槭树科槭树属植物的提取物及其提取方法与应用

摘要

本发明公开了一种槭树科槭树属植物的提取物及其提取方法与应用。本发明提取物是将槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物以水－乙醇或水－丙酮为溶剂，采用微波提取方法得到的。本发明采用微波协助萃取法从槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物中提取得到一种具有较高的脂肪酸合酶抑制活性的提取物，该提取物可在制备减肥药物、防治癌症的药物中得到广泛应用，具有很高的药用价值。同时，本发明通过选择适当的提取溶剂，微波功率、微波频率、微波处理时间，占空比等因素将槭树属植物叶中有效物的提取时间缩短到10－16秒，提取方法简单、效率高，充分体现了微波工艺的巨大优势，极具应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及植物提取物及其提取方法与应用；特别是涉及槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物及其提取方法，以及该提取物在医药领域的用途。

背景技术

脂肪酸合酶，原称脂肪酸合成酶，(EC 2.3.1.85，fatty acid synthase，缩写为FAS)，动物体内的脂肪酸合酶称为I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合酶称为II型FAS。国内外基础研究表明，脂肪酸合酶是可以用于治疗目的的潜在靶位。

目前为止，已报道的脂肪酸合酶抑制剂较少，只有合成的C75(Kuhaida F.P.，PizerE.S.，Li J.N.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97，3450-3454(2000))，较早发现的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)(Vance D.，Goldberg I.，Mitsuhashi O.et al.Biochem BiophysRes Commun.48，649-656(1972))和绿茶中的酯型儿茶素EGCG(Wang X.，Tian W.X.Biochem.Biophys.Res.Commun，288(5)：1200-1206(2001))和ECG(Wang X.，SongK.S.，Guo Q.X.，et al.Biochem Pharmacol，66：2039-2047(2003))。这些抑制剂所具有的共同缺点是抑制活性不够高，应用价值受到局限，因此寻找到抑制活性高的脂肪酸合酶抑制剂具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种对脂肪酸合酶抑制活性高的槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物及其提取方法。

本发明所提供的槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物，是将槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物以水-乙醇或水-丙酮为溶剂，采用微波提取方法得到的。

优选的槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物为鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭或欧亚槭。

该提取物的提取方法，包括如下步骤：

1)以水-乙醇或水-丙酮为溶剂，将溶剂与槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的叶子或翅果混合，溶剂与叶子或翅果的重量比为8-30∶1。

2)输入微波进行提取，收集提取液，去除溶剂得到所述提取物。

其中，在水-乙醇或水-丙酮中，乙醇或丙酮的体积百分数为50-70％。

微波提取的微波频率为2450-2500MHz；微波功率≥700W。微波提取的时间为8-60秒；占空比3-5％；微波提取的次数为2-4次。

上述微波提取后进行过滤，保留滤液并浓缩；浓缩的方法为减压下低温蒸发，目的是除去其中的有机溶剂。

为得到更好的纯化效果，还可对经过滤和浓缩得到的有效物进一步处理，方法为：将提取物用乙酸乙酯进行萃取，除去有机溶剂后经干燥得到固态槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物。

本发明的另一目的是提供本发明提取物的用途。

经发明人实验证实，本发明槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物对脂肪酸合酶具有很高的抑制活性，可以应用在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗等方面，作为控制体重、防治与肥胖相关的疾病等方面药物的活性成分，在制备减肥药物中得到应用。

同时，本发明人还证实，本发明槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物对多种肿瘤细胞均具有较强的抑制生长的作用，可在制备防治癌症的药物中发挥巨大作用。

本发明采用微波协助萃取法从槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物中提取得到一种具有较高的脂肪酸合酶抑制活性的提取物，该提取物可在制备减肥药物、防治癌症的药物中得到广泛应用，具有很高的药用价值。同时，本发明通过选择适当的提取溶剂，微波功率、微波频率、微波处理时间，占空比等因素将槭树属植物叶中有效物的提取时间缩短到10-16秒，提取方法简单、效率高，充分体现了微波工艺的巨大优势，极具应用价值。

具体实施方式

下述实施例中，所用的脂肪酸合酶均为用常规方法(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996，不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系，生物化学杂志，12(2)：234-236)自新鲜鸭肝中分离提纯的，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带。

脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)：234-236)。

实施例1、鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶中有效物质的提取

将10月份采集的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：

用乙醇-水混合溶剂(乙醇的体积百份数为70％)分别与上述粉碎的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭，欧亚槭的干叶按重量份数比20∶1混合，经微波处理提取16秒。采用的微波频率2450MHz，微波输出功率700W，占空比4％。将得到的提取液过滤，在同样条件下再提取3次，过滤后，将三次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去其中的溶剂，得到有效物质浸膏，即脂肪酸合酶抑制剂。

实施例2、鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶中有效物质的提取

将10月份采集的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：

用丙酮-水混合溶剂(丙酮的体积百份数为60％)分别与上述粉碎的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭干叶按重量份数比25∶1昆合，转入玻璃容器，微波提取12秒。微波输出功率为800W，微波频率同上，占空比5％。将处理溶液过滤，在同样条件下再加入丙酮-水混合溶剂对残渣再提取，反复3次，过滤后，将三次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到有效物质水相。

可对水相中的有效物进一步浓缩，具体方法为：先用等体积的石油醚分3-4次进行萃取，除去其中的脂类物质和色素，再用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，将此浸膏进一步(真空)干燥可得到固态物质。

实施例3、鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭翅果中有效物质的提取

将10月份采集的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭翅果洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：

用乙醇-水混合溶剂(乙醇与水的体积份数比为60∶40)分别与上述粉碎的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭翅果按重量份数比10∶1混合，转入玻璃容器，微波提取20秒，微波输出功率为700W，微波频率2500MHz，占空比3.6％。溶液过滤，在同样条件下再提取3次，过滤后，将三次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂，得到含有效物质的水相，可对水相中的有效物进一步浓缩。具体方法为：用乙酸乙酯进行萃取3次，将合并的乙酸乙酯提取液(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，将此浸膏进一步(真空)干燥可得到固态物质。

实施例4、槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物对脂肪酸合酶抑制活性的检测：

37℃下，在2毫升石英比色皿中加入该酶底物：0.2mM乙酰辅酶A溶液25微升，0.4mM，丙二酸单酰辅酶A溶液50微升和1.3mM NADPH溶液50微升，再加入0.1M，pH 7.0磷酸盐缓冲液1.85毫升及FAS溶液30微升混匀，启动酶促反应。用分光光度计监测单位时间内340nm波长处吸光值A的变化，以(ΔA/min)来表示FAS的活力。在一定浓度槭叶提取物存在下，FAS全酶反应的活力下降，当其活力下降一半时所需槭叶提取物的浓度即IC₅₀值，用该数值表示鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶提取物对FAS的抑制能力，上述测活体系中FAS的终浓度为7微克/毫升。

测定结果表明：在上述测活条件下，鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶乙酸乙酯提取物的IC₅₀分别为0.4-2.5微克/毫升，折合成干叶重，约为8-60微克/毫升。

实施例5、槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer Linn)植物的提取物抑制肿瘤细胞实验

细胞培养：将食道癌CAES-17、胃癌BGC-823、乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3M和肝癌BEL-7402五种癌细胞株(均购自医科院药物研究所)培养于含10％小牛血清、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI-1640培养液中，在适当湿度，含5％CO₂的培养箱中37℃单层贴壁传代培养。

收集对数生长期的五种肿瘤细胞，分别接种于96孔板中，2×10⁴个/孔，贴壁培养24小时换成分别含有按照实施例1、实施例2和实施例3方法获得的鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭，欧亚槭提取物的培养液，按不同鞑靼槭、挪威械、细柄槭、田园槭，欧亚槭提取物浓度分成7组(设0、5、10、20、40、60、80μg/ml共7个实验组，每个浓度设3个复孔，实验结果取平均值)。

继续培养24小时，换成不含提取物的培养液，同时加入20μl MTT(四甲基偶氮唑蓝，5mg/ml)继续培养4小时。弃上清液，每孔加入200μl二甲基亚砜(DMSO)(对照组加入等量培养液和二甲基亚砜)，水平震荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定吸光值(A)，波长570nm，并按下述公式计算提取物对癌细胞生长的抑制作用，结果如表1、表2、表3、表4、表5所示，

细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组A₅₇₀/对照组A₅₇₀)×100％

表1不同浓度鞑靼槭提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)

  提取物浓度(μg/ml)  5  10  20  40  60  80  空白对照组  食道癌CAES-17  18  32  42  49  52  58  0  胃癌BGC-823  27  37  45  52  59  55  0  乳腺癌MCF-7  26  43  56  58  56  52  0  肝癌BEL-7402  23  33  47  58  69  79  0  前列腺癌PC-3M  42  37  49  53  56  69  0

表2不同浓度挪威槭提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)

  提取物浓度(μg/ml)  5  10  20  40  60  80  空白对照组  食道癌CAES-17  20  30  42  48  53  60  0  胃癌BGC-823  37  39  43  50  59  63  0  乳腺癌MCF-7  34  41  50  58  60  65  0  肝癌BEL-7402  33  37  45  49  59  64  0  前列腺癌PC-3M  28  37  49  51  66  71  0

表3不同浓度细柄槭提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)

  提取物浓度(μg/ml)  5  10  20  40  60  80  空白对照组  食道癌CAES-17  24  27  41  44  56  72  0  胃癌BGC-823  27  33  49  50  62  60  0  乳腺癌MCF-7  31  44  52  56  58  63  0  肝癌BEL-7402  35  47  49  55  69  74  0  前列腺癌PC-3M  38  52  58  61  69  76  0

表4不同浓度田园槭提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)

  提取物浓度(μg/ml)  5  10  20  40  60  80  空白对照组  食道癌CAES-17  24  28  35  39  48  64  0  胃癌BGC-823  23  27  39  44  55  60  0  乳腺癌MCF-7  18  26  44  49  50  63  0  肝癌BEL-7402  19  36  43  46  58  68  0  前列腺癌PC-3M  24  35  36  41  49  53  0

表5不同浓度欧亚槭提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)

  提取物浓度(μg/ml)  5  10  20  40  60  80  空白对照组  食道癌CAES-17  22  26  36  45  50  52  0  胃癌BGC-823  26  32  39  46  52  50  0  乳腺癌MCF-7  30  34  42  46  48  61  0  肝癌BEL-7402  31  37  39  45  49  64  0  前列腺癌PC-3M  24  42  38  51  49  67  0

注：上述抑癌实验所用鞑靼槭、挪威槭、细柄槭、田园槭、欧亚槭叶提取物已经乙酸乙酯进行萃取浓缩。