一种促进海洋绿藻直接光照产氢的方法

摘要

本发明海洋绿藻直接光照产氢的方法，具体地说是一种添加解偶联剂调控海洋绿藻直接光照产氢的方法，不需要暗诱导，直接光诱导氢酶表达产生氢气。取对数生长后期的藻细胞悬浮在新鲜的海水培养基中，调节藻密度到约为2.80～3.00×106个/ml，并添加海水体积1～2‰的康维方营养盐；将离心浓缩后的藻细胞重新放置在光照下培养1～6小时，调节藻液的pH为7.50～8.50；排除反应系统内的氧气；加入解偶联剂，使藻液中解偶联剂的浓度为5～10μM，直接光照产氢。本发明使用较低浓度的解偶联剂，提高了光照产氢量、连续光照产氢时间，为研究海洋绿藻的光照产氢提供了一种有效的方法。

说明书

技术领域

本发明海洋绿藻直接光照产氢的方法，具体地说是一种添加解偶联剂调控海洋绿藻直接光照产氢的方法，不需要暗诱导，直接光诱导氢酶表达产生氢气。

背景技术

微藻放氢的现象发现于1942年，但是将微藻放氢现象用于氢能生产的研究则在近二、三十年。国际能源局“氢能执行合约”于1999年启动了“光生物制氢”项目；欧盟项目COST8.41“氢代谢的生物学和生物化学多样性”主要研究微藻中氢酶产氢的分子生物学基础及影响氢酶活性及稳定性的基本因素。根据制氢过程所用酶系的种类和产氢过程电子迁移途径的不同，微藻制氢可分为固氮酶系产氢和可逆氢酶产氢两类，也就是蓝藻(蓝细菌)制氢与绿藻制氢。微藻制氢的第一步是微藻通过光合作用系统II(PS II)吸收太阳能将水分解为质子、电子和氧气，其反应式如下：

           

在第二步，蓝藻主要依靠体内存在的固氮酶系将氮气转化为氨气，作为副产物同时产生氢气，其反应式如下：

        

而绿藻则依靠体内的可逆氢酶在厌氧光照下直接将质子还原为氢气，反应式如下：

                 

固氮酶产氢过程需要消耗大量ATP形式的代谢能，固氮过程中用于产氢的质子只有光合作用系统II产生的质子的25％，太阳能利用效率和产氢效率显然偏低，因此该过程用于能源制氢难具吸引力；绿藻制氢依靠可逆氢酶直接将质子还原为氢气，不需要直接消耗ATP形式的能量。从理论上分析，其太阳能利用率显著优于固氮酶产氢，因此近十年来，微藻产氢研究的重点已逐渐转向绿藻可逆氢酶制氢的研究。

目前，绿藻光照产氢过程研究得较多的是淡水绿藻，如莱因衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，但其培养过程中需要消耗宝贵的淡水资源和易染菌。海洋单细胞绿藻具备完整的光合作用系统，光合效率高、生长速度快。因此研究海洋绿藻光照产氢具有重要的理论和工程意义。

发明内容

本发明在于提供一种海洋绿藻添加解偶联剂直接光解水制氢的方法。通过对培养的海洋绿藻细胞的培养、浓缩、浓缩后静止培养、藻液pH的调节、系统内氧气的排除、添加解偶联剂后光照，实现了海洋绿藻的连续光照产氢。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明根据绿藻在厌氧条件下能够诱导氢酶表达产生氢气，采用适当浓度的解偶联剂(羰基氰化物间氯苯腙)部分降低光合系统II的光化学活性，降低光合放氧使其低于线粒体呼吸耗氧，从而使反应体系在光照条件下保持厌氧状态，诱导氢酶表达；解偶联剂还能显著降低跨类囊体膜质子梯度，增加质子氢和氢酶的作用机率，使光照产氢速率和产氢量大大增加。可按如下步骤操作：

(1)产氢海洋绿藻细胞的培养：接种海洋绿藻细胞到灭菌完全冷却后的新鲜天然海水中，并添加1‰的康维方营养盐，以日光灯作为光源；

具体为：接种藻密度约5.0～7.0*10⁵个/ml，用高温高压灭菌后的天然海水添加1‰的康维方营养盐做培养基，体积为3升的锥形培养瓶，培养藻液的体积为2升；以日光灯作为光源，从上下两个方向同时照射，液面的光照强度为4500～5000Lx；初始接种密度约为5.0～7.0*10⁵个/ml，光暗时间比为12～14∶12～10；光照期间每3～6个小时来回晃动培养瓶，使藻细胞能够充分接受光照；培养温度控制在20～28℃。

特点：日光灯的光波波长主要集中在400～700nm，与太阳光可见光区的波长范围相近，藻细胞的光合作用系统能够这个范围内的光能；从上下两个方向同时照射，能够保证培养瓶中的藻细胞充分接受光照，利于其生长；来回晃动藻液，不仅可以增加藻细胞的游动性，而且使培养体系内部的藻细胞也能够充分接受光照，使培养体系内的细胞均匀、快速生长；从藻细胞生长所需的光照强度和光能的消耗考虑，提供液面光照强度4500～5000Lx较为合适；合适的接种密度既可以缩短接种后的延迟期，又可以节省原始藻液。

(2)产氢海洋绿藻细胞的浓缩：取对数生长后期的藻细胞，浓缩到2.80～3.00*10⁶个/ml，重新悬浮在灭菌完全冷却后的天然海水中，并添加1～2‰的康维方营养盐；

具体为：取对数生长后期的绿藻细胞，在转速1500～2000rpm下，离心2～5min，去掉上层液体，将下层藻细胞重新悬浮在灭菌完全冷却后的天然海水培养基中，调节藻细胞浓度约为2.80～3.00*10⁶个/ml，并添加1～2‰的康维方营养盐。

特点：对数生长后期的绿藻细胞生命力旺盛，体内聚积了丰富的营养物质；将浓缩后的藻细胞重新悬浮在灭菌完全冷却后的新鲜天然海水培养基中，并添加1～2‰的康维方营养盐，使高浓度的绿藻细胞能够继续吸收充足的营养，保持良好的细胞活性。

(3)浓缩后藻细胞的静止培养：将离心浓缩后的绿藻细胞重新放置在光照下培养1～6小时左右；

特点为：浓缩前藻细胞生活的藻液环境pH为9.50左右，而新鲜的海水培养基的pH为浓缩后8.00～8.30左右，所以通过静止培养来使藻细胞适应培养基pH的变化。

(4)藻液pH的调节：用1M的氢氧化钠溶液或是盐酸溶液调节藻液的pH到7.50～8.50；

具体为：取500ml藻液到灭菌冷却后的玻璃反应器中，用磁力搅拌器搅拌，转速为150～200rpm，缓慢滴加1M的氢氧化钠溶液或是盐酸溶液到藻液内部，缓慢调节藻液的pH到7.50～8.50；

特点为：合适的搅拌速率使高密度的藻细胞均匀地分布在反应器内，且搅拌产生的剪切力不会破碎细胞；在搅拌情况下，缓慢滴加酸碱调节液到藻液内部，使酸碱调节液均匀分布，藻液的pH缓慢变化，不会影响藻细胞的活性。

(5)反应系统内氧气的排除：用ZZ.ZZ₁₁型口腔针将氮气导入反应系统内液面以下，通氮气5～10min即可将反应系统内的氧气；

特点为：通气速度为每秒钟一个气泡，避免气泡上升过程中破碎产生的剪切力破碎藻细胞。

(6)直接光照产氢：向反应器中加入用二甲基亚砜做溶液配制浓度为20mM的解偶联剂(羰基氰化物间氯苯腙或羰基氰化物间氟苯腙)0.10～0.25ml，反应体系藻液中解偶联剂实际浓度为5～10uM，10min后开始光照，光源为光照强度为6000～8000Lx的单面日光灯，用气相色谱检测反应体系气体组成，温度控制在20～28℃；

特点为：在光照强度6000～8000Lx下，5～10uM的解偶联剂既能部分抑制藻细胞PSII光化学活性，降低光合放氧；同时使PSII保持一定的光化学活性，为持续光照产氢提供质子和电子。

(7)光照产氢过程藻细胞PSII光化学活性的测定：从反应体系取5～10uL藻液，加入到叶绿素荧光仪测量杯中进行测量；

具体为：从反应体系取5～10uL藻液，加入到叶绿素荧光仪测量杯中进行测量，用专用搅拌器搅拌30S，使藻细胞在测量杯中分布均匀，然后测量藻细胞PSII的光化学效率；

特点为：通过叶绿素荧光仪测定藻细胞在光照产氢过程中的荧光动力学参数，来表征藻细胞在光照产氢过程中PSII光化学活性的变化。

本发明优点如下：

1.制氢路线合理、操作简单。本发明采用生长繁殖快、光合效率高的海洋绿藻；本发明在光照产氢前不需要长时间暗诱表达氢酶，本发明通过调节藻液的pH、光照强度和添加合适浓度的解偶联剂直接光照就能达到相同的光照产氢效果。

2.解偶联剂使用浓度低。在相同藻细胞浓度下，本发明只使用10uM(反应体系中的浓度值)的解偶联剂部分降低光合系统II的光化学活性，降低光合放氧使其低于线粒体呼吸耗氧，从而使反应体系在光照条件下保持厌氧状态，诱导氢酶表达，同时保持PSII一定的光化学活性，为光照产氢提供电子；解偶联剂还能显著降低跨类囊体膜质子梯度，增加质子氢和氢酶的作用机率，使光照产氢速率和产氢量大大增加就能到达良好的的产氢效果。

3.持续产氢时间长、产氢量高。在相同藻液密度下，本发明可以连续光照产氢48小时左右，光照产氢量高。

附图说明

图1为本发明添加解偶联剂光照产氢曲线图；

图2为本发明添加解偶联剂光照产氢过程中藻细胞PSII光化学活性变化图。

具体实施方式

海洋亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)添加解偶联剂直接光照产氢

1)产氢海洋亚心型扁藻细胞的培养

接种海洋亚心型扁藻细胞到高温高压灭菌并完全冷却后的新鲜天然海水中，并添加其体积1‰的康维方营养盐，以日光灯作为光源，从上下两个方向同时照射，液面的光照强度为4500～5000Lx；体积为3升的锥形培养瓶，培养的藻液体积为2升；初始接种密度为6.00*10⁵个/ml，并添加2ml的康维方营养盐，光暗时间比为14∶10；光照期间平均3个小时来回晃动培养瓶，不仅可以增加藻细胞的游动性，而且使培养体系内部的藻细胞也能够充分接受光照，使培养体系内的细胞均匀、快速生长；

藻细胞生长到对数生长后期约需16天左右，此时藻细胞的浓度约为1.8～2.0*10⁶个/ml；

2)产氢藻细胞的浓缩

取对数生长后期的扁藻细胞，计数藻液细胞浓度；将藻液进行离心浓缩，在转速1500rpm下，离心2min，去掉上层液体，将下层藻细胞重新悬浮在灭菌完全冷却后的新鲜天然海水培养基中，调节藻细胞浓度约为3.00*10⁶个/ml，并用血球计数器计数藻液中实际藻细胞浓度，并添加海水体积2‰的康维方营养盐；

3)浓缩后藻细胞的静止培养：将离心浓缩后的扁藻细胞重新放置在光照下培养2小时左右；

4)藻液pH的调节：取上述500ml藻液到灭菌冷却后的玻璃反应器中，用磁力搅拌器搅拌，转速为200rpm，缓慢滴加1M的氢氧化钠溶液或是盐酸溶液到藻液内部，缓慢调节藻液的pH到8.50；在调节过程中缓慢地添加氢氧化钠溶液或是盐酸溶液，使藻液的pH缓慢地变化；

5)反应系统内氧气的排除：用ZZ.ZZ₁₁型口腔针将氮气导入反应系统内液面以下，通气速度为每秒钟一个气泡，10min即可将反应系统内的氧气降低到1000ppm左右；反应器的直径为4cm，各接口或取样端口均用真空脂或真空封泥密封；

6)直接光照产氢：向上述反应体系中加入用二甲基亚砜做溶剂配制的解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(用二甲基亚砜配制羰基氰化物间氯苯腙成15uM的解偶联剂)，使藻液中解偶联剂的浓度为10uM，10min后开始光照，用气相色谱检测反应体系气体组成，能够连续光照产氢48h左右，产氢量为19umols H₂/mg Chl；

采用排水法读取液柱的变化，便可换算出光照产氢过程中气体体积的变化，单面日光灯照射作为光源，光照强度为8000Lx；光照过程中采用磁力搅拌器，使藻细胞均匀悬浮在反应器内，搅拌速率为200rpm。

7)藻细胞PSII光化学活性的测定：从反应体系取10uL藻液，加入到叶绿素荧光仪测量杯中进行测量，用专用搅拌器搅拌30S，使藻细胞在测量杯中分布均匀，然后测量藻细胞PSII的光化学活性的效率。