三疣梭子蟹和日本蟳的线粒体DNA序列比较分析及三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的SNP位点筛选

摘要

本文利用线粒体DNA序列分析技术分别对三疣梭子蟹和日本蟳不同地理群体的遗传结构进行了分析,同时,对三疣梭子蟹MIH基因进行了SNP位点的筛选。主要研究结果如下:
　　 采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体、和我国山东即墨市会场村三个野生群体的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平,结果显示我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16SrRNA基于片段构建的NJ系统树所反应的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于日本蟳的分类关系上,基于16SrRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支；而青蟹属的三种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的2种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。
　　 对采自莱州湾和胶州湾的日本蟳2群体的线粒体16SrRNA和COI基因片段进行了PCR扩增和测序,分别得到长度为519bp和658bp的碱基序列。研究结果显示这2个基因片段在种内的变异都较低,对2个基因同源序列分析表明,在线粒体16SrRNA基因片段中共检测到7个变异位点(包括6个单一变异位点,1个简约信息位点)和7种单倍型；在COI基因中共检测到8个变异位点(包括6个单一变异位点,2个简约信息位点)和7种单倍型。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了两群体间的序列差异和遗传多样性水平,结果显示2个日本蟳野生群体的遗传多样性比较丰富。用MEGA4.0软件构建了NJ和UPMGA系统树,基于16SrRNA基因片段的系统树显示梭子蟹科的4个属聚为两大支:日本蟳不同的单倍型先聚在一起,然后与青蟹属的3种蟹聚为一支；梭子蟹属的三疣梭子蟹、远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起；再与美青蟹属的美洲蓝蟹、巴西蓝蟹等聚为一支。基于COI基因显示日本蟳不同的单倍型先聚在一起,再与其他3种蟳聚为一支；梭子蟹属的远海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后与美青蟹属的2种蟹相聚为一支。该结果与传统分类一致。
　　 采用PCR-SSCP技术对三疣梭子蟹的蜕皮抑制激素基因的外显子进行了SNP位点的筛选,根据3个外显子设计了7对特异性引物,引物M1的扩增产物的SSCP电泳条带有多态性,对有多态性的条带进行克隆测序,对照测序峰图,发现1个SNP位点,即G212A,碱基的变化导致了精氨酸→谷氨酰胺的改变,对于蜕皮抑制激素的生物学活性的影响,值得进一步的研究。