葛根素在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用

摘要

本发明公开了葛根素在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。动物试验证明，葛根素对宫内膜异位症具有明显的治疗作用，更重要的是葛根素与danazol(丹那唑)相比，具有无可比拟的安全性。葛根素效果比较好，基本不会造成不良影响，因而具有子宫内膜异位症的治疗的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及葛根素的一种新的用途，尤其是在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。

背景技术

葛根素(puerarin)是从豆科植物野葛(puerarialobata)甘葛藤(puerarin thomsonii)根中提取的一种黄酮苷。在国内，1974年方起程等成功地提取了葛根素，1993年葛根素被卫生部批准用于临床。作为改善心脑血管循环的新药，因其毒性低，安全范围广，疗效好而成为临床上应用较多的药物。

子宫内膜异位症(endometriosis)是指有功能的子宫内膜出现于子宫腔内壁以外的部位。它引起的继发性痛经、不孕、慢性盆腔痛等症状严重影响患者的生活质量。尽管子宫内膜异位症为妇科良性疾病，但它具有侵袭性、广泛种植、易复发的特征，与恶性肿瘤十分相似。子宫内膜异位症是育龄妇女的一个常见病和多发病，发病率高达15％，并且发病率呈逐年上升趋势。虽然子宫内膜异位症的发现已有100多年的历史，并且多年来对子宫内膜异位症的发病机理进行了深入广泛的研究，但其确切的发病机理还不十分清楚。由于病因不明，目前治疗方法有多种，尚无一种药物能达到根治效果。因此，积极探索有效的治疗方法具有十分重要的意义。

临床和实验研究证实，子宫内膜异位症是激素依赖性疾病。子宫内膜异位症患者初潮前无发病，绝经后异位的内膜可逐渐萎缩被吸收，如使用雌激素替代疗法，此病还会复发。而切除卵巢或服用danozol使机体处于低雌激素状态，病灶可明显缩小，疗程结束后随着体内雌激素水平的恢复，有的病人也会复发。可见子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病。异位内膜可随卵巢周期性变化而出现周期性增生、分泌变化，但变化不一定与子宫腔内膜变化同步；卵巢雌/孕激素的周期性分泌，对异位内膜和在位内膜起同样的作用，但雌二醇可能起主导作用，特别是中期的雌二醇峰在刺激子宫内膜增厚的同时，也可刺激异位的内膜生长。因此子宫内膜异位症的激素治疗一般采用假孕疗法和假绝经疗法，能够取得一定的疗效。但由于此二醇水平的降低，导致患者出现类似更年期样的改变，带来了比较明显的副作用。同时此类药物价格昂贵，且长期服用导致肝功能损害，停药后又易复发，这些缺点限制了这些药物的应用。

植物雌激素为一系列来自植物的复合物，存在于大部分植物、水果和蔬菜中，植物雌激素的结构和甾体类激素相似，可与体内的雌激素受体结合，但其活性较人类雌激素弱10²-10⁵倍，有雌激素和抗雌激素双重效应，如何发挥何种效应取决于内源性雌激素水平和植物雌激素的种类和数量。葛根素是中药葛根的主要有效成分，是一种植物雌激素，具有弱雌激素样活性的化合物，能够和内源性雌激素竞争性地与雌激素受体结合形成雌激素受体复合物，占据了受体结合部位，阻止了体内雌激素分子与受体相结合，因而有效地减弱了靶细胞对雌激素的应答，而起到了抗雌激素作用。另外，植物雌激素与雌激素受体结合后，刺激性激素结合球蛋白的产生，并抑制酪氨酸酶和雌激素合成酶的活性，从而减轻雌激素的促细胞的增殖作用。

同时实验证实，葛根素的急性和亚急性毒性远小于合成的雌激素，不且不会在体内残留，保证了人体健康。由于子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病，而葛根素具有雌激素样和抗雌激素样作用，且其作用具有靶向性，

能否将葛根素用于治疗子宫内膜异位症，以拓展葛根素的应用领域，是人们所十分关注的课题。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开葛根素在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用，以拓展葛根素的应用领域，同时克服现有技术存在的上述缺陷。

发明人惊讶的发现，葛根素对子宫内膜异位症具有十分显著的疗效，可以用于制备治疗子宫内膜异位症药物。发明人同时发现，中小剂量葛根素(用药剂量：大鼠灌胃200mg/kg和60mg/kg体重天)对子宫内膜异位症具有明显的治疗作用，动物试验证明，本发明的葛根素大鼠静脉注射用量在200mg/kg时，没有任何毒副作用

所说的葛根素，采用市售产品，如陕西赛德高科生物股份有限公司的产品。

可以将葛根素与医药学上可接受的载体以组合物的形式，施加于需要治疗的对象，一般用量为60～200mg/公斤体重天，具体可综合各种情况等进行变化。

所说的载体是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂水等，葛根素与上述载体构成的组合物，组合物中，优选的含量为10～50mg/ml，可以通过口服的形式施加于需要这种治疗的对象。

动物试验证明，中小剂量葛根素对子宫内膜异位症具有明显的治疗作用，更重要的是葛根素与danazol相比，具有无可比拟的安全性。效果比较好，基本不会造成不良影响。因而葛根素具有治疗子宫内膜异位症的前景。

为了更好地理解本发明的实质，以下将用葛根素的药理试验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

具体实施方式

                            实施例1

水溶剂：

取1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将30000mg葛根素溶解，混合均匀，消毒配置成30mg/ml的水溶剂，装瓶制成成品。

                            实施例2

1材料：

1.1实验动物：

健康、性成熟未交配的SD雌性大鼠90只，鼠龄70d-80d，每只大鼠体重160-180g。大鼠由复旦大学医学院动物中心提供，由本院动物实验中心动物房，采用12h明12h暗交替饲养。

1.2主要器材：

Forma725型-80℃低温冰箱(美国)，BCD-248普通冰箱(上冻青岛海尔集团)，Olympus PM-10AD型显微镜(日本OLYMPUS公司)，高速低温离心机(德国Hereaus公司)，Access全自动微粒化学发光分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，Array 360特定蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特公司)，匀浆器，湿盒，恒温温箱，浸蜡箱，包埋箱，切片机，烘箱等。

1.3主要试剂：

细胞色素芳香化酶P450单克隆抗体(购自北京中山生物工程公司)，雌激素受体α单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，兔二抗(购自日本NICHIREI公司)，葛根素(≥98％，购自陕西赛德高科生物股份有限公司)；danazol(上海华联制药有限公司，100mg/粒)，TES缓冲液，全自动微粒子化学发光免疫分析仪(美国)，DAB，Tris(PH7.6)，1％盐酸，PBS缓冲液，10％福尔马林，甲醇，乙醇，脱钙剂，二甲苯，石蜡，苏木素-伊红(HE)染色剂等。

1.4方法：

1.4.1子宫内膜异位症模型的建立：

子宫内膜异位症模型根据(俞超芹，刘玉环，彭新萍，等．内异方对子宫内膜异位症IL-6、IL-10的调节作用．第二军医大学学报，1999，20(9)：621)文献俞超芹等方法制作：2％戊巴比妥钠0.3ml腹腔麻醉，开腹找到子宫，剪下右侧子宫长约3cm，行两端结扎包埋术，剥离剪下的子宫内膜，切成3块4mm×4mm大小的内膜片段，用4/0肠线分别固定于对侧子宫的中段、Y型分叉处和卵巢附近。另设假手术组，即按上述方法剪下右侧子宫长约3cm，行端端结扎包埋术，将3块4mm×4mm大小的自体脂肪用4/0无损伤缝线分别固定于对侧子宫的中段、Y型分叉处和卵巢附近。4周后麻醉剖腹探查，见移植的内膜组织体积增大，呈透明结节状、囊状，出现澄清液体集聚，被结缔组织覆盖并有血管形成。

1.4.2分组处理：

将模型大鼠随机分为5组：

1)非治疗组：双蒸水灌胃，每日2ml/只；

2)实施例1的葛根素水溶剂大剂量组：灌胃，每日600mg/kg；

3)实施例1的葛根素水溶剂中剂量组：灌胃，每日200mg/kg；

4)实施例1的葛根素水溶剂小剂量组：灌胃，每日60mg/kg；

5)danazol组：灌胃，每日400mg/kg，共4周；

另外，假手术组：双蒸水灌胃，每日2ml/只；

以上6组均在同等条件下饲养4周。在饲养过程中丢失10只大鼠，病死2只，灌胃不当死亡4只，故实验结束时余74只大鼠。

2观察指标与方法：

2.1子宫系数、卵巢系数、异位灶重量以及处理组对异位灶的抑制率：

1)子宫系数＝子宫湿重mg/体重kg

2)卵巢系数＝卵巢湿重mg/体重kg

3)异位灶生长抑制率＝(非治疗组平均异位灶重量-治疗组平均异位灶重量)/非治疗组平均异位灶重量×100％

2.2肝、肾、骨骼以及子宫内膜、卵巢、异位内膜组织的病理形态学：

2.2.1取材和处理：

根据阴道涂片，分别于治疗结束动情前期断头处死。

1)立即取部分肝、肾、卵巢、子宫内膜、异位内膜组织，用10％福尔马林固定。

2)另取部分卵巢、子宫内膜、异位内膜组织立即冻存于-80℃低温冰箱中。

3)用脱钙剂将骨骼脱钙48小时后，自来水冲洗2小时，再次置入10％福尔马林中固定。

2.2.2石蜡标本制备：

将10％福尔马林固定的肝、肾、骨骼、卵巢、子宫内膜、异位内膜组织制成病理切片(第二军医大学附属长海医院病理科协助完成)。

1)第一步：脱水：将组织置于70％乙醇浸泡30分钟，然后置于90％乙醇浸泡30分钟，其次置于95％乙醇浸泡30分钟，再次置于95％乙醇浸泡30分钟，最后置于100％乙醇浸泡30分钟。

2)第二步：透明：将脱水后的标本置于二甲苯浸泡30分钟，重复两次，直至肉眼观察组织呈透明状，完成透明。

3)第三步：浸蜡：将透明后的标本放入石蜡，再置于浸蜡箱，温度调至56～58℃进行浸蜡处理30分钟，重复三次，完成浸蜡。

4)第四步：包埋：将浸蜡处理过的组织取出放入充满熔融石蜡的包埋框，使其冷却从而形成铸块，完成包埋。

5)第五步：切片：用AO切片机将铸块切成5微米的切片。

2.2.3苏木素-伊红染色：

1)将切片脱蜡至水。

2)甲醇固定15分钟。

3)95％乙醇处理30秒。

4)自来水30秒。

5)苏木素染液染色5分钟。

6)自来水2分钟。

7)75％盐酸乙醇溶液分化30秒。

8)自来水2分钟。

9)温热水(50℃)5分钟。

10)单蒸水1分钟。

11)95％乙醇溶液1分钟。

12)酸化伊红乙醇2分钟。

13)95％酒精和纯酒精脱水各2次，每次2分钟。

14)二甲苯透明10秒。

15)中性树胶封片，完成封固。

16)干燥后镜下观察，随机挑选视野，拍照。

2.3血清磷、钙含量测定：

2.3.1取材：

断头后立即用不抗凝试管收集血液，室温静置2小时后，3000r/分钟离心15分钟，取血清。

2.3.2实验方法

用偶氮砷III比色自动生化分析仪测定血清钙的含量，用紫外分光光度自动生化分析仪测定血清磷的含量(长海医院检验科协助完成)。

2.4卵巢、子宫内膜、异位子宫内膜与血清雌二醇水平测定：

2.4.1取材：

取卵巢、子宫内膜与异位内膜组织标本，称重，将组织剪碎，加入冰TES缓冲液1ml，4℃冰浴45s，4℃条件下105000g/分钟离心60分钟，分别吸取上清液，置低温下待侧。

2.4.2实验方法：

用全自动微粒子化学发光免疫分析法检测血清、子宫、卵巢和异位灶中雌二醇的水平(中国科学院上海药物研究所协助完成)。

2.5雌激素受体α、细胞色素芳香化酶P450免疫组织化学测定：

2.5.1实验方法：

1)分别将子宫内膜、卵巢和异位灶石蜡切片用二甲苯脱腊后，用75％乙醇固定30分钟。

2)用含0.5％过氧化氢的甲醇处理后，进行抗原修复。

3)分别与稀释成1∶100的抗体-鼠抗人ERα单克隆抗体、鼠抗人芳香化酶单克隆抗体-在4℃孵育15小时。

4)Tris(PH7.6)冲洗3次后，滴加稀释为1∶500的过氧化物酶标记的兔抗体γ-球蛋白(二抗)，湿盒室温下孵育4h。

5)用Tris(PH7.6)冲洗3次，DAB-H202显色10分钟后，置入自来水中终止反应。

6)苏木素中衬染1分钟，自来水冲洗。

7)用1％盐酸分化后，自来水冲洗。

8)酒精梯度脱水，吹干。

9)滴加树胶封片。

10)光学显微镜下随机选取视野，计数每个视野的细胞染色数目。并计算细胞的染色率。

11)PBS代替I抗作阴性对照，已知阳性片为阳性对照。

2.5.2结果判定方法：

阳性染色为棕黄色颗粒，定位于细胞浆中，观察染色切片中10个具有代表意义的高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均数作为结果。其中阳性染色细胞数＜25％为(+)，25％-50％为(++)，＞50％为(+++)，无阳性细胞为(-)。

2.6统计学处理：用SPSS11.0统计软件进行统计。

细胞色素芳香化酶P450和ERα阳性率的数据属构成比资料，采用X²检验，计量资料采用单因素方差分析。

结果：

1子宫系数、卵巢系数、异位灶重量以及处理组对异位灶的抑制率：

    表1子宫系数、卵巢系数、异位内膜重量以及处理组对异位内膜的抑制率

                                                        (x±s)

   组别   动物数   n  剂量   mg/kg  子宫系数mg/g   体重  卵巢系数mg/g   体重  异位灶湿重   g  抑制率   ％  非治疗组  假手术组  danazol组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  11  10  11  14  15  13    400  600  200  60  1.204±0.490  1.255±0.219  1.472±0.473  1.330±0.403  1.131±0.247  1.383±0.349  0.401±0.069  0.395±0.129  0.411±0.130  0.380±0.175  0.360±0.081  0.402±0.133  0.061±0.049  /  0.022±0.020^#  0.028±0.025^#  0.028±0.020^#  0.009±0.019^#  /  /  64.20  54.19  54.35  85.22

与非治疗组相比，#P＜0.001。

检验结果提示：葛根素大、中、小剂量组、danazol组、假手术组及非治疗组子宫系数之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。葛根素大、中、小剂量组、danazol组、假手术组及非治疗组卵巢系数之间的差异均无统计学意义(P＞0.05)。葛根素大、中、小剂量组异位灶重量均显著低于非治疗组(P＜0.001)，但与danazol组之间均无显著差异(P＞0.05)。而葛根素小剂量组异位灶重量低于其它治疗组，但统计学上无明显差异(P＞0.05)。大、中、小剂量的葛根素和danazol对异位灶均有较强的抑制作用，但各治疗组之间的抑制作用无明显差异(P＞0.05)。

2肝、肾和骨骼病理形态学：

2.1肝脏：

1)假手术组：小叶结构完好，肝窦清晰，肝细胞呈放射性排列，大小均匀，单核，核浆比例正常，胆管上皮细胞呈立方型。

2)葛根素大剂量组：与假手术组基本相似。

3)葛根素中剂量组：与假手术组基本相似。

4)葛根素小剂量组：与假手术组基本相似。

5)非治疗组：与假手术组基本相似。

6)danazol组：肝细胞脂肪样变性，胞浆透明度增加，细胞胞浆不清，部分细胞核崩解，肝板破坏，汇管区增粗。

2.2肾脏：

1)假手术组：肾盂上皮细胞呈假复层(适合功能要求)，上皮完整。

2)葛根素大、中、小剂量组、非治疗组以及danazol组与假手术组肾脏形态无明显改变。

2.3骨骼：

1)假手术组：骨小梁粗壮，排列整齐并连接成网，间隙较小，形态结构完整，骨小梁密度、面积正常，无减少。

2)非治疗组：与假手术组基本相似。

3)葛根素大剂量组：骨小梁变细，骨皮质变薄，形态结构性差，有扭曲和断裂，小梁间间隙增大，骨小梁密度和面积减少。

4)葛根素中剂量组：骨小梁稍细，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，骨小梁密度、面积无明显减少。

5)葛根素小剂量组：与假手术组基本相似。

6)danazol组：骨小梁稍细，排列尚整齐并连接成网，部分区域骨小梁间隙略增大，骨小梁密度、面积无明显减少。

3血清磷、钙含量：

                    表2血清磷、钙含量

                                        (x±s，n＝6，mmol/ml)

  组别  血清磷  血清钙  非治疗组  假手术组  danazol组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  2.157±0.196  2.183±0.140  2.075±0.135  2.127±0.130  2.152±0.298  2.027±0.292  2.198±0.190  2.282±0.175  2.127±0.287^#  1.983±0.245^#*  2.168±0.148  2.400±0.194

与假手术组相比*P＜0.03；与葛根素小剂量组相比#P＜0.05。

检验结果提示：葛根素大、中、小剂量组、danazol组、假手术组以及非治疗组之间血清磷含量均无显著差异(P＞0.05)；葛根素大剂量组的血清钙含量与假手术组有显著差异(P＜0.03)，与非治疗组和danazol组相比血清钙含量无明显差异(P＞0.05)；葛根素中、小剂量组血清钙含量与假手术组、非治疗组比较均无显著差异(P＞0.05)；葛根素大剂量组、danazol组血清钙的含量明显少于葛根素小剂量组(P＜0.05)；葛根素中剂量组血清钙的含量与葛根素小剂量组、danazol组比较无显著差异(P＞0.05)。4血清、子宫内膜、卵巢及异位内膜中雌二醇水平：

                表3血清、子宫内膜、卵巢及异位内膜中的雌二醇水平

                                                (x±s，n＝6，pg/ml)

  组别  血清  子宫内膜  卵巢  异位内膜  非治疗组  假手术组  danazol组  葛根素大剂量  葛根素中剂量  葛根素小剂量  31.167±7.834  20.833±4.916^△    19.167±3.971^#  5.833±3.125^#▲    22.833±5.636^*  19.500±1.049^#  7.862±3.628^*  8.764±9.017  6.273±3.705  9.023±2.292  2.961±2.026  2.461±1.306  7.729±3.557  7.737±5.915  1.325±1.531^△    2.433±1.873^△    3.657±2.054^△    2.947±1.845^△  29.345±14.615  /  11.282±5.100^#  18.217±5.416^△    16.497±9.251^*  8.218±0.528^#

与非治疗组相比，△P＜0.05；与非治疗组相比，#P＜0.001；与非治疗组相比，*P＜0.01；与假手术组相比，▲P＜0.001。

检验结果提示：非治疗组血清中雌二醇水平显著高于假手术组和其他治疗组(P＜0.003)，葛根素大剂量组的血清雌二醇水平显著降低，明显低于假手术组(P＜0.001)，葛根素中、小剂量组以及danazol组的血清雌二醇水平也明显低于非治疗组，但与假手术组相比无明显差异(P＞0.05)。非治疗组与其他各组之间的子宫内膜雌二醇水平均无显著差异(P＞0.05)。非治疗组卵巢雌二醇水平与假手术组之间无明显差异(P＞0.05)，葛根素三个剂量组以及danazol组的卵巢雌二醇水平明显下降，且与非治疗组、假手术组之间的差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而葛根素三个剂量组之间以及与danazol组的卵巢雌二醇水平相比均无明显差异(P＞0.05)。葛根素三个剂量组及danazol组异位内膜中雌二醇水平与非治疗组相比均明显下降(P＜0.05)，葛根素三个剂量组之间的异位内膜中雌二醇水平也无明显差异(P＞0.05)。非治疗组的异位内膜中雌二醇水平明显高于子宫内膜雌二醇水平(P＜0.01)。

5卵巢、子宫内膜组织形态观察：

5.1卵巢组织形态：

1)假手术组：镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，颗粒细胞呈多层(多为6-8层)，形态完整、排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列。

2)葛根素大剂量组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

3)葛根素中剂量组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

4)葛根素小剂量组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

5)非治疗组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

6)danazol组：卵巢形态均无明显改变，与假手术组基本相似。

5.2在位子宫内膜组织形态：

1)假手术组：在位内膜上皮细胞形态规则，呈正常高柱状，内膜腺体数量较多，腺上皮细胞和间质细胞形态规则。

2)葛根素大剂量组：内膜上皮细胞发生肿胀，出现空泡、变性。内膜腺体直径小，数量少，间质细胞也少，内膜上皮较薄。

3)葛根素中剂量组：在位内膜上皮细胞形态规则，上皮呈正常高柱状，内膜腺体、腺上皮细胞以及间质细胞基本没改变。

4)葛根素小剂量组：与假手术组基本相似。

5)非治疗组：内膜上皮细胞层次较乱，上皮增生，内膜腺体、腺上皮细胞以及间质细胞基本没改变。

6)danazol组：在位内膜上皮细胞呈扁平立方形，并且出现了较多的上皮细胞残迹，内膜腺体数量少，间质细胞少，内膜上皮较薄。

5.3异位子宫内膜组织形态：

1)非治疗组：异位内膜上皮细胞形态规则，呈正常高柱状，内膜腺体较多，但直径较小，间质细胞较多。

2)葛根素大剂量组：异位内膜腺上皮细胞形态改变，发生肿胀，并出现空泡、变性，间质细胞形态改变，数量减少。

3)葛根素中剂量组：异位内膜上皮细胞层次紊乱，细胞出现空泡、变性，内膜腺体数量减少，间质细胞也较少。

4)葛根素小剂量组：异位内膜上皮细胞萎缩，出现了较多的上皮细胞残迹，空泡较多，内膜腺体非常少，间质细胞也较少。

5)danazol组：异位内膜上皮细胞呈扁平立方形，并且出现了较多的上皮细胞残迹，内膜腺体少，间质细胞较少，并出现了许多空泡。

6雌激素受体α的表达：

6.1卵巢雌激素受体α的表达：

                    表4雌激素受体α在卵巢的表达

                                                        (x±s，n＝6)

  组别  +++  ++  +  -  阳性率(％)  假手术组  非治疗组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  danazol组  1  2  1   2  1  2  1  3  2  3   2  2  2  3   4  1  1   1  1  1  83.3  83.3  100  83.3  83.3  83.3

检验结果提示：葛根素大、中、小剂量组、danazol组、假手术组以及非治疗组之间卵巢雌激素受体α的表达无明显差异(P＞0.05)。

6.2在位内膜雌激素受体α的表达：

                表5在位内膜中雌激素受体α的表达

                                                        (x±s，n＝6)

  组别  +++  ++  +  -  阳性率   假手术组  非治疗组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  danazol组   2  3  3  3  4  3   1  2  2      2    2  1  2   1  1  1  1  1  1  (％)  83.3  83.3  83.3  83.3  83.3  83.3

检验结果提示：葛根素大、中、小剂量组、danazol组、假手术组以及非治疗组之间在位内膜雌激素受体α的表达无明显差异(P＞0.05)。

6.3异位内膜雌激素受体α的表达：

                    表6雌激素受体α在异位内膜的表达

                                                        (x±s，n＝6)

  组别  +++  ++  +  -  阳性率(％)  非治疗组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  danazol组  3   3  3  1  2  3  2   4   2   2   1  1  1  1  1  83.3  83.3  83.3  83.3  83.3

检验结果提示：葛根素大、中、小剂量组、danazol组以及非治疗组之间异位内膜雌激素受体α的表达均无明显差异(P＞0.05)。

7细胞色素芳香化酶P450的表达：

7.1在位内膜细胞色素芳香化酶P450的表达：

             表7细胞色素芳香化酶P450在在位子宫内膜的表达

                                                        (x±s，n＝6)

  组别  +++  ++  +  -  阳性率(％)  假手术组  非治疗组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  danazol组   2   3  2  3   2  2    1   2  2  1    6   2  2  4  2  0  100  66.7^☆    66.7^☆    33.3^△    66.7^☆

与非治疗组相比△P＜0.05；与假手术组相比☆P＜0.05。

检验结果提示：细胞色素芳香化酶P450在正常子宫内膜中无表达，在子宫内膜异位症组的在位内膜中均有表达。葛根素小剂量组在位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达与非治疗组相比有明显差异(P＜0.05)，而与假手术组相比差异不明显(P＞0.05)；葛根素大、中剂量组、danazol组在位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达与非治疗组相比无明显差异(P＞0.05)，与假手术组相比差异明显(P＜0.05)；葛根素大、中、小剂量组之间的在位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达无明显差异(P＞0.05)；葛根素大、中、小剂量组与danazol组相比，在位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达也无明显差异(P＞0.05)。

7.2异位内膜细胞色素芳香化酶P450的表达：

            表8细胞色素芳香化酶P450在异位子宫内膜的表达

                                                           (x±s，n＝6)

  组别  +++  ++  +  -  阳性率(％)  非治疗组  葛根素大剂量组  葛根素中剂量组  葛根素小剂量组  danazol组  4  1  1  1   2  3  3   2   1  1   3   1  1  5  1  100  83.3  83.3  16.7^★#  83.3

与非治疗组相比★P＜0.001；与葛根素大、中剂量组、danazol组相比#P＜0.05。

检验结果提示：细胞色素芳香化酶P450在子宫内膜异位症组的异位内膜均有表达。葛根素小剂量组异位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达与非治疗组相比有明显差异(P＜0.001)；葛根素小剂量组异位内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达与葛根素大、中剂量组、danazol组相比，差异显著(P＜0.05)。葛根素大、中剂量组、danazol组异位子宫内膜中细胞色素芳香化酶P450的表达与非治疗组相比无明显差异(P＞0.05)。

讨论：

1子宫内膜异位症动物模型的选择：

目前子宫内膜异位症的发病机制尚不明了，药物治疗和术后复发率较高。由于伦理学问题，很难在人体中进行子宫内膜异位症的对照研究，更不能反复进行创伤性检查。为了研究子宫内膜异位症的发病机理和治疗效果，需要建立子宫内膜异位症的理想模型。理想的动物模型应该尽可能与人类疾病相似，且规范化，能够准确地再现该疾病的特点，能可靠地反映疾病的发展变化规律，还应对临床有适用性和可控性，复制时经济易行^[23]。子宫内膜异位症常用的动物模型有猴、狒狒、兔和大鼠等。猴和狒狒像人一样有月经，所以是最理想的动物模型。但由于价格、饲养及实验动物缺乏等方面的问题，难以在实验室广泛使用。而兔无月经，又无动情周期，无自发性排卵，其生育特点也不同于人类，与人体情况相差较大。近年来，许多研究以大鼠作为子宫内膜异位症的动物模型，大鼠虽无月经，但其动情周期与人月经周期相似，有一定规律性。许多研究表明，实验性大鼠子宫内膜异位症模型可以反映人类子宫内膜异位症的病理生理过程^[27]。我们在大鼠动情周期的动情期制作子宫内膜异位症模型，利用阴道涂片观察其动情期，并且在此期移植的子宫内膜成活率高，模型使用可靠。

本研究观察到子宫内膜异位症大鼠异位子宫内膜移植物体积增大，并有液体积聚，说明其具有活性。对照组大鼠建模后4周移植物的体积和外观与治疗结束时相比无明显差异，表明子宫内膜移植物的生长在移植后的4周已基本稳定，这与Katsuki的研究结果符合。

研究证明，人正常子宫内膜无细胞色素芳香化酶P450表达，而子宫内膜异位症患者的在位和异位内膜均有细胞色素芳香化酶P450表达。而本研究中也发现子宫内膜异位症大鼠的在位和异位子宫内膜中均有细胞色素芳香化酶P450的表达，而假手术组子宫内膜却无细胞色素芳香化酶P450的表达，证实了大鼠子宫内膜异位症与人子宫内膜异位症的病理生理有一定的相似性。

2子宫内膜异位症异位灶雌激素的来源：

据研究发现，局部异位灶由于以下原因导致雌激素水平相对增高：1)异位内膜特异表达的转录刺激因子ST-1与cAMP激活启动区2位点结合后激活异位内膜芳香化酶基因表达信号系统；本实验已提示异位灶中有芳香化酶P450的表达。2)异位内膜分泌的前列腺素PGE₂通过cAMP依赖受体Ep2诱导异位内膜间质细胞芳香化酶的表达。雌激素又刺激内膜间质细胞环氧化酶2表达，促进PGE₂合成，而PGE₂是已知芳香化酶最强的诱导剂，因此异位病灶局部形成一个正反馈环，不断合成雌激素，刺激异位内膜不断生长。3)雌酮和雌二醇可以相互转化，雌二醇转化雌酮由17β-HSD-2作用，雌酮经17β-HSD-1作用而转化为雌二醇。而异位内膜异常表达17β-HSD-1，而17β-HSD-2缺乏，其结果是异位内膜的雌二醇水平高于宫腔内膜，有利于异位内膜生长。

本研究发现，子宫内膜异位症动物模型外周血、卵巢雌二醇水平明显高于假手术组，子宫内膜异位症模型的异位灶雌二醇水平明显高于在位内膜，且在位内膜与异位灶中均存在芳香化酶P450的表达。上述结果提示，异位病灶雌激素的来源可能有以下几种途径：(1)卵巢雌二醇合成增多。卵巢利用血液中胆固醇通过若干酶的催化作用，合成雄烯二酮(A)和睾酮(T)。排卵前，在促卵泡激素(FSH)作用下卵泡成熟，颗粒细胞内芳香化酶受FSH活化，雄烯二酮和睾酮经芳香化而转化成雌酮和雌二醇。本实验证实子宫内膜异位症模型大鼠卵巢中方香化酶P450的活性增强，促进了雄烯二酮和睾酮向雌酮和雌二醇的转化。(2)异位病灶的自分泌和旁分泌也是雌激素的一个来源。实验表明，异位病灶中有较强的芳香化酶P450的表达，可在局部合成雌激素，促进异位内膜生长。

3子宫内膜异位症异位子宫内膜雌激素受体的研究：

雌激素通过与靶细胞内的雌激素受体α结合，促进或抑制一些蛋白的表达，诱发一系列的生物效应。子宫内膜异位症是雌激素依赖性疾病，异位灶的生长与雌二醇息息相关，我们推测异位灶除雌激素水平升高以外，其雌激素受体α表达是否亦增强，导致其对雌激素敏感性增强。故我们测定了局部雌激素受体α，研究其在异位子宫内膜中的表达。

实验结果提示，子宫内膜异位症大鼠异位病灶中确实存在雌激素受体α，但是与正常对照的子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜的雌激素受体α表达没有差异。经葛根素治疗后，在位和异位内膜雌激素受体α的表达也没有明显改变，说明子宫内膜异位症异位病灶中的雌激素受体α表达并没有增强。因市场上没有适用于大鼠标本的雌激素受体β抗体，所以本实验没有对这种抗体进行相同的研究。

4葛根素治疗子宫内膜异位症的疗效及机理：

子宫内膜异位症大鼠用三种剂量的葛根素治疗4周后，移植物体积缩小，内膜呈萎缩状态。有部分移植物甚至消失，而小剂量葛根素的治积效果更佳，大部分大鼠的移植物消失。

葛根素治疗子宫内膜异位症的机理，有以下几种可能：一是葛根素的抗雌激素作用。葛根素竞争性地与雌激素受体结合，占据了受体结合部位，阻止了体内雌激素分子与受体相结合，因而有效地减弱了靶细胞对雌激素的应答，从而抑制了异位内膜的生长。

其次，葛根素抑制了异位病灶雌激素的自分泌。

我们发现，子宫内膜异位症大鼠异位灶雌二醇水平明显高于在位内膜组织，而葛根素治疗后异位灶雌二醇水平显著下降，提示葛根素抑制了异位灶雌二醇的分泌，而其抑制异位灶雌二醇的自分泌与减少异位灶中芳香化酶P450的表达有关。研究显示，子宫内膜异位症大鼠的在位和异位子宫内膜中均有细胞色素芳香化酶P450的表达，而正常子宫内膜中却无细胞色素芳香化酶P450的表达。提示子宫内膜异位症局部雌激素产生较正常子宫内膜增加，进一步证实子宫内膜异位症的存在与雌激素密切相关。小剂量葛根素治疗后，子宫内膜异位症大鼠的异位病灶中细胞色素芳香化酶P450的表达均明显减弱，提示了葛根素通过抑制细胞色素芳香化酶P450的表达，使局部雌激素生成减少，从而抑制了异位内膜的生长。

第三，葛根素能够抑制卵巢中雌激素的合成。实验结果表明，小剂量葛根素明显减弱了卵巢的细胞色素芳香化酶P450的表达，降低了卵巢雌二醇的合成，进而有效地抑制异位内膜的生长。

5葛根素治疗子宫内膜异位症的副作用：

葛根素能够有效地治疗子宫内膜异位症，但它是否有一定的副作用呢？对此，我们做了以下的研究：(1)卵巢。组织病理学观察：卵巢形态学基本无改变；而卵巢系数也与假手术组没有明显差别，提示了葛根素除了降低卵巢雌二醇合成外，对卵巢没有明显毒性作用。(2)子宫及子宫内膜。葛根素治疗组的子宫系数与假手术组基本没有差别；组织病理学观察：葛根素中、小剂量组的子宫内膜腺上皮细胞形态规则，内膜腺体比较多，腺上皮细胞呈正常高柱状，间质细胞基本没改变；葛根素大剂量组的子宫内膜腺上皮细胞发生肿胀，出现空泡、变性，内膜腺体直径小，数量少，间质细胞也少，内膜上皮较薄。这些现象与经danazol治疗后子宫内膜的改变基本相似。提示了大剂量的葛根素对子宫内膜具有一定的不良影响。(3)肝肾。组织形态学观察：未发现葛根素对肝肾有不良影响。(4)骨骼：临床与实验研究均已证实，内源性雌激素水平的降低可导致骨质疏松的发生，而本实验结果提示，大剂量葛根素治疗后，出现骨质疏松的表现：骨小梁变细，骨皮质变薄，形态结构性差，有扭曲和断裂，小梁间间隙增大，骨小梁密度和面积减少。而未发现中小剂量葛根素对骨骼产生不良的影响：骨小梁粗壮，排列整齐并连接成网，间隙较小，形态结构完整，骨小梁密度，面积正常，无减少。这可能因为大剂量的葛根素与雌激素受体竞争结合力比较强，大大地降低了内源性雌激素的作用，抑制了骨中钙质的沉着，导致骨质丢失，引起骨质疏松。为了进一步了解葛根素对骨骼的影响情况，我们又对血清磷和血清钙的测定，发现葛根素大、中、小剂量组血清磷的含量与danazol组、假手术组以及非治疗组相比无明显变化；但葛根素大剂量组的血清钙含量虽然与非治疗组相比无明显改变，却低于假手术组，并且血清钙的含量明显少于葛根素小剂量组，danazol组血清钙含量也低于于葛根素小剂量组，这可能因为大剂量的葛根素抑制了内源性雌激素，血中雌激素减少，引起血清钙的降低。而danazol是一种17α乙炔睾丸酮的衍生物，它通过对垂体促性腺激素的抑制，使FSH、LH水平下降，或直接抑制产生卵巢类固醇的酶，抑制卵巢类固醇的产生，造成持续性卵巢功能低落，也会导致内源性雌激素水平的降低，进一步引发血清钙的减少。

总之，中、小剂量的葛根素既能够有效地治疗子宫内膜异位症，并且没有明显的副作用；而大剂量的葛根素不仅抑制了异位内膜组织，也使正常子宫内膜的生长受到了抑制，而且还对骨骼产生了不良影响，引起了骨质疏松。

另外，danazol虽然广泛应用于治疗子宫内膜异位症，但许多学者的认为其可引起轻度或中度肝细胞损害，对肝功能、脂代谢方面造成不利影响，在本实验中也已证实其对肝脏有损害。

结论

本课题研究了植物雌激素对大鼠子宫内膜异位症治疗作用。葛根素能够抑制子宫内膜异位症大鼠异位灶的生长，其作用机制可能为：1.与雌激素受体α竞争性结合，阻断了内源性雌二醇的作用；2.减弱异位内膜细胞色素芳香化酶P450的表达，抑制了异位内膜的雌激素自分泌；3.减弱卵巢细胞色素芳香化酶P450的表达，降低了卵巢雌激素的合成，有效地减弱了靶细胞对雌激素的应答，从而抑制了异位内膜的生长。

研究表明，中小剂量葛根素治疗子宫内膜异位症，效果比较好，基本不会造成不良影响，是一种值得进一步开发研究的药物。