用于在生物聚合物上培养角膜内皮细胞和相关细胞以及产生人工角膜移植物的方法和组合物

摘要

本发明公开了在合成自生物聚合物的基质的内皮侧上粘附并生长单层的培养的人角膜内皮细胞以产生更为生物等效的人工角膜的方法。该方法将包括使用粘附或者生长促进剂如纤连蛋白、层粘连蛋白、RGDS、IV型胶原蛋白、与聚卡波非缀合的bFGF，和与聚卡波非缀合的EGF。本发明还描述了生成自给聚合物的方法，该聚合物含有粘附分子和生长因子以支持培养的人角膜内皮细胞的粘附和增殖来用于角膜移植，其可以作为半厚度装置或者全厚度的钮替代物。本发明公开了一种用于将培养的角膜色素内皮(PRE)细胞植入到视网膜下空间以用于治疗年龄相关的黄斑变性(ARMD)的方法。该方法将使得递送单层细胞片中的移植的RPE成为可能，并且更适于发挥它们的生理功能。

说明书

本专利申请要求于2003年10月10日提交的美国专利申请系列号60/510,359、2003年10月10日提交的60/510,350和2003年10月10日提交的60/510,349的优先权，并将其全部内容完整地结合入本发明作为参考。

背景技术

1.发明领域

本专利申请描述了剖离(dissect)，接种，并随后将人角膜内皮细胞和视网膜色素内皮细胞纯培养物在胞外基质上繁殖的改进的方法，以及制造人工角膜移植物的组合物和方法。

2.现有技术的描述

由于多种原因，眼睛的角膜部分可能需要手术修复或者被替换。例如，角膜可能被刮坏或者疤痕化或者受到其它物理性损伤，从而很大程度上影响视力。角膜还会受到各种退行性疾病的影响，如果患者要想获得正常或者接近正常的视觉，则需要换角膜。

人眼睛中的角膜是由基本上平行的、相对紧密的组织层所组成的一种特化结构。角膜的最外层或者最表层是上皮层。这是一个组织的保护层，其在被损伤后再生。向眼内的方向推进，所见到的是被称为Bowan’s膜的内皮层的基础表面。紧贴着Bowman’s膜的是角膜基质，其为具有分散角膜(keratocytic)细胞的细胞外胶原蛋白建筑基质。该基质层在其最深水平与被称为Descemet’s膜的角质层(细胞膜)结合，此角质层后又接着形成角膜后表面的单细胞厚度的特化内皮细胞的单层。所述的内皮层在患病，受到刮坏或者其它损伤后不会再生，必须更换。

在一些包括人在内的动物物种中，角膜内皮通常不会在体内复制来替换因损伤或者老化而损失的细胞(Murphy C，等，Invest.OphthalmologyVis.Sci.1984；25：312-322；Laing R A，等，Exp.Eye Res.1976；22：587-594)。但是人角膜细胞可以在体外用富含生长因子的、包含胎牛血清的培养基中在正常的组织培养条件下培养获得(Baum JL，等，Arch.Ophthalmol.97：1136-1140，1979；Engelmann K，等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.29：1656-1662，1998；Engelmann K，和Friedl P；In Vitro Cell Develop.Biol.25：1065-1072，1989)。如果被培养的细胞可以被用于替换角膜内皮细胞的损失，其将大大增强人角膜供体库。这是很重要的，因为供体角膜可以被扩增以克服当前由于内皮细胞数量缺乏的原因而无法进行角膜移植的问题(Gospodarowicz D，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：464-468，1979；Gospodarowicz D，等，Arch.Ophthalmol.97：2163-2169，1979)。该角膜库[由于低细胞数量而导致被弃的供体角膜]占每年全部捐献角膜的30％(National Eye Institute：Summary report on the cornea task force.InvestOphthalmol Vis Sci 12：391-397，1973)。此外，从低起始密度培养人角膜内皮细胞的方法，以及将体外培养的细胞重接种到剥落角膜钮(button)的能力，将会使接受者自己未损伤的基质用于同种细胞和自体基质类型的移植成为可能(Insler MS，和Lopez JG，Cornea 10：136-148，1991)。

组织培养技术正在被成功地用于培养组织和器官等效物。这些技术的基础涉及胶原蛋白基质结构，通过使用正确的活细胞、营养成分，和培养条件的组合，这些结构能够被重塑入功能性组织和器官。组织等效物已经被广泛地描述于许多专利中，包括美国专利号4,485,096；4,485,097；4,539,716；4,546,500；4,604,346；4,837,379；和5,827,641，将它们全部在此加入作为参考。一种组织等效物的成功应用是活皮肤等效物，其在形态学上类似于真人皮肤。所述的活皮肤等效物由两个层组成：上部分由分化的和复层人上皮角质形成细胞组成，其覆盖胶原蛋白基质中一个较厚的、较低的人真皮成纤维细胞层。Bell，等，J.of Biochemical Engineering，113：113-119(1991)。

已经对培养角膜上皮和内皮细胞进行了研究。Xie，等，In Vitro Cellular& Developmental Biology，25：20-22(1989)和Simmons，等，Toxicology andApplied Pharmacology，88：13-23(1987)。

由于世界范围的供体人角膜的长期短缺，产生用于向患有角膜内皮和上皮疾病的患者体内移植用的人工角膜基质越来越引起人们的关注，所述的患者还包括在事故中角膜创伤破裂而需要全部角膜替换的那些。

目前，多数试图生成替代角膜基质的方法依赖于使用天然来源或者人工组合的聚合物凝胶，所述的人工组合通过交联聚合物的蛋白质部分而成。由于大多聚合物凝胶在水相中占高达80％的总体积，如果人工角膜基质被放置与水性流体接触，它们将会膨胀。在这种情况下，被移植的人工角膜基质将会持续处于外室的水性环境中。随后聚合物凝胶的膨胀将会引起聚合物凝胶内的浑浊(haziness)以及因人工基质厚度增加引起的视觉失真。因此需要在人工基质的内侧放置一层培养的人内皮细胞以作为液体穿透的屏障并同时通过将流体从基部向顶端方向持续地泵出来将基质维持在正确的厚度，这样使得人工基质保持薄而且维持高清晰度。

制造一种角膜移植用人工基质，使生物聚合物在其合成过程中含有诱导并维持细胞粘附和增殖的制剂，这样将会是有利的。可以支持三种不同细胞类型的人工角膜，可被用作要比仅仅一个装置更加有效的角膜等效物，所述的三种不同细胞类型为凸面的角膜内皮细胞，内部的角膜细胞，和凹面的角膜内皮细胞。角膜内皮细胞层作为持续将流体向外泵出的流体屏障。角膜细胞从伤口处生长出来并将移植的人工角膜锚定在原位，角膜替代物可以实现一种相对脱水的状态，这是通过正常的完整的角膜所维持的，所述的完整的角膜能够使其在移植操作后保持透明(deturgence)和稳定性。

除了角膜创伤，作为一种衰老疾病天然发生在人体内的年龄相关的黄斑变性。(Gartner S，和Henkind P.，Br.J.Ophthalmol.1981 Jan；65(1)：23-8；JMarshall等，Br.J.Ophthalmol.1979，Vol 63，181-187)。视网膜色素上皮(RPE)被认为与这些变性疾病非常相关，这是因为其作为持续杆状体外部分的吞噬作用和累积性暴露于毒性因子的结果所引起的高压而导致的生物学和生理学功能的丧失。(Dorey CK.，等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1989 Aug；30(8)：1691-9；Hogan MJ，Trans.Am.Acad.Ophthal.-molOtolaryngol 1972；7：64-80)。已经建议将RPE细胞移植作为人变性黄斑和周围视网膜疾病的可能疗法(Li，L.和Turner，JE.，Exper.Eye Res.47：911(1988)；Lane，C.，等，Eye.1989；3(Pt 1)：27-32)。这些提议的结果产生了这样的需要：需要在细胞移植过程中通过手术将人RPE细胞递送入视网膜下空间。通过直接将RPE细胞悬液注射到视网膜下空间来作为RPE细胞移植的方法，由于被注射入的细胞聚集而形成簇而不是作为单层沉降(这对它们正常发挥功能是一个必要的条件)而使预期的临床效果不佳。(GourasPG.，等，Curr.Eye Res.1985；4：253-265；Lopez R.，等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1987；28：1131-1137)。移植作为单层放置在一片生物可降解的聚合物膜上的培养的RPE细胞可以解决这一问题。

到本发明出现前，现有技术方法在培养人角膜内皮细胞(HCEC)遇到了问题，例如HCEC细胞只能以高细胞密度(2000-5000细胞/mm²)被接种，因此限制了以小量样品起始原代培养的可能性，而且HCEC细胞不能以低接种密度(50-100细胞/mm²)被连续传代，从而限制了扩大HCEC储备以用于储存和未来使用的能力。

发明概述

本发明提供了一种用于修饰生物聚合物表面以增强培养的角膜内皮细胞对生物聚合物的粘附及随后在其上生长。特别是，培养的细胞将能够保持粘附到生物聚合物表面并执行其生理学功能例如形成紧密细胞连接以防止流体进入生物聚合物而引起不需要的膨胀，以及表现从基部到顶部方向的Na/K泵活性来从生物聚合物中去除过量的流体，这样就可以保持替代角膜基质(生物聚合物)的deturgence和清晰度。

本发明的方法涉及使用粘附蛋白例如纤连蛋白，层粘连蛋白，RGDS，IV型胶原蛋白，与聚卡波非缀合(conjugated)的bFGF，和与聚卡波非缀合的EGF。聚卡波非是一种轻度交联的聚合物。交联剂是二乙烯乙二醇。聚卡波非还是一种含有作为其负电荷源的多个羧基基团的弱多酸。这些酸基团允许氢与细胞表面键合。聚卡波非与黏蛋白一样，具有在水中吸收其40-60倍重量的能力，并且通常被用作非处方缓泻剂(Equalactin，KonsylFiber，Mitrolan，Polycarb)(Park H，等，J.Control Release 1985；2：47-57)。聚卡波非是一种非常大的分子并因此不被吸收。聚卡波非还是非免疫原性的，即使在实验室中，生成对该聚合物的抗体迄今也是不可能的。

在一个实施方案中，本发明公开了自给(self-sustaining)的聚合物，该聚合物包埋或者在其合成过程中已经在该生物聚合物中掺入包含一种或多种下列物质的粘附混合物：纤连蛋白，层粘连蛋白，RGDS，与聚卡波非缀合的bFGF；与聚卡波非缀合的EGF，和硫酸肝素。所述的生物聚合物可以被模塑成任何需要的形状，其中优选角膜的形状，培养的人角膜内皮细胞将被接种到凹面并且使其增殖直到汇合。

本发明还将公开一种自给的生物聚合物，该聚合物也可以被模塑成正常人角膜的一半厚度并且被覆盖以培养的人角膜内皮细胞，用于被称为Deep Lamellar Endothelial Keratoplasty(DLEK)过程的半厚度移植(Terry，M.A.，Eye.2003 Nov；17(8)：982-8；Loewenstein A，和Lazar M.，Br.J.Ophthalmol.1993；77：538)。

在另一个实施方案中，所述的自给生物聚合物可以被模塑成全厚度或者半厚度的角膜形状，而且在用环钻术打出11mm直径的钮(button)后，培养的人角膜内皮细胞将会被接种到人工基质的凹面。

本发明的又一个目的是提供一种生物聚合物表面，其具有金刚石样(diamond like)的碳涂层并用粘附混合物处理所述的涂覆(coated)的表面，从而形成一种适合于在体外培养角膜内皮细胞的生物聚合物表面。

本发明的另一个实施方案涉及使用薄(厚度为10-100微米)的生物聚合物片作为载体将视网膜色素内皮(RPE)细胞移植到眼睛的视网膜下空间来治疗年龄相关的黄斑变性(ARMD)。或者可以将生物可降解的聚合物薄片作为培养的RPE细胞的载体以用于移植步骤。使用该生物可降解系统的好处是在聚合物被降解后不久RPE细胞就可以与Bruch’s膜和下面的脉管系统接触，并且较快地执行其转运和吞噬功能。

通过参考下面优选实施方案的详细描述，本发明的这些和其它目的，以及其它许多伴随的益处，将变得显而易见。

附图简述

图1显示在不同基质上培养的人内皮细胞的长期系列增殖的世代曲线。

图2描述了不同粘附因子对培养的人角膜内皮细胞在存在或不存在bFGF时的影响。

图3是培养的人角膜内皮细胞粘附到被涂覆了粘附剂的剥落的人角膜钮的时间曲线。

详细描述和优选的实施方案

在描述本发明的优选实施方案的时候，为了清楚起见采用了特定的命名学。但是，本发明并不意欲被这些特定的术语所限，而且应该理解每个特定的术语包括所有以类似方式操作来实现类似目的的技术等价物。

先前的研究已经证明，人角膜内皮细胞(HCEC)可以在聚合物表面上生长(T.Mimura等，2004 Invest.Ophthal.Vis.Sci.Vol.45.No.9 2992-2997；F.Li等，2003 Proc.Nat.Acad.Sci.USA Vol 100.15346-15351)。但是，这些细胞可以保持粘附到聚合物珠上最大可达12-24周(M.S.Insler和J.G.Lopez，1989 Curr.Eye Res.Vol.9：23-30)。

本发明描述了修饰人工基质的内皮面的方法。这是通过培养的HCEC的长期粘附以及它们行使重要生物功能以维持人工角膜的完整性和清洁的能力使之成为可能的。为此，本发明公开了预先确定的粘附蛋白和生长因子的混合物(粘附混合物)，即，浓度范围为PBS中0.1μg-500μg/ml的纤连蛋白，浓度范围为PBS中0.1μg-500μg/ml的层粘连蛋白，浓度范围为PBS中0.1μg-200μg/ml的RGDS，0.01M乙酸中的浓度范围为1μg-1000μg/ml IV型胶原蛋白，0.01M乙酸中的浓度范围为1μg-1000μg/ml I型胶原蛋白，与聚卡波非(0.01μg/ml)缀合的浓度范围为PBS中1ng-500ng/ml的bFGF，和与聚卡波非缀合的浓度范围为PBS中1ng-500ng/ml的ESF。

所述的预先确定的粘附混合物将被添加到聚合物凝胶的凹面，该胶被模塑成角膜形状。随后将聚合物凝胶在4℃下温育20分钟-24小时的时间范围。而后，去除剩余的粘附混合物，角膜已经准备好被接种入培养的角膜内皮细胞。在备选的实施方案中，一种衍生自培养的牛内皮细胞的天然细胞外基质可以被直接沉积到所述的聚合物上。

来自牛来源的角膜内皮细胞被接种在角膜形状的聚合物凝胶的内皮面上。该装置将被凹面向上地放置于一个35mm的培养皿中，其中被接种的细胞在孔的空间中，将其在37℃下于10％CO₂的恒温箱中温育2小时。将大约2ml的培养基(补充了10％小牛血清，5％胎牛血清，和2％w/v葡聚糖(MV 40,000))加入以完全浸没人工角膜。使牛内皮细胞培养至汇合7天。随后用蒸馏水中的20mM的氢氧化铵溶液处理内皮细胞层5分钟，用PBS洗涤10遍，人工角膜基质已经准备好用培养的人角膜内皮细胞涂覆。在另一个实施方案中，可以用金刚石样碳(diamond-like carbon，DLC)来涂覆所述的人工角膜基质，使用等离子枪来在真空环境中将一薄层碳沉积到角膜形的聚合物上。

在备选方案中，用来形成内皮层的角膜内皮细胞可以来自多种哺乳动物来源。已经使用了来自绵羊、家兔，和奶牛的非转化的角膜内皮细胞。以及用SV40的大T抗原转化了小鼠角膜内皮细胞。(Muragaki，Y.，等，Eur.J.Biochem.207(3)：895-902(1992).)也可以使用的非人细胞类型包括转化的小鼠角膜内皮细胞系，或者来自绵羊或者家兔的正常角膜内皮细胞。正常的家兔内皮细胞可以来自酶解离的角膜内皮或者角膜外植体并在MSBM培养基中被连续培养(Johnson，W.E.等，In Vitro Cell.Dev.Biol.28A：429-435(1992))，所述的培养基通过加入50μg/mL的肝素和0.4μg/mL的肝素结合生长因子-1(MSBME)而被改进。

在另一个实施方案中，来自非角膜来源的内皮细胞也可以被用于本发明。已经被用于本发明的非角膜来源的内皮细胞包括羊科和犬科的脉管以及人脐静脉内皮细胞。这些内皮细胞可以被包含SV40大T抗原的重组体反转录病毒所转化(Muragaki，等，1992，如上)。被转化的细胞继续在角膜等效物中生长并由于缺乏接触抑制而在非细胞层的顶部形成堆。非转化的细胞将会在基质细胞-胶原蛋白层下形成单层。或者，正常内皮细胞可以被以如上方式转染，只是添加物为表达热敏感基因的重组构建体。这些转化的细胞在降低温度的连续培养下将会生长。形成汇合的内皮细胞层后，可以将温度提升以使转化基因失活，从而使细胞恢复其正常调控并表现出接触抑制，进而形成类似于非转化细胞的内皮细胞单层。多数肽是热敏感的(除了热激蛋白)，这样，选择可通过升高培养温度而使其失活的肽的余地就很大。这种转化方式还促进了使用难以获得和培养的细胞类型，如人角膜内皮细胞。

本发明的自给的聚合物将会包埋，或者在其合成过程中在该生物聚合物中掺入粘附和/或生长促进剂，该粘附和/或生长促进剂包含下列的一种或者多种：浓度范围为0.1μg-500μg/ml聚合物凝胶的纤连蛋白，浓度范围为0.1μg-500μg/ml聚合物凝胶的层粘连蛋白，浓度范围为0.1μg-100μg/ml聚合物凝胶的RGDS，浓度范围为1ng-500ng/ml聚合物凝胶的、与聚卡波非缀合的bFGF，浓度范围为10ng-1000μg/ml聚合物凝胶的、与聚卡波非缀合的EGF，和浓度为范围为1μg-500μg/ml聚合物凝胶的硫酸肝素。该富集的生物聚合物被随后模塑成角膜形状，或者作为全厚度的角膜替代物(人角膜的正常厚度)，或者半厚度的角膜替代物(可达正常人角膜的厚度一半)。将培养的人角膜内皮细胞以低密度(大约2000-150,000细胞/ml，优选20,000细胞/ml)接种到人工基质的凹面，并使培养物在37℃的10％CO₂恒温箱中培养7-10天。

通过倒置显微镜观察确定，当角膜内皮细胞培养至汇合后，将角膜替代物用PBS漂洗3次，使其备用于移植。

在另一个实施方案中，全厚度或者半厚度形式的人工基质与培养的人角膜内皮细胞的汇合层一起，通过以饱和密度(大约0.5×10⁵-1×10⁷细胞/ml，优选10⁶细胞/ml)接种细胞，被接种到用11mm环钻打孔的钮上。将200μl细胞等分试样加到钮上并将该样品在37℃的10％CO₂恒温箱中温育2小时-24小时。用PBS将角膜替代物洗涤3遍，备好用于角膜移植。

为了培养视网膜色素内皮细胞，将一种组分和合成都对本领域技术人员已知的生物相容的生物聚合物模塑成统一厚度1-1000微米，优选10一100微米的薄片。将RPE细胞在膜上培养至汇合或者以高接种密度涂覆在膜上以覆盖超过95％的膜表面。该RPE涂覆的聚合物片将作为载体系统放置于眼的后部。

为了按照本发明操作该步骤，将RPE涂覆的片切成所需的足以覆盖Bruch’s膜上受损RPE区域的尺寸。随后这些片被以RPE细胞向上地放置并被吸入一个套管中。将片以RPE细胞位于内侧的方式折叠起来。为了准备用于视网膜下空间中植入用的手术位点，将一个气泡注射到被鉴定为已经发生宿主RPE细胞损伤的视网膜下空间。通过用吸针吸出存在的被破坏RPE细胞的方式清理该区域。用平衡盐溶液(BSS)洗涤该区域一遍，涂覆聚合物的折叠RPE片将被沉积到合适的位置。吸出气泡从而使得视网膜恢复到正常形式，从而将RPE片保持在合适位置。

在另一个实施方案中，可以用一种组成和合成都对本领域技术人员已知的生物可降解的聚合物来合成载体片。将培养的RPE细胞培养至汇合或者以高接种密度沉积以覆盖整个聚合物片表面。随后将片切成所需尺寸并且如前所述地植入到眼的视网膜下空间。

关于本发明，所述的生物聚合物或者生物聚合物的生物可降解形式可以被包埋有、或者在其合成过程中掺入粘附剂，该粘附剂包含下列的一种或者多种：纤连蛋白，层粘连蛋白，RGDS，IV型胶原蛋白，与聚卡波非缀合的bFGF，与聚卡波非缀合的EGF，和硫酸肝素。随后可将培养的RPE细胞培养在这样的聚合物片上直至汇合，或者将其以高接种密度沉积以覆盖整个表面。其上带有RPE细胞的片随后被切成所需尺寸并如前所述地植入到视网膜下空间中。

实施例1：原代人角膜内皮细胞的非酶促剖离

用大体积的(50ml)磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤来自人供体的角膜缘(在中心部分已经被去除用于移植后)或者全部供体角膜。随后将其内皮面朝上地置于支持体上。用显微解剖仔细地将梁网状物和虹膜残余物去除。使用尖头的宝石工用镊非常仔细地剥离内皮细胞层和Descemet’s膜，注意不要剥离任何下面的基质组织。该步骤可以通过在倒置显微镜下观察解离的Descemet’s膜来确认其只在一面携带角膜内皮细胞而另一面则什么都没有。将组织片置于涂覆了35mm ECM的组织培养皿或者类似合适的容器上，填充大约0.5ml的培养基(带有15％胎牛血清、富集了250ng/mlb-FGF的DME-H16)。将该皿在37℃下于10％的CO₂恒温箱中温育24小时，随后加入另外1ml的培养基。将样品无干扰地情况下培养约7天以观察角膜内皮细胞集落是否从组织样品中向外迁移，此时(样品放置培养7-14天后)每隔一天对培养基进行更换，直到细胞计数达到200-500个细胞。

实施例2：人角膜内皮细胞在高分传比下的培养

当来自组织样品生长物的原代细胞计数达到200-500时，用STV溶液(生理盐水中0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA)将细胞从皿中释放出来。当细胞变圆但是依旧粘附于培养皿的时候去除STV溶液。因为剩下的STV会被含有15％胎牛血清的培养基失活，所以不必进行离心步骤。将角膜细胞放置到60-mm涂覆ECM的皿上(大约500个细胞每皿)。每隔一天对培养基进行换液并且在换液时加入250ng/ml浓度的b-FGF。培养至汇合后(约在铺板7-10天后)，在相同的分传比(1∶16-1∶64)下再次传代细胞，或者将细胞以10⁶细胞/ml每安瓿的密度冻存在10％DMSO，15％FCS中并置于液氮保存备用。传代可以进行高达8次而不会丧失细胞功能或者形态学完整性。

HCEC贮液的冷冻。

对于所收集的每5ml HCEC，在细胞悬液中加入0.5ml的DMSO。将每1.1ml的混合物等份加入到1.5ml冻存管中以得到大约1百万细胞/瓶的终浓度。将这些小瓶置于泡沫聚苯乙烯盒中并静置于-80℃的冰箱中24小时。一天后，将安瓿转换到液氮中用于长期存放。

实施例3：角膜钮的剥落

从眼库中获得人供体角膜钮。这些角膜钮被认为由于内皮细胞数量不足的原因而不适于被移植，但是在其它方面它们都是健康且无疾病的，并且其均按照眼库指南所获得。

将角膜钮内皮面向上地置于支持体上，用PBS洗涤3次。随后，将氢氧化铵溶液以10mM-200mM的浓度仔细地加入到角膜钮中而不从顶端溢出。将角膜在大约10℃-25℃下保存5分钟-2小时。而后去除氢氧化铵，用PBS将角膜钮里面洗涤大约10次。用棉拭轻柔地滑过内皮表面以去除一切残余的细胞骨架和碎片。用PBS再次洗涤角膜钮三遍，用11mm的环钻钻孔，该角膜可以随后被用于培养的人角膜内皮细胞涂覆。

或者，天然的角膜内皮可以通过加入Triton-X100去除，所述Triton-X100的浓度为蒸馏水中的0.5-5％，其被静置在10℃下5分钟-2小时，其后的步骤如前所述。此外，可以用蒸馏水在4℃-25℃的温度下处理角膜内皮20分钟-2小时的时间。随后，用棉拭轻柔地滑过内皮表面以去除一切残余的细胞骨架和碎片。而后用11mm的环钻对角膜钻孔。实施例4：用粘附蛋白和生长因子处理剥落的角膜

钻孔后，再一次将剥落的角膜钮内皮面向上地置于支持体上。将含有纤连蛋白(PBS中浓度范围为10μg-500μg/ml)，层粘连蛋白(PBS中10μg-500μg/ml)，RGDS(PBS中1μg-100μg/ml)，IV型胶原蛋白(0.1M乙酸中10μg-1000μg)，b-FGF(PBS中1-500ng/ml)，EGF(PBS中1ng-500ng/ml)的粘附蛋白溶液小心地加入到剥落的角膜钮上。将该样品在4℃培育5分钟-2小时的时间，在培育时间末将该混合物去除并用PBS洗涤角膜三遍。

实施例5：用粘附剂和生长因子的混合物涂覆聚合物用于高密度细胞接种

将满足人工基质特性的生物聚合物或者聚合物凝胶模塑成角膜形状。将人工基质凹面向上地放置并用PBS湿润。大约0.5-0.8ml的等份粘附混合物(含有浓度范围为PBS中0.1μg-500μg/ml的纤连蛋白，浓度范围为PBS中0.1μg-500μg/ml的层粘连蛋白，浓度范围为PBS中0.1μg-200μg/ml的RGDS，0.01M乙酸中的浓度范围为1μg-1000μg/ml IV型胶原蛋白，0.01M乙酸中的浓度范围为1μg-1000μg/ml I型胶原蛋白，与聚卡波非缀合(以0.01μg/ml)的浓度范围为PBS中1ng-500ng/ml的bFGF，和与聚卡波非缀合的浓度范围为PBS中lng-500ng/ml的ESF)将会被灌输入角膜形聚合物的凹表面，并将该样品随后在4℃-25℃下温育10分钟-2小时的时间范围。将粘附混合物去除；用PBS洗涤人工聚合物角膜基质3遍，其可被用于培养的人角膜内皮细胞的接种。用STV溶液(生理盐水中的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA)脱离培养皿中的培养的角膜内皮细胞。将内皮细胞在2000rpm下离心5分钟，用1ml含有0.1-5％胎牛血清的DME-H16培养基重悬细胞沉淀。用颗粒计数器确定细胞数量并将细胞浓度调节到10⁶细胞/ml。将人工角膜随后用11mm的环钻打孔，并将其200ml的等份(含有2000-2×10⁶细胞，优选150,000-250,000细胞)接种到角膜形基质上以覆盖表面区域的95％。

将人工角膜在用于移植前温育20分钟-24小时。将大约0.2-0.5ml的1％的透明质酸钠层(Healon^Advanced Medical Optics，Santa Ana，CA)铺到细胞层上作为防护剂。

实施例6：用粘附剂和生长因子涂覆生物聚合物用于培养的人角膜内皮细胞的稀疏密度接种

在另一个实施方案中，将生物聚合物模塑成角膜形。加入足量的粘附混合物以涂覆人工基质的凹表面，如前面实施例5中描述的那样。在4℃温育结束时，将粘附混合物去除；用PBS洗涤聚合物角膜3遍。将人工角膜随后用11mm的环钻打孔，在此同时保持与35mm组织培养皿中的PBS水合。如前所述那样将培养的人角膜内皮细胞从培养皿中分离开。用2000rpm将内皮细胞甩下来，在5ml的培养基中重悬，其中的培养基补充了15％胎牛血清。用颗粒计数器确定细胞数量并将细胞浓度调节到大约100,000细胞/ml。将大约100μl的含有大约20,000细胞的等份细胞悬液接种到人工角膜上并在37℃下的10％CO₂恒温箱中温育。两个小时后，将2ml培养基(补充了15％胎牛血清和250ng/ml bFGF的DME-H16)加入到皿中以完全浸没聚合物角膜和细胞。人角膜内皮细胞起初覆盖聚合物角膜的全部表面的大约10％。允许细胞增殖7天，期间每隔一天对培养基进行换液并且在培养基换液时添加250ng/ml的bFGF。在6-7天内细胞达到100％汇合，此时人工角膜准备用于移植。

实施例7：用来自牛角膜内皮细胞的细胞外基质的沉积涂覆聚合物以用于高密度接种培养的人内皮细胞

在另一个实施方案中，将生物聚合物首先模塑成角膜形。随后用11mm的环钻切割样品并将其凹面向上地放置到35mm的组织培养皿中。培养的牛角膜内皮细胞将被从其培养皿中分离并随后将细胞悬液调节到20,000细胞/ml的密度。将大约200μl的细胞悬液等份加入到聚合物角膜中并且将样品在37℃下的10％CO₂恒温箱中温育2小时。而后将大约2ml含有DME-H16的培养基加入到25mm皿中以完全没过人工角膜，所述的培养基被补充有10％牛血清，5％胎牛血清，2％葡聚糖(40,000MV)，和50ng/ml的bFGF。使得所述牛内皮细胞增殖7天，期间每隔一天加入浓度为50ng/ml的bFGF。在第七天去除培养基并加入2ml的氢氧化铵(蒸馏水中的20mM)在25℃处理5分钟。随后每次用2ml的PBS对人工角膜进行洗涤，洗涤10遍。

如前述制备的培养的人角膜内皮细胞悬液将被调节到终细胞密度为100,000细胞/ml。200μl等份的人细胞悬液将被加入到人工角膜中，其细胞的数目足以覆盖超过95％的表面区域。将大约0.2-0.5ml的1％的透明质酸钠层(Healon^Advanced Medical Optics，Santa Ana，CA)铺到细胞层上作为防护剂。将细胞角膜在37℃下的10％CO₂恒温箱中温育20分钟-24小时。聚合物角膜已准备被移植。

实施例8：用产生自牛角膜内皮细胞的细胞外基质涂覆聚合物以用于培养的人角膜内皮细胞的稀疏细胞接种

如先前实施例7中所描述，将生物聚合物角膜用牛内皮细胞沉积的细胞外基质涂覆。将人工角膜用11mm的环钻打孔并凹面向上地放置于35mm的组织培养皿中。如上所述的那样将培养的人角膜内皮细胞制备成细胞悬液。该细胞悬液的终密度被调节到每毫升20,000个细胞。将200μl等份(含有4000)的细胞加入到细胞外基质涂覆的聚合物角膜上。将样品在37℃下10％CO₂中温育，期间每隔一天对培养基进行换液。在第七天，人角膜内皮细胞将会增殖覆盖表面积的100％。随后用PBS对人工角膜洗涤3遍，备用于移植。

实施例9：用金刚石样碳(DLC)涂覆生物聚合物用于高密度接种培养的人角膜内皮细胞

将生物聚合物模塑成角膜形。随后使聚合物角膜进行碳等离子沉积过程。等离子装置由下列部分组成：由Lawrence Berkeley National Laboratory，Berkeley，CA生产的真空弧形等离子枪，其以重复脉冲方式运作从而将高电功率和热负荷相关问题最小化。装备有碳负极的等离子枪形成了纯碳等离子的密集卷流(plume)，其具有大约10eV的定向流能。将等离子注射入一个90°的磁性滤器(弯曲的电磁线圈)以从负极去除所有颗粒材料，随后将其转运过一个用来平化辐射形等离子分布的大的永久磁多孔构型。通过这种方式，会使得碳等离子均质地沉积在大的沉积区域范围内空间上。为了进一步增强膜的均匀性，将要被DLC涂覆的基质放置于缓慢旋转的盘上，从而消除了方位角不均一性。等离子枪、真空室和转盘组合被用来形成厚度为大约20-4000，优选200-400的DLC膜。等离子枪可以被用于涂覆皿，片，块，珠，微载体，凹和凸表面人工角膜，以及聚合物片。

DLC沉积后，用11mm的环钻将人工角膜打孔并用PBS洗涤3次。如前所述地制备培养的人角膜内皮细胞悬液，将终细胞密度调节到大约每毫升10⁶个细胞。将含有200,000细胞的200μl细胞悬液等份加入到人工基质的凹的涂覆的面，其细胞数量足以覆盖表面积的95％。将样品在37℃下10％CO₂中温育20分钟-24小时。人工角膜将备好用于移植。

实施例10：用金刚石样碳(DLC)涂覆生物聚合物用于人角膜内皮细胞的稀疏群体接种

将生物聚合物模塑成角膜形。随后如实施例9中所述的那样将碳等离子沉积到凹面上。将大约200μl等份的培养的人角膜内皮细胞以终浓度每毫升20,000细胞加入到人工基质中，所述的人工基质被置于35mm的组织培养皿中。将样品在37℃下10％CO₂中放置2小时。随后加入2ml含有补充了10％胎牛血清的DME-H16以及250ng/ml的bFGF的培养基。如实施例5中那样使人角膜内皮细胞增殖7天。当在第7天细胞覆盖人工角膜的100％表面区域时，用PBS洗涤聚合物角膜3遍，备用于移植。

实施例11：包埋有粘附或者生长促进剂并且具有接种在其凹面上的人角膜内皮细胞稀疏培养物的人工全厚度的角膜替代物

在此实施方案中，生物聚合物包埋有或者在其合成过程中在组成中已经掺入含有下列物质中一种或者多种的粘附混合物：浓度范围为0.1μg-500μg/ml聚合物凝胶的纤连蛋白，浓度范围为0.1μg-500μg/ml聚合物凝胶的层粘连蛋白，浓度范围为0.1μg-100μg/ml聚合物凝胶的RGDS，与聚卡波非缀合的浓度范围为1ng-500ng/ml聚合物凝胶的bFGF，与聚卡波非缀合的浓度范围为10ng-1000ng/ml聚合物凝胶的EGF，和浓度范围为1μg-500μg/ml聚合物凝胶的硫酸肝素。然后将生物聚合物模塑成所需的角膜形状，其具有等于正常健康人角膜的大约0.4-0.8mm厚度的厚度，该厚度取决于需要可更厚或者更薄。

将培养的人角膜内皮细胞以大约2000-2×10⁶细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml的密度引入到角膜替代物的凹面。含有DME-H16(补充了15％胎牛血清和250ng/ml的bFGF，并且细胞密度为20,000细胞/ml)的足量培养基被加入到位于25mm培养皿中的人工角膜基质的凹面。在大约2小时37℃下10％CO₂的温育后，向培养皿中加入2ml相同的培养基以完全浸没角膜等效物。每隔一天对培养基进行换液并且每次培养基换液后加入250ng/ml的bFGF。在7天到10天，人角膜内皮细胞将在人工角膜上达到一种汇合状态。用PBS洗涤人工角膜3遍，备用于移植。

为了治疗患者，本发明需要使用已知的外科手术技术从接受者患者去除损坏的角膜，植入人工全厚度角膜，并将所述角膜通过手术或者其它方法固定。

实施例12：包埋有粘附或者生长促进剂并且具有接种在其凹面上的人角膜内皮细胞稀疏培养物的人工半厚度的角膜替代物

在该实施方案中，生物聚合物包埋有或者在其合成过程中在其组成中已经掺入实施例1中详细描述的粘附混合物。该生物聚合物被模塑成所需的角膜形状，其厚度可达正常健康人角膜的大约0.4-0.8mm厚度的一半厚度，但是取决于需要其可以更厚或者更薄。大约2000-2×10⁶细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml的稀释密度的培养的人角膜内皮细胞被接种到人工基质的凹表面上，并且使细胞在大约7-10天长至汇合。用PBS洗涤该半厚度的人工角膜3遍，然后准备用于移植。

该实施方案中的手术步骤包括仅去除与损伤或者患病内皮相关的层状形式的接受者基质的内部的一半，随后用半厚度人工基质将其替代，所述的半厚度人工基质在其凹侧长有培养的人角膜上皮细胞，并用手术或者其它手段固定。

实施例13：包埋有粘附和/或生长促进剂并且具有接种在其凹面上的人角膜内皮细胞的饱和密度培养物的人工全厚度角膜替代物

在该实施方案中，生物聚合物包埋有或者在其合成过程中在其组成中已经掺入实施例1中详细描述的粘附混合物。该生物聚合物被随后模塑成所需的角膜形状，其具有等于正常健康人角膜的厚度。高密度(10⁴-5×10⁶细胞/ml)(10⁶细胞/ml)的培养的人角膜内皮细胞悬液被制备在含有补充了1-5％胎牛血清的DME-H16的培养基中。用11mm的环钻对人工角膜基质进行打孔。将大约200μl的等份细胞悬液加入到11mm直径的钮的凹侧。将样品在37℃下10％CO₂中培养20分钟-24小时。随后用PBS洗涤人工角膜基质3遍，备用于移植。

当角膜替代物准备好了以后，通过已知的外科手术技术实现将受损的角膜钮从接受者中的去除，随后用人工角膜将其替代，并用手术或者其它方法固定。

实施例14：包埋有粘附和/或生长促进剂并且具有接种在其凹面上的饱和密度的培养的人角膜内皮细胞的人工半厚度角膜替代物

在这个备选的实施方案中，生物聚合物包埋有或者在其合成过程中在其组成中已经掺入实施例1中详细描述的粘附混合物。该生物聚合物被随后模塑成所需的角膜形状，其具有达正常健康人角膜厚度一半的厚度。大约10⁴-5×10⁶细胞/ml，优选10⁶细胞/ml的高密度的培养的人角膜内皮细胞悬液被用来接种在先前实施例3中描述的11mm直径的被打孔的钮中。温育期过后，用PBS洗涤角膜替代物3遍，备用于移植。

该实施方案中的手术步骤包括仅去除与损伤或者患病内皮相关的层状形式的接受者基质的内部的一半，随后用半厚度人工基质将其替代，所述的半厚度人工基质在其凹侧长有培养的人角膜内皮细胞，并用手术或者其它手段固定。

实施例15：均一厚度为10-100微米的生物聚合物片作为将被递送到眼睛视网膜下空间以用于RPE细胞移植的培养的RPE细胞粘附的平台

均一厚度范围为大约1-1000微米，优选大约10-100微米的生物相容性聚合物薄片被培养的RPE细胞包被。为了实现这一步骤，将各种动物物种或者人源的培养的RPE细胞用STV溶液(生理盐水中0.05％的胰蛋白酶，0.02％的EDTA)从培养皿中分离。一旦RPE细胞变圆但是仍然粘附于培养片，就将大部分ST移出。随后将仍然保留STV薄膜的培养物在37℃下10％的CO₂中温育2-3分钟。通过加入5ml培养基(补充了15％胎牛血清的DME-H16)来去除RPE细胞，并在1ml吸管(pipetman)的协助下轻柔地冲洗。将细胞悬液的密度调节为大约2000-2×10⁶细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml。将足量的细胞加入到生物聚合物片的表面以形成25mm培养皿中的弯月面内侧。将样品静置在37℃下10％的CO₂中两小时。随后向皿中加入2ml培养基(补充了15％胎牛血清和100ng/ml的bFGF)以完全浸没其上粘附有RPE细胞的聚合物片。可以使该片在培养基中漂浮，但是将其用胶粘附到底部是可能的。每隔一天对培养基进行换液，并且在每次培养基换液后加入100ng/ml的bFGF。RPE细胞在7-10天会培养至汇合，这可以通过倒置显微镜观察来证实。随后将片切割成所需的尺寸用于覆盖视网膜下空间的目的移植区域。覆盖了RPE细胞的片将被吸入到套管中。折叠所述的片使RPE细胞位于片的顶面。在如前所述地制备植入点后，所述的片将被放置到受损的区域上。

在另一个实施方案中，培养的RPE细胞将被以高接种密度(2×10⁶细胞/ml)沉积到聚合物片上并且将样品在37℃下10％的CO₂中温育2-24小时。随后用大体积的BSS(每次冲洗10ml)广泛地(3-5次)冲洗片以去除没有被整合到单层内的多余的细胞。随后将片切割成所需的尺寸并如前所述地植入。

实施例16：用培养的RPE细胞涂覆10-100微米均一厚度的生物可降解的生物聚合物，其被用于移植到眼的视网膜下空间

将具有均一厚度为10-100微米的生物可降解的聚合物片放置于35mm的培养皿中。培养的RPE细胞被如前所述地制备成细胞密度为大约2000-2×10⁶细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml的悬液。将足够量的细胞悬液加入到片中以形成弯月面。在37℃下10％CO₂中温育大约2小时后，加入2ml含有补充了15％胎牛血清和100ng/ml的bFGF的DME-H16的培养基。如先前实施例15所述的那样使RPE层生长至汇合，并且进行RPE植入。或者，可以用饱和密度的培养的RPE细胞沉积该生物可降解的聚合物片，而后在37℃下10％CO₂的环境中温育2-24小时。温育后，用10ml BSS广泛地(5-10次)洗涤该片并随后如先前实施例15所述的那样植入。

实施例17：用培养的RPE细胞涂覆生物聚合物，该生物聚合物包埋有或者在其合成过程中已经掺入粘附和生长促进剂，用于移植入眼视网膜下空间的目的

在这个实施方案中，均一厚度为大约1-1000微米，优选大约10-100微米的生物聚合物包埋有、或者将在其合成过程中掺入粘附和生长促进剂，其包含下列的一种或者多种：浓度范围为1μg-200μg/ml聚合物凝胶的纤连蛋白，浓度范围为1μg-200μg/ml聚合物凝胶的层粘连蛋白，浓度范围为0.1μg-50μg/ml聚合物凝胶的RGDS，与聚卡波非缀合的浓度范围为40ng-500ng/ml聚合物凝胶的bFGF，与聚卡波非缀合的浓度范围为100ng-1000ng/ml聚合物凝胶的EGF，和浓度范围为0.1μg-100μg/ml聚合物凝胶的硫酸肝素。随后，如前所述，将培养的RPE细胞或者象以前那样以低接种密度(大约10⁴-5×10⁵细胞/ml，优选大约200,000细胞/ml)培养在聚合物片上7天，或者以饱和密度(大约2×10⁶细胞/ml)沉积到聚合物片上。随后如实施例15中所述的那样执行植入步骤，将RPE植入到眼的视网膜下空间。

实施例18：用培养的RPE细胞涂覆生物聚合物，该生物聚合物包埋有或者在其合成过程中已经掺入粘附和生长促进剂，用于移植入眼视网膜下空间的目的

在另一个实施方案中，均一厚度为大约1-1000微米，优选大约10-100微米的生物聚合物包埋有或者将在其合成过程中掺入粘附和生长促进剂，其包含下列的一种或者多种：浓度范围为1μg-200μg/ml聚合物凝胶的纤连蛋白，浓度范围为1μg-200μg/ml聚合物凝胶的层粘连蛋白，浓度范围为0.1μg-50μg/ml聚合物凝胶的RGDS，与聚卡波非缀合的浓度范围为40ng-500ng/ml聚合物凝胶的bFGF，与聚卡波非缀合的浓度范围为100ng-1000ng/ml聚合物凝胶的EGF，和浓度范围为0.1μg-100μg/ml聚合物凝胶的硫酸肝素。将培养的RPE细胞象先前实施例15所述的那样以大约2000-2×10⁶细胞/ml，优选大约20,000细胞/ml的低接种密度起始培养在所述生物可降解的聚合物片上7天，或者RPE细胞以饱和密度(大约2×10⁶细胞/ml)沉积到实施例15中也描述过的生物可降解的聚合物片上。如前所述进行植入步骤，来实现将RPE涂覆的聚合物片插入到眼的视网膜下空间。

已经对本发明进行了描述，对于本领域技术人员来说，很容易对本发明做出许多改进而不会背离由所附权利要求所限定的本发明的实质。

在此将所公开的美国专利，专利申请以及所有其它上述引用参考文献全部完整地结合到本说明书中作为参考。