具有免疫调节作用的抗化学性肝损伤的中药制剂

摘要

本发明涉及一种具有免疫调节作用的抗酒精致肝细胞损伤以及相应引起的血清转氨酶升高的口服制剂，其中含有有效量的灵芝多糖；本发明还涉及一种具有免疫调节作用的防治化学性肝损伤的口服制剂，其中含有有效量的虫草多糖。本发明特别涉及一种具有免疫调节作用的抗化学性肝损伤的复方口服制剂，其中含有有效量的灵芝多糖和虫草多糖。

说明书

技术领域

本发明涉及保健品和中药口服制剂，特别是一种具有免疫调节作用的防治化学性肝损伤的保健品或中药口服制剂及其制备方法。

背景技术

脂肪肝在一些欧美国家普通成年人中B超检出率达到20％，我国上海、北京等经济发达城市也达到10％以上，并呈逐年上升趋势。其中，酒精引起的化学性肝损伤约占脂肪肝患者的50％。酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化常相继发生或同时存在；无论肝组织超微结构改变轻重，均有不同程度的肝功能异常，血清转氨酶水平升高。在病变程度上，酒精性脂肪肝一旦发展为酒精性肝硬化则难以恢复，往往需要肝脏移植。

对于由酒精等化学因素所致的肝损伤，常规的治疗方案是戒酒，或者给予高营养支持等一些事后补救的方法，目前尚无特异性的治疗措施。因此以预防为主，研发具有防治化学性肝损伤的保健药品具有重要意义。本发明选用食药两用灵芝和冬虫夏草为原料，以中药传统的水煮法为基础，对富含多糖成分的中药水提取物部分进行筛选和复方制剂的研究。

灵芝，广义上包括已知180余种的多孔菌灵芝属之中的任何一种，狭义上是指为中华人民共和国药典(2005年版，二部)所收载的赤芝Ganoderma Lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinensiZhao，Xuet Zhang的干燥子实体。据药典所载，灵芝性味甘，平；有补气安神，止咳平喘之功效，可治眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。灵芝在我国最早的药学著作《神农本草经》中被列为上品，谓其能“益心气”、“安惊魂”、“补肝益气”、“坚筋骨”、“好颜色”，久服可“不老延年”；它也是美国《草药药典》仅收录的10种中草药之一。现代科学研究表明，灵芝含有多糖、多种氨基酸、甾类、三萜类、生物碱、有机酸、甘露醇等多种生物活性物质，并含有多种微量元素。其所含的灵芝多糖被认为是其药理活性的主要成分，《中华人民共和国药典》2005年版，一部已将灵芝多糖作为灵芝质量的控制标准。目前以从赤芝中获得的灵芝多糖的药理活性研究最多、最为深入，发现灵芝多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫力和耐缺氧能力等(参见世界科学技术一中医药现代化6(2)：57-62；2004.)，从其他种灵芝属来源的多糖与赤芝多糖具有相似的药理活性。但尚未见灵芝多糖对于防治酒精所致急性肝损伤以及相应引起的血清转氨酶升高的特别研究。

灵芝多糖的生产，除以野生或人工栽培的灵芝子实体为原料外，也可从灵芝菌深层发酵的菌丝体或发酵液中提取。有研究显示灵芝子实体、菌丝体中灵芝多糖均由葡萄糖、果糖组成，且这两种单糖在子实体和菌丝体多糖中的摩尔比相同，为不同种属来源的灵芝多糖具有相似的生物学活性提供了分子基础。因人工栽培子实体生产周期长、成本高，现多采用深层液体发酵法生产灵芝多糖(参见中国食用菌23(6)：36-39；2004)。灵芝多糖分子量从数百到数十万，除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高浓度酒精，而溶于热水，因此适用于水提取-醇沉淀工艺提取。

中药冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis(BerK.)Sacc.。它是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，俗称虫草。据中华人民共和共药典(2005年版，二部)记载，其性味甘，平；功能补肺益肾，止血，化痰；主治久咳虚喘，劳嗽咳血，阳痿遗精，腰膝酸软。现代药理学研究已证明虫草多糖可调节免疫力、降血糖、抗肿瘤，但尚未见虫草多糖抗酒精所致急性肝损伤以及相应引起的血清转氨酶升高的文献报道。

虫草多糖的生产途径包括：一是从天然来源的冬虫夏草子实体中提取，二是从发酵培养的菌丝体和发酵液中提取。因冬虫夏草特殊的生长要求，野生来源的产量有限。目前虫草多糖的主要产生途径是使用冬虫夏草菌种进行液体发酵，并且已经能达到工业化生产规模(参见广州食品工业科技，19(4)：12-15；2003)。虫草多糖也多溶于热水，不溶于高浓度酒精，因此可用水提取-醇沉淀法分离、纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有免疫调节作用的抗急性化学性肝损伤，特别是抗酒精引起的急性化学性肝损伤的口服制剂及其制备方法。

本申请的发明人研究发现，使用《中华人民共和国药典》入药的灵芝和冬虫夏草为原料，提取的灵芝多糖和虫草多糖均具有对抗酒精所致的化学性肝损伤的效应。并且将上述两种多糖成分组成的复方制剂口服，在减少多糖总用量的前提下，能显著对抗酒精致肝细胞损伤以及相应引起的血清转氨酶升高。本发明的制剂与同类产品相比，不但能对酒精所致的化学性肝损伤有辅助保护作用，而且能显著减少致死量酒精引起的死亡，改善醉酒后的生存状态。安全性试验研究发现，本发明制剂没有可观察到的毒性反应，适合一般成年人长期大量服用。

本发明提供了一种具有免疫调节作用的抗酒精致肝细胞损伤以及相应引起的血清转氨酶升高的口服制剂，其中含有有效量的灵芝多糖，以及选择性的药学上可接受的载体。相应的，本发明还提供了灵芝多糖用于制备治疗或预防具有免疫调节作用的抗酒精致肝细胞损伤以及相应引起的血清转氨酶升高的药物的用途。

另一方面，本发明提供了一种具有免疫调节作用的防治化学性肝损伤的口服制剂，其中含有有效量的虫草多糖，以及选择性的药学上可接受的载体。相应的，本发明还提供了虫草多糖用于制备治疗或预防具有免疫调节作用的防治化学性肝损伤的药物的用途。

在优选的技术方案中，本发明提供了一种具有免疫调节作用的抗化学性肝损伤的复方口服制剂，其中含有有效量的灵芝多糖和虫草多糖，以及选择性的药学上可接受的载体。在更优选的技术方案中，本发明的口服制剂中以多糖重量计，组方中含有：灵芝多糖10％～90％、虫草多糖10％～90％，优选灵芝多糖30％～80％、虫草多糖20％～70％，更优选灵芝多糖40％～60％、虫草多糖40％～60％。

用于本发明的灵芝多糖和虫草多糖可以按照本发明实施例提供的制备方法制备得到，也可以按照现有技术公开的已知方法获得(例如参见广州食品工业科技19(4)：12-15；2003)，也可以通过市售途径获得。

按照不同的提取方法均可获得适用于本发明的多糖提取物。例如水提取-醇沉淀法、膜过滤法和碱液提取-盐析法技术等。

按照本发明优选的技术方案，可以将灵芝或虫草发酵的菌丝体用水提取，或者将药用灵芝或虫草原料用水提取(优选采用水煮法，或水回流提取法，控制温度80℃-100℃，时间1小时-4小时)，用醇沉淀(优选用乙醇，优选醇浓度为60％-95％，温度4℃-30℃，时间3小时-12小时)，由此可获得富含灵芝多糖或虫草多糖的粗提物，将得到的粗提物以适量水溶解，再用醇沉淀(优选用乙醇，优选醇浓度为60％-95％，温度4℃-30℃，时间3小时-12小时)精制，然后分别喷雾干燥或减压干燥，制成粉末，粉碎过筛，用于配制所述制剂，也可以将所述灵芝多糖或虫草多糖提取物直接用于配制所述制剂。

在优选的实施方案中，将粉碎后的灵芝原料热水回流浸提1-3次，滤渣重提1-3次，合并滤液，减压浓缩，乙醇沉淀，沉淀以去离子水稀释，喷雾干燥或减压干燥成浸膏粉。虫草菌株发酵，离心收集菌丝体，热水浸提1-3次，与离心上清液合并，减压浓缩，乙醇沉淀，沉淀以去离子水稀释，喷雾干燥或减压干燥成浸膏粉。

本发明产品的主要功效成分为灵芝多糖和虫草多糖，因此以多糖含量的检测为产品质量的控制方法。提取物中多糖的含量测定可采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法等，本发明参照《中华人民共和国药典》2005年版一部130页灵芝含量测定项下，采用硫酸-蒽酮法，优选的适用于本发明的灵芝和虫草提取物中多糖含量为10～90％。

本发明还提供了上述单方制剂的制备方法，所述方法包括可以将所述灵芝多糖或虫草多糖提取物或其粉末直接配制成制剂，也可以选择性的加入药学上可接受的载体，加工成口服制剂。

本发明还提供了上述复方制剂的制备方法，所述方法包括将所述灵芝多糖和虫草多糖提取物或其粉末按所需比例混合，可以直接配制成制剂，也可以选择性的加入药学上可接受的载体，混合均匀，加工成口服制剂。

本发明的制剂以多糖为主要成分，可调节机体免疫力，对人体具有保健作用，特别是可对抗致死剂量的酒精所致的急性肝损伤。按常规方法可直接或选择性添加适宜的药用载体制成胶囊、片剂、颗粒剂或口服液，即可作为一般亚健康人群的保健品，又可作为化学性肝损伤的防治药物。对于体重60kg的成年人，如单用灵芝多糖或单用虫草多糖使用剂量为不低于0.2g/次，优选不低于0.4g/次，最优选0.9g/次-10g/次，1-4次/日，优选2次或3次；服用按比例组成的灵芝多糖和虫草多糖的复方制剂使用剂量为不低于0.05g/次，优选不低于0.1g/次，最优选0.2g/次-2.0g/次，1-4次/日，优选2次或3次，即可对酒精所致的急性肝损伤产生明确的保护效应。

附图说明

图1.显示了单独用灵芝多糖和虫草多糖对血清ALT水平的影响。*P＜0.05；**P＜0.01与正常对照组比；n＝6。

图2.显示了单独用灵芝多糖和虫草多糖对血清AST水平的影响。*P＜0.05；**P＜0.01与正常对照组比；n＝6。

图3.显示了灵芝提取物和虫草提取物复方制剂对血清ALT水平的影响。*P＜0.05；**P＜0.01与正常对照组比；#P＜0.05与乙醇20mg/kg组比。

图4.显示了灵芝提取物和虫草提取物组方对血清AST水平的影响。*P＜0.05；**P＜0.01与正常对照组比；#P＜0.05与乙醇20mg/kg组比。

图5.显示了生物活性实施例2中的组方V对乙醇引起的急性肝损伤小鼠血清ALT水平的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与乙醇20mg/kg组比。

图6.显示了生物活性实施例2中的组方V对乙醇引起的急性肝损伤小鼠血清AST水平的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与乙醇20mg/kg组比。

图7.显示了生物活性实施例2中的组方I-V对乙醇引起的环磷酰胺注射小鼠胸腺指数的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与环磷酰胺组比。

图8.显示了生物活性实施例2中的组方I-V对乙醇引起的环磷酰胺注射小鼠脾指数的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与环磷酰胺组比。

图9.显示了生物活性实施例2中的组方I-V对乙醇引起的环磷酰胺注射小鼠白细胞计数的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与环磷酰胺组比。

图10.显示了生物活性实施例2中的组方I-V对乙醇引起的环磷酰胺注射小鼠红细胞计数的影响。^**P＜0.01与正常对照组比，^#P＜0.05与环磷酰胺组比。

具体实施方案

实施例1

取灵芝8kg，粉碎，加入10倍量热水回流浸提2小时，过滤，滤渣以同样方式重提1次，合并滤液，控制温度在50℃的条件下减压浓缩，浓缩液加入95％乙醇沉淀过夜，加入去离子水重新溶解沉淀，加入95％乙醇沉淀12小时，减压干燥，得灵芝浸膏粉，粉碎，过100目筛，得灵芝提取物。经硫酸-蒽酮法检测，提取物中灵芝多糖含量为35％。

实施例2

按10％的接种量将冬虫夏草菌接种到发酵瓶中，发酵液组成为白糖4.0％、豆粉1.0％、酵母粉0.42％、KH₂PO₄ 0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.075％，28℃发酵120小时后离心，收集发酵液备用，菌丝体加入10倍量的去离子水，95℃浸煮5小时，过滤，滤液再加入5倍量的去离子水，95℃浸煮5小时，过滤。合并发酵液的离心上清液和菌丝体两次浸煮滤液，50℃减压浓缩至原来体积的三分之一，加入95％乙醇沉淀过夜，以2倍量的去离子水重新溶解沉淀，加入95％乙醇沉淀12小时，减压干燥，得虫草浸膏粉，粉碎，过100目筛，得虫草提取物。经硫酸-蒽酮法检测，提取物中虫草多糖含量为30％。

实施例3

制备1000粒复方中药胶囊：分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物135克，和实施例2的方法制得的虫草提取物135克，总重量270克，(按复方中灵芝多糖50％、虫草多糖50％的比例)，混合均匀，充填成1000粒胶囊。

实施例4

冲剂的制备：分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物570克，和实施例2的方法制得的虫草提取物285克(按复方中灵芝多糖70％、虫草多糖30％的比例)，混合均匀，制成粉末，制粒，分装即得。

实施例5

分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物680克，和实施例2的方法制得的虫草提取物170克(按复方中灵芝多糖80％、虫草多糖20％的比例)，与适当辅料混合均匀，制成粉末，加入去离子水稀释，分装、灭菌，即得。

生物活性实施例1

试验方法：使用依照文献(Alcohol 1(1)：5763；1999.)方法改进的酒精致小鼠急性肝损伤模型。

实验采用昆明小鼠，♂，体重18～22g。实验组分为空白对照组，酒精模型组和药物处理组。药物处理组以灌胃方式给予实施例1的灵芝提取物，或实施例2的虫草提取物，空白对照组和酒精模型组按相同方式给予溶剂蒸馏水。于末次给药前16小时，酒精模型组和药物处理组灌胃给予白酒，空白对照组以同样方式给予等剂量的溶剂，撤去各组小鼠饲料，使其自由饮水。于末次给药后2小时，取小鼠眼球血，测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

结果判定：根据临床检查肝功能的血常规检测标准，以能降低饮酒小鼠血清AST或ALT水平者判为有效。

使用上述方法研究发现乙醇20mg/kg灌胃可使小鼠血清ALT和AST水平分别升高153.6％和66.1％，灵芝提取物和虫草提取物在其主成分灵芝多糖和虫草多糖含量分别为400mg/kg时可分别使醉酒小鼠血清ALT和AST水平降低21.4％和12.3％，18.8％和7.0％，结果如附图1和2所示。

结论：灵芝提取物和虫草提取物分别对酒精所致的化学性肝损伤具有保护效应。

生物活性实施例2

按照均匀设计原则将实施例1的灵芝提取物和实施例2的虫草提取物以多糖含量计算按不同比例组方如下：

组方I灵芝多糖∶虫草多糖＝1∶2；

组方II灵芝多糖∶虫草多糖＝1∶4；

组方III灵芝多糖∶虫草多糖＝4∶1；

组方IV灵芝多糖∶虫草多糖＝2∶1；

组方V灵芝多糖∶虫草多糖＝1∶1；

采用生物实施例1的研究方法，发现给予小鼠乙醇20ml/kg灌胃，其血清ALT和AST分别升高232.4％和23.4％；组方I、组方III、组方IV和组方V在其中多糖含量为80mg/kg可使醉酒小鼠血清ALT和AST水平分别减少34.4％和8.2％，37.5％和22.2％，42.8％和20.2％，32.4％和15.9％，结果如附图3和4所示。

结论：复方灵芝多糖-虫草多糖能有效降低醉酒小鼠血清转氨酶水平。

生物活性实施例3

根据该中药复方的筛选研究结果，选定灵芝多糖与虫草多糖含量比为1∶1的组方V进一步作药效学研究。结果如下：

药物组方V对急性肝损伤小鼠血清转氨酶水平的影响：

小鼠给予乙醇20mg/kg灌胃，其血清ALT和AST水平显著升高，与正常对照组比分别升高620.4％和106.8％；给予组方V 80mg/kg、160mg/kg和400mg/kg可显著降低醉酒小鼠血清的ALT和AST水平，使醉酒小鼠血清ALT分别降低29.2％、48.3％和51.5％，使AST水平分别降低23.2％、38.6％和24.5％，且呈一定的剂量依赖性，结果如附图5和6所示。

药物组方V对小鼠醉酒后16小时生存状态的影响：

小鼠急性给予乙醇20mg/kg，灌胃16小时后，5/10恢复正常，2/10反应迟钝，1/10昏迷，2/10死亡。给予组方V 80mg/kg、160mg/kg和400mg/kg可明显改善小鼠醉酒后的生存状态，结果见表1。

表1.药物组方V对醉酒小鼠生存状态的影响

  组别  n  生存状态RIDIT′s Critical U-Values  恢复正常  反应迟钝  昏迷  死亡  正常对照组  乙醇20mg/kg组  组方V 80mg/kg组  组方V 160mg/kg组  组方V 400mg/kg组  10  10  10  10  10  10  5  7  9  8  0  2  1  0  1  0  1  1  0  1  0  2  1  1  0  1.6476  -2.0969^*  -0.5991^#  0.7938^#  0.2546^#

注：组方V以其中所含的多糖成分计.*P＜0.05与正常对照组比，#P＜0.05与乙醇20mg/kg组比.

结论：以灵芝多糖和虫草多糖为主要成分的组方能有效对抗乙醇所致的小鼠急性肝脏损伤，并能改善醉酒16小时后小鼠的生存状态。

生物活性实施例4

实验采用昆明小鼠，♂，体重18～22g。实验组分为空白对照组，环磷酰胺组和药物处理组。药物处理组预防给予药物，空白对照组和环磷酰胺组以相同方式给予等量的溶剂。在倒数第二次给药后1-2小时，环磷酰胺模型组和药物治疗组小鼠腹腔注射适量环磷酰胺，空白对照组以同样方式给予等量溶剂注射。于末次给药后2小时，取血，测白细胞计数；处死动物，迅速取脾脏和胸腺，滤纸拭干，称重。

使用上述方法研究组方I、组方II、组方III、组方IV和组方V，发现灵芝提取物与虫草提取物组方在其多糖含量分别为20％～80％和20％～80％时，对注射环磷酰胺小鼠下降的白细胞计数、胸腺指数、免疫指数、红细胞计数分别有不同程度的逆转效应，如附图7～10所示。

结论：以灵芝多糖和虫草多糖组成的复方制剂，在灵芝多糖含量为20％～80％，虫草多糖含量为20％～80％时，具有免疫调节作用。

本发明人采用市售的灵芝多糖和虫草多糖产品利用上述生物活性实施例方法测定，获得了类似的效果。