用于三疣梭子蟹的简单重复序列引物

摘要

本发明公开了一种用于三疣梭子蟹的简单重复序列引物，该引物的序列分别为CAC ACA CAC ACA CAC AG，AGA GAG AGA GAG AGA GYT，AGA GAG AGA GAG AGA GYC，AGA GAG AGA GAGAGA GYA，GAG AGA GAG AGA GAG AYT，CAC ACA CAC ACA CAC ARC，CAC ACA CAC ACA CAC ARG，GTG TGT GTG TGT GTG TYA，GTG TGT GTG TGT GTG TYC，GTG TGT GTG TGT GTG TYG。筛选出的10条简单重复序列引物，条带清淅，可重复性高，引物长，退火温度高，易操作，成本低。该引物序列长度为16－18个碱基，扩增的退火温度比RAPD引物增加6－8个碱基，扩增的退火温度比RAPD技术提高了14－20℃，降低了成本，操作步骤简化。可用于三疣梭子蟹种质评价和遗传结构分析。

说明书

                           技术领域

本发明涉及一种应用于三疣梭子蟹的种质评价和遗传结构分析的引物。

                           背景技术

目前常用来进行评价生物遗传多样性和种质鉴定的分子标记均具有一定程度的缺陷，如RAPD技术(随机扩增序列多态性DNA，Random amplified polymorphic DNA)，常因RAPD引物过短10个碱基、退火温度过低一般36-37℃，导致扩增产物的一些非特异结果，其可靠程度和真实性是主要的缺陷；而AFLP技术(扩增片段长度多态性，Amplified fragment length polymorphism)，又因操作条件复杂如要求酶切、成本相对较高而限制了其广泛的应用。

内部简单重复序列即ISSR(Inter-simple sequence repeat)，是一种新兴的分子标记技术。ISSR-PCR技术最早是Zietkiewiez(1994)提出的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记。它是以PCR技术为基础，利用真核生物基因组中广泛存在的简单串联重复，即SSR(simple sequence repeat)来设计引物，无需预先克隆和测序，从而对位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离获得多态性图谱。ISSR又依引物在5’或3’端加锚定碱基与否而分为锚定简单重复序列间扩增(anchored inter-simple sequence repeat，ASSR)和非锚定简单重复序列间扩增(Nonanchored inter simple sequence repeat)，亦称MP-PCR(microsatellite primedPCR)(P.Boudry，2002)。ASSR的引物是由2～4个核苷酸组成的简单串联重复序列和5’或3’端锚定的1～3个选择性碱基两部分组成，这样保证了引物与基因组DNA中特定SSR的5’或3’端结合，从而进行PCR扩增；ISSR技术则正好克服了RAPD和AFLP技术的这些缺点，具有很好的应用价值。

目前ISSR分子标记在植物上应用较为广泛，在动物三疣梭子蟹上未有应用。

                             发明内容

本发明的目的是要提供一种用于三疣梭子蟹的简单重复序列引物，该引物可克服现有技术引物过短，退火温度低，操作条件复杂，成本高的缺陷。

本发明的目的是这样实现的：先进行UBC#9标准引物通过生物公司合成100条，再进行三疣梭子蟹基因组的提取，再进行PCR反应体系，再进行引物的筛选和优化；对UBC-9#通用引物库的100条引物的三疣梭子蟹基因组进行扫描，筛选出10条条带清晰，可重复性高的三疣梭子蟹ISSR引物，这10条引物是：

                                   表一

  引物编号  序列  变性温度℃  最佳反应退火温度℃  JSMBL1  JSMBL2  JSMBL3  JSMBL4  JSMBL5  JSMBL6  JSMBL7  JSMBL8  JSMBL9  JSMBL10  CAC ACA CAC ACA CAC AG  AGA GAG AGA GAG AGA GYT  AGA GAG AGA GAG AGA GYC  AGA GAG AGA GAG AGA GYA  GAG AGA GAG AGA GAG AYT  CAC ACA CAC ACA CAC ARC  CAC ACA CAC ACA CAC ARG  GTG TGT GTG TGT GTG TYA  GTG TGT GTG TGT GTG TYC  GTG TGT GTG TGT GTG TYG  54.6  53.88  56.16  53.88  53.88  56.16  55.0  52.7  56.16  56.16  52  52  55  52  52  55  53  50  55  55

表一中的R＝(A+G)，Y＝(C+T)。

本发明引物的用法：先提取三疣梭子蟹的基因组DNA，再合成表1中的10条三疣梭子蟹引物，再PCR扩增，再电泳检测与数据统计。

所述的提取三疣梭子蟹的基因组DNA是采用SDS裂解液配方：10mmol/LTris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS，提取的步骤为取三疣梭子蟹的步足上的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600μl的SDS组织裂解液，放入55℃水浴摇床，裂解1h后加入蛋白酶K10μl(20mg/ml)，继续裂解3～4h，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部，让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解，裂解完毕后每只离心管加入600μl Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，加入600μl氯仿异戊醇混合液(24∶1)，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min，12000rpm，离心10min，取上清液，加入1200μl冷冻无水乙醇，颠倒45-55次，室温静置10～15min，8000rpm，离心10min，弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500μl 70％的乙醇，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min，弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕，加入50μlTE，溶解DNA，4℃保存，制备0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

所述的PCR扩增，其中PCR体系为25μl，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U；反应条件：95℃预变性5min；然后进入以下40个循环：94℃变性45s，每个引物按表一中的最佳退火温度退火45s，72℃延伸1.5min，72℃再次延伸10min，最后4℃保存。

所述的电泳检测与数据统计为：

(1)琼脂糖凝胶板的制备：称取2g琼脂糖加入100ml 0.5×TBE，摇匀，置微波炉加热至完全熔化取出，冷却到50～60℃后加5μl GoldView荧光染料(EB也可以)，摇匀，在距底板0.5-1mm的位置放样品梳，倒入封好的凝胶槽，厚度约3-5mm，制成2％的胶。

(2)加样：8μl样品中加1.5μl左右溴酚加样缓冲液，混匀后加入凝胶点样孔中，同时设立DNA分子量标准物(DL-2000)；

(3)电泳：电压以每cm 3～5V的原则设置总电压，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿1-2cm处时，关闭电源，电泳过程中可以用手提紫外灯检查；

(4)取出凝胶板，置紫外透射仪观察，即可见绿色的DNA条带；

(5)凝胶呈像系统(Chemi Doc XRS)拍照，记录结果；

(6)经电泳获得的图谱每群体在所有位点的谱带式样组成一个01矩阵。用Arequin2.0软件进行分子方差分析(AMOVA)，计算遗传多态度(π)和遗传分化指数(Fst)等各种种质资源评价指标，最终得出评价结果。

本发明应用PCR技术筛选出10条可用于三疣梭子蟹种质评价的遗传结构分析的简单重复序列引物，条带清淅，可重复性高，引物长，退火温度高，易操作，成本低。该引物序列长度为16-18个碱基，扩增的退火温度比RAPD引物增加6-8个碱基，扩增的退火温度比RAPD技术提高了14-20℃，大大降低了PCR反应需要酶切步骤，这较AFLP技术大大降低了成本而且操作步骤简化了。

                           具体实施方式

一、引物的筛选：

1.100条标准引物的合成

UBC#9标准引物通过上海生工合成100条。

2.三疣梭子蟹基因组的提取

采集6个三疣梭子蟹自然群体，分别来自大连、东营、连云港、舟山、湛江和福建东山6个地方的自然海域，新鲜样品带回实验室，采用标准酚-氯仿法抽提基因组DNA。

3.PCR反应体系

PCR体系：25μl，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、10×Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTP mixture 0.5μl；反应条件：首先95℃预变性5min，然后进入以下40个循环94℃变性45s，45℃-53℃ Touchdown程序退火45s，72℃延伸1.5min，然后72℃再次延伸10min，最后4℃保存。

4.引物筛选

由于每条引物的退火温度不同，在筛选引物的过程中，采用了TouchDown程序，第一个循环的退火温度为53℃，接下来的每个循环退火温度降低0.5℃，16个循环之后降至45℃，然后以此退火温度进行30个循环。从100条引物中结果共筛选出10条可以扩增出有清晰条带的引物(见表一)。

5.引物优化

对筛选出的10条引物，通过梯度PCR仪作退火温度梯度，结果10条引物的最佳扩增的退火温度如表一。整个反应的优化结果是25μl体系中Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U。

二、引物的用法：

1.提取三疣梭子蟹的基因组DNA

(1)SDS裂解液配方：10mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，0.1mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5％SDS。

(2)步骤：取三疣梭子蟹的步足上的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600μl的SDS组织裂解液，放入55℃水浴摇床，裂解1h后加入蛋白酶K10μl(20mg/ml)，继续裂解3～4h，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部，让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解；

裂解完毕后每只离心管加入600μl Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置10～15min；

12000rpm，4离心10min；

取上清液，加入600μl氯仿异戊醇混合液(24∶1)，轻轻振荡摇匀，颠倒50次；室温静置10～15min；

12000rpm，离心10min；

取上清液，加入1200μl冷冻无水乙醇，颠倒45-55次；室温静置10～15min；

12000rpm，离心10min；

弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500μl 70％的酒精，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min；

弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕；

加入50μlTE，溶解DNA，4℃保存；

制备0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2.合成表1中的10条三疣梭子蟹引物。由生物公司合成表1中的10条引物。

3.PCR扩增

PCR体系：25μl，Mg²⁺浓度为2.5mmol/L、Buffer的体积为2.75μl、DNA模板50ng、Taq酶1U。

反应条件：95℃预变性5min；然后进入以下40个循环：94℃变性45s，每个引物按表一中的最佳退火温度退火45s，72℃延伸1.5min，72℃再次延伸10min；最后4℃保存。

4.电泳检测与数据统计

(1)琼脂糖凝胶板的制备：称取2g琼脂糖加入100ml 0.5×TBE，摇匀，置微波炉加热至完全熔化取出，冷却到50～60℃后加5μl GoldView荧光染料，摇匀，在距底板0.5-1mm的位置放样品梳，倒入封好的凝胶槽，厚度3-5mm，制成2％的胶。

(2)加样：8μl样品中加1.5μl溴酚加样缓冲液，混匀后加入凝胶点样孔中，同时设立合适的DNA分子量标准物(DL-2000)；

(3)电泳：电压以每cm 3～5V的原则设置总电压，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿1-2cm处时，关闭电源，电泳过程中可以用手提紫外灯检查；

(4)取出凝胶板，置紫外透射仪观察，即可见绿色的DNA条带；

(5)凝胶呈像系统(Chemi Doc XRS)拍照，记录结果；

(6)经电泳获得的图谱每群体在所有位点的谱带式样组成一个01矩阵。用Arequin2.0软件进行分子方差分析(AMOVA)，计算遗传多态度(π)和遗传分化指数(Fst)各种种质资源评价指标，最终得出评价结果。