包含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的新型显像剂

摘要

本发明涉及用于体内显像的诊断显像剂。此类显像剂包含用显像部分标记的合成半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂，所述显像部分适合体内诊断显像。本发明还提供包含所述显像剂的药物组合物和放射性药物组合物，以及用于制备放射性药物组合物的药盒。本发明还提供半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的螯合剂缀合物，它们适合用于制备包含放射性金属离子或顺磁性金属离子的显像剂。在涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的各种疾病状态中，本发明显像剂可用于其体内的诊断显像和/或治疗监测。

说明书

发明领域

本发明涉及用于体内显像的诊断显像剂。此类显像剂包含用显像部分标记的合成半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抑制剂，所述显像部分适合体内诊断显像。

发明背景

细胞程序性死亡(细胞凋亡)是一个复杂的过程，涉及许多包含多级调控的细胞过程。细胞凋亡由两种途径之一引发。第一种是通过细胞表面死亡受体引发的外源性途径，第二种是通过内源性启动因子(例如UV辐射引起的DNA损伤)引发的内源性途径。这两种途径在需要能量的细胞协调死亡(co-ordinated death)中达到终点，与坏死性细胞死亡不同，细胞协调死亡不涉及炎症反应。将要凋亡的细胞在其细胞表面发出“吃掉我”的信号，这些信号诱使其它细胞通过吞噬作用而将它们消灭。

细胞凋亡在体内的许多过程中是必不可少的。例如，胚胎发育完全依赖细胞凋亡，组织快速更新需要被严格调节，以避免严重的病理后果。细胞凋亡调控障碍可能引起癌症(细胞死亡不足)和神经病例如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)(细胞死亡过多)。此外，细胞凋亡也可能预示有受损的组织，例如局部缺血/再灌注损伤后心脏内区域。

膜联蛋白5是内源性人蛋白(RMM 36kDa)，它可结合凋亡细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)，亲和力大约为10^-9M。^99mTc-标记的膜联蛋白5已用于体内细胞凋亡显像[Blankenberg等，J.Nucl.Med.，40，184-191(1999)]。但是，使用这种方法存在几个问题。首先，膜联蛋白5也可进入坏死细胞，结合暴露在细胞膜内层(inner leaflet)的PS，这可能导致假阳性结果。其次是高血池活性，这种活性在注射标记的膜联蛋白5后维持至少2个小时。这意味着最佳显像时间在注射后10～15小时之间[Reutelingsperger等，J.Immunol.Meth.，265(1-2)，123-32(2002)]，使得这种方法不适合用于急性冠状动脉综合征患者的临床判定。此外，肾和肝对膜联蛋白5的清除在腹部具有极强的本底信号。这使得对腹部细胞死亡的显像(例如在肾移植以及肿瘤监测中)变得不可能。

WO 01/89584在实施例16-18和实施例21公开了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3底物四肽DEVD(即Asp-Glu-Val-Asp)的螯合剂缀合物可用于凋亡组织的体内显像，采用MRI或闪烁显像术。

Haberkorn等[Nucl.Med.Biol.，28，793-798(2001)]研究了用潜在细胞凋亡显像剂放射性同位素¹³¹I标记的pan-caspase抑制剂Z-VAD-fmk，即苄氧基羰基-Val-Ala-DL-Asp(O-甲基)-氟甲基甲酮。发现抑制剂的细胞绝对吸收量很低，他们认为这是因为每个激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶仅仅俘获一个抑制剂分子。他们推断标记的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶底物应该不会出现此问题，将是用于显像剂的更好方法。

Lahorte等[Eur.J.Nucl.Med.，31，887-919(2004)]综述了用于细胞凋亡显像的放射性药物。

因此，仍然需要可快速显像(例如在注射后1小时内)并且在血液和本底器官具有良好清除率的细胞凋亡显像剂。

发明概述

现已发现，用显像部分标记的合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂是有用的诊断显像剂，用于在患有涉及异常细胞凋亡、尤其是过度细胞凋亡的疾病的哺乳动物体内显像。

显像部分可以是放射性的(例如放射性金属离子、发射γ射线的放射性卤素或发射正电子的放射性非金属)或非放射性的(例如顺磁性金属离子、超极化NMR活性核或适合用于体内显像的旋光染料)。

过度细胞凋亡与许多人类疾病有关，并且已证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶对于许多疾病的进展有重要作用。因此，本发明显像剂可在许多疾病状态中用于体内诊断显像和/或治疗监测，所述疾病状态包括：

(a)急性疾病，例如对心脏和脑缺血/再灌注损伤的应答(例如心肌梗塞或中风)、脊髓损伤、外伤性脑损伤、移植后的器官排斥反应、肝变性(例如肝炎)、脓毒病和细菌性脑膜炎；

(b)慢性疾病，例如神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s Disease)、唐氏综合征(Down′s Syndrome)、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、帕金森病(Parkinson′s disease))、免疫缺陷疾病(例如HIV)、关节炎、动脉粥样硬化和糖尿病；

(c)监测在癌症中诱导细胞凋亡的药物的功效，例如以下的癌症：膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌。

发明详述

第一个方面，本发明提供一种显像剂，所述显像剂包含用显像部分标记的合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的K_i小于2000nM，并且将所述标记的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂给予哺乳动物体内后，能够以非侵入性方式从外部检测到该显像部分，或者能够利用设计用于体内的探测器检测到该显像部分，例如血管内辐射探测器或光学探测器(例如内窥镜)、或设计用于外科手术中的辐射探测器。

迄今为止，已经鉴定出至少14种不同的人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，它们被命名为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶2等。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶被分为三种主要的功能类型：

第I组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1、4、5和13)，它们主要涉及炎症反应途径；

第II组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、6和7)，它们是效应子(effector)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或“处决者(executioner)”半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；

第III组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8、9和2)，它们是起始子(initiator)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。

本发明涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂，它也被称为CPP32，是29kDa的半胱氨酸蛋白酶。

本发明的合适显像剂具有良好的细胞膜通透性，因此能够靶向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是一种胞内酶。为了促进细胞膜运输，本发明显像剂可任选包含下文定义的“前导肽”。优选的显像剂在体内不容易被代谢，因此最优选在人体内的半衰期为60-240分钟。显像剂优选通过肾排泄(即可由尿排泄)。在凋亡病灶，显像剂的信号/本底比优选为至少1.5，尤其优选至少5，最优选至少10。当显像部分是放射性的时候，优选在小于或等于放射性同位素的放射衰变半衰期内清除掉1/2峰浓度的显像剂，显像剂在体内是非特异性结合的或游离的。

显像剂的合适分子量最多为5000道尔顿。分子量优选150-3000道尔顿，尤其优选200-1500道尔顿，最优选300-800道尔顿。

本发明合适的合成半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的K_i小于2000nM。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3能够以相对于其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的高浓度在几乎所有组织中表达，并且与第II组其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶相比，具有高催化活性。但是，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3只在凋亡期间以活性形式表达。这就构成了本发明标记的抑制剂作为具有良好信噪比的有效显像剂的基础。抑制常数K_i是酶-抑制剂结合物的离解常数[Lehninger，A.L.，Nelson，D.L.和Cox，M.M.(1993)Principles ofBiochemistry(第2版)，Worth，New York Stryer，L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman，New York]。优选，抑制剂对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的K_i小于500nM、最优选小于100nM。本发明合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的选择性高于其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。这样的选择性抑制剂对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的功效(由K_i定义)高于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1，前者的功效是后者的至少50倍，优选至少100倍，最优选至少500倍。

本发明合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选是不可逆的，即共价结合所述酶。由于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是胞内酶，所以半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选具有良好的细胞膜通透性，即在体内可被有效地运输穿过哺乳动物细胞膜。就此而言，优选非肽类抑制剂。

术语“用......标记的”是指半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂本身包含显像部分，或者显像部分作为额外的部分任选经过连接基连接到抑制剂上，如以下式I的图示。当半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂本身包含显像部分时，这意味着“显像部分”构成抑制剂化学结构的一部分，并且是放射性或非放射性同位素，其丰度水平显著高于所述同位素的天然丰度水平。这样的高丰度同位素的丰度水平是所述同位素的天然丰度水平的至少5倍，优选至少10倍，最优选至少20倍；理想的是以上倍数为至少50倍，或者所述同位素的富集水平为90-100％。包含“显像部分”的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的实例在下文介绍，但是包括具有高丰度¹³C或¹¹C的CH₃以及具有高丰度¹⁸F的氟烷基，这样在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂化学结构中，显像部分是¹³C、¹¹C或¹⁸F同位素标记的。放射性同位素³H和¹⁴C不适合用于显像部分。

可以从哺乳动物体外部检测到“显像部分”，或者可以利用设计用于体内的探测器(例如血管内放射或光学探测器(例如内窥镜)或在外科手术中使用的辐射探测器)检测到“显像部分”。优选在体内给予后，可以从外部以非侵入性方式检测到的显像部分。“显像部分”优选：

(i)放射性金属离子；

(ii)顺磁性金属离子；

(iii)发射γ射线的放射性卤素；

(iv)发射正电子的放射性非金属；

(v)超极化NMR活性核；

(vi)适合用于体内显像的旋光染料。

最优选的显像部分是放射性的，尤其是放射性金属离子、发射γ射线的放射性卤素和发射正电子的放射性非金属，特别优选那些适合采用SPECT或PET显像的显像部分。

当显像部分是放射性金属离子(即放射性金属)时，术语“放射性金属”包括放射性过渡元素、镧系元素、锕系元素以及金属主族元素。不包括半金属砷、硒和碲。合适的放射性金属可以是正电子发射体，例如⁶⁴Cu、⁴⁸V、⁵²Fe、⁵⁵Co、^94mTc或⁶⁸Ga；或γ发射体，例如^99mTc、¹¹¹In、^113mIn、⁶⁷Cu或⁶⁷Ga。优选的放射性金属是^99mTc、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga和¹¹¹In。最优选的放射性金属是γ发射体，尤其是^99mTc。

当显像部分是顺磁性金属离子时，这样的合适金属离子包括：Gd(III)、Mn(II)、Cu(II)、Cr(III)、Fe(III)、Co(II)、Er(II)、Ni(II)、Eu(III)或Dy(III)。顺磁性金属离子优选Gd(III)、Mn(II)和Fe(III)，尤其优选Gd(III)。

当显像部分是发射γ射线的放射性卤素时，合适的放射性卤素选自¹²³I、¹³¹I或⁷⁷Br。发射γ射线的放射性卤素优选¹²³I。

当显像部分是发射正电子的放射性非金属时，这样的合适正电子发射体包括：¹¹C、¹³N、¹⁷F、¹⁸F、⁷⁵Br、⁷⁶Br或¹²⁴I。发射正电子的放射性非金属优选¹¹C、¹³N、¹²⁴I和¹⁸F，尤其优选¹¹C和¹⁸F，最优选¹⁸F。

当显像部分是超极化NMR活性核时，这样的NMR活性核具有非零核自旋，包括¹³C、¹⁵N、¹⁹F、²⁹Si和³¹P。其中优选¹³C。术语“超极化”是指NMR活性核的极化程度增强，高于其平衡极化程度。¹³C(相对于¹²C)的天然丰度约为1％，在超极化前，将合适的¹³C标记的化合物适当地富集至丰度为至少15％，优选丰度为至少50％，最优选丰度为至少90％。将本发明半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的含碳取代基的至少一个碳原子适当地富¹³C，随后将其超极化。

当显像部分是适合体内光学显像的报告部分(reporter)时，报告部分是任何能够用光学显像术直接或间接检测的部分。报告部分可以是光散射体(例如有色或无色的粒子)、光吸收体或光发射体。更优选报告部分是染料，例如发色团或荧光化合物。染料可以是任何在电磁波谱中与紫外光至近红外波长范围内的光相互作用的染料。最优选的报告部分具有荧光特性。

优选的有机发色报告部分和荧光报告部分包括具有广泛离域电子系统的报告部分，例如花青类、部花青类、靛花青类(indocyanines)、酞菁类、萘酞菁类(naphthalocyanines)、三苯甲烷类(triphenylmethines)、卟啉类、吡啶(pyrilium)染料、噻喃(thiapyriliup)染料、方酸(squarylium)染料、croconium染料、薁(azulenium)染料、靛苯胺类、苯并吩嗪(benzophenoxazinium)染料、苯并硫杂吩噻嗪(benzothiaphenothiazinium)染料、蒽醌类、萘醌类(napthoquinones)、阴丹士林类(indathrenes)、邻苯二甲酰吖啶酮类(phthaloylacridones)、三苯酚合苯醌类(trisphenoquinones)、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移的染料及染料络合物、环庚三烯酮类、四嗪类、双(二硫醇烯)络合物、双(苯-二硫醇盐)络合物、碘苯胺染料、双(S，O-二硫醇烯)络合物。还可使用荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同吸收/发射特性的改性GFP。当某些稀土金属(例如铕、钐、铽或镝)的络合物是荧光纳米晶(量子点)时，在某些情况下也可使用这些络合物。

可以使用的发色团的具体实例包括：荧光素、磺基罗丹明101(sulforhodamine 101)(德克萨斯红(Texas Red))、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、靛氰绿、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green 88、Oregon Green 514、四甲基罗丹明、Aaexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750。

特别优选在400nm至3μm之间、尤其在600nm至1300nm之间的可见或近红外区具有最大吸收值的染料。

光学显像法和测量技术包括但不限于：发光显像；内窥镜检查法；荧光内窥镜检查法；光学相干体层摄影术；透射显像；时间分辨透射显像；共焦显像；非线性显微镜检查；光声显像；声光显像；光谱法；反射光谱法；干涉测量法；相干干涉测量法；扩散光学体层摄影术和荧光调节的扩散光学体层摄影术(连续波、时域和频域系统)；以及光散射、吸收、极化、发光、荧光寿命、量子产率和猝灭的测量方法。

本发明显像剂优选下式I的显像剂：

                       (式I)

其中：

{抑制剂}是本发明的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂；

[前导肽]是四聚体(4mer)至二十聚体(20mer)肽细胞膜转运肽，并且通过其氨基端或羧基端缀合；

-(A)_n-是连接基，其中各A独立地为-CR₂-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR₂CO₂-、-CO₂CR₂-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO₂NR-、-NRSO₂-、-CR₂OCR₂-、-CR₂SCR₂-、-CR₂NRCR₂-、C_4-8亚杂环烷基、C_4-8亚环烷基、C_5-12亚芳基、C_3-12亚杂芳基、氨基酸、糖或单分散性聚乙二醇(PEG)结构单元；

其中R独立选自H、C_1-4烷基、C_2-4烯基、C_2-4炔基、C_1-4烷氧基烷基或C_1-4羟基烷基；

n为0-10的整数，

m为0或1；

X^a为H、OH、Hal、NH₂、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4烷氧基烷基、C_1-4羟基烷基，或者X^a为显像部分。

如式I所示，本发明化合物是用显像部分标记的。如上文的定义，这意味着{抑制剂}、连接基-(A)_n和前导肽中的一个或多个包含或缀合至少一个“显像部分”。优选半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂或连接基连接或包含显像部分。

本发明“前导肽”是有利于细胞膜运输的四聚体(4mer)至二十聚体(20mer)肽。这非常重要，因为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是胞内酶，因此显像剂必须能够穿过细胞膜。但是，“前导肽”不提供体内的生物学靶向作用。合适的前导肽是本领域众所周知的，包括Tat肽、速普肽(tachylplesin)衍生物和抗微生物肽(protegrin)衍生物。下面给出具体的“前导肽”序列以及有关参考文献：

表1：前导肽

  前导肽  说明  Ref  1  CNSRLHLR和  CENWWGDV  利用噬菌体肽文库  的血管靶向  Pasqualini R Q J.Nucl.Med.，  43(2)：159-62(1999).  2  KWSFRVSYRGISYRRSR  速普肽衍生物  WO 99/07728；WO 00/32236；  Nakamura等J Biol Chem.15；  263(32)：16709-13(1988).：Tamura H.  等Chem.Pharm.Bull.Tokyo 41，  978-980(1993).  3  AWSFRVSYRGISYRRSR  速普肽衍生物  WO 99/07728  4  RKKRRQRRR  TAT  Mie M等Biochem Biophys Res  Commun.24；310(3)：730-4(2003)；  Potocky TB等Biol Chem.2003年  9月29日[Epub aheadofprint]  5  RRLSYSRRRF  抗微生物肽衍生物  WO 99/07728.  6  RGGRLSYSRRRFSVSVGR  Protegrin  WO 00/32236；Kokryakov等FEBS  Lett.；327(2)：231-6(1993).  7  RGGRLSYSRRRFSTSTGR  Tropic protegrin  (SynB1)  WO 99/07728；WO 00/32236.  8  PRPRPLPFPRPGPPGPRPIPR  Ip(Bac7)  9  RQIKIWFQNRRMKWKK  -Penetratin  10  RGGGLSYSRRRFSTSTGR  tropic protegrin  11  ILPWKWPWWPWRR  Ip(Indolicin)  12  FKCRRWQWRMKKLGA  Ip(LferrinB)  13  RLSRIVVIRVSR  Ip  (十二肽)

“前导肽”优选Tat肽、速普肽衍生物和抗微生物肽衍生物。最优选速普肽衍生物和抗微生物肽衍生物。

术语“氨基酸”是指L-氨基酸或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或者天然的或纯粹是合成的氨基酸模拟物，氨基酸可以是旋光纯的(即单一对映异构体，因此是手性的)或各对映异构体的混合物。本发明优选的氨基酸是旋光纯的。

术语“糖”是指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。可任选将糖官能化，从而使其容易与氨基酸偶联。由此，例如氨基酸的葡糖胺衍生物可以通过肽键缀合其它氨基酸。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(可购自Novabiochem)就是其中一个实例：

在式I中，X^a优选是显像部分。这样的优点是，式I的连接基-(A)_n-使得显像部分远离金属蛋白酶抑制剂的活性部位。这在显像部分的体积相对较大(例如金属络合物或放射性碘原子)时显得尤其重要，这样不会削弱抑制剂与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的结合作用。这种效果可通过结合柔韧性(例如简单烷基链)实现，这样大体积基团能够让自身位置远离活性部位和/或刚性间隔基(例如环烷基或芳基)，刚性间隔基朝向金属络合物，远离活性部位。

还可利用连接基的性质改变显像剂的生物分布。由此，例如在连接基中引入醚基团将有助于最小化血浆蛋白结合作用。当-(A)_n-包含聚乙二醇(PEG)结构单元或1-10个氨基酸残基的肽链时，连接基可以改变显像剂在体内的药代动力学和血液清除率。这样的“生物改性剂”连接基可以使显像剂从本底组织(例如肌肉或肝脏)和/或从血液加速清除，从而减少本底干扰，获得更好的诊断图像。生物改性剂连接基还可用于促进特定途径的排泄，例如促进通过肾脏而不是肝脏进行排泄。

当-(A)_n-包含1-10个氨基酸残基的肽链时，氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。

当-(A)_n-包含PEG部分时，优选包含由式IIA或式IIB的单分散性PEG样结构进行低聚反应获得的单元：

式IIA的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3，9，12，15-四氧杂十七烷酸其中p为1-10的整数，C端单元(*)连接显像部分。或者，可以使用基于式IIB丙酸衍生物的PEG样结构：

其中p如式IIA中的定义，q是3-15的整数。

在式IIB中，p优选1或2，q优选5-12。

当连接基不包含PEG或肽链时，-(A)_n-优选具有连接原子的主链，所述连接原子组成2-10个原子、尤其优选2-5个原子、最优选2-3个原子的-(A)_n-部分。最小的2个原子的连接基主链使得显像部分与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂充分隔离，这样将任何相互作用最小化。

非肽连接基(例如亚烷基或亚芳基)的优点是，它们与所结合的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂没有明显的氢键作用，这样连接基不会缠绕抑制剂。优选的亚烷基间隔基团是-(CH₂)_q-，其中q为2-5。亚芳基间隔基团优选以下的亚芳基：

其中a和b独立地为0、1或2。

连接基-(A)_n-优选包含二甘醇酸部分、顺丁烯二酰亚胺部分、戊二酸、丁二酸、基于聚乙二醇的单元或式IIA的PEG样单元。

当显像部分包含金属离子时，金属离子呈现为金属络合物。因此，这类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂与金属离子的缀合物适合由下式Ia表示：

                      (式Ia)

其中A、n、m和X^a如上式I中的定义。

术语“金属络合物”是指金属离子与一种或多种配体的配位络合物。尤其优选的是，金属络合物是“抗螯合转移作用(resistant totranschelation)”的，即不容易和其它潜在的竞争性配体在金属配位部位发生配体交换。潜在的竞争性配体包括体外的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂本身加上制剂中的其它赋形剂(例如制剂中使用的辐射防护剂或抗微生物防腐剂)、或体内的内源性化合物(例如谷胱甘肽、转铁蛋白或血浆蛋白)。金属络合物优选连接在连接基-(A)_n-或前导肽的一个氨基酸残基上。金属络合物最优选连接在距离抑制剂最远的一个A残基上，这样前导肽也可连接在连接基的末端A残基上，或者作为支链连接在非末端的A残基上。

式Ia的金属络合物由式Ib配体的缀合物获得：

                      (式Ib)

其中A、n、m和X^a如上式I中的定义。

本发明中使用的合适配体所形成的金属络合物具有抗螯合转移作用，这样的配体包括：2-6个、优选2-4个金属供体原子排列得到5-6元螯合环(通过使碳原子或非配位杂原子的非配位主链与金属供体原子连接而得到)的螯合剂；或包含与金属离子牢固结合的供体原子的单齿配体，例如异腈、膦或二氮烯(diazenide)。作为螯合剂一部分牢固结合金属的供体原子类型的实例包括：胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成强金属络合物，甚至单齿配体或双齿配体膦也形成合适的金属络合物。异腈和二氮烯的线性几何结构使得它们不容易结合为螯合剂，因此通常用作单齿配体。合适异腈的实例包括简单烷基异腈例如叔丁基异腈以及醚取代的异腈例如mibi(即1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。合适膦的实例包括替曲膦以及单齿配体膦(例如三(3-甲氧基丙基)膦。合适二氮烯的实例包括HYNIC系列配体，即肼取代的吡啶或烟酰胺。

例如，与锝形成抗螯合转移作用的金属络合物的合适螯合剂的实例包括但不限于：

(i)下式的二胺二肟：

其中E¹-E⁶各自独立地为R′；

各R′为H或C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10氟烷基、C_2-10羧基烷基或C_1-10氨基烷基，或者两个或多个R′与它们所连接的原子一起构成饱和或不饱和的碳环或杂环，并且其中一个或多个R′缀合半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂；

Q为式-(J)_f-的桥接基团；

其中f为3、4或5，各J独立地为-O-、-NR′-或-C(R′)₂-，前提条件是-(J)_f-包含最多一个为-O-或-NR′-的J基团。

Q优选以下的基团：

Q＝-(CH₂)(CHR′)(CH₂)-，即丙二胺二肟或PnAO衍生物；

Q＝-(CH₂)₂(CHR′)(CH₂)₂-，即戊二胺二肟或PentAO衍生物；

Q＝-(CH₂)₂NR′(CH₂)₂-。

E¹-E⁶优选选自：C_1-3烷基、烷基芳基、烷氧基烷基、羟基烷基、氟烷基、羧基烷基或氨基烷基。最优选E¹-E⁶各自为CH₃。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选在E¹或E⁶的R′基团缀合，或者在Q的R′基团缀合。最优选，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在Q的R′基团缀合。当半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂在Q的R′基团缀合时，R′基团优选在桥头位置。在该种情况下，Q优选-(CH₂)(CHR′)(CH₂)-、-(CH₂)₂(CHR′)(CH₂)₂-或-(CH₂)₂NR′(CH₂)₂-，最优选-(CH₂)₂(CHR′)(CH₂)₂-。

尤其优选的双官能的二胺二肟螯合剂是螯合剂1：

                      (螯合剂1)

这样半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂通过桥头-CH₂CH₂NH₂缀合。

(ii)具有硫醇三酰胺供体的N₃S配体(例如MAG₃(巯基乙酰基三甘氨酸))和相关配体；或具有二酰胺吡啶硫醇供体的N₃S配体(例如Pica)；

(iii)具有二胺二硫醇供体的N₂S₂配体(例如BAT或ECD(即双半胱氨酸乙酯)、或具有酰胺胺二硫醇供体的N₂S₂配体(例如MAMA)；

(iv)具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供体的N₄开链配体或大环配体，例如1，4，8，11-四氮杂环十四烷(cyclam)、单氧代-1，4，8，11-四氮杂环十四烷或二氧代-1，4，8，11-四氮杂环十四烷。

(v)具有二胺二苯酚供体的N₂O₂配体。

上述配体特别适合用于络合锝(例如^94mTc或^99mTc)，Jurisson等[Chem.Rev.，99，2205-2218(1999)]对其进行了更全面的描述。这些配体也可用于其它金属，例如铜(⁶⁴Cu或⁶⁷Cu)、钒(例如⁴⁸V)、铁(例如⁵²Fe)或钴(例如⁵⁵Co)。Sandoz在WO 91/01144中介绍了其它配体，包括特别适合铟、钇和钆的配体，尤其包括大环的氨基甲酸酯和氨基膦酸配体。形成钆的非离子型(即中性)金属络合物的配体是已知的，US4885363介绍了这样的配体。当放射性金属离子是锝时，配体优选四齿配位基的螯合剂。锝的优选螯合剂是二胺二肟、或者具有上述的N₂S₂或N₃S供体的螯合剂。

当显像部分是放射性卤素(例如碘)时，合适的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂包括：非放射性前体卤素原子例如芳基碘或芳基溴(以允许交换放射性碘)；活化的前体芳环(例如苯酚基团)；有机金属前体化合物(例如三烷基锡或三烷基甲硅烷基)；或有机前体(例如三氮烯)或亲核取代的良好离去基团(例如碘盐)。Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]介绍了引入放射性卤素(包括¹²³I和¹⁸F)的方法。放射性卤素(尤其是碘)可以连接到合适的前体芳基上，以下是这些前体芳基的实例：

这两个前体芳基均包含取代基，这些取代基使得在芳基环上很容易进行放射性碘取代反应。或者，通过放射性卤素交换而直接发生碘化反应，可以合成含放射性碘的取代基，例如

当显像部分是碘的放射性同位素时，放射性碘原子优选直接通过共价键连接芳族环(例如苯环)或乙烯基，因为已知连接饱和脂肪族体系的碘原子很容易在体内代谢，因此会损失放射性碘。

当显像部分包含氟的放射性同位素(例如¹⁸F)时，可以如下进行放射性卤化：利用¹⁸F氟化物与合适的具有良好离去基团的前体(例如烷基溴、甲磺酸烷基酯或甲苯磺酸烷基酯)反应而直接标记。¹⁸F也可如下引入：在胺前体用烷基化剂(例如¹⁸F(CH₂)₃OMs，其中Ms是甲磺酸根)进行N-烷基化反应，得到N-(CH₂)₃¹⁸F，或者用¹⁸F(CH₂)₃OMs或¹⁸F(CH₂)₃Br在羟基进行O-烷基化反应。¹⁸F还可如下引入：使N-卤代乙酰基与¹⁸F(CH₂)₃OH反应物进行烷基化反应，得到-NH(CO)CH₂O(CH₂)₃¹⁸F衍生物。对于芳基体系来讲，用芳基重氮盐、芳基硝基化合物或芳基季铵盐进行¹⁸F氟化物亲核置换反应，是得到芳基-¹⁸F衍生物的合适途径。

按照Kahn等[J.Lab.Comp.Radiopharm.45，1045-1053(2002)]和Borch等[J.Am.Chem.Soe.93，2897(1971)]公开的方法，通过¹⁸F-C₆H₄-CHO还原性氨化，含伯胺的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂也可用¹⁸F标记。这种方法还可用于芳基伯胺，例如含苯基-NH₂或苯基-CH₂NH₂的化合物。对于基于肽的不含卤代烷基酮官能团的抑制剂来讲，这种方法可用于肽的氨基氧基衍生物[Poethko等，J.Nuc.Med.，45，892-902(2004)]。

含胺的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂也用¹⁸F如下标记，使其与例如以下的¹⁸F标记的活性酯反应：

得到酰胺键接产物。Vaidyanathan等[Nucl.Med.Biol.，19(3)，275-281(1992)]和Johnstrom等[Clin.Sci.，103(增刊48)，45-85(2002)]公开了所示N-羟基丁二酰亚胺酯及其标记肽的用途。Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)]更详细地介绍了有关¹⁸F标记的衍生物的合成路线。

为了最大化体内灵敏度，最优选显像部分包含放射性元素。显像部分优选包含发射正电子或γ射线的放射性同位素。

本发明合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选以下的抑制剂：

(i)式III的四肽衍生物：

        Z¹-Asp-Xaa1-Xaa2-Asp-X¹        (III)

其中

Z¹是连接四肽的氨基端的代谢抑制性基团；

Xaa1和Xaa2独立地为任何氨基酸；

Asp是天冬氨酸的惯用三字母缩写词；

X¹是连接四肽的羧基端的-R¹或-CH₂OR²；

其中R¹为H、-CH₂F、-CH₂Cl、C_1-5烷基、C_1-5烷氧基或-(CH₂)_qAr¹，其中q为1-6的整数，Ar¹为C_6-12芳基、C_5-12烷基-芳基、C_5-12氟代芳基或C_3-12杂芳基；

R²为C_1-5烷基、C_1-10酰基或Ar¹；

(ii)喹唑啉或苯氨基喹唑啉；

(iii)2-羟吲哚磺酰胺；

(iv)氧代氮杂并吲哚啉；

(v)下式IV的化合物：

其中

X²为H、C_1-5烷基或-(CH₂)_r-(S)_s-(CH₂)_tAr³，其中r和t为0-6的整数，s为0或1，Ar³为C_6-12芳基、C_5-12烷基取代的芳基、C_5-12卤代芳基或C_3-12杂芳基；

Ar²为C_6-12芳基或C_3-12杂芳基；

X³为R^b；

X⁴为-SO₂-或-CR₂-

R^a为H、C_1-5烷基或P^GP，其中P^GP为保护基团；

R^b为R^a或C_1-5酰基；

各R^c独立地为H或C_1-5烷基；

(vi)下式V的化合物：

(vii)吡嗪酮；

(viii)式VI的二肽：

            Z¹-Val-Asp-CH₂-S-R¹(VI)

其中-CH₂SR¹连接到二肽的羧基端，Z¹和R¹如式(III)中的定义；

(ix)下式XI的水杨酸磺酰胺：

                      式XI

其中Ar⁶为5-6元C_4-6芳基或杂芳基环，X⁶为H或-CH₂SR²，其中R²的定义同上。

术语“氨基酸”的定义同上。

式III的肽醛(X¹＝R¹＝H)、酮[X¹＝R¹＝C_1-5烷基或-(CH₂)_qAr¹]或苯氧基甲基酮(X¹＝-CH₂OR₂，R²＝Ar¹＝苯基)抑制剂是可逆的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂，而氯甲基和氟甲基衍生物(X¹＝R¹＝-CH₂F或-CH₂C1)以及酰氧基甲基酮(X¹＝-CH₂OR²，R²＝C_1-10酰基)是不可逆的抑制剂。相信卤代甲基酮肽结合半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的半胱氨酸硫醇，形成硫代甲基酮，由此不可逆地钝化所述酶。正如上文指出的那样，优选这样的不可逆抑制剂。因此，式III的X¹优选-CH₂F或-CH₂OR²，其中R²＝C_1-10酰基。当R²为C_1-10酰基时，优选这样的酰基为2，6-二取代的苯甲酰基，例如(2，6-二甲基苯基)(C＝O)-或[2，6-双(三氟甲基)苯基](C＝O)。

术语“代谢抑制性基团”(Z¹)是指生物相容性基团，它抑制肽或氨基酸在氨基端的体内代谢。这样的基团是本领域技术人员众所周知的，对于肽的氨基端，合适的基团选自：乙酰基、Boc(Boc为叔丁氧羰基)、Fmoc(Fmoc是芴基甲氧基羰基)、苄氧基羰基、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。肽的氨基端的代谢抑制性基团优选乙酰基。

在式III中，Xaa1和Xaa2最优选任何L-氨基酸，Xaa1-Xaa2优选Glu-Val或Gln-Met，这样优选的式III化合物为：Z¹-Asp-Glu-Val-Asp-X¹或Z¹-Asp-Gln-Met-Asp-X¹(即Z¹-DEVD-X¹或Z¹-DQMD-X¹)。

在式III中，天冬氨酰基和谷氨酰基侧链的羧基优选为游离的羧酸盐，这样半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂是有效的。但是，羧基也可以为酯(例如甲基酯)，从而改善细胞通透性。随后，上述酯通过非坏死性细胞中的酯酶脱去保护。对于式III而言，显像部分优选连接在Z¹或X¹位置。当显像部分包含金属时，通过连接该金属络合物的任意一端或两端，实现对式III肽的氨基端或羧基端的代谢作用的抑制。

术语“保护基团”(P^GP)是指可抑制不希望发生的化学反应的基团，但是这类基团应该有足够的反应性，使其可以在温和条件下从所保护的官能团断裂，并且在所述温和条件下不会改变分子的其余部分。在脱去保护后，获得所需的产物。保护基团是本领域技术人员众所周知的，对于氨基，保护基团可选自Boc(Boc是叔丁氧羰基)、Fmoc(Fmoc是芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde[即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)；对于羧基，保护基团可选自甲基酯、叔丁基酯或苄基酯。对于羟基，合适的保护基团有苄基、乙酰基、苯甲酰基、三苯甲基(Trt)或三烷基甲硅烷基(例如四丁基二甲基甲硅烷基)。对于巯基，合适的保护基团有三苯甲基和4-甲氧基苄基。更多的保护基团的应用参见Protective Groups in Organic Synthesis，Theorodora W.Greene和PeterG.M.Wuts，(第三版，John Wiley & Sons，1999)。

式III的部分半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂是市售的，例如Ac-DEVD-CHO、Ac-AAVALLPAVLLALLAP-DEVD-CHO、Z-DEVD-FMK和Ac-DEVD-CMK，可以通过VWR INTERNATIONALLTD(Hunter Boulevard，Magna Park，Lutterworth LE17 4XN UNITEDKINGDOM)从Calbiochem购得。其它抑制剂可以按照Thornberry等[J.Biol.Chem.，272(29)，17907-17911(1997)；出处同上，273(49)，32608-32613(1998)]介绍的方法制备。本发明含肽的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂和前导肽也可通过常规固相合成法得到，参见P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Girald；Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，CRC Press，1997。

Scott等[J.Pharmacol.Exper.Ther.，304(1)，433-440(2003)]介绍了喹唑啉或苯氨基喹唑啉半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂。这样的化合物优选具有以下通式VII结构的化合物：

其中：

R³为H或Cl；

R⁴为Cl或F；

R⁸为-CONH-X⁵或-CH＝CH-Ar⁴，其中X⁵为C_1-6烷基、C_2-6烯基或-(CH₂)_sAr⁴；其中s为0或1，Ar⁴为-C₆H₅X⁶，X⁶为Hal、CF₃或-SO₂NR⁶R⁷，

R⁶和R⁷独立地为C_1-3烷基，或者可以结合在一起构成C_5-7环烷基环。

R⁸优选-CONH-X⁵，其中X⁵＝-(CH₂)_sAr⁴，X⁶优选F、CF₃或-SO₂NC₆H₁₀。

本发明2-羟吲哚磺酰胺衍生物优选式VIII化合物：

其中：

R⁹为H或C_1-4烷基；

R¹⁰为C_1-10烷基、芳基C_1-4烷基、杂芳基C_1-4烷基C_3-7环烷基，或者R⁹和R¹⁰与它们所连接的氮原子一起构成3-10元环，该环任选额外包含选自O、N或S的杂原子；

R¹¹和R¹²独立地为H、C_1-6烷基、NO₂或Hal；

R¹³为H、C_1-6烷基、C_6-12芳基烷基或C_3-12杂芳基烷基；

R¹⁴和R¹⁵为Cl，或者与它们所连接的碳原子一起构成C＝O羰基。

在式VIII中，R¹⁴和R¹⁵优选结合在一起为C＝O，即靛红衍生物。R¹³优选H或CH₃。R⁹和R¹⁰优选C_4-6环烷基，最优选C₅环烷基。当R⁹和R¹⁰为C_4-6环烷基时，环烷基环优选被X⁷取代，其中X⁷为-CH₂OR¹⁶或-CH₂NHR¹⁶，R¹⁶为C_1-3烷基或C_4-7芳基。式VIII的2-羟吲哚磺酰胺衍生物可以按照Lee等[J.Biol.Chem.，275，16007-16014(2000)]介绍的方法制备。

显像部分优选连接到式VIII抑制剂的取代基R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²或R¹³上，最优选连接在R⁹、R¹⁰或R¹³取代基上。对于用¹⁸F标记，R¹³为-CH₂ONH₂(对于上述的4-¹⁸F-苯甲醛亚胺路线来讲)，或者为-CH₂OH(对于用¹⁸F-(CH₂)₃Br或¹⁸F-(CH₂)₃OTs型O-烷基化剂标记来讲)。或者，R¹³为H，这样可直接N-烷基化，得到所需的¹⁸F衍生物。

本发明氧代氮杂并吲哚啉优选IDN5370，如下式IX所示：

最优选的氧代氮杂并吲哚啉是Indun A：

Deckwerth等[Drug Devel.Res.，52，579-586(2001)]以及WO98/11109介绍了本发明的氧代氮杂并吲哚啉。

本发明合适的吡嗪酮为下式X的化合物：

其中：

R¹⁷为OH、NH₂、NHRⁱ、N(Rⁱ)₂、R_i、C_1-6烷氧基、Ar⁵、Het¹、X⁹(CO)-、X⁹SO-或X⁹SO₂-，其中各Rⁱ独立地为C_1-6烷基，C_1-6烷基任选被1-3个选自以下的取代基取代：OH、Hal、CO₂H、CF₃、NH₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、Ar⁵和C_1-4酰基，

Ar⁵为C_6-14芳族环，它任选被1-3个以下的取代基取代：OH、Hal、CO₂H、CF₃、NH₂、NHCH₃、N(CH₃)₂、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、Het¹或C_1-4酰基，

X⁹为Rⁱ、Ar⁵或Het¹；

Het¹为含1-4个选自O、S和N的杂原子的5-15元杂环或杂芳环，它们可任选被1-2个氧代基团以及1-3个选自以下的基团取代：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4酰基和CF₃；

R¹⁹为H、C_1-20烷基、Ar⁵或Het¹；

R¹⁹为H、Hal或C_1-6烷基；

R²⁰为H、C_1-6烷基、Ar⁵、Het¹、-(CH₂)_zSRⁱ、-(CH₂)_zORⁱ、-(CH₂)_zOC(O)R^j或-(CH₂)_zNR²¹R²²，其中z为1、2或3；

R^j为C_1-8烷基、Ar⁵或Het¹；

R²¹和R²²独立地为H、Rⁱ、Ar⁵或Het¹，或者R²¹和R²²与它们所连接的氮原子一起构成含1-4个选自O、S和N的杂原子的3-10元环系，该环系可任选被1-2个氧代基团以及1-3个选自以下的基团取代：C_1-4烷基、Het¹、C_1-4羧基、C_1-4酰基和C_1-6甲酰胺基；

R^d和R^e独立地为H、C_1-6烷基或Ar⁵，或者可以与它们所连接的碳原子一起构成3-7元非芳族脂环或杂环，它们任选包含1个选自O、S和NR²³的杂原子，其中R²³为H、C_1-4烷基或C_1-4酰基；

R^f和R^g独立地为H、Ar⁵、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基烷基或C_5-7环烷基；

w为0-6的整数。

对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3具有选择性的吡嗪酮优选L-826，791或M-826[Hotchkiss等，Nature Immunol.，1(6)，496-501(2000)]：

US 6,444,811介绍了本发明半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂吡嗪酮的合成方法，流程1也展示了它的合成方法。原料是市售的二甲基乙二肟。

流程1

式V化合物可以按照WO 03/024955介绍的方法制备。式VI化合物可以按照流程2所示的方法制备：

流程2

式VI的二肽抑制剂为天冬氨酰基酮，Han等[Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，805-808)]介绍了这类抑制剂。这些抑制剂是有效的选择性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂。对于式VI，显像部分优选连接在Z¹或X¹位置。式VI的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂优选下式VIa的化合物：

其中

R²⁴为C_6-12芳基或C_6-12杂芳基；

R²⁵为C_1-4烷基或苄基，其中苄基的苯环任选被1-2个卤原子取代；

R²⁴优选苄基，其中苄基的苯环任选被1-2个选自以下的基团取代：卤素；1-3烷氧基；被C_1-3羧基或C_2-4羧基酯取代的C_1-3烷氧基；C_1-3酰基；C_2-4烯基或C_1-3烷基磺酰基。

R²⁵优选苄基或2-氯-5-氟-苄基。

尤其优选的式VI抑制剂包含R¹的取代2-氯-6氟苄基和Z¹的2，5-二取代的苄基羰基。这些抑制剂是下式VIb的化合物：

            抑制剂           Z²

            6A              OCH₂CO₂Me

            6A′            OCH₂CO₂H

            6B              OCH₂CO₂lPr

            6C              SO₂Me

                            (VIb)

抑制剂6A、6A′、6B和6C对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3具有低纳摩尔范围内的IC₅₀[Han等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，805-808)]。酯衍生物6A和6B在细胞内水解为更有效的酸6A′。

Han等[Bioorg.Med.Chem.Lett.，14(3)，805-808(2004)]介绍了式VI化合物的合成方法以及基于式VI化合物的最优选的强效半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂。显像部分优选连接在式VIb的苯环，最优选连接在Z²位。考虑按照流程3所示方法，能够引入¹⁸F标记物：

流程3

式XI抑制剂可以按照Choong等[J.Med.Chem.45，5005-5022(2002)]、Erlanson等[Nature Biotech.，21，308-314(2003)]或WO03/024955介绍的方法制备。优选的式XI抑制剂具有选自苯基、噻吩或吡啶(尤其是噻吩)的Ar⁶。在式XI中，X⁶优选-CH₂SAr⁷，其中Ar⁷为卤素取代的苯环。优选的式XI抑制剂为下式XIa的化合物：

本发明优选的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂是式III的四肽、式VI的二肽或式VIII的2-羟吲哚磺酰胺。最优选的抑制剂是式III的四肽以及式VI的二肽。

当本发明显像剂包含放射性或顺磁性金属离子时，金属离子适合以金属络合物形式存在。这样的金属络合物适合通过式Ia缀合物与适当的金属离子的反应而制备。式Ia的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的配体-缀合物或螯合剂-缀合物可以通过双官能螯合方法制备。因而，制备连接了官能团的配体或螯合剂(分别是“双官能连接物”或“双官能螯合物”)的方法是众所周知的。所连接的官能团包括：胺、硫氰酸酯、马来酰亚胺和活性酯，例如N-羟基丁二酰亚胺或五氟苯酚。本发明螯合剂1是胺官能化双官能螯合物的一个实例。这样的双官能螯合物可以与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂上合适的官能团反应，形成所需的缀合物。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂上的所述合适官能团包括：羧基(用于与胺官能化双功能螯合剂形成酰胺键)；胺(用于与羧基-或活性酯-官能化的双官能螯合剂形成酰胺键)；卤素、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯(用于对胺官能化的双官能螯合剂进行N-烷基化)和硫醇(用于与顺丁烯二酰亚胺官能化的双官能螯合剂反应)。

本发明的放射性金属络合物可以如下制备：使适当氧化态的放射性金属的溶液与式Ia的配体缀合物在适当pH下反应。所述溶液可优选包含与金属弱络合的配体(例如葡糖酸盐或柠檬酸盐)，即放射性金属络合物通过配体交换制备。这样的条件可用于抑制不需要的副反应，例如金属离子的水解。当放射性金属离子是^99mTc时，常用的原料是由⁹⁹Mo发生器得到的高锝酸钠。锝存在于Tc(VII)氧化态的^99mTc高锝酸盐中，Tc(VII)氧化态是相对惰性的氧化态。因此为了制备低氧化态(Tc(I)-Tc(V))的锝络合物，通常需要加入合适的药物可接受的还原剂，例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚磺酸、二价锡离子、Fe(II)或Cu(I)，从而促进络合反应。药物可接受的还原剂优选二价锡盐，最优选氯化亚锡、氟化亚锡或酒石酸亚锡。

当显像部分为超极化NMR活性核(例如超极化¹³C原子)时，所需的超极化化合物可以如下制备：用超极化气体(例如¹²⁹Xe或³He)进行极化交换反应，得到合适的¹³C富集的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂。

第二个方面，本发明提供药物组合物，该组合物包含上述的显像剂以及生物相容性载体，并且为适合哺乳动物给药的形式。“生物相容性载体”是可以液体，尤其是可以悬浮或溶解显像剂的液体，这样组合物是生理上可耐受的，即可以给予哺乳动物而没有毒性或过度的不适感。生物相容性载体适合为注射用液体载体，例如无菌无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(它可以被方便地平衡，使得最终注射产品是等渗的或非低渗的)；一种或多种张度调节物质(例如血浆阳离子与生物相容性抗衡离子的盐)、糖类(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二元醇(例如甘油)或其它非离子型多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。

第三个方面，本发明提供放射性药物组合物，该组合物包含上述的显像剂(其中显像部分是放射性的)以及生物相容性载体(如以上第二个实施方案中的定义)，并且为适合哺乳动物给药的形式。这样的放射性药物适宜装在封闭容器中，容器封口适合用皮下注射针单次或多次刺穿，并且同时保持无菌完整性。这样的容器可以包含单次或多次给药剂量。优选的多次剂量容器包括一个装多次给药剂量的大玻璃瓶(例如体积为10-30cm³)，由此，在适合临床情况的制剂的有效期内，可以不同的时间间隔将单次给药剂量抽取到医用注射器。预灌装注射器设计用于一次人体剂量，因此优选是一次性注射器或适合临床使用的其它注射器。预灌装注射器可以任选附加注射器屏蔽罩，以避免操作员被辐射。这样的合适的放射性药物注射器屏蔽罩是本领域公知的，优选包含铅或钨。

当显像部分包含^99mTc时，适合诊断显像的放射性药物中^99mTc的放射量是180-1500MBq，取决于体内的显像部位、吸收量和信号/本底比(target to background ratio)。

本发明放射性药物可以用药盒制备，如以下第5和第6种实施方案所述。或者，放射性药物可以在无菌制造条件下制备，得到所需的无菌产品。放射性药物也可以在非无菌条件下制备，最后采用例如γ照射法、高压灭菌法、干热法或化学处理法(例如用环氧乙烷处理)灭菌。本发明放射性药物优选用药盒制备。

第四个方面，本发明提供合成的本发明半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂与配体的缀合物。所述缀合物可用于制备放射性金属离子或顺磁性金属离子标记的合成的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂。所述配体缀合物优选为以上定义的式Ia的缀合物。本发明第四方面的缀合物的配体优选螯合剂。所述螯合剂优选具有二胺二肟、N₂S₂二胺二硫醇或N₃S二酰胺吡啶硫醇供体。所述螯合剂最优选二胺二肟。

第五个方面，本发明提供用制备上述放射性药物组合物的非放射性药盒，其中放射性药物组合物的显像部分包含放射性金属。药盒包含配体与式(I)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的缀合物。当放射性金属是^99mTc时，药盒适合还包含生物相容性还原剂。以上第四个实施方案介绍了所述配体缀合物及其优选的方面。

这样的药盒设计用于适合人体给药(例如直接注射到血流)的无菌放射性药物产品。对于^99mTc来讲，所述药盒优选被冷冻干燥，药盒是设计用于与无菌的由^99mTc放射性同位素发生器得到的^99mTc高锝酸盐(TcO₄^-)再生，获得无需进一步处理就适合人体用药的溶液。合适的药盒包括容器，容器中装有游离碱或酸式盐形式的配体缀合物或螯合剂缀合物以及“生物相容性还原剂”，例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚磺酸、二价锡离子、Fe(II)或Cu(I)。生物相容性还原剂优选二价锡盐，例如氯化亚锡或酒石酸亚锡。或者，药盒任选包含一种金属络合物，在加入放射性金属后，这种金属络合物经过金属转移反应(即金属交换)，得到所需的产物。

合适的药盒容器包括可维持无菌完整性和/或放射安全性的密封容器，任选在顶部空间充入惰性气体(例如氮气或氩气)，并且允许通过注射器加入或抽取溶液。优选这样的容器是隔片封闭的小瓶，其中气密性隔膜用外部密封物(通常是铝)包卷。这样的容器具有额外的优点，即隔膜能够经受真空(如果需要)，例如改变顶部空间的气体或使溶液脱气。

非放射性药盒可任选还包含其它组分，例如交换型螯合剂(transchelator)、辐射防护剂、抗微生物防腐剂、pH调节剂或填充剂。“交换型螯合剂”是这样的化合物，它与放射性金属快速反应，形成弱络合物，然后被配体置换。对于锝而言，它使形成还原性水解锝(RHT)的风险降至最低，RHT的形成是由于高锝酸盐的快速还原反应与锝络合反应竞争而造成的。合适的交换型螯合剂是弱有机酸(即pKa为3-7的有机酸)与生物相容性阳离子的盐。合适的弱有机酸有乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、酚类或膦酸类。因此，合适的盐包括乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐、酚盐或膦酸盐。优选的盐是酒石酸盐、葡糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐或膦酸盐，尤其优选膦酸盐，最优选二膦酸盐。术语“生物相容性阳离子”是指可与离子化负电荷基团形成盐的正电荷抗衡离子，所述正电荷抗衡离子也是无毒的，因此适合给予哺乳动物体，尤其是人体。合适生物相容性阳离子的实例包括：碱金属的钠离子或钾离子；碱土金属的钙离子和镁离子；铵离子。优选的生物相容性阳离子是钠离子和钾离子，最优选钠离子。交换型螯合剂优选MDP(即亚甲基二膦酸)与生物相容性阳离子的盐。

术语“辐射防护剂”是指通过俘获高反应性游离基(例如由放射分解水得到的含氧游离基)而抑制降解反应(例如氧化还原过程)的化合物。本发明的合适辐射防护剂选自抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即2，5-二羟基苯甲酸)以及它们与上述生物相容性阳离子形成的盐。

术语“抗微生物防腐剂”是指可抑制潜在有害微生物(例如细菌、酵母或霉菌)生长的试剂。抗微生物防腐剂还可具有某些杀菌特性，这取决于剂量。本发明抗微生物防腐剂的主要作用是在重建之后的放射性药物组合物(即放射性诊断产品本身)中抑制任何所述微生物的生长。不过，在本发明非放射性药盒的一种或多种组分重建之前，也可任选利用抗微生物防腐剂抑制潜在有害微生物的生长。合适的抗微生物防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯类，即对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯或它们的混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。抗微生物防腐剂优选对羟基苯甲酸酯类。

术语“pH调节剂”是指可用于确保重建药盒的pH在人或哺乳动物给药的可接受范围(pH约为4.0-10.5)的化合物或多种化合物的混合物。合适的pH调节剂包括药物可接受的缓冲剂，例如三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、磷酸盐或TRIS[即三(羟甲基)氨基甲烷]；药物可接受的碱，例如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。当所用缀合物为酸式盐形式时，pH调节剂可以任选放在单独的小瓶或容器中，这样药盒使用者可以将调节pH作为多个步骤操作的一部分进行操作。

术语“填充剂”是指药物可接受的增量剂，它在生产和冷冻干燥期间可有利于原料的处理。合适的填充剂包括无机盐(例如氯化钠)和水溶性糖或糖醇(例如蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或海藻糖)。

第六个方面，本发明提供用于制备放射性药物制剂的药盒，制剂中显像部分包含非金属放射性同位素，即发射γ射线的放射性卤素或发射正电子的放射性非金属。这样的药盒包含“前体”，前体优选为无菌无热原的形式，这样仅用最少的处理步骤，与放射性同位素的无菌源反应，得到所需的放射性药物。对于放射性同位素具有相对较短半衰期的放射性药物、处理简易性以及由此减少对放射药师的放射剂量来讲，以上考虑因素尤其重要。因此，药盒重建的反应介质优选以上定义的“生物相容性载体”，最优选水溶液。

合适的“前体”包含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的无菌无热原形式的非放射性衍生物，它用于与适宜化学形式的所需非金属放射性同位素进行化学反应，使得反应能够以最少的步骤(最好是一步)并且没有太多纯化处理(最好无需进一步提纯)就得到所需的放射性产物。可以方便地获得具有良好化学纯度的上述前体。对于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的某些官能团，“前体”可任选包含以上定义的保护基团(P^GP)。Bolton，J.Lab.Comp.Radiopharm.，45，485-528(2002)介绍了合适的前体。

本实施方案的优选前体包括可进行亲电或亲核卤化反应的衍生物；利用选自下述的烷基化剂很容易进行烷基化反应的衍生物：烷基卤、氟烷基卤、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯；或可烷基化硫醇部分从而形成硫醚键的衍生物。第一类衍生物的实例包括：

(a)有机金属衍生物，例如三烷基锡烷(例如甲基甲锡烷基或三丁基甲锡烷基)或三烷基硅烷(例如三甲基甲硅烷基)；

(b)用于卤素交换反应的非放射性烷基碘或烷基溴以及用于亲核卤化反应的甲苯磺酸烷基酯、甲磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯；

(c)用于亲电卤化反应的活化芳族环(例如酚类)和用于亲核卤化反应的活化芳族环(例如芳基碘、芳基重氮、硝基芳基)。

很容易进行烷基化反应的优选衍生物包括醇类、酚类或胺类，尤其是酚类和具有空间位阻的伯胺或仲胺。可将含硫醇的放射性同位素反应物烷基化的衍生物优选N-卤代乙酰基衍生物，尤其是N-氯乙酰基和N-溴乙酰基衍生物。

可以在无菌制造条件下使用所述前体，得到所需的无菌无热原的物质。也可以在非无菌条件下使用所述前体，最后采用例如γ照射法、高压灭菌法、干热法或化学处理法(例如用环氧乙烷处理)灭菌。优选使用所述前体的无菌无热原形式。最优选，在上述封闭容器中使用无菌无热原前体。

药盒的“前体”优选共价连接在固体载体基质上。这样的话，所需的放射性药物产物在溶液中形成，而原料和杂志仍然结合在固相。WO 03/002489介绍了与¹⁸F氟化物进行固相亲电氟化反应的前体。WO 03/002157介绍了与¹⁸F氟化物进行固相亲核氟化反应的前体。因此，药盒可包含能够塞入经适当改装的自动合成仪中的筒模块(cartridge)。除了结合固体载体的前体之外，筒模块可以包含用于除去不需要的氟离子的柱状物，以及连接的适当容器，这样就允许蒸发反应混合物并可按需制造产物。还可包括试剂、溶剂、合成所需的其它消耗品以及载有软件的光盘，所载软件允许合成仪的运行满足顾客对放射浓度、体积、给药时间等的要求。方便的是，药盒的所有组件都是一次性的，使得各次操作之间的污染降至最低，所有组件将是无菌的并且是有质量保证的。

第七个方面，本发明公开了第一个实施方案的显像剂在对哺乳动物的疾病状态进行体内诊断显像中的用途，所述疾病状态涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。这样的非侵入性显像将涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的异常凋亡，并且可在许多疾病中用于监测细胞死亡。相信在细胞高度增殖和细胞高度凋亡的病症(例如心肌梗塞、侵入性肿瘤和移植排斥反应)中，细胞凋亡显像将是非常有价值的。这样的显像在监测上述疾病的化疗药物治疗中也是很有用的。

在细胞凋亡被认为具有重要影响的，但是凋亡事件数量相对较少的其它疾病(例如阿尔茨海默病)中，有用的细胞池将会很小，因此更难于显现。所以认为，本发明的细胞凋亡显像剂似乎最好应用于细胞凋亡相对急性的病症，例如心肌梗塞、侵入性肿瘤和移植排斥反应。对于涉及慢性细胞凋亡的那些疾病，例如神经病和侵入性较小的肿瘤，可能没有足够的凋亡细胞来指示高于本底的部分。

本质上，所有的癌症治疗方法(包括放疗、化疗或免疫疗法)都在它们的肿瘤细胞靶中诱导细胞凋亡。细胞凋亡显像可能具有提供快速、直接地评估或监测肿瘤治疗的有效性的能力，这可能从根本上改变治疗癌症患者的方式。预计在对治疗有反应的肿瘤患者上，由于肿瘤中凋亡反应升高，所以显像剂的吸收量将显著增加。在治疗后肿瘤对显像剂的吸收没有增加，则可以确定对进一步治疗没有反应的肿瘤患者。

对患有可检测癌症的患者的治疗性介入进行评价有着多种用途：

·评价新型抗癌药物的抗肿瘤活性；

·确定有效的治疗方案；

·确定新型抗癌药物的最佳剂量和给药进度；

·确定现有抗癌药物与新型药物的联合药物的最佳剂量和给药进度；

·更有效地对临床试验中癌症患者进行分层，分为治疗方案的有反应者和无反应者；

·及时有效地评价患者个体对建立的治疗性抗癌方案的反应。

本发明通过以下详细的实施例进行说明。实施例1介绍了化合物1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成方法。实施例2提供了1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的其它合成方法，它避免了使用可能有害的叠氮中间体。实施例3介绍了氯代亚硝基烷烃前体的合成。实施例4介绍了本发明优选的胺取代的双官能二胺二肟(螯合剂1)的合成。实施例5提供了本发明肽抑制剂的合成方法。实施例6和8提供了本发明两种放射性卤化前体的合成方法。实施例7提供了本发明非肽半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的合成方法。实施例9介绍了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制测定法，实施例10介绍了基于细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3测定法。实施例11和12提供了用于¹⁸F放射性标记半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的合适的¹⁸F标记的化合物的合成方法。实施例13介绍了本发明放射性碘化抑制剂的方法。

实施例1：1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成

(步骤a)：3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯

甲酯基亚甲基三苯基正膦(167g，0.5mol)的甲苯(600ml)用3-氧代戊二酸二甲酯(87g，0.5mol)处理，将反应物用油浴加热至100℃，在120℃、氮气氛下加热36小时。然后，真空浓缩反应物，将油性残余物与40/60石油醚/乙醚(1∶1，600ml)研磨。沉淀出三苯基氧化膦，将上清液倾析移出/滤出。将真空蒸发的残余物在高真空Bpt下进行Kugelrohr蒸馏(烘箱温度180-200℃，0.2托)，得到3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89.08g，53％)。

NMR ¹H(CDCl₃)：δ3.31(2H，s，CH₂)，3.7(9H，s，3xOCH₃)，3.87(2H，s，CH₂)，5.79(1H，s，＝CH，)ppm.

NMR¹³C(CDCl₃)，δ36.56，CH₃，48.7，2xCH₃，52.09和52.5(2xCH₂)；122.3和146.16C＝CH；165.9，170.0和170.53xCOO ppm.

(步骤b)：3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化

将3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89g，267mmol)的甲醇(200ml)溶液与(10％钯/碳：50％水)(9g)在氢气氛下(3.5巴)振荡30小时。溶液通过硅藻土过滤，真空浓缩，得到3-(甲氧基羰基甲基)戊二酸二甲酯(油状物，84.9g，94％)。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ2.48(6H，d，J＝8Hz，3xCH₂)，2.78(1H，六重峰，J＝8Hz CH，)3.7(9H，s，3xCH₃).

NMR ¹³C(CDCl₃)，δ28.6，CH；37.50，3xCH₃；51.6，3xCH₂；172.28，3xCOO.

(步骤c)：三甲基酯至三乙酸酯的还原和酯化

在氮气氛下，在2L三颈圆底烧瓶中，将氢化铝锂(20g，588mmol)的四氢呋喃(400ml)用三(甲氧基羰基甲基)甲烷(40g，212mmol)的四氢呋喃(200ml)溶液小心处理1小时。发生剧烈的放热反应，引起溶剂强烈回流。将反应物用油浴在90℃加热，在回流下加热3天。小心滴加乙酸(100ml)猝灭反应物，直到停止释放氢气。将搅拌的反应混合物用乙酸酐溶液(500ml)小心处理，乙酸酐溶液以引起温和回流的速率加入。使用烧瓶蒸馏，搅拌，然后在90℃(油浴温度)加热至蒸馏出四氢呋喃。再次加入乙酸酐(300ml)，使反应物返回至回流装置，搅拌，用油浴在140℃加热5小时。让反应物冷却后过滤。氧化铝沉淀用乙酸乙酯洗涤，在50℃水浴温度、真空(5mmHg)下，用旋转蒸发器浓缩合并的滤液，获得油状物。将油状物溶于乙酸乙酯(500ml)，用饱和碳酸钾水溶液洗涤。分离出乙酸乙酯溶液，经硫酸钠干燥，然后真空浓缩，获得油状物。将油状物在高真空下进行Kugelrohr蒸馏，得到三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，96％，油状物)。在0.1mmHg的Bp.220℃。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ1.66(7H，m，3xCH₂，CH)，2.08(1H，s，3xCH₃)；4.1(6H，t，3xCH₂O).

NMR ¹³C(CDCl₃)，δ20.9，CH₃；29.34，CH；32.17，CH₂；62.15，CH₂O；171，CO.

(步骤d)：从三乙酸酯脱去乙酸酯基

三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，165mM)的甲醇(200ml)和880氨水(100ml)溶液用油浴在80℃加热2天。将反应物再用880氨水(50ml)处理，用油浴在80℃加热24小时。再加入880氨水(50ml)，将反应物在80℃加热24小时。然后，真空浓缩反应物以除去所有的溶剂，得到油状物。将油状物溶于880氨水(150ml)，在80℃加热24小时。然后，真空浓缩反应物以除去所有的溶剂，得到油状物。进行Kugelrohr蒸馏，得到乙酰胺(bp 170-180，0.2mm)。将装有乙酰胺的球管洗干净，继续蒸馏。在bp 220℃、0.2mm下蒸馏出三(2-羟基乙基)甲烷(22.53g，92％)。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ1.45(6H，q，3xCH₂)，2.2(1H，五重峰，CH)；3.7(6H，t 3xCH₂OH)；5.5(3H，brs，3xOH).

NMR ¹³C(CDCl₃)，δ22.13，CH；33.95，3xCH₂；57.8，3xCH₂OH.

(步骤e)：三元醇至三(甲烷磺酸酯)的转化

在氮气氛下，向搅拌后的三(2-羟基乙基)甲烷(10g，0.0676mol)的二氯甲烷(50ml)冰冷溶液中，缓慢滴加甲烷磺酰氯(40g，0.349mol)的二氯甲烷(50ml)溶液，以温度上升不超过15℃的速率滴加。然后滴加吡啶(21.4g，0.27mol，4eq)的二氯甲烷(50ml)溶液，以温度上升不超过15℃的速率滴加，为放热反应。将反应物在室温下搅拌24小时，然后用5N盐酸溶液(80ml)处理，分离各层。水层用二氯甲烷(50ml)再次萃取，合并有机萃取液，经硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩，得到被过量的甲烷磺酰氯污染的三[2-(甲磺酰氧基)乙基]甲烷。理论产量为25.8g。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ4.3(6H，t，2xCH₂)，3.0(9H，s，3xCH₃)，2(1H，六重峰，CH)，1.85(6H，q，3xCH₂).

(步骤f)：1，1，1-三(2-叠氮基乙基)甲烷的制备

在氮气氛下，将三[2-(甲磺酰氧基)乙基]甲烷[步骤1(e)，被过量的甲烷磺酰氯污染](25.8g，67mmol，理论值)的无水DMF(250ml)搅拌溶液在15分钟内用叠氮化钠(30.7g，0.47mol)分批处理。观测到放热，用冰浴冷却反应物。30分钟后，反应混合物用油浴在50℃加热24小时。反应物变为棕色。让反应物冷却，用稀碳酸钾溶液(200ml)处理，用40/60石油醚/乙醚(10∶1，3×150ml)萃取三次。有机萃取液用水(2×150ml)洗涤，经硫酸钠干燥后过滤。将乙醇(200ml)加入到汽油/乙醚溶液中，以维持三叠氮化物的溶液，将体积真空减小至不少于200ml。加入乙醇(200ml)，再次真空浓缩以除去最后的痕量汽油，剩下不少于200ml的乙醇溶液。将三叠氮化物的乙醇溶液直接用于步骤1(g)。

注意：不要将所有的溶剂都除去，因为叠氮化物很可能爆炸，在任何时候都应该保存在稀溶液中。

真空蒸发少于0.2ml的溶液，以除去乙醇，对此少量样品进行NMR操作：

NMR ¹H(CDCl₃)，δ3.35(6H，t，3xCH₂)，1.8(1H，七重峰，CH，)，1.6(6H，q，3xCH₂).

(步骤g)：1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备

三(2-叠氮基乙基)甲烷(15.06g，0.0676mol)(假定前面的反应为100％的收率)的乙醇(200ml)溶液用10％钯/碳(2g，50％水)处理，氢化12小时。每2小时排空反应容器一次，以除去反应释放的氮气，重新充入氢气。取样进行NMR分析，以证实三叠氮化物完全转化为三胺。注意：未还原的叠氮化物可能在蒸馏时爆炸。通过硅藻土垫过滤反应物以除去催化剂，真空浓缩，得到油状三(2-氨基乙基)甲烷。将其在bp.180-200℃，0.4mm/Hg通过Kugelrohr蒸馏进一步提纯，得到无色油状物(8.1g，从三醇开始的总收率为82.7％)。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ2.72(6H，t，3xCH₂N)，1.41(H，七重峰，CH)，1.39(6H，q，3xCH₂).

NMR ¹³C(CDCl₃)，δ39.8(CH₂NH₂)，38.2(CH₂.)，31.0(CH).

实施例2：1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的另一种制备方法

(步骤a)：用对甲氧基-苄胺酰胺化三甲酯

将三(甲氧基羰基甲基)甲烷[2g，8.4mmol；按照以上步骤1(b)制备]溶于对甲氧基-苄胺(25g，178.6mmol)。安装蒸馏装置，在氮气流下加热至120℃ 24小时。通过所收集的甲醇量监测反应进展。将反应混合物冷却至室温，加入30ml乙酸乙酯，然后将沉淀出的三酰胺产物搅拌30分钟。通过过滤分离三酰胺，滤饼用足量的乙酸乙酯洗涤几次，以除去过量的对甲氧基-苄胺。干燥后，获得白色粉末(4.6g，100％)。将基本上不溶的产物直接用于下一步骤，无需进一步提纯或表征。

(步骤b)：1，1，1-三[2-(对甲氧基苄基氨基)乙基]甲烷的制备

在用冰水浴冷却的1000ml三颈圆底烧瓶中，将步骤2(a)的三酰胺(10g，17.89mmol)小心加入到250ml 1M硼烷溶液(3.5g，244.3mmol)中。加入完毕后，撤去冰水浴，将反应混合物缓慢加热至60℃。将反应混合物在60℃搅拌20小时。提取反应混合物样品(1ml)，与0.5ml5N HCl混合，静置30分钟。向样品中加入0.5ml 50 NaOH，然后加入2ml水，搅拌溶液直到所有的白色沉淀溶解。溶液用乙醚(5ml)萃取，蒸发。将残余物以1mg/ml溶于乙腈，通过MS分析。如果MS光谱发现单酰胺或二酰胺(M+H/z＝520和534)，则说明反应不完全。为了完成反应，再次加入100ml 1M硼烷的THF溶液，在60℃搅拌反应混合物6小时以上，按照前面的取样步骤获取新的样品。根据需要，再次加入1M硼烷的THF溶液直到完全转化为三胺。冷却反应混合物至室温，缓慢加入5N HCl，[注意：会形成大量的泡沫！]。加入HCl直到不再有气体释放。将混合物搅拌30分钟，然后蒸发。将块状物悬浮于NaOH水溶液(20-40％；1∶2 w/v)，搅拌30分钟。混合物用水(3倍体积)稀释。混合物用乙醚(2×150ml)萃取[注意：不要使用卤代溶剂]。合并的有机相用水(1×200ml)、盐水(150ml)洗涤，经硫酸镁干燥。蒸发后获得油状物(7.6g，84％)。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ：1.45，(6H，m，3xCH₂；1.54，(1H，七重峰，CH)；2.60(6H，t，3xCH₂N)；3.68(6H，s，ArCH₂)；3.78(9H，s，3xCH₃O)；6.94(6H，d，6xAr).7.20(6H，d，6xAr).

NMR ¹³C(CDCl₃)，δ：32.17，CH；34.44，CH₂；47.00，CH₂；53.56，ArCH₂；55.25，CH₃O；113.78，Ar；129.29，Ar：132.61；Ar；158.60，Ar；

(步骤c)：1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备

将1，1，1-三[2-(对甲氧基苄基氨基)乙基]甲烷(20.0克，0.036mol)溶于甲醇(100ml)中，加入Pd(OH)₂(5.0克)。将混合物在高压釜中氢化(3巴，100℃)，搅拌5小时。分别在10小时和15小时后加入两批Pd(OH)₂(2×5克)。过滤反应混合物，滤液用甲醇洗涤。蒸发合并的有机相，真空蒸馏(1×10^-2，110℃)残余物，得到2.60克(50％)1，1，1-三(2-氨基乙基)甲烷，按照上述实施例1介绍的方法确认。

实施例3：3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷的制备

将2-甲基丁-2-烯(147ml，1.4mol)和亚硝酸异戊酯(156ml，1.16mol)的混合物用cardice/甲醇浴冷却至-30℃，用顶部的空气搅拌器剧烈搅拌，滴加浓盐酸(140ml，1.68mol)，滴加速率应使温度保持在-20℃以下。这需要约1小时，由于大量放热，必须注意防止过热。加入乙醇(100ml)以降低浆状物(在加入结束时形成)的粘性，在-20℃至-10℃搅拌反应物2小时以完成反应。真空过滤收集沉淀，用4×30ml冷(-20℃)乙醇和100ml冰冷水洗涤，然后真空干燥，得到为白色固体的3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷。合并乙醇滤液和洗涤液，用水(200ml)稀释后冷却，在又一批3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷结晶后，在-10℃静置1小时。过滤收集沉淀，用最少的水洗涤，真空干燥，得到3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(总共115g，0.85mol，73％)，NMR显示纯度高于98％。NMR ¹H(CDCl₃)，各异构体的混合物(异构体1，90％)1.5d，(2H，CH₃)，1.65d，(4H 2x CH₃)，5.85，q，和5.95，q，合起来1H。(异构体2，10％)1.76s，(6H，2x CH₃)，2.07(3H，CH₃)。

实施例4：双[N-(1，1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-氨基乙基)甲烷(螯合剂1)的合成

在室温、氮气氛下，向三(2-氨基乙基)甲烷(4.047g，27.9mmol)的无水乙醇(30ml)剧烈搅拌溶液中加入无水碳酸钾(7.7g，55.8mmol，2eq)。将3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(7.56g，55.8mol，2eq)溶于无水乙醇(100ml)，将75ml以上溶液缓慢滴加到反应混合物中。通过二氧化硅TLC[在二氯甲烷、甲醇、浓(0.88sg)氨水操作色谱板；100/30/5，通过喷雾茚三酮和加热而展开TLC板]监测反应。发现单烷基化、二烷基化和三烷基化的产物，RF按该顺序持续增高。分析型HPLC操作条件：RPR反相柱，7.5-75％乙腈/3％氨水梯度。真空浓缩反应物以除去乙醇，重新悬浮于水(110mol)中。水性浆状物用乙醚(100ml)萃取以除去部分三烷基化的化合物和亲油性杂质，在水层中剩下单烷基化产物和所需的二烷基化产物。将水溶液用乙酸铵(2eq，4.3g，55.8mmol)缓冲以确保良好的色谱分离。将水溶液在4℃储存过夜，然后通过自动制备型HPLC纯化。

产量(2.2g，6.4mmol，23％)。

质谱；正离子10V锥电压。实测值：344；M+H计算值＝344。

NMR ¹H(CDCl₃)，δ1.24(6H，s，2xCH₃)，1.3(6H，s，2xCH₃)，1.25-1.75(7H，m，3xCH₂，CH)，(3H，s，2xCH₂)，2.58(4H，m，CH₂N)，2.88(2H，t CH₂N₂)，5.0(6H，s，NH₂，2xNH，2xOH).

NMR ¹H((CD₃)₂SO)δ1.1 4xCH；1.29，3xCH₂；2.1(4H，t，2xCH₂)；

NMR ¹³C((CD₃)₂SO)，δ9.0(4xCH₃)，25.8(2xCH₃)，31.02xCH₂，34.6CH₂，56.82xCH₂N；160.3，C＝N.

HPLC条件：流速8ml/min，25mm PRP柱，

A＝3％氨水溶液(比重＝0.88)/水；B＝乙腈

时间                              ％B

0                                 7.5

15                                75.0

20                                75.0

22                                7.5

30                                7.5

每次操作都装载3ml水溶液，在时间窗12.5-13.5分钟收集。

实施例5：3-碘-苯甲酰基-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-H(化合物3)的合成

                      化合物3

在H-Asp(tBu)-H NovaSyn TG树脂(NovaBiochem)上，通过标准固相肽化学法装配与以上序列一致的肽酰树脂(Barany，G；Kneib-Cordonier，N.；Mullen，D.G.(1987)Int.J.Peptide Protein Research 30，705-739)。使用手动氮起泡器装置(Wellings，D.A.，Atherton，E.(1997)，Methods in Enzymology(Fields，G.编辑)，289，第53-54页，AcademicPress，New York)。为了脱去叔丁基保护基团，装配的肽酰树脂3-碘-苯甲酰基-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)-H NovaSyn TG树脂(化合物1)用含2.5％水的三氟乙酸(TFA)处理。将天冬氨酰基和谷氨酰残基的侧链用亚硫酰二氯(20当量)的甲醇溶液转化为它们的甲酯，得到肽树脂(化合物2)。将肽酰树脂用含0.1％三氟乙酸(TFA)的60％乙腈(ACN)的水溶液处理4小时，使得肽产物(化合物3)从树脂释放。将树脂残余物滤出，通过旋转蒸发浓缩滤液，与乙醚研磨，将产物离心分离。将产物通过LC-MS表征：采用分析型RP-HPLC柱(Phenomenex Luna 3μC18(2)50mm×2mm)，用0-70％ ACN/0.1％ TFA水溶液梯度洗脱10分钟，流速0.3ml/min，通过λ＝214nm的UV吸收以及电喷雾质谱检测洗脱液。在t_R＝8.2分钟证实产物，[M+H]⁺在733.5m/z，预测值在733.2m/z。

实施例6：用于放射性卤化的三甲基甲锡烷基前体(化合物4)的合成

                      化合物4

将肽树脂3-碘-苯甲酰基-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-HNovaSyn TG树脂(化合物2，实施例5)用微波技术甲锡烷基化。在氩气氛下，将3-碘官能化树脂(50mg，0.012mmol)置于照射管，用含四(三苯基膦)合钯(7mg，0.006mmol)和六甲基二锡(7.86mg，5μl，0.024mmol)的无水N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)处理。将照射管密封，放入空腔内，在100℃照射5分钟。冷却后，洗涤黑色混合物，甲锡烷基化肽(化合物4)从树脂断裂，按照以上实施例5处理。将产物通过LC-MS表征：采用分析型RP-HPLC柱(Phenomenex Luna 3μ C18(2)50mm×2mm)，用10-80％ ACN/0.1％ TFA水溶液梯度洗脱10分钟，流速0.3ml/min，通过λ＝214nm的UV吸收以及电喷雾质谱检测洗脱液。在t_R＝8.3分钟证实所需产物，[M+H]⁺在771.1m/z，预测值在771.2m/z。

实施例7：1-(4-碘苄基)-5-(2-甲氧基甲基-吡咯烷-1-磺酰基)-1H-吲哚-2，3-二酮(化合物5)的合成

                      化合物5

在氩气氛、室温下，将60％氢化钠加入到5-(2-甲氧基甲基-吡咯烷-1-磺酰基)-1H-吲哚-2，3-二酮(靛红衍生物；Calbiochem目录号218826；50mg，0.154mmol)和无水DMF(5ml)的透明黄色溶液。混合物立即变为深紫色。搅拌10分钟后，加入4-碘苄基溴(46.56mg)的DMF(200μl)溶液，继续在室温下搅拌。随着反应的进行，紫色褪去，24小时后，TLC(氯仿∶甲醇，8∶2，rf约为2)表明完全反应。减压蒸发除去DMF，残余物用快速色谱(氯仿∶甲醇8∶2)处理，获得61mg(73％)黄色半固体。将产物通过制备型RP-HPLC进一步提纯。将柱(Phenomenex Luna C18 10μ，22×250mm)用30-80％乙腈(ACN)/0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液梯度以10ml/min的速率洗脱60分钟。汇集所需峰部分，获得纯净化合物5。分析型RP-HPLC：t_R＝5.39分钟，(Phenomenex Luna 3μ C18(2)50mm×2mm，30-80％ ACN/0.1％ TFA水溶液，10分钟，0.3ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的[M+H]⁺预计在541.0m/z，实测在540.9m/z。

实施例8：5-(2-甲氧基甲基-吡咯烷-1-磺酰基)-1-(4-三甲基甲锡烷基-苄基)-1H-吲哚-2，3-二酮(化合物6)

                      化合物6

将化合物5(27mg，0.05mmol；实施例7)、四(三苯基膦)合钯(5.78mg，0.005mmol)、六甲基二锡(21μl，0.10mmol)和甲苯(8ml)的透明黄色溶液用微波照射在120℃加热5分钟。过滤所得黑色混合物。将滤液蒸发至干，残余物用快速色谱(乙酸乙酯∶己烷1∶1)纯化，获得黄色油状纯净产物，收率83％。分析型RP-HPLC：t_R＝7.92分钟，(Phenomenex Luna 3μ C18(2)50mm×2mm，30-80％ ACN/0.1％ TFA水溶液，10分钟，0.3ml/min，λ＝214nm)。电喷雾MS：产物的[M+H]⁺预计在578.9m/z，实测在578.9m/z。

实施例9：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的体外抑制测定

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂的体外功效采用市售测定药盒(例如：Biomol，BIOMOL International L.P.5120 Butler Pike，Plymouth Meeting，PA 19462-1202)评估。简单地说，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3测定药盒是设计用于测量半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性的完整分析系统。它包含了比色底物(DEVD-pNA)和荧光底物(DEVD-AMC)。对硝基酰基苯胺(pNA)从比色底物的断裂在405nm增加了吸收量。荧光测定基于7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)染料从肽底物羧基端的断裂。所述染料从底物的断裂在460nm增加它的荧光强度。使用方便的96孔微板进行测试。所述药盒可用于筛选半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(潜在的治疗靶)的抑制剂。也包括作为原型对照抑制剂1的抑制剂DEVD-CHO(醛)。DEVD氨基酸序列从PARP[聚(ADP-核糖)聚合酶]中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3切割位点得到。

实施例10：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞测定

Jurkat和HL-60细胞用于基于细胞的模型，用星孢素诱导细胞凋亡，参见Wang等，“A Role for Mitochondrial Bak in ApoptoticResponse to Anticancer Drugs(线粒体Bak在对抗癌药物的凋亡反应中的作用)”，J.Biol.Chem.，2001年8月；276：34307-34317。

基于双功能细胞的测定是测试半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂进入细胞的能力以及随后结合半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3靶的能力所必需的。本测试基于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的荧光染料抑制剂(FLICA)。该抑制剂具有细胞渗透性，一旦进入细胞，就共价结合活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，可以检测到FLICA荧光。在加入到细胞群体后，FLICA探针进入各个细胞，共价结合位于活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶杂二聚体的大亚基上的反应性半胱氨酸残基，由此抑制进一步的酶活性。结合的标记试剂保留在细胞内，而任何未结合的试剂将扩散出细胞，被洗去。绿色荧光信号是在加入试剂时，细胞群体中存在的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3数量的直接量度。包含结合标记试剂的细胞可以用96孔板测定其荧光性。

本测试有效的测试品也是靶向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的抑制剂，将它们加入凋亡细胞，然后进行FLICA处理。有效的试验化合物将阻断FLICA与活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的结合，从而允许通过监测FLICA相关荧光的任何减少来测量功效。

实施例11：用于N-烷基化的¹⁸F标记的衍生物的合成：

甲苯磺酸3-[¹⁸F]氟丙酯的合成

用塑料注射器(1ml)，将Kryptofix 222(10mg)、乙腈(300μl)、碳酸钾(4mg)和水(300μl)的溶液(在玻璃小瓶中制备)经由二路栓(two-waytap)转移到位于黄铜加热器中的碳玻璃反应器。然后通过二路栓加入含¹⁸F氟化物(185-370MBq)的目标水(0.5-2ml)。将加热器设在125℃，启动计时器。15分钟后，以1分钟的间隔加入三等份乙腈(0.5ml)。将¹⁸F氟化物总共干燥40分钟。40分钟后，将加热器用压缩空气冷却，打开罐盖，加入二对甲苯磺酸1，3-丙二醇酯(5-12mg)和乙腈(1ml)。重新盖上罐盖，用塞子封闭管道。将加热器设定在100℃，在100℃标记10分钟。标记后，甲苯磺酸3-[¹⁸F]氟丙酯通过Gilson RP HPLC分离，采用以下的分离条件：

柱                u-bondapak C18 7.8×300mm

洗脱剂            水(泵A)∶乙腈(泵B)

环大小            1ml

泵速              4ml/min

波长              254nm

梯度              5-90％洗脱剂B，20分钟

产物Rt            12分钟

一旦分离，将收集的样品(约10ml)用水(10ml)稀释，加到调节后的C18 sep pak上。将sep pak用氮气干燥15分钟，用有机溶剂吡啶(2ml)、乙腈(2ml)或DMF(2ml)冲洗。洗掉约99％的活性。

通过在吡啶回流，将甲苯磺酸3-[¹⁸F]氟丙酯用于N-烷基化胺类。

实施例12：用于S-烷基化的[¹⁸F]-硫醇衍生物

步骤(a)：3-[¹⁸F]氟代三苯甲基硫基丙烷的制备

用塑料注射器(1ml)将Kryptofix 222(10mg)、乙腈(800μl)、碳酸钾(1mg)和水(50μl)的溶液(在玻璃小瓶中制备)经由二路栓转移到位于黄铜加热器中的碳玻璃反应器。然后通过二路栓加入含¹⁸F氟化物(185-370MBq)的目标水(0.5-2ml)。将加热器设在125℃，启动计时器。15分钟后，以1分钟的间隔加入三等份乙腈(0.5ml)。将¹⁸F氟化物总共干燥40分钟。40分钟后，将加热器用压缩空气冷却，打开罐盖，加入三甲基-(3-三苯甲基硫基-丙氧基)硅烷(1-2mg)和DMSO(0.2ml)。重新盖上罐盖，用塞子封闭管道。将加热器设定在80℃，在80℃标记5分钟。标记后，将反应混合物通过RP HPLC分析，采用以下HPLC条件：

柱            u-bondapak C18 7.8×300mm

洗脱剂        0.1％ TFA/水(泵A)∶0.1％ TFA/乙腈(泵B)

环大小        100μl

泵速          4ml/min

波长          254nm

梯度          1分钟         40％ B

              15分钟        40-80％ B

              5分钟         80％ B

反应混合物用DMSO/水(1∶1 v/v，0.15ml)稀释，加到调节后的t-C18 sep pak上。将柱用水(10ml)洗涤，用氮气干燥，将3-[¹⁸F]氟-1-三苯甲基硫基-丙烷用4份乙腈(每份0.5ml)洗脱。

步骤(b)：3-[¹⁸F]氟-丙-1-硫醇的制备

用氮气流将3-[¹⁸F]氟-1-三苯甲基硫基-丙烷的乙腈(1-2ml)溶液在100℃蒸发10分钟，蒸发至干。加入TFA(0.05ml)、三异丙基硅烷(0.01ml)和水(0.01ml)的混合物，然后在80℃加热10分钟，得到3-[¹⁸F]氟-丙-1-硫醇。

步骤(c)：与-N(CO)CH₂Cl前体反应

标记氯乙酰基前体一般过程是，用压缩空气冷却装有3-[¹⁸F]氟-1-巯基-丙烷(步骤(b))的反应容器，然后加入氨水(27％水溶液，0.1ml)和前体(1mg)的水(0.05ml)溶液。将混合物在80℃加热10分钟。

实施例13：[¹²³I]-放射性标记半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂

步骤a：化合物5的另一种合成方法

化合物5是非放射性类似物，即碘同位素是¹²⁷I，按照以下流程4制备。

流程4

            100μl pH 4，0.2M乙酸铵

            100μl Na¹²⁷I/0.01M NaOH，1×10^-7摩尔

            142μl乙腈

            10μl 0.01M过乙酸，1×10^-7摩尔

            58μg化合物1/58μl乙腈，1×10^-7摩尔

            RT 5’

化合物6                                          化合物5

质谱分析证实了化合物5的结构。

步骤b：化合物5A的合成

对于制备¹²³I标记的化合物5(化合物5A)，按照类似于步骤(a)的方案进行。向8-30μl无载体的碘化钠[¹²³I]中加入100μl 0.2M乙酸铵缓冲液(pH 4)、10μl碘化钠[¹²⁷I]，碘化钠(15mg/100ml)的0.01M氢氧化钠溶液(1×10^-8摩尔)和50μl乙腈。将各试剂混合，转移到硅烷化的P15小瓶。最后加入10μl 0.001M过乙酸溶液(1×10^-8摩尔)和58μl化合物6(1mg/ml)的乙腈溶液(1×10^-7摩尔)。[¹²³I]-化合物5(化合物5A)用HPLC纯化，用含10％乙醇(帮助溶解)的50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)稀释至20MBq/ml或100MBq/ml，其典型比活分别为14MBq/nmol和41MBq/nmol。两种制剂在pH 7.5(＞95％ RCP，4小时)下均是稳定的。观测到与¹²⁷I标准品(步骤(a))共洗脱，从而证实了化合物的结构。