通过施加由特异性和选择性的电以及电磁信号产生的场上调骨细胞中骨形态发生蛋白( BMP)基因表达的系统以及方法

摘要

本发明提供了通过在患病或受损骨的治疗中施加由特异性和选择性的电信号和电磁信号产生的场调节骨细胞中骨形态发生蛋白基因表达的方法和装置。基因表达是指人基因组(DNA)的特异性部分(基因)被转录为mRNA以及其后被翻译为蛋白的过程的上调或下调。本发明提供了用于靶向治疗受损或患病的骨组织的方法和装置，包括产生用于骨形态发生蛋白基因表达的增加最佳化的场的特异性和选择性的电信号和电磁信号，以及将骨暴露于由特异性和选择性信号产生的场来调节在这种骨组织中骨形态发生蛋白基因的表达。所产生的方法和装置可作为其它治疗的辅助用于靶向治疗骨折，骨折危险，延迟愈合，不愈合骨折，骨缺损，脊柱融合，骨坏死或者缺血性坏死中的一种或者所有类型，以及治疗骨质疏松症。

说明书

相关申请的交叉引用

本专利申请是美国专利申请10/257,126的部分继续，所述美国专利申请是于2001年2月23日提交的PCT/US01/05991的美国国家阶段专利申请，其要求在2000年2月23日提交的美国临时申请60/184,491的优先权。本申请也要求2004年1月12日提交的美国临时专利申请60/535,755的优先权。这些专利申请的内容在此处全文引入作为参考。

技术领域

本发明涉及通过施加由特异性和选择性的电以及电磁信号产生的场上调骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)基因表达用于治疗受损的或患病的骨的方法，本发明还涉及产生这种信号的装置。

发明背景

被认为存在于多种生物组织与细胞中的生物电交互作用与活性是目前了解得最少的生理学过程之一。然而，最近已有大量研究涉及与某些组织与细胞的生长与修复相关的这些交互作用与活性。尤其是，目前很多研究针对通过电与电磁场刺激与它们对骨和软骨生长与修复的影响。研究人员相信这样的研究可用于开发用于多种医学难题的新型治疗方法。

在通常已知为骨质疏松症的疾病中，骨脱矿质并变得异常稀疏。骨包含细胞与基质的有机组分与无机或者矿物成分。细胞与基质包含充满给予骨硬度的磷酸钙(85％)与碳酸钙(10％)的矿物成分的胶原纤维支架。虽然通常认为老年人易患骨质疏松症，但是某些类型骨质疏松症可能感染骨未受机能性应力影响的所有年龄的人。在这样的病例中，病人在延长的固定期间可能经历坚质骨与松质骨的显著损失。已知老年病人由于骨折后固定时不使用骨会引起骨损失；这可能最终导致已经骨质疏松的骨骼的继发性骨折。骨密度的降低可能导致椎骨塌陷、臀部、前臂、腕部、踝部的骨折，以及无行为能力的疼痛。需要对这种疾病进行其它的非-外科手术治疗。

自从1979年美国食品和药品管理局(Food and DrugAdministration)的批准，脉冲电磁场(PEMFs)与电容耦合(CC)已被广泛用于治疗难愈合骨折以及骨愈合中的相关问题。这种治疗形式尝试的最初基础是观察到作用于骨上的物理应力引起微小电流的出现，伴随机械应力，所述微小电流的出现被认为是将物理应力转换成促进骨形成的信号的机制。与成功治疗不愈合骨折的直接电场刺激一起，利用PEMF与电容耦合(其中电极被置于治疗区的皮肤上)的非侵入性技术同样被认为是有效的。PEMFs在高度导电性的细胞外液体中产生较小的感应电流(Faraday电流)，而电容耦合直接在组织中产生电流；由此PEMFs与CC均模拟了内生电流。

最初认为是由于发生在骨内晶体表面的现象的内生电流，已经证明主要是由于在包含带有固定负电荷的有机组分的骨小管内含有电解质的液体的运动，产生所谓的“流动电势”。骨内电学现象的研究已经证明了当软骨受到机械压缩时出现机械-电转换机制，引起骨基质中蛋白聚糖与胶原中液体与电解质在带有固定负电荷的的表面上的运动。这些流动电势在骨内起一定的作用，并且伴随着机械应力导致能够刺激可钙化基质的骨细胞合成的信号转导，并由此形成骨。

直流电流、电容耦合以及PEMFs在骨科治疗中的主要应用是不愈合骨折的愈合(Brighton等，J Bone Joint Surg 63：2-13，1981；Brighton和Pollack，J Bone Joint Surg 67：577-585，1985；Bassett等，Crit RevBiomed Eng，17：451-529，1989；Bassett等，JAMA，247：623-628，1982)。已经报道了成人髋部无血管坏死与儿童Legg-Perthe氏疾病的临床反应(Bassett等，Clin Orthop，246：172-176，1989；Aaron等，Clin Orthop，249：209-218，1989；Harrison等，J Pediatr Orthop4：579-584，1984)。同样已经显示PEMFs(Mooney，Spine，15：708-712，1990)与电容耦合(Goodwin，Brighton等，Spine，24：1349-1356，1999)可以显著地提高腰椎融合术的成功率。还有增进周围神经再生与功能并且促进血管生成的报道(Bassett.Bioessays，6：36-42，1987)。与安慰剂治疗的病人相比，患有类固醇注射及其他传统的方法难治愈的永久性旋转肌群肌腱炎的病人显示显著的疗效(Binder等，Lancet，695-698，1984)。最后Brighton等人已经证明大鼠中合适的电容耦合电场既可预防又可逆转脊柱腰段椎骨的骨质疏松症(Brighton等，JOrthop Res，6：676-684，1988；Brighton等，J Bone Joint Surg，71：228-236，1989)。

最近，这个领域的研究集中在对组织与细胞的效应刺激上。例如，已经推测直流电流不穿透细胞膜并且通过细胞外基质分化作用实现控制(Grodzinsky，Crit Rev Biomed Eng，9：133-199，1983)。与直流电流相反，已经有报道说PEMFs可以穿透细胞膜并或者对它们进行刺激或者直接影响胞内的细胞器。一个有关PEMFs对细胞外基质的作用与体内软骨内骨化的研究发现软骨分子合成的增加与骨小梁的成熟(Aaron等，J Bone Miner Res，4：227-233，1989)。最近，Lorich等(ClinOrthop Related Res，350：246-256，1998)以及Brighton等(J Bone JointSurg，83-A，1514-1523，2001)报道电容耦合电信号的信号转导是通过电压-门控钙离子通道进行的，而PEMFs或组合电磁信号是通过钙离子从细内贮藏处的释放进行的。在所有三种类型的电刺激中，细胞溶质钙增加，随后活化的(细胞骨骼)钙调节蛋白增加。

1996年由本发明者报道了周期双轴0.17％机械应力在培养的MC3T3-E1骨细胞中引起TGF-β₁mRNA的显著增加(Brighton等，Biochem Biophys Res Commun，229：449-453，1996)。接着在1997年进行了几项重要的研究。在一项研究中报道同样的周期双轴0.17％机械应力在类似的骨细胞中引起PDGF-A mRNA的显著增加(Brighton等，Biochem Biophys Res Commun，43：339-346，1997)。还有报道60kHz电容耦合的20mV/cm电场在类似的骨细胞中引起TGF-β₁的显著增加(Brighton等，Biochem Biophys Res Commun，237：225-229，1997)。然而，这种场对其他基因的影响在该文中未有报道。

在上面-引用的题为“通过施加特异性且选择性的电以及电磁信号调节基因(Regulation of Genes Via Application of Specific and SelectiveElectrical and Electromagnetic Signals)”的母案专利申请中，公开了用来确定用于产生调节患病或者受损组织靶基因的场的特异性且选择性电以及电磁信号的方法。本发明基于在其中描述的技术，描述了通过施加由特异性且选择性电以及电磁信号产生的场调节一种称作骨形态发生蛋白基因表达的靶基因家族表达的方法，用于作为其它治疗的辅助治疗治疗新鲜骨折(fresh fracture)，骨折危险(fracture at risk)，延迟愈合，不愈合骨折，骨缺损，脊柱融合，骨坏死或者缺血性坏死中的一种或者所有类型，以及治疗骨质疏松症。

发明概述

本发明涉及通过施加由特异性且选择性的电和/或电磁信号产生的场调节骨细胞中骨形态发生蛋白的基因表达。通过对电场持续时间、振幅、频率、和占空度进行剂量-应答曲线试验，发现了用于上调骨细胞中骨形态发生蛋白mRNA的最佳信号。最佳信号产生振幅为20mV/cm、持续时间为24小时、频率为60kHz、占空度为50％和正弦波形的电容耦合电场。尤其是，本发明涉及通过施加由这种信号产生的场上调骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)的基因表达。

根据本发明，提供了使用电容耦合电场、电磁场或组合的场(combined fields)特异性和选择性上调BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的基因表达(通过mRNA测量)的方法。用电场持续时间为约24小时、频率为约60kHz、占空度为约50％和正弦波形的约20mV/cm的电容耦合电场引起BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7mRNA的上调，治疗新鲜骨折，骨折危险，延迟愈合，不愈合骨折，骨缺损，骨坏死，骨质疏松症等。根据本发明的方法，“特异性和选择性的”信号为上调BMP基因表达的具有预定的振幅、持续时间、占空度、频率和波形特征的信号(特异性)。这使得人们可选择不同的信号上调BMP基因表达，以实现给定的生物或治疗应答(选择性)。本发明另外涉及使用本文所述的方法产生特异性和选择性的信号，以用于产生上调BMP基因表达的场的装置。

在相关的方面中，本发明涉及用于作为其它治疗的辅助治疗治疗新鲜骨折(fresh fracture)，骨折危险(fracture at risk)，延迟愈合，不愈合，骨缺损，脊柱融合，骨坏死中的一种或者多种类型，以及治疗骨质疏松症的方法和装置。本发明的方法还包括通过有系统地改变已知增强、或推测增强BMP的细胞产量的起始信号的持续时间测定用于BMP基因表达的“特异性和选择性”信号的方法学。在选择最佳的持续时间之后，改变信号的振幅以通过BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7基因表达测定最佳持续时间。以如上所述相同的剂量应答方式有系统地改变占空度、频率和波形同时保持其它信号特征不变。重复这个过程直到确定了产生BMP表达最大增加的最佳信号。

在以下发明详述中说明本发明的这些和其它方面。

附图说明

由以下的发明详述连同附图，本发明将更加清楚。其中：

图1图解了当骨细胞暴露于20mV/cm的电容耦合的电场不同持续时间时，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的mRNA的表达。如图所示，在24小时持续时间的信号发生多种BMP的mRNA的最大表达。

图2图解了当骨细胞暴露于24小时持续时间的不同电容耦合的电场振幅时，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的mRNA的表达。如图所示，在20mV/cm的场振幅发生多种BMP的mRNA的最大表达。

图3图解了当骨细胞暴露于20mV/cm的场振幅以及24小时的信号持续时间的不同电容耦合的电场频率时，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的mRNA的表达。如图所示，60kHz的频率，发生多种BMP的mRNA的最大表达。

图4图解了当骨细胞暴露于60kHz的频率，20mV/cm的场振幅以及24小时的信号持续时间的不同电容耦合的电场占空度时，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的mRNA的表达。如图所示，50％的占空度，发生多种BMP的mRNA的最大表达。

图5图解了当骨细胞暴露于50％占空度的不同开-关时间，20mV/cm的场振幅，以及60kHz的电容耦合的电场时，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7的mRNA的表达。如图所示，1分钟开/1分钟关，50％占空度，发生多种BMP的mRNA的最大表达。

图6图解了当骨细胞暴露于电容耦合的持续的50％占空度信号(20mV/cm，60kHz，正弦波)以及脉冲的50％占空度信号时，二者比较的BMP-2mRNA的表达。如图所示，这两种信号都显示基本上相同的BMP-2mRNA 5倍的增加。

图7图解了当骨细胞暴露于50％占空度，电容耦合的信号(20mV/cm，60kHz，正弦波)24小时时，BMP-2蛋白的产量以及碱性磷酸酶的活性。如图所示，BMP-2的产量增加1.9倍，碱性磷酸酶的活性增加1/6倍。

图8图解了根据本发明的示范性实施方案，用于上调骨形态发生蛋白的基因表达的装置。

示范性实施方案的详述

参照图1-8进行本发明的详细描述。本领域技术人员可以理解，参照这些图，在此给出的描述仅仅为了示范性的目的，并且无意以任何方式限定本发明的范围。关于本发明范围的全部的问题可以通过参考所附的权利要求得以解决。

本发明基于可以通过施加由特异性和选择性的电信号和/或电磁信号产生的场调节某些基因表达的发现。换句话说，本发明的发明人发现了产生用于调节骨、软骨和其它组织细胞中每种基因的场的特异性的电信号和/或电磁信号，并且这些特异性的信号能够特异性和选择性地调节这种细胞中的基因。尤其是，根据本发明，可通过施加由特异性和选择性的电信号和/或电磁信号产生的场调节控制组织或细胞的生长、维持、修复和退化或衰退的基因表达以产生有益的临床效果。这种发现可用于开发作为其它治疗的辅助治疗针对某些包括新鲜骨折(fresh fracture)，骨折危险(fracture at risk)，延迟愈合，不愈合，骨缺损，骨坏死中的任一种或者多种类型的病症，以及治疗骨质疏松症的治疗方法。

在此使用的短语“信号”用来指由装置输出的包括机械信号、超声信号、电磁信号与电信号的多种信号。在此使用的术语“场”指在靶组织之内的电场，可以是组合场或脉冲电磁场，或由直流电流、电容耦合或者电感耦合产生的场。

短语“远程的”是指从远处起作用、作用于或控制。“远程”调节是指从远处控制基因的表达。“远程地”提供是指从远处提供。例如，从远程源提供特异性和选择性的信号可以指从距离组织或细胞一段距离的源、或从身体外侧或外面的源提供信号。

短语“特异性和选择性的”信号是指该信号产生具有预定的振幅、持续时间、占空度、频率和波形特征，上调或下调靶基因或靶向的功能上互补基因的电场(特异性)。这使得人们可选择不同的“特异性和选择性的”信号用于上调或下调多种基因的表达以实现给定的生物学或或治疗学应答(选择性)。

术语“调节”是指控制基因表达。应该理解调节包括上调和下调。上调是指增加基因的表达，而下调是指抑制或阻止基因的表达。

“功能上互补”是指两个或多个基因在给定细胞或组织中的表达为互补的或协同的。

“组织”是指细胞连同形成患者的结构材料中的一种的细胞外物质的聚集。如本文中使用的，术语“组织”包括肌肉和器官组织、肿瘤组织以及骨或软骨组织。另外，本文中使用的术语“组织”还指单个细胞。

“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。

本发明提供了针对某些组织、细胞或疾病的治疗方法和装置。尤其是，可以通过施加由对靶组织或细胞中待调节的基因具有特异性和选择性的电信号产生的场调节受损或患病的组织或细胞中与修复过程有关的基因表达。可通过施加对每个基因或每组互补基因组具有特异性和选择性的信号，上调或下调基因表达以产生有利的临床效果。例如，特定的特异性和选择性的信号可产生上调某种所需的基因表达的电场，而相同的或另一特定的特异性和选择性的信号可能产生下调某种不希望的基因表达的电场。某一个基因可由一个特定的特异性和选择性的信号产生的场上调并由另一个特异性和选择性的信号产生的场下调。本领域技术人员应该理解，可通过调节那些控制组织生长、维持、修复和退化或衰退的基因靶向某些患病的或受损的组织进行治疗。

本发明的方法和装置基于识别用于产生对与某些靶患病或受损组织有关的基因表达具有特异性和选择性的场的那些信号。例如，不同形式的电流(如，电容耦合、电感耦合、组合的场)可以通过对每种所选基因改变施加的场的频率、振幅、波形或占空度而特异性和选择性地调节患者体内靶组织或细胞中的基因表达。暴露于电流的持续时间还可以影响电流特异性和选择性地调节患者体内靶组织或细胞中的基因表达的能力。特异性和选择性的信号可系统地产生施用于每种基因的电场，直到发现提供对基因表达具有所需效果的频率、振幅、波形、占空度和持续时间的适当组合。

应该理解，因为多个因素可以影响用于某种基因表达的电场的特异性和选择性，治疗可以靶向多种患病的或受损的组织或疾病状态。尤其是，具有适当的频率、振幅、波形和/或占空度的电场对某些基因的表达可以是特异性和选择性的，并从而用于靶向治疗。时间因素(如暴露于电场的持续时间)也可以影响电场对特定基因表达的特异性和选择性。可通过施加电场以特定的持续时间使基因表达的调节变得更有效(或使基因表达的调节变得可能)。因此，本领域技术人员应该理解，本发明提供了改变施加电场的频率、振幅、波形、占空度和/或持续时间直到发现对某种基因表达特异性和选择性的电场，以提供针对多种患病的或受损的组织或疾病的治疗。

因此，本发明可以提供靶向治疗，因为有可能通过施加由具有适当的频率、振幅、波形和/或占空度的特异性和选择性的信号以适当的持续时间产生的场调节与特定的患病的或受损组织有关的某些基因的表达。因此可影响产生电场的信号的特异性和选择性以调节某些基因的表达，用于靶向某些患病的或受损的组织或待治疗的疾病状态。尤其是，本发明提供了作为治疗新鲜骨折(fresh fracture)，骨折危险(fracture at risk)，不愈合，骨缺损，脊柱融合，骨坏死中的一种或者任一种类型的辅助治疗，以及治疗骨质疏松症的靶向治疗。

本发明还提供了一种装置，其包括对BMP基因表达具有特异性和选择性的至少一种信号的源。本发明的装置可以提供这种信号的产生用于由适于施加由所述特异性和选择性的信号产生的场的至少一个电极施加于骨细胞。

本发明的装置能够将由特异性和选择性的信号产生的场直接施加于患病的或受损的组织和/或施加于患者的皮肤。本发明的装置还可提供了远程施加特异性和选择性的场(如从距离患病或受损组织一段距离施加场)，虽然应该理解电容耦合的装置必须接触受试者的皮肤。在电容耦合的情况中，本发明的装置可包括用于将电极附着于患者身体上受损或患病的组织附近的装置。例如，如图8中所示，可将自附着性电导电极在骨折骨18或关节20的两侧附着于患者的皮肤。本发明的装置可包括用于将装置附着于患者身体的自附着性电极。例如，本发明的装置10可包括连接于动力单元14的电极12，在动力单元14的反面具有VELCRO^补片16，使得动力单元14可以附着于配合在患者的硬质敷料(cast)的VELCRO^带(未显示)。在电感耦合的情况中，本发明的装置可包括代替电极连接于动力单元的线圈或螺线管。

本发明的装置10可以通过多种方式使用。装置10可为便携式的，或者可临时或永久地附着于患者身体。优选本发明的装置10为非侵入式的。例如，可通过施加适合于与患者皮肤接触的用于施加由预定的特异性和选择性的信号产生的场的电极将本发明的装置10施用于患者的皮肤。这种信号还可通过其中随时间电流变化，从而产生穿透组织的特异性和选择性的电磁场的线圈或者螺线管(未显示)施加。还能够将本发明的装置10植入患者体内，包括植入到患者的皮下与患者的骨直接接触。

本领域技术人员应该进一步理解，可以以多种形式提供本发明的装置，包括具有施用于一对或多对电极的编程的、多个、可转换的、特异性和选择性信号的电容耦合动力单元，或连接于具有可转换的、多个、特异性和选择性信号的动力单元的电磁线圈或螺线管和用于产生特异性和选择性的信号的具有动力供应的超声波刺激器。一般说来，装置的偏好基于患者的认可和患者的配合。目前本领域中已有的最小的和最便携的装置为电容耦合单元，然而，具有高度敏感皮肤的患者可能更优选使用电感耦合设备。另一方面，超声波单元需要最大程度的患者合作，但是某些患者可能期望使用。

实施例

在以下实施例中说明本发明，其只是用于说明的目的而并非意在限制本发明的范围。

材料和方法

将MC3T3-E1骨细胞(5×10⁵细胞/cm²)铺板培养在特异性改变的Cooper平皿上。使细胞生长七天，刚好在试验条件开始之前更换培养基。这些研究中的试验用细胞培养物经过电容耦合的60kHz正弦波信号电场，输出振幅为44.81V峰峰值。在平皿中培养基中产生电流密度为300μA/cm²的20mV/cm的计算场强。对照细胞培养皿与刺激皿相同，只是电极没有连接于函数发生器。

在试验的最后，根据厂商的说明书，使用TRIzol分离总RNA并使用SuperScript II逆转录酶进行逆转录(RT)。在实时RT-PCR技术中使用的寡核苷酸引物选自公开的cDNA序列或使用Primer Express软件程序设计的序列。使用ABI Prism7000Sequence Detection System进行RT-PCR产物的定量实时分析。

如下所述系统地寻找用于所需的上调(BMP)基因-包括BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7等的最佳信号。使用已知增加(或甚至只是推测能增加)给定蛋白的细胞产量的电信号(例如，60kHz正弦波)作为用于确定产生用于该蛋白的基因表达(mRNA)的场的特异性信号的起始信号。首先通过改变信号的持续时间同时保持所有其它信号特征(振幅、占空度、频率和波形)不变作出剂量-应答曲线(图1)。这测定了起始信号对该蛋白的基因表达的最佳持续时间。如图1所示，不同BMP mRNA的最大表达发生在24小时的信号持续时间。然后进行第二剂量-应答曲线的制作，这次改变电场的振幅(mV/cm)同时保持最佳持续时间和其它信号特征不变(图2)。如图所示，在20mV/cm发生多种BMP mRNA的最大表达。进行第三剂量应答，这次改变信号频率，同时保持上述获得的最佳持续时间和最佳振幅不变(图3)。如图所示，60kHz的频率发生多种BMP mRNA的最大表达。通过将占空度从100％(恒定)变化到10％或者更小，同时保持上述获得的最佳持续时间，振幅和频率不变进行第四剂量应答(图4)。如图所示，50％的占空度发生多种BMP mRNA的最大表达。最后，通过改变关的时间/开的时间参数，同时保持上述获得的50％的占空度以及分别为20mV/cm和60kHz的振幅和频率进行第五剂量应答(图5)。如图所示，1分钟开/1分钟关的50％占空度发生多种BMP mRNA的最大表达。

通过这种方法，确定了用于产生多种BMP的基因表达的最大增加的最佳信号。

第六试验的进行是将持续的50％占空度(电容耦合，20mV/cm，60kHz正弦波)与脉冲的50％占空度(电容耦合，20mV/cm，60kHz)相比较。如图所示，每种信号都显示BMP-2mRNA约5倍的增加(图6)。

最后的试验是为了阐述BMP mRNA产物-也就是BMP-2蛋白的产量的增加以及可以由BMP-2水平诱导的碱性磷酸酶的活性的增强。用50％占空度(电容耦合的，20mV/cm，60kHz，正弦波)信号刺激24小时后，BMP-2产物以及碱性磷酸酶的活性分别增加1.9-倍和1.6-倍(图7)。

图8图解了用于治疗患有膝骨关节炎的患者的本发明的装置10。如图所示，两个环形的、软的传导性的、自附着性的电极12位于膝部的关节结合缝(joint line)20两侧的皮肤上。电极12连接于动力单元14，在动力单元14的反面具有VELCRO补片16，使得动力单元14可以附着于配合在患者的小腿、大腿或腰周围的VELCRO带(未显示)。可在患者每晚上床之前或任何其它方便的时间将电极12置于皮肤上。当然，也可使用其它适合类型的电极12。

优选动力单元14是小型的(如6-8盎司)并且由标准的9伏电池提供动力，其为置于皮肤上的电极12发射5V峰峰值、6-10mAmp、20mV/cm、60kHz的正弦波信号。当1分钟开和1分钟关增值中采用适合的占空度(50％)，每天提供大约24小时的这种信号时，其显示显著地上调编码BMP的基因。

本发明清楚地显示实施例中描述的最佳电场可以非常显著地上调BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7mRNA，并由此增强骨的形成。本领域技术人员应该认识到，本文中描述的电容耦合的适合电场与电感耦合和产生等价的、或接近等价的电场特征的所有电磁系统一样有效。本领域技术人员还应该理解，可通过更多数据点的更多实验发现更独特的信号特征(如，100±3％的占空度，30±3分钟)，但是每种信号特征的这种相对小的变化认为是在参考了本文教导的本领域技术人员的水平范围内。

本领域技术人员还应该理解，可在本发明的范围内对本发明进行多种其它的改进。例如，可通过结合在支撑物、包扎物、或硬质敷料中的两个或多个适当的表面电极(成对的或条状的)，将本文描述的最佳场施加于任何骨，并通过电容耦合递送。另外，可以通过结合到支撑物、包扎、或硬质敷料中的线圈或螺线管将本发明描述的最佳电场施加到任何骨并通过电感耦合递送。因此，本发明的范围不限于上述的优选实施方案，而只由权利要求限制。