-4抗原的四价混合物的小鼠中仅有50％被保护。在DEN-2病毒攻击后28天观察，注射DEN-3 C15/全长prM/全长E抗原的小鼠中仅有50％被保护。所有的PBS免疫小鼠和75％的注射对照载体(pMV10.1的小鼠在DEN-2病毒攻击后12天死亡。这些实验的结果显示本发明的上述重组多肽抗原(和编码这些重组抗原的核酸)能够在体内诱导、促进和/或增强对至少野生型Den-2病毒的保护性免疫应答。如果需要，使用其它动物模型也可以进行类似的实验。
进行类似的实验，用这些重组的抗原免疫小鼠(或其它动物模型)，并且用Den-1，Den-3和/或Den-4病毒攻击以评估该重组抗原诱导、促进或调控的对一种或多种这些WT登革病毒的免疫应答。
类似的实验，采用本发明的其它抗原和/或编码该抗原的核酸免疫的小鼠或其它哺乳动物模型来进行，以及用四种WT登革病毒血清型中的至少一种攻击。
实施例19
本实施例举例说明了本发明的重组抗原的制备和应用，包括，例如，四价抗原，在探测，诊断，筛选和/或确定样品，如，哺乳动物的生物样品中存在的对至少一种，优选两种或多种，甚至更为优选地，所有4种WT登革病毒血清型的抗体的方法中作为诊断抗原或筛选抗原(例如，诊断工具)。该重组抗原可被用于血清分析，被覆盖在微量滴定板上或点滴在斑点印迹分析的合适膜上(如，硝化纤维，尼龙)或浸量尺膜上。该微量滴定板或膜或浸量尺膜(dip-sticks)可以用从转染细胞的上清液中的重组抗原直接包被。
如实施例5中所述的与克隆2/7，5/21，2G11和6E12对应的每一种均由重组的PRM15/tE蛋白形式的本发明的四种四价抗原被选择，作为诊断抗原用于测试。重组的C15/全长prM/全长E多肽抗原(例如，2/7-D1，5/21-D1，2G11-D4，和6E12-D4)，其确信可形成VLPs，可以同样被应用。采用重组抗原作为诊断抗原或本发明的探测，诊断，筛选或确定对样品中4中WT登革病毒血清型中的一种或多种的抗体的存在的诊断或筛选方法中的诊断或筛选的工具的可行性被通过斑点印迹分析证明。特别地，人类293细胞被用pMaxVax10.1质粒编码四种选择的四价抗原的每一种来进行转染。转染后的三天，获得培养基的上清液，并且以10-100μl的系列稀释在硝化纤维膜点样。为了评估实验的灵敏度，从注射了登革病毒的小鼠中获得的血清(或从其它哺乳动物，如人类中获得的血清)被在PBS以1∶2000稀释，用于探测或筛选特定类型的抗体。为了探测或筛选，膜首先被用测试血清温育，然后用连接到探测试剂(HRP(辣根过氧化物酶)，AP(碱性磷酸酶)，或FITC(异硫氰酸荧光素))上的第二抗体温育。含有斑点的培养基上清液的斑点印迹表明这些重组抗原多肽变体的每一种都被很好的分泌(图13A)，并且被所有4种类型特异性的抗DEN抗血清识别(图13B)；因此，这些克隆能够被用于探测或筛选对4种WT DEN血清型的任一种的血清抗体。更进一步的，如在图13A和13B中说明，小至大约10μl的从每个斑点的细胞培养基中获得的粗上清液足以探测到血清中类型特异性的抗DEN抗体，其使得用重组的登革抗原(包括，例如，重组的四价登革抗原)制备诊断性斑点印迹更加容易和经济。
这些实验的结果表明了即使极少量的本发明的重组登革病毒抗原(或其组合物)也可以给从受试者，例如，哺乳动物，包括人类中获得的生物样品的分析提供一个方便的底物，检测是否存在对一种或多种病毒血清型的抗登革病毒的抗体。本发明包括了探测和/或筛选在被登革病毒感染的哺乳动物，包括人类的血清中一种或多种类型特异性的抗体的存在的方法。该方法包括上面所描述的那些。此外，本发明的重组抗原(以及编码它们的核酸)可以被用于其它的诊断实验，例如，平板ELISA和浸量尺实验(dip stick assay)，用于探测感染了登革病毒的哺乳动物的血清中的一种或多种类型特异性的抗体。
本发明还包括包含一种或多种的本发明的重组抗原的，优选包括一种或多种本发明的与两种或多种抗体反应(或结合或特殊结合到)的那些重组的登革抗原，以及优选所有四种登革病毒血清型的诊断性斑点印迹。本发明还进一步提供了包含一种或多种该诊断性斑点印迹和/或一种或多种该诊断性重组抗原的试剂盒。
实施例20
本实施例举例说明了斑点印迹分析包含重组的C15/全长prM/全长E蛋白核苷酸序列的核苷酸文库和从所述文库中选择那些表达重组抗原(以重组的C15/全长prM/全长E蛋白形式或全长prM/全长E蛋白形式)的重组的核苷酸，与WT prM/E抗原各自在所述的哺乳动物细胞中的分泌和/或表达相比，该重组抗原显示出在哺乳动物中更好的分泌和/或表达。
用包含以C15/全长prM/全长E形式(或全长prM/全长E形式)编码了的分离的克隆DNA序列的质粒进行的96孔细胞培养形式进行大肠杆菌的文库转染和随后的293细胞转染，采用与实施例2和14中所描述的技术来执行。包含同样形式的质粒—4种WT登革病毒血清型的每一种的C15/全长prM/全长E融合蛋白编码核苷酸序列(或全长prM/全长E蛋白编码核苷酸序列)被用于在293细胞转染中作为对照。在重组抗原表达合适的一个阶段后，从该293细胞培养物中获得的无细胞的抽出的上层清液，随后按照生产商说明，通过标准斑点印迹技术被连接到膜上。斑点印迹膜按照实施例1所描述的用于蛋白质印迹的方法，与从小鼠腹水中获得的抗DEN-1，DEN-2，DEN-3，以及DEN-4抗体和适当的酶交联的第二抗体温育。如斑点印迹中存在更强的信号所显示的，与对照WT登革C15/全长prM/全长E的编码核酸(编码WT登革全长prM/全长E的核酸)相比，显示出更高的分泌和/或表达水平的克隆，随后被选择用于进一步的克隆和分析。
本实验证实了分析重组核酸的文库的典型策略，所述重组核酸编码具有在大小上与全长prM/全长E融合蛋白相似的氨基酸序列的重组登革抗原，该文库用来选择那些在哺乳动物细胞中比相应的相似大小的WT登革抗原显示出更好的或增强的表达和/或分泌水平的抗原。
实施例21
本实施例举例说明了每个含有在长度上与包含C15信号序列，全长prM蛋白以及全长E蛋白的融合蛋白在长度上相同或基本上相同或基本相似(例如，具有至少约75％，80％，85％，86％，87％，88％或89％，优选至少约90％，91％，92％，93％，或94％，以及更优选至少约95％(例如，约87-95％)，96％，97％，98％，99％，99.5％的长度同一性)的氨基酸序列的重组登革抗原的生产。
克隆25B10(SEQ ID NO：259)(以C15/全长prM/全长E蛋白形式)和克隆16G11(PRM 15/tE形式)(SEQ ID NO：187)的核苷酸序列被用合适的限制性内切酶消化，并且克隆16G11的核苷酸序列用足够的和合适的25B10(SEQ IDNO：259)E蛋白C端的密码子优化的核苷酸片段在它的C端(它的截短的E蛋白的C端)延伸，并且用足够的和合适的25B10(SEQ ID NO：259)的C15/全长prM的N端的密码子优化的核苷酸片段在它的N端(它的PRM15信号肽的N端)延伸，以获得具有C15/全长prM/全长E蛋白形式的重组克隆，如实施例12中所述。
相似的，重组克隆25B10(SEQ ID NO：259)(以C15/全长prM/全长E蛋白形式)和重组克隆18H6(PRM 15/tE形式)(SEQ ID NO：235)的核苷酸序列用合适的限制性内切酶消化，并且克隆18H6的核苷酸序列用足够的和合适的25B10(SEQ ID NO：259)E蛋白C端的密码子优化的核苷酸片段在它的截短的E蛋白的C端延伸，并且用足够的和合适的25B10(SEQ ID NO：259中观察到)的C15/全长prM/的N端的密码子优化的核苷酸片段在它的PRM15信号肽的N端延伸，从而获得具有C15/全长prM/全长E蛋白形式的重组克隆，如实施例12中所述。相似的，野生型DEN-4 C15/全长prM/全长E(SEQ ID NO：234)的核苷酸序列和重组克隆16G11(PRM 15/tE形式)(SEQ ID NO：187)和18H6(PRM 15/tE形式)(SEQ ID NO：235)被用合适的限制性内切酶消化，并且16G11和18H6的每一个的核苷酸序列用足够的和合适的DEN-4 C15/全长prM/全长E蛋白(SEQ ID NO：234)编码核苷酸序列的E蛋白编码序列的C端序列的密码子优化的核苷酸片段在截短的E蛋白的C端延伸，并且用足够的和合适的DEN-4 C15/全长prM/全长E蛋白的编码核苷酸序列的C15/prM的N端序列的密码子优化的核苷酸片段在PRM15的N端延伸，从而获得具有C15/全长prM/全长E蛋白形式的各自的重组克隆，如实施例12中所述。得到的重组核酸被称为16G11-25B 10ext(SEQ ID NO：255)(即，以PRM 15/tE形式的16G11用合适的25B 10核苷酸序列延伸至C15/全长prM/全长E形式)；16G11-D4(SEQ ID NO：254)(即，以PRM 15/tE形式的16G11用合适的WTDen-4核苷酸序列延伸至C15/全长prM/全长E形式)；18H6-25B 10ext(SEQ IDNO：255)(即，以PRM 15/tE形式的18H6用合适的25B10核苷酸序列延伸至C15/全长prM/全长E形式)；18H6-D4(SEQ ID NO：254)(即，以PRM 15/tE形式的18H6用合适的WT Den-4核苷酸序列延伸至C15/全长prM/全长E形式)。这些延伸的核酸序列被扩增和克隆到pMaxVax10.1载体上，如上文所述。16G11-25B10ext，16G11-D4，18H6-25B10ext，和18H6-D4的相应重组多肽序列分别为SEQ ID NOS：255，254，257和256。这些扩增的质粒通过基本上如实施例15所述的注射小鼠以及随后的ELISA实验在体内被分析。克隆25B10，16G11-25B10ext，16G11-D4，18H6-25B10ext，和18H6-D4的重组抗原全部在小鼠中诱导在ELISA实验中与所有4种登革病毒强烈交叉反应的抗体(数据未显示)。
实施例22
本实施例举例说明了采用ELISpot实验(酶交联免疫SPOT)以测定分泌γ-干扰素的T淋巴细胞(T细胞)数量，作为本发明的多肽激活T细胞作用的标志。
选自适当的用于检测登革病毒疫苗的哺乳动物模型的受试者(包括，例如，但不限于，同系产生的小鼠，猴子或黑猩猩)或人类患者(例如，在临床I阶段实验中)被注射特定的pMaxVax10.1DNA质粒载体(约0.5-1ml不含内毒素的载体(例如，PBS或其它合适的盐缓冲溶液，0.1M NaCl，或其它任何溶液具有约7.4pH值的合适的载体)中含有约0.5-2mgDNA质粒载体作为注射量，用于，例如，人类或猴子；与前述实验中给体内小鼠实验使用的质粒的量/成分适合于小鼠)，其中每个载体包含本发明的具体的重组抗原的编码核苷酸序列。例如，每个受试者被注射包含下述一种的pMaxVax10.1DNA质粒载体：1)编码PRM 15/tE融合蛋白的重组的核苷酸序列(例如，具有SEQID NOS：157(2G11)，158(5/21)，159(6E12)，185(16B4)，187(16G11)，172(18E11)，200(18H2)，235(18H6)的核苷酸序列)；2)编码C15信号肽/全长prM蛋白/tE融合蛋白的重组的核苷酸序列(例如，具有SEQ IDNOS：254(16G11-D4)，255(16G11-25B10ext)，256(18H6-D4)，257(18H6-25B10ext)的核苷酸序列)(见，例如，实施例1和12所描述的方法)；或本发明的其它重组序列。可选的，但优选的，初次DNA质粒给药后，在初次DNA质粒注射后约14-28天，给予免疫原性量的由包含在该质粒载体(初次呈递)的同一核酸编码的重组多肽或者通过再次施用相同的pMaxVax10.1载体来加强。优选的，第二次(多肽)蛋白加强(用同样的重组多肽)和/或DNA质粒载体加强(用编码同样重组多肽的同样的质粒载体)在初次感染后的2-6月之间被给药。一组对照受试者不进行注射，另一组对照受试者注射pMaxVax10.1null。对于被测试每种质粒构建体优选用多位受试者进行试验。
血清在合适的测试时间(例如，在初次DNA质粒注射后约60天，120天，或180天，优选包括在最后的重组多肽抗原/DNA载体加强后2-4周的衰退期)从受试者中收集，并且T细胞通过本领域公知的技术进行分离。例如，在人类患者的临床研究中，外周单个核细胞(PBMC)可以通过在Histopaque-1077(Sigma，St.Louis，MO)中离心(用Ficoll梯度分离)，从人血液中分离。T细胞按照生产商的说明，通过用抗人类CD2单克隆抗体(mAbs)染色细胞以及采用FACS Vantage SE分类CD2阳性(CD2+)细胞，或用磁珠(例如，Dyn abeads，Dynal，Lake Success，NY)去除mAbs染色特异的CD14，CD20，CD56和CD94细胞，从而达到分离和纯化。在该技术中有用的抗体可以从Pharmigen(San Diego，CA)购买到。按照生产商的说明，采用DynalDynabeads磁分离T细胞，首先通过用纯的抗CD14，CD20，CD56和CD94的单克隆抗体标记PBMCs，随后用羊抗小鼠Dynabeads标记细胞而完成的。非T细胞用磁排除从而移去。当用CD3mAbs染色分析时，T细胞的纯度应当达到96-99％，CD3mAbs可以从Pharmigen(San Diego，CA)购买到。
96孔的ELISpot平板用对IFN-γ特异性的抗体(免疫球蛋白(Ig))包被。例如，NIB42捕捉抗体(Pharmigen)可以被用于平板包被。其它的可被应用的捕捉抗体也是本领域所公知的。抗体(Ig)结合到ELISpot平板上的硝化纤维上。
被激活的T细胞被转移到ELISpot平板，IFN-γ在培养阶段被释放。在T细胞周围局部释放的IFN-γ被结合，因此通过IFN-γ特异的抗体被“捕捉”。细胞以及任何过量的细胞因子被洗掉。还对IFN-γ特异的第二抗体被加入。该抗体与能够转换反应物至不能溶解的染色产物的酶相结合。例如，4S.B3生物素化的探测抗体(Pharmigen)可被用于测量IFN-γ的产生。其它的可应用的探测抗体是本领域公知的。再洗涤平板一次，并加入酶底物。底物转化为不溶的产品，形成有颜色的斑点，表示被捕获的由临近的T细胞分泌的细胞因子的区域。根据生产商的说明，用显微镜或使用数字成像系统如ELISpotreader(如Scanalytics，Inc.发售的ELISpot reader)计数有颜色的斑点。
相对于得自注入pMaxVax10.1null或没有进行DNA注射的机体血浆的T细胞，得自已经注入包含本发明重组核酸的pMaxVax10.1载体的机体血浆的T细胞显示显著的更高水平的IFN-γ表达。
本实施例说明运用ELISpot来量化循环中的抗原特异性的CD8+T细胞的数量。本实施例还证明了T细胞活性的抗原特异性的增加与将编码本发明的重组多肽的DNA序列给药于机体，如哺乳动物有关。
实施例23
本实施例显示与由本发明重组多肽诱导或调节的IFN-γ表达有关的T细胞ELISPot分析。
外周血单个核细胞(PBMCs)的哺乳动物模型或人体中分离，并用一种或更多本发明的重组抗原攻击攻击约6-24小时，例如，但不限于PRM15/tE形式的SEQ ID NOS：66(克隆2G11)，67(5/21)，69(6E12)，89(16B4)，93(克隆16G11)，108(18E11)，109(18H2)，110(18H6)，或C15/全长prM/全长E形式的SEQID NOS：254(克隆16G11-D4)，256(16G11-25B1Oext)，257(18H6-D4)，和/或258(18H6-25B10ext)，然后与酶标记的细胞因子抗体混合。该混合物然后被化学处理，以使被结合的抗体-细胞复合物(即，细胞因子-分泌型细胞)染成蓝色。
可用于定量IFN-γELISPot分析的IFN-γELISPot分析可以购自BiosourceInternational，Camarrillo，CA。该分析按照生产商的说明书，使用标准技术完成。例如，在单细胞悬液中计数IFN-γ分泌型细胞的是由往各孔中加入50μl稀释的包被的抗体，然后加入50μl的PBS进行。每个孔在4℃下培养过夜。然后抽吸样本，用缓冲液冲洗5-10次。然后把200μl包被后的(post-coating)溶液加入到各孔，然后在37℃培养一小时或在4℃培养过夜。孔被吸取，不要冲洗。将1001μl预刺激的单细胞制备物加入各孔中。平板用盖子盖起来，在包含7％CO2湿润空气中和37℃下培养5小时。抽吸各孔，加入200μl冰冷的去离子水，把平板置于融化冰中10分钟。用PBS冲洗容器10次。加入100μl稀释生物素化的抗体溶液，盖住容器，在37℃下培养1小时或在4℃下培养一晚。抽吸孔，用PBS冲洗容器5-10次。各孔中加入50μl稀释的标记抗生素抗体溶液(GABA)。盖住平板，在37℃下培养1小时。抽吸孔，冲洗5-10次。各孔中加入30ul的活化溶液。在光显微镜检查斑点。当清晰的斑点已经形成，可以通过用蒸馏水冲洗孔来使反应停止。将使用PRM 15/tE融合蛋白形式和C15/全长prM/全长E融合蛋白形式的重组克隆的结果，与从用野生型登革病毒PRM15/tE融合蛋白和C15/全长prM/全长E融合蛋白免疫的机体获得的结果进行比较。这些结果还与得自没有用任何登革病毒抗原免疫的机体的结果相比较。
ELISpot分析的结果显示，本发明的重组多肽可以诱导和/或调节从T细胞表达IFN-γ。本发明还提供用本发明的重组多肽和/或多核苷酸进行ELISpot分析的可选择技术。
实施例24
本实施例显示T细胞增殖分析来测量响应用本发明的重组多肽抗原刺激的患者T细胞的增殖。
适宜机体(优选人类患者)中的T细胞由实施例22的pMaxVax 10.1载体刺激，然后取出全血样本，和分离特异性T细胞子集。附着到顺磁性颗粒的单克隆抗体识别特异的细胞表面标志，当样本放入磁场中时，T细胞就被分离出来。T细胞激活的信号可以由该技术测定。例如，增加的细胞内ATP蓄积与T细胞激活有关，这样荧火虫荧光素酶的发光ATP分析可用于测量被分离细胞中的激活水平(商业上适宜的分析法的例子是购自Cylex的Luminetics分析)。
另外的或可选的，T细胞增殖可以由3H-胸苷结合测量。简言之，293细胞(或COS-7细胞或其它感兴趣的细胞)可以用编码本发明的重组登革病毒抗原如，重组四价登革病毒多肽抗原的pMaxVax10.1质粒载体转染，(如所述的，例如实施例22)或缺乏插入的对照质粒载体(如，pMaxVax10.1载体)。根据生产商的说明，Effectine HTP(Qiagen，Valencia，CA)96孔细胞转染方法可用于质粒转染。
转染24小时后，大约5×104个纯化的T细胞(所述的纯化，如，在实施例21中)在存在辐射(5000弧度(rads))转染子和溶解抗人体CD3mAbs(5μg/ml)，以96-孔平板培养形式(如，该系统可购自VWR，Westchester，PA)，在37℃和包含5％CO2的湿润气体，以三份培养具有10％FCS(200ul/容器)的Yssel′s介质中，培养总共3天(72小时)。1微居里(Ci)/孔3H-胸苷(Amersham，Piscataway，NJ)可以在培养期的最后8小时时脉动加入到细胞培养物中，细胞采用细胞采集器(Tomtec，Hamden，CT)采集并在滤纸上计数。培养孔中3H-胸苷的摄取/结合是由根据产品说明书，使用MicroBeta闪烁计数器(Wallac，Turku，Finland)在干燥滤纸上测量放射性来确定的。T细胞的增殖以三个孔的平均每分钟计数(cpm)来表示。
至少一些本发明的编码重组多肽抗原的质粒(如，本发明的编码重组四价多肽抗原的质粒)诱导的T细胞应答和/或T细胞增殖的水平显著高于质粒对照和/或至少与编码具有相同或基本上相似或基本上相同长度(如，至少大约75％，80％，85％，86％，87％，88％ or 89％，优选至少大约90％，91％，92％，93％，或94％，更优选至少大约95％(如，约87-95％)，96％97％，98％，99％，99.5％相同长度)的WT登革病毒融合蛋白的质粒具有相同水平，(如，如果质粒编码包含PRM15/tE融合蛋白重组多肽抗原，编码了包含DEN 1，2，3，或4PRM/tE蛋白的WT登革病毒多肽的质粒被用于比较；如果编码C15/全长prM/全长E融合蛋白的重组多肽抗原的质粒；编码了包含DEN 1，2，3，或4的C15/全长prM/全长E融合蛋白的WT登革病毒多肽的质粒被用于作为对照)。以显著高于由质粒载体对照(或其它对照)的水平，和优选以与分别包含野生型登革病毒PRM15/tE编码序列或C15/全长prM/全长E编码序列的pMaxVaxl10.L相似或相当的水平诱导或促进T细胞的增殖和/或活化的编码了重组PRM15/tE编码序列或重组的C15/全长prM/全长E编码序列的质粒载体被确定，、选择或分离用于进一步表征(例如，测序，在其它T细胞活性试验，和/或多样性分析中的作用)。
本实验显示了适合于评价本发明的重组多肽抗原对于T-细胞增殖效果的分析法。本实验也显示，至少一些本发明的重组抗原诱导或促进哺乳动物细胞中的T细胞增殖和/或T细胞活化。
实施例25
本实施例表明应用细胞毒性分析来定量具体样本中表达本发明重组登革病毒抗原的T细胞的数量。
如实施例22所述，293细胞的群体用编码重组多肽抗原的pMax Vax10.1质粒载体，pMaxVax10.1null质粒载体(对照组)转染，或不进行转染。转染细胞以铬的放射性同位素(51Cr)标记。得到如实施例21所述的分离和纯化的机体的T细胞(如人体T细胞)，与靶细胞混合，混合物培养几个小时。抗原表达细胞被溶解，释放51Cr到培养液中。重组抗原特异溶解可以通过比较在存在或缺乏机体效应细胞时，表达重组抗原或对照抗原的293细胞的溶解来计算。这些试验的结果可以由细胞显示重组特异抗原的溶解的百分率来表示。这些试验中显示重组抗原特异细胞溶解的百分率显示，本发明的重组抗原可以在机体内诱导显著的细胞毒性免疫应答。本实施例提供一种测量表达重组登革病毒特异抗原的T细胞量(数量)的方法。
实施例26
本实施例显示运用四聚体分析(tetramer assay)测量识别(和/或结合或选择性结合)在本发明的重组多肽中的特异性表位的CD8+T细胞的总量(数量)。
存在在本发明的重组多肽中的假定的MHC类别I结合序列可以由使用适宜表位鉴定法或程序的序列分析鉴定，如，斯坦福大学开发的BONSAI算法，TEPITOPE算法，SYFPEITHI程序(由Rammensee等提供算法)，MAPPP p程序(见http：//www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)，PREDEP程序(见http：//bioinfo.md.huji.ac.il/marg/Teppred/mhc-bind/)，ProPred程序(http：//www.imtech.res.in/raghava/propred)，和BIMAS程序(见http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio)，其各种描述见于，如Altuvia等，Mol.Immunol.，31，1-19(1994)，Brusic等，Nue Acids Res.，22，3663-3665(1994)，Hammer等，J Exp.Med.，180，2353-2358(1994)，Parker等，J.Immunol.，152，163-175(1994)，Sturniolo等，Ad.Immunol.，66，67-100(1997)，和Cunha-Neto，Braz.J.Med.Biol.Res.，32(2)，199-205(1999)，或适宜分析本发明的重组多肽的氨基酸序列的其它软件。测试多肽的氨基酸序列也可用序列分析确定预期的T细胞表位，使用软件程序如EpiPlot 1.0(见http：//genomics.com/software/files/epiplotl.exe)，Brown University School of Medicine开发的EPIMER/EPIMAX算法(现在由EpiVax，Inc.(Providence，Rhode Island)掌握)，或序列分析算法，如SOHHA算法(见Reyes等，MethodsEnzymol 202：225-38(1991))。另外，在本发明的多肽序列用于鉴别和/或预告T细胞表位的信息和软件也可见网页：http：//www.epitope-informatics.com，http：//www.vaccinome.com/index.htm，http：//syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm，http：//www.imtech.res.in/raghaa/propred/index.html，http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlaj3ind/，http：//epivax.com/epitope.html，andhttp：//www.tepitope.com.
鉴别T细胞和B细胞表位的相关技术可见于，如WO 99/53058，Kammerer等，Clin Exp Allergy 27：1015-1026(1997)，Sakakibara等JVetMed Sci 60：599-605(1998)，Jiang等，Protein Sci 9：403-416(2000)，Milik等，Nat Biotech 16(8)：753-756(1998)，Walshet等，Jlmmunol Meth，121：1275(1989)，和Schoofs等，Jlmmunol 140：611-616(1987)。
T细胞如实施例22所述分离和纯化。T细胞与包含简单预测MHC I结合序列或上述方法/分析之一确定的T细胞表位的多肽结合，该多肽结合到HLA-I类分子(辅助将表位展示到免疫系统的CD8+细胞表面的分子)—更特别的，荧光标记的MHC类别I分子的合成四聚体形式。因为CD8+细胞识别结合MHC类别I分子的短多肽形式的抗原，具有适宜T细胞受体的T细胞结合标记的四聚物(tetramer)，可以通过实施例2的流式细胞仪来进行定量。具有针对特异性表位的受体而没经过在前抗原刺激的T细胞可被定量。这些试验的结果是高度定量和灵敏的。
至少一些重组多肽包含在上述分析中与T细胞反应(或结合或特异性结合)的表位。这些实验的结果证实了伴随至少本发明的一些重组多肽的细胞毒性作用。
本实验提供一种适宜的分析法，用于量化与本发明的多肽反应(或结合或选择性结合)的CD8+T细胞。本实验也提供用于确定这些多肽中新的T细胞表位的技术。
实施例27
本实施例显示一种恒河猕猴(rhesus macaque monkey)的免疫方法，给予其足够有效量的编码本发明免疫原或抗原的核苷酸序列来诱导猴子产生抵抗一种或多种(优选抵抗两种或多种)登革病毒血清型的保护性免疫应答。该剂量可以是免疫原性量(immunogenic amount)或抗原量(antigenic amount)。使用野生型登革病毒抗原和猕猴的DNA免疫方法已经被公开(见，如Raviprakash等，J.Gen.Virology 81：1659-1667(2000)中的方法，其引入本文作为参考)，和这些方法可选择地选用或在需要时改进。
本发明的RNA或DNA序列可用于下文所述的方法。在下面的研究中，免疫抗原或抗原编码DNA序列可用于每个研究中。每个研究都遵守“Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals.Institute of Laboratory AnimalResources，″National Research Council，DHHS Publication No.NIH-86-23(1985)中的指导方针。动物来自Walter Reed Army Institute of Research animalfacility in Forest Glen，MD。
大约7-24岁的猕猴(Macaca mulatta)可通过ELISA分析和噬菌斑减少中和试验预先测定抵抗四种登革病毒血清型中每种登革病毒的抗体的存在。没有证据显示其接触了登革病毒(如，对登革病毒呈血清阴性反应)的猴子每三只一组分为几组。非对照组的猴子每只都以肌内注射(i.m.)或皮内注射(i.d.)组合物的方式接种，该组合物包含免疫原量或抗原量的(如，约0.1μg到大约5mg)包含(如本发明实施例22)核酸序列的pMaxVax10.1DNA质粒载体，和载体，例如无内毒素载体，例如药学可接受载体(如PBS或其它适宜的盐缓冲液，0.1M NaCl，或其它维持pH值大约7.4的适宜载体)；该载体任选还包含另外的辅料，例如防腐剂，可选择地，其它包含本发明核苷酸序列的质粒载体也可应用。每个特定组的猴子都使用相同的载体，相同的浓度和相同的方式给药。
在一个研究中，包含核酸序列编码重组pRM15/tE登革病毒病毒抗原融合蛋白的pMaxVax10.1载体被检验。在这些研究中，如，组中的每只猴子都给药pMaxVax10.1载体，该载体包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含重组PRM15基因和重组截断包膜(E)基因。所述核酸序列包括，如，以下物质之一：SEQ ID NO：157(克隆2G11)，158(克隆5/21)，159(克隆6E12)，185(克隆16B4)，187(克隆16G11)，200(克隆18H2)，172(克隆18E11)，和235(克隆18H6)。
在另一个研究中，pMaxVax10.1载体包含编码重组C15/全长prM/全长E登革病毒病毒抗原融合蛋白的核酸序列。在这些研究中，如，组中的每只猴子都以包含重组C15基因，重组全长prM基因和重组全长E基因的载体给药。这些核酸序列包含，例如以下物质之一：SEQ ID NO：254(克隆16G11-D4)，255(克隆16G1 1-25B10ext)，256(克隆18H6-D4)，和257(克隆18H6-25B10ext)。
作为对照，对照组的三只猴子的每个猴子单独用载体(即没有质粒的载体)的模拟免疫。作为另一对照组，另一群的三只测试猴子的每个猴子用相同剂量的pMaxVax10.1null质粒载体对照(空载体)免疫(如，用于i.m.或i.d.注射，1mg的pMaxVax10.1null质粒载体以与重组载体相同的剂量给药，一次注射或分次注射)。
当肌肉内或皮内注射给药为优选的给药途径时，包含编码本发明的免疫原或抗原的DNA或RNA序列的载体(和载体组合物)可以由各种上述的标准给药途径给药，载体组合物可以是任意上述的物质，包括但不限于，针头注射、胃肠外给药、皮下给药、基因枪或其它biolistic传递方法，通过皮肤，口腔传递，吸入，局部或穿皮给药法(如，使用透皮贴剂或软膏)。
给药的重组质粒载体总量由给药方法决定。用于针头注射给药时，大约0.3到大约2mg，通常大约1mg的DNA质粒载体是典型的给药剂量。用于基因枪给药时，大约0.1μg到大约100μg质粒载体，典型的是大约1μg到大约10μg质粒载体，用于给药。
用于免疫的质粒载体组合物总容积典型的依靠给药的DNA载体(以mg记)的剂量或数量。通过注射给药1mg的DNA载体，总容积典型地为0.5ml。载体组合物的总容积可以由一种给药方式给药，也可分为几种给药方式连续地，相继地，或同时在一个或更多位置的小容积给药于动物。
例如，用于肌肉内注射给药，0.5ml总体积的DNA质粒载体组合物可以典型地给药于猴子，一次注射或两次注射入猴子的肌肉，如，胫骨前肌。用于真皮内给药，0.5ml总体积的DNA质粒载体组合物典型地分五次，每次0.1ml给药于猴子(如猴子的前胸真皮区域)。本领域的技术人员可以使用和/或改进本领域已知的其它的给药方式，容积和组合物。
DNA质粒载体可以任选与如下物质合用：一种或多种转染促进剂(包括如上所述的物质)，一种或多种免疫刺激序列(包括，如包含CpG岛或未甲基化CpG基序的核酸序列，术语称ISS基序)(见Krieg，Trends in Microbiol 7：64-65(1999))，一种或多种细胞因子(如GM-CSF)，一种或多种佐剂(如LAMP，明矾，其它已知佐剂)，和/或一种或多种共刺激分子编码序列。这类共刺激分子编码序列包括但不限于，如，至少一种哺乳动物B7-1编码核苷酸序列或B7-1同系物编码核苷酸序列，至少一种哺乳动物B7-2编码核苷酸序列或B7-2同系物编码核苷酸序列，或至少一种新共刺激多肽编码核苷酸序列，其被描述在2001.6.22申请的国际专利申请WO02/00717中，(包括如，至少一种核苷酸序列编码，如CD28结合蛋白(“CD28BP”)，如CD28BP-15)，或以上任意的组合。佐剂可以与一种或多种本发明的重组登革病毒多肽一起传递进入机体。在一个形式中，包含编码重组抗原多肽和细胞内靶向佐剂(如LAMP蛋白序列)和/或溶酶体结合膜蛋白的序列的DNA载体可用于传递进入机体。
在首次接种后，免疫接种(如，疫苗接种)要以同等载体组合物和同样的浓度(如1mg载体/0.5ml总体积))重复至少2次。每种后来的接种或免疫经常称作“加强”。第二次接种(即第一次“加强”)在首次接种后2周或一个月，第三次接种(即第二次“加强”)在首次接种后大约2-6个月(最典型的是首次接种后大约4，5或6个月)。如果是皮内接种，猴子可以在首次接种的12，14或18个月后，以相同的载体和相同的剂量进行第四次接种。分别在第一，二，三，四次接种时，将相同的浓度(，如1mg/0.5ml)的“空”质粒载体(如pMaxVax10.1null)或相同体积的(如0.5ml)载体(如药学可接受载体)施用给对照组动物。
可选择的，对于另一组猴子，如实施例28所述，一种或多种的本发明的重组多肽可用于在初次接种后被用于接种或免疫加强。比较使用本发明的多肽抗原和编码本发明的免疫原或使用编码本发明的抗原的DNA或RNA序列的一次或多次加强的效果。多肽抗原可以由多种本文所描述的标准途径给药，包括如，胃肠外给药，肌内注射和真皮施用(见实施例28)。
当肌内注射和真皮注射为优选的给药途径时，包含编码本发明的免疫原或抗原的DNA或RNA序列的载体也可由下列标准的给药途径给药，如，胃肠外给药，皮下给药，或Biolistic注射(如，基因枪)。
血清来自于每只猴子(如每只猴子每天取血，取5-10天)。血清用于在上述ELISA分析法和/或PRNT分析，检验每种登革病毒血清型(DEN-1，DEN-2，DEN-3，和DEN-4)的特异抗体的存在。接种猴子血清中和四种登革病毒病毒血清型的每一种的能力是由PRNT分析确定。PRNT分析法的阴性对照包括得自被免疫前的猴子的血清集合。“接触抗原(prime)”通常定义为第一次免疫。
以上述剂量的重组多肽编码的核酸序列预防性给药的效力可以通过用一种或多种登革病毒，优选多重登革病毒血清型，攻击经过免疫的猴子和观察这些猴子后来的病毒血症的发生(包括发病，程度和病毒血症的持续时间)或病毒血症的未发生来进行评价
选择几组猴子，用四种血清型的一种或多种的活登革病毒进行体内攻击在一个攻击研究中，猴子在首次免疫9个月或12个月后用登革病毒攻击在另一个攻击研究中，猴子在首次免疫15个月或18个月后用登革病毒攻击在每个攻击研究中，对照组的猴子都被维持和观察以用于比较在病毒攻击前，从每只猴子采血液来获取血清。然后，每只猴子都以如下的方法接种，如在腿或胳膊皮下注射大约0.5ml的注射夜，包含大约1×102到5×104空斑形成单位(p.f.u.)(典型的为1×102到大约1.5×104p.f.u.，1×102到大约1.25×104p.f.u.，1×103或大约1.25×104p.f.u.)的四种血清型的一种的活登革病毒。至少两只猴子注射一种血清型的一种登革病毒：所有病毒血清型在每个攻击研究中都使用。
由初次感染后大约15和大约30天的通过从已被接种和对照的猴子采血来获得血清；选择性的，血清也可以在初次感染后的其它天获得，血清中特异于每一种登革病毒血清型的病毒血症和抗体被测定。病毒血症通过在Raviprakash et al.，J.Gen.Virology 81：1659-1667(2000)中提到的如下操作进行测定。抗体反应通过前述的或本技术领域己知的方法(例如见Raviprakashet al.，J.Gen.Virology 81：1659-1667(2000))进行测定。由一和编码了本发明所述一种重组抗原的质粒载体免疫的猴子的反应与那些注射了空载体或单独的载体的猴子进行比较。
对于那些接种了一种包含一种本发明所述重组登革病毒抗原编码核酸的质粒载体的猴子在特定登革病毒攻击后存活，这种重组登革病毒抗原编码核酸诱导抵抗这种登革病毒感染的保护性免疫反应。保护可以是完全或部分保护。完全保护可以在那些完全防止病毒血症产生的被免疫的猴子中观察到；部分保护可以在那些与对照猴子相比仅产生较少病毒血症的被免疫猴子中观察到。
本发明包括编码重组PRM15/tE登革病毒抗原融合蛋白和/或重组C15/全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白(和其载体)的重组核酸，其在一种非人类灵长类模型如恒河猕猴模型中，在用一种或多种登革病毒血清型体内攻击后，在体内诱导产生抵抗至少一种登革病毒血清型的登革病毒感染，优选抵抗至少两种登革病毒血清型，更优选抵抗至少三种或至少四种登革病毒血清型的保护性免疫反应。
另一个例子，本发明包括编码重组tE登革病毒抗原融合蛋白和/或重组全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白(和其载体)的重组核酸，其在一种非人类灵长类模型中，在用一种或多种登革病毒血清型体内攻击后，在体内诱导产生抵抗至少一种登革病毒血清型的登革病毒感染，优选抵抗至少两种登革病毒血清型，更优选抵抗至少三种或至少四种登革病毒血清型的保护性免疫反应。在这个例子中，这种被编码的重组多肽不包括PRM15信号肽或C15信号肽。
本发明还包括对四种登革病毒血清型中的一种引起的登革病毒感染进行抗御的中和抗体。这些抗体的产生是响应给机体施用一种重组核酸，这种重组核酸编码一种重组PRM15/tE登革病毒抗原融合蛋白或一种重组C15/全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白，而且可以通过标准方法从该受试者的血清中分离出来。包含有这样的核酸的载体可以被给药到机体中。
实施例28
这个实施方案说明了一种用有效总量的本发明所述一种或多种重组登革病毒多肽抗原免疫恒河猕猴的方法，所述有效总量足以在猴子体内诱导对一种或多种(而且优选两种或多种)登革病毒的保护性免疫反应，这样的量可以是免疫原性量或抗原性量。
这种使用了登革病毒抗原和灵长类动物的免疫方法已经被描述，而且这样的方法可以选择性的在此处使用或按照期望的进行修改。例如见Eckels等，Amer J Medicine and Hygiene(1994)50：472-487；Raviprakash等.J.Gen.Virol.(2000)81：1659-1667。
本发明的重组多肽可以在下述的方法中被使用。每一项研究都是根据”Guide for the Care and Use of Laboratory Animals，Institute of LaboratoryAnimal Resources，”National Research Council，DHHS PublicationNo.NIH-86-23(1985)中的指导方法进行的。所用动物来自Walter Reed ArmyInstitute of Research animal facility in Forest Glen，MD。
通过ELISA分析和噬斑减少中和测试对大约7到24岁恒河猕猴(Macacamulatta)，进行四组登革病毒血清中每一组的登革病毒的抗体的存在进行了预先测试。那些没有迹象表明被暴露于这种登革病毒(例如对这样的登革病毒为血清阴性)的猴子被分为三只猴子/每组的几组。非对照组中的每只猴子在最初的一天用组合物进行肌内接种(i.m.)或皮内接种(i.d.)，该组合物在载体内(如实施例22所述)包含免疫原性量或抗原性量的(例如大约0.1μg-1mg，大约0.5-500μg，大约0.5-100μg，大约1-50μg，大约1-10μg，大约5-30μg，大约15-25μg或大约0.5μg到大约2μg)本发明所述的重组多肽。这种载体可以包括，例如无内毒素的载体，这样的载体例如一种药物载体(例如PBS或其它合适的盐水缓冲剂，0.1M NaCl，或任意合适的保持溶液PH值在大约7.4的载体)，而且可以选择性的包括其它赋形剂如防腐剂，给药的量一样，所述重组多肽可以与佐剂(例如弗氏不完全佐剂(FIA)或氢氧化铝)和/或脂质体一同给药，给药的量可以是如与通常用DNA载体或DNA疫苗给药相同的量。技术人员可以确定佐剂和脂质体的类型和包含的量。其中一组猴子用作对照组；对照组中的猴子用PBS或其它合适的盐溶液模拟免疫。
选择性的，一只猴子用一种包含有一种载体(例如药学可接受载体)和编码了本发明所述的一种重组多肽的核酸载体的组合物进行给药。施用足量的组合物，以产生免疫原性量和抗原性量的被编码多肽(例如，从大约50μg到大约10mg，大约100μg到大约5mg，大约1-5mg，或大约2-5mg的核酸被给药)。典型情况，所述载体是PBS。至少一种佐剂和/或脂质体可以通常用DNA载体或DNA疫苗呈递时的量被包括在这种组合物中技术人员可以容易地确定佐剂或脂质体的类型和包含的量
在一项研究中，一组猴子用至少一种包含有PRM15/tE登革病毒抗原融合蛋白(或这类多肽的组合)的本发明所述的重组登革病毒多肽进行给药例如，这类多肽可以包含有以下的一种或多种序列：SEQ ID NO：66(克隆2G11)，67(克隆5/21)，69(克隆6E12)，89(克隆16B4)，93(克隆16G11)，109(克隆18H2)，108(克隆18E11)，和110(克隆18H6)。选择性的，给药的这种重组多肽包含有重组tE登革病毒多肽抗原，而且不包括PRM15信号肽。
在第二项研究中，一组猴子用至少一种包含有重组C15信号肽/全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白的本发明所述的重组登革病毒多肽进行给药。这类多肽可以包含有，例如以下的一种序列：SEQ ID NO：250(克隆16G11-D4)，251(克隆16G11-25B10ext)，252(克隆18H6-D4)，和253(克隆18H6-25B10ext)。选择性的，给药的这种重组多肽包含有重组全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白，而且不包括C15信号肽。技术人员能够理解，本发明的其它多肽可以在这些方法中使用。优选的，使用本发明所述的重组四价登革病毒多肽抗原。
如实施例27中所述，这和重组登革病毒多肽可以选择性与以下一起给药，一种或多种转染促进剂(包括例如已知的促进剂和那些文中所述的促进剂)，一个或多种免疫促进序列(例如包含有CpG岛或无甲基化CpG基序，ISS基序的核苷酸序列)，一种或多种细胞因子(例如GM-CSF)，一种或多种佐剂，和/或一种或多种共刺激分子多肽(例如B7-1多肽，37-2多肽，一种在2001年6月22日申请的国际专利申请WO 02/00717中介绍的新的共刺激多肽(包括例如CD28结合多肽，例如CD28BP-15))，或它们的组合，也可以用一种载体或赋形剂，例如一种防腐剂。
这种多肽化合物给药的方法可以是文中所述的任何方法，包括，例如但不限于，针头注射，通过皮肤压迹，皮下给药，非肠道给药，口部给药，吸入法或局部或经皮给药(例如，使用透皮贴剂或软膏)。重组多肽的给药总量依赖于给药的方式。使用针注射给药，这种重组多肽的给药量在大约0.1μg-1mg，大约0.5-500μg，大约0.5-100μg，大约1-50μg，大约1-10μg，大约5-30μg，大约15-25μg或大约0.5μg到大约2μg。本技术领域的技术人员可以轻易地测定适合于其它途径给药的多肽用量。
对每次免疫的多肽组合物的总份量通常依赖于实施例27中所述的总量或给药的多肽的一次剂量(按照mg单位)。化合物的总份量可以通过一次给药或划分成几个更小的份量在动物体的一个或更多个部位，连续地，顺序地或同时地进行给药。例如，通过肌内给药，这种多肽化合物的总份量可以通过对猴子的一块肌肉例如是胫骨前肌一次注射或两次注射进行给药通过皮内注射给药，类似的多肽组合物总份量可以被分做更小的相同的份量而且通过多次给药投药到一个猴子体内(例如猴子的前胸皮肤部位)。本技术领域的其中一种技术可以使用和/或修改成本技术领域已知的其它给药形式，份量和化合物。
在最初接种后，这种免疫(例如接种疫苗)用同样的多肽在相同的量和浓度上重复至少两次。每一次使用多肽的接下来的接种或免疫被称作一次“加强”。第二次接种或免疫(例如最初接种后的第一次“加强”)是在最初接种的大约两个星期到一个月后进行给药，而一个第三次接种(例如第二次“加强”)是在第二次接种后大约一到大约六个月后进行给药(更典型的是大约3个月，4个月或大约6个月)。对照动物单独用载体(例如药学载体)用同样的份量在最初接种后的第二次和第三次接种之间进行给药。
选择性的，对另外一组猴子，如实施例27中所述，本发明中的(如上述)一个或更多DNA或RNA序列可以用于最初接种后的一次或更多的加强接种。使用一种本发明所述多肽抗原的加强效力与一种编码本发明所述免疫原或抗原的DNA或RNA序列进行比较。
实施例27中说明了接下来的步骤，血清从每只猴子那里获得，而且这样的血清通过ELISA分析和/或PRNT分析对其中特异性针对每一种登革病毒血清(DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4)的抗体的存在进行测试。通过PRNT分析测定被接种的猴子的血清对四组登革病毒血清中每一组的中和能力
本发明所述的这样的重组多肽的预防性给药的效力的评定通过如实施例27中所述的有免疫性的猴子对一种或多种登革病毒，优选多重登革病毒血清型的病毒的反应，和病毒血症发生的观察或这些猴子其后病毒血症不发生的观察而得到。
有效量的本发明的一种或多种重组多肽给药非人类的灵长类动物，体内诱导针对至少一种登革病毒攻击的防护性免疫反应。保护可以是完全的或部分保护。完全保护可以在完全受到保护而不产生病毒血症的接受免疫的猴子中观察到；部分保护可以在那些只是对比对照猴子具有减轻的病毒血症的接受免疫的猴子中观察到。
本发明包括重组PRM15/tE登革病毒抗原融合蛋白和重组C15/全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白(和其组合物)，其在体内，在一种非人类灵长类模型如恒河猕猴中，一种或多种登革病毒血清型的病毒攻击之后，诱导针对至少一种登革病毒血清型，优选至少两种，更优选至少三或四种登革病毒血清型引起的登革病毒感染的防护性免疫应答。
另一个例子，本发明也包括重组截短的E登革病毒抗原融合蛋白和重组全长prM/全长E登革病毒抗原融合蛋白(和其组合物)，其在一种非人类灵长动物模型中，在一种或多种登革病毒血清型的病毒攻击后，在体内诱导针对至少一种登革病毒血清型，优选至少两种，更优选至少三或四种登革病毒血清型引起的登革病毒感染的保护性应答。在这个例子中，这种编码重组多肽不包括PRM15信号肽或C15信号肽。
实施例29
这个实施例说明用组合物免疫人类的方法，所述组合物包含药学可接受载体(例如PBS)和至少一种编码本发明所述的重组免疫原或抗原的DNA或RNA或至少一种本文所描述的本发明人类密码子优化的DNA或RNA序列。例如，任何编码重组的PRM15/tE融合蛋白的核苷酸序列，例如包括但不限于，SEQ ID NO：157(克隆2G11)，158(克隆5/21)，159(克隆6E12)，185(克隆16B4)，187(克隆16G11)，200(克隆18H2)，172(克隆18E11)，235(克隆18H6)中的任何序列，或这些核苷酸序列的任意组合物或混合物，或任意的编码重组C15/全长prM/全长E融合蛋白的核苷酸序列，例如，包括但不限于，选自SEQ ID NO：254(克隆16G11-D4)，255(克隆16G11-25B10ext)，256(克隆18H6-D4)，257(克隆18H6-25B10ext)，204(2G11-D4)，和202(6E12-D4)中的任何序列，或这些核苷酸序列的混合物，可以被用于这种方法中。另一个例子，包含有一种药学可接受载体和至少一种编码重组PRM15/tE融合蛋白的核苷酸序列和至少一种编码重组C15/全长prM/全长E融合蛋白的核苷酸序列组合物也可以被使用(例如18H6(SEQ ID NO：235)，2G11-D4(SEQ ID NO：204)，和6E12-D4(SEQ ID NO：202))。其它本发明所述免疫刺激多核苷酸或所述核苷酸的组合也可以用于这种方法。
用一种或多种本发明的重组DNA或RNA序列的免疫人类的方法可以采用与实施例27中所述的相似方法进行。预防性地给予有效量(例如免疫原性量或抗原性量)的本发明的一种或多种DNA或RNA序列给人，导致在人体中产生或增强至少一和优选至少两种至少三种或至少四种登革病毒的免疫反应。因为本发明中这样的多核苷酸，在人类受试者中诱导或增强了针对一种或多种登革病毒的保护性免疫反应。这样的反应可以是部分保护反应，但优选完全保护反应。这样的多核苷酸或几种不同重组多核苷酸的组合用作一种DNA疫苗，这种疫苗诱导了防止由至少一种优选至少两种更优选至少三种或四种登革病毒血清型引起的感染的免疫反应。
另外，本发明提供了用一种或多种本发明所述重组登革病毒多肽预防性免疫人的方法，这些多肽在例如一种合适的载体中，这样的载体例如是一种药学可接受载体(PBS)，而且可选择的是任意合适的佐剂，例如明矾。用一种或多种本发明所述的重组多肽免疫人类的方法与实施例27中所述的相似方法进行。任意本发明的重组多肽或这样多肽的组合可以用于人的免疫；例如，这样的多肽可以包含一种或多种下列的序列：SEQ ID NO：66(克隆2G11)，67(克隆5/21)，69(克隆6E12)，89(克隆16B4)，93(克隆16G11)，109(克隆18H2)，108(克隆18E11)，和110(克隆18H6)或251(16G11-25B10)。选择性的，给药的这种重组多肽包含有重组tE登革病毒多肽抗原，而且不包括PRM15信号肽，另一方面，本发明的任意重组多肽的两种或多种的组合也可以用于给药。
除了多核苷酸之外，这样的多肽可以被给药到人体中，或者选择性的代替这样的多核苷酸。这种重组多肽以有效在人体中诱导和增强免疫反应的量给药。这样的有效量包含，例如免疫原性量或抗原性量。建议的剂量如上所述，这样的抗原多肽可以用作蛋白疫苗，这样的多肽的给药可以经过上述的种种途径；通过注射的经皮和肌内给药是多肽给药的典型路径
实施例27和28中用于恒河猕猴免疫的重组登革病毒多核苷酸和多肽的给药总量可以相似的用于人类免疫；选择性的，总量可以通过考虑人类体重相对于猕猴，按比例调整。例如，相比用于猴子的免疫剂量，用于人类免疫的登革病毒肽抗原的剂量要稍微的高一些(例如，大约0.5μg-1mg，大约0.5-500μg，大约0.5-100μg，大约1-50μg，大约1-10μg，大约5-30μg，大约15-25μg)。预防性地施用有效量的一种或多种本发明的重组登革病毒多肽抗原，在人体中诱导抵抗至少一种，优选至少两种，更优选至少三种或四种登革病毒的保护性免疫反应。
本发明的这种多肽和多核苷酸可以用载体或赋形剂配制成组合物，包括做为文中所述的药学组合物，而且可以通过文中所述的种种途径(同样见实施例27和28)对人体进行给药。这样的多核苷酸可以通过文中所述载体(例如见实施例27)被呈递。本发明这种重组登革病毒多肽可以单独给药(例如做为一种蛋白疫苗)，或者与含有编码本发明相应的多肽的多核苷酸的质粒载体联合给药(在其之前或之后)。其它形式介绍在实施例28中。
相似地，这种多核苷酸可以通过质粒载体单独给药(例如作为一种DNA疫苗)，或者与相应的本发明的被编码的多肽联合给药(之前或之后)，而且如实施例27和28中所述，各种加强策略和方法也可以使用。例如，至少一种这样的重组多核苷酸(例如重组DNA疫苗)或至少这样的重组多肽(例如重组蛋白疫苗)可以被首先以有效量给药到人体中来诱导免疫反应，而且在一段合适的时期后(可以由本技术领域的技术人员确定)(例如，大约一周，大约一个月，大约4，5，6，12或18个月等等)，包含有相同或不同量的多核苷酸(DNA疫苗)或多肽(蛋白疫苗)的“加强”免疫给药到相同的人体内。如果需要，可以对人进行多次加强免疫。
另一方面，本发明提供一种方法，包括给人施用有效量的组合物，该组合物包含有至少一种编码本发明的至少一种登革病毒抗原的核酸，其可与一种或多种编码一种或多种WT登革病毒prM/E融合蛋白，WT登革病毒PRM15/tE融合蛋白和/或WT C15/全长prM/全长E融合蛋白的核酸组合，而且，任选地，和编码共刺激分子或细胞因子(例如GM-CSF或干扰素)的核苷酸，或者编码所述共刺激分子和/或细胞因子的核苷酸的组合进行组合，其中所述量足以诱导抵抗至少一种，至少两种优选至少三种或四种登革病毒血清型的保护性免疫反应。
还有另一个方面，本发明提供一种方法，包括给人施用有效量的组合物，该组合物包含有至少一种本发明的重组登革病毒抗原，其与一种或多种WT登革病毒prM/E融合蛋白，WT登革病毒PRM15/tE融合蛋白和/或WT C15/全长prM/全长E融合蛋白组合，而且，任选地，与一种或多种共刺激分子或细胞因子，例如GM-CSF或干扰素，或者所述共刺激分子和/或细胞因子的组合相组合，其中所述的量足以诱导抵抗至少一种，至少两种，和优选至少三种或四种登革病毒血清型的保护性免疫反应。
在文中所述的所有这些方法和方式中，在那些接受了一种或多种多核苷酸和/或多肽免疫的人体中诱导产生的免疫反应，可以使用上述的ELISA分析和/或PRNT分析，在不同的时间，包括在各种免疫之前和/或之后，通过测定例如从所述人体中得到的血清(血液)中的抗体滴定水平进行测量。
下面是序列表。
前述的发明已经在较为详细地被描述以达到清楚易懂的目的，对本领域的普通技术人员而言，通过阅读本文所公开的内容可在不背离本发明实质范围的基础上在形成和细节上进行各种改变。应当理解，本文所描述的实施方案和实施方案仅仅是为了举例说明本发明的目的，根据本文的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是被教导的，其在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围之内。例如，上述的所有技术和仪器可以不同的组合被使用。
所有的参考，包括出版物，专利申请，专利，和/或此处引用的其它文章，包括在上文中引用而没有特别指明被引入作为参考的，都在此全部引入作为参考，达到相同与每份参考文献单独或特别指出全文在此引入作为参考的目的，并在此全文被展示。在描述发明(尤其在权利要求内容中)中所使用的术语“一个”和“该”以及类似指示被理解为包括单数和复数，除非此处另有指示或与内容明显矛盾。术语“包含”，“具有”，“包括”，“含有”等被解释为开放式的术语(例如，意思是“含有，但不限于”)，除非另有指示，作为封闭式的术语是“由...组成”和“基本上由...组成”。该处的数值范围的详述只作为涉及的单独的每个范围的分开的数值的速记方法，除非此处另有指示，如该处还单独引用的一样，每个单独的数值在说明书中引用。此处所描述的所有方法可通过任何合适的顺序进行，除非此处另有指示或明显与内容相矛盾。此处所提供的任一或所有实施例的用途，或典型的语句(例如，“例如”)仅仅是为了更好的举例说明本发明，对本发明的范围不构成任何限制，除非另有说明。说明书的用语都不被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明实践是不关键的。本发明描述过程中的标题仅仅是为了方便，不对公开内容构成任何限制。
此处对任何专利或专利内容的引用不反映任何关于该专利文件中所描述或要求保护的主题的专利性的观点。相反，引用该专利文件仅仅给合适的技术和组合物提供方便参考，包括那些本领域公知的技术和组合物。
一种上述序列模式的全部氨基酸或核苷酸序列被认为在此单独说明。这样，例如，三个残基的氨基酸序列模式，其中“Xaa”表示该模式中氨基酸的位置，代表20中不同的氨基酸序列的公开(即可以出现在Xaa位置的每个天然氨基酸残基的序列)。
本发明的病毒载体颗粒组合物任何技术和任何特征能够以合适的形式结合，除非另外提出或明显在内容上相矛盾。
本发明优选的实施方案和方案在本文中描述，包括发明人所知的实行本发明的最佳模式。在阅读了前述的说明书，这些优选实施例的改变对本领域技术人员来说是显而易见的。发明人希望本领域技术人员合适的运用这些变化，发明人希望本发明能通过本文提供的特例之外的其它方式实现。相应的，本发明在合适的法律允许范围内包括所附权利要求提到的主题的所有修改和等同物，进一步的，上述部分的结合以其所有可能的变化形式包含在本发明内，除非本文提到或明显在内容上矛盾。
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