荧光分子探针及其在过渡金属和重金属离子检测中的应用

摘要

本发明涉及一种荧光分子探针及其在过渡金属和重金属离子识别和检测中的应用，该荧光分子探针不仅具有抗过渡金属和重金属离子对荧光基团的淬灭性能和良好的选择性，而且还能在各种溶液，特别是在含水溶液中对非d10电子结构的过渡金属和重金属离子选择性荧光增强识别，本发明的荧光分子探针可以通过分子中的反应性基团将其固载于聚合物或固体表面，实现器件化，用于上述目的的荧光传感器器件的关键部分，本发明可应用在生物组织及细胞等微环境中的钴离子检测，也可用于水、污水以及水溶液、乳液、悬浮体系等中的钴离子检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光分子探针，包括其设计与合成，本发明还涉及一种该荧光分子探针在过渡金属和重金属离子识别和检测中的应用。

背景技术

荧光分子探针技术应用于过渡金属及重金属离子的检测，可实现微环境中的原位检测。但通常由于过渡金属及重金属离子可通过自旋-轨道耦合以及电子或能量转移使荧光基团的荧光淬灭，导致检测灵敏度下降。另外，金属离子及荧光分子探针的识别基在水溶液中的溶剂化倾向强于有机溶剂，使荧光分子探针与被检测物种的结合性能下降，因此，许多探针分子只在有机溶剂中才表现出识别作用。但实际上能够在水溶液中表现出识别性能的荧光分子探针才具有广泛的实用价值。

设计、合成能够在水溶液中具有选择性的，并能实现荧光增强识别的荧光分子探针目前还是一项具有挑战性的研究工作。已报道的在含水溶液中对过渡金属和重金属离子荧光增强识别的荧光分子探针几乎都是检测具有d¹⁰电子结构的金属离子的探针。因此，设计并合成一类能够在各种溶液，特别是在含水溶液中对非d¹⁰电子结构的过渡金属和重金属离子选择性荧光增强识别的荧光分子探针是当前本领域的一项重要课题。我们曾在《J.Am.Chem.Soc》.2004，125，2272-2273报道了2，6-二氨甲基吡啶为识别基团的荧光分子探针能够选择性荧光增强识别汞离子，本发明是该项研究的继续。

发明内容

本发明的发明目的首先是设计合成一种不仅具有抗过渡金属和重金属离子对荧光基团的淬灭性能和良好的选择性，而且还能在各种溶液，特别是在含水溶液中对非d¹⁰电子结构的过渡金属和重金属离子选择性荧光增强识别的荧光分子探针，本发明的另一个目的是提供一种该荧光分子探针在过渡金属和重金属离子识别和检测中的应用技术。

本发明荧光分子探针的具有以下结构通式：

通式中：

R₁、R₂、R₃代表氢、烷基、羟烷基、羧烷基、聚氧乙烯基、芳基、芳烷基或无取代基。

X₁、X₂代表氮原子或氧原子。

X₃代表氮原子、硫原子、氧原子、磷原子或两端有代的亚烷基二胺、二硫衍生物。

F₁和F₂代表两个荧光发色基团。

Q₁、Q₂代表具有1-10个碳原子的亚烷基或双亚烷基。

在上述通式的荧光分子探针中，烷基还可以是具有1-20个碳原子的直链或异构烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基等短链烷基；也可以是十二烷基、十八烷基等长链烷基，长链烷基有助于提高探针的脂溶性。羟烷基是指具有1-12个碳原子的羟烷基，如羟甲基、羟乙基、羟丙基、二羟基丙基、4-羟基丁基等，短链羟烷基有利于提高探针分子在极性溶剂中的溶解性。羧烷基是指具有1-12个碳原子的羧烷基，如羧甲基、羧乙基、羧丙基等，羧烷基引入探针分子以碳原子数少于7的短链衍生物最好。聚氧乙烯基是指聚合度在1-40的聚氧乙烯基，如二聚氧乙烯基、三聚氧乙烯基，四聚氧乙烯等，聚氧乙烯基团的引入有利于提高探针分子的水溶性。芳基是指苯、萘、蒽、芘、吡啶、萘酰亚胺、苯并呋咱等。芳烷基是指苯甲基、呋喃甲基、萘甲基、蒽甲基、芘甲基、噻吩甲基、喹啉甲基、邻菲啰啉甲基、吡啶甲基、苯乙基、呋喃乙基、萘乙基、蒽乙基、芘乙基、噻吩乙基、喹啉乙基、邻菲啰啉乙基、吡啶乙基、N-乙基萘酰亚胺、N-乙基苝四酸二酰亚胺、4-乙氨基萘酰亚胺等、其中含杂原子的芳烷基有助于改善识别选择性，具有荧光发射功能的芳烷基有助于改善识别灵敏性。

在上述通式的荧光分子探针中，荧光基团是指4-氨基-1，8-萘酰亚胺、萘、蒽、芘、苯并呋咱、3，4，9，10-苝四酸二酰亚胺、香豆素、丹磺酰胺、荧光素、罗丹明、氟硼吡咯、苯并咪唑、咔唑、苯并恶唑等具有荧光发射功能的有机基团。

在上述通式的荧光分子探针中，荧光基团与识别基团间的连接基团Q₁、Q₂代表具有1-10个碳原子的亚烷基或双亚烷基，如亚甲基、1，1-亚乙基、1，2-亚乙基、1，1-亚丙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丙基、1，1-亚丁基、1，2-亚丁基、1，3-亚丁基、1，4-亚丁基等直至10个碳原子的亚烷基；也可以由上述亚烷基中的两个亚烷基构成本连接基团，如两个1，2-亚乙基、亚甲基和1，2-亚乙基、亚甲基和1，3-亚乙基、1，2-亚乙基和1，3-亚乙基等。

在上述通式的荧光分子探针中，两个吡啶之间的连接基团X3除代表氮原子、硫原子、氧原子、磷原子等杂原子外，还包括两端有取代的亚烷基二胺、二硫衍生物，如乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、1，3-亚丙二胺、1，2-亚丙二胺、1，2-亚丁二胺、1，3-亚丁二胺、1，4-亚丁二胺、哌嗪、1，3-环戊二胺、1，3-环己二胺、1，2-二硫代乙烷、1，3-二硫代丙烷、1，2-二硫代丙烷、1，2-二硫代丁烷、1，3-二硫代丁烷、1，4-二硫代丁烷等。

在上述通式的荧光分子探针中，双(2，6-二甲基吡啶)衍生物是具有多个配位原子的识别基团，有利于识别特定半径及电子结构的金属离子；分子的两端连有荧光基团，这两个荧光基团通过光诱导电子转移(PET)受控于识别基团中的部分氮原子。当识别基中的氮原子与金属离子结合时，PET过程被阻断，两个或更多个荧光基团的荧光同时增强，有利于使识别灵敏度提高。

以4-氨基-1，8-萘酰亚胺荧光基团为例，该类探针可通过如下的典型合成路线得到。

分子式中的R、R₇和R₈可以是氢原子、烷基、取代的烷基和芳基。

4-氨基萘酰亚胺是一个具有强推-拉电子体系的荧光化合物，具有荧光量子产率高、斯托克斯(Stokes)位移大、荧光发射波长适中等优点，经常被用于荧光分子探针的设计与合成。在4-氨基萘酰亚胺的推电子基团部位通过连接基与识别部分，即被识别物的受体部分相连，这样的结构有利于电子授体向发色团的转移，强化PET过程。

另外，本发明还设计、合成了以蒽、4-氨基-7-硝基苯并呋咱等为荧光基团的双吡啶识别基荧光分子探针，这些分子上一般都连接羟基等极性基团，有助于整个荧光探针分子的亲水性，便于荧光探针在水溶液中的应用，而且为分子探针的进一步衍生和固载提供了反应活性基团。

本发明所涉及的荧光分子探针，也可以通过其它带伯胺基、仲胺基等反应活性基团的荧光化合物与2，6-二氯甲基吡啶、2，6-二溴甲基吡啶或2，6-二甲基磺酸酯甲基吡啶等及其这些吡啶的衍生物缩合得到。

本发明的荧光分子探针不仅具有抗过渡金属和重金属离子对荧光基团的淬灭性能和良好的选择性，而且还能在各种溶液，特别是在含水溶液中对非d¹⁰电子结构的过渡金属和重金属离子选择性荧光增强识别，可在水、有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈、DMSO等以及水与有机溶剂的混合溶液中识别过渡金属离子。如实施例2合成的荧光分子探针P-2在乙醇和水(1∶1)的混合溶剂中(0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，pH＝7.3)，在多种金属离子中(如Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺)，对Co²⁺表现出好的选择性荧光增强识别。故其可应用在生物组织及细胞等微环境中的钴离子检测，还可用于水、污水及及水溶液、乳液、悬浮体系等中的钴离子检测。由上述结果可以看出本发明设计、合成的Co²⁺荧光分子探针是非常成功的。如实施例12合成的荧光分子探针P-12在乙腈、二甲基亚砜和水(4∶1∶15，pH＝8.6缓冲溶液浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中)，在多种金属离子中(如Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺)，对Hg²⁺和Cd²⁺表现出选择性荧光增强识别。

本发明设计、合成的一类双2，6-二胺甲基吡啶衍生物荧光分子探针具有结构相对简单、易于合成、在水溶液中对过渡金属离子有选择性荧光增强识别作用，并可进一步用于固载识别敏感器件的制作，如本发明的荧光分子探针可以通过分子的反应性基团将其固载于聚合物或固体表面，实现器件化，用于上述目的的荧光传感器器件的关键部分。既可将其应用于各种溶液及分散体系中过渡金属离子的识别和检测；也可用于生物样品中过渡金属离子的识别与检测。

附图说明

图1是Co²⁺浓度与荧光强度的关系，其中纵座标为荧光强度，横座标为荧光发射波长(λ_em/nm，激发波长为410nm)。

图2是荧光分子探针P-2识别各种常见金属离子的选择性，其中纵座标为最大发射波长处(540nm)的荧光强度，横座标为不同的金属离子。

具体实施方式

                              实施例1

将N-丁基-4-(2-(2-羟乙氨基)乙氨基)-1，8-萘酰亚胺180mg(0.385mmol)、2，6-二氯甲基吡啶70mg(0.40mmol)溶于50ml乙腈，回流约8h。蒸出溶剂。经硅胶柱色谱分离得中间体(P-1-1)为深黄色黏稠液体，产率：69％(130mg)。

将上述中间体P-1-1130mg(0.262mmol)、单乙醇胺8mg(0.13mmol)加入至50ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约7h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得深黄色黏稠液体(P-1)，产率：55％(70mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.46(d，J＝7.2Hz，2H)，8.27(d，J＝8.4Hz，2H)，8.15(d，J＝8.2Hz，2H)，7.44(m，4H)，6.95(m，4H)，6.53(br，2H)，4.16(t，J＝7.6Hz，4H)，3.6-3.8(m，14H)，3.20(br，4H)，2.98(br，6H)，2.75(br，4H)，1.70(m，4H)，1.44(m，4H)，0.97(t，J＝6.9Hz，6H).

                              实施例2

将N-羟乙氧基乙基-4-哌嗪基-1，8-萘酰亚胺401mg(1.09mmol)与2，6-二氯甲基吡啶229mg(1.30mmol)加入至50ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约6h，冷却至室温。将反应液旋干，用硅胶柱色谱分离，得到淡黄色固体(P-2-1)。熔点：119.3-120.1℃，产率：53％(290mg)。

将P-2-1203mg(0.398mmol)、单乙醇胺11mg(0.18mmol)加入至30ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约6h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得黄色固体(P-2)。熔点：89.0～90.1℃，产率：45％(80mg)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.57(d，J＝7.2Hz，2H)，8.50(d，J＝8.4Hz，2H)，8.40(d，J＝8.4Hz，2H)，7.66(m，4H)，7.38(d，J＝7.2Hz，2H)，7.30(d，J＝10.8Hz，2H)，7.20(d，J＝8.4Hz，2H)，4.43(t，J＝5.6Hz，4H)，4.00(s，4H)，3.85(t，J＝5.6Hz，4H)，3.72(t，J＝3.2Hz，4H)，3.68(t，J＝3.2Hz，4H)，2.89(br，10H).

                              实施例3

将N-丁基-4-哌嗪基-1，8-萘酰亚胺380mg(1.126mmol)与2，6-二氯甲基吡啶200mg(1.136mmol)加入至50ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约7h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得到中间体为黄绿色固体(P-3-1)。熔点：147.0～147.8℃，产率：58％(290mg)。

取上述中间体P-3-1172mg(0.360mmol)、单乙醇胺10mg(0.164mmol)加入至30ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约6h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得金黄色固体(P-3)。熔点：85.8～86.9℃，产率：60％(92mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.57(d，J＝7.2Hz，2H)，8.50(d，J＝8.0Hz，2H)，8.40(d，J＝8.4Hz，2H)，7.68(t，J＝8.0，2H)，7.63(t，J＝8.0，2H)，7.39(d，J＝7.6Hz，2H)，7.30(s，2H)，7.21(d，J＝8.0Hz，2H)，4.16(t，J＝7.4Hz，4H)，4.02(br，4H)，3.85(s，4H)，3.73(t，J＝4.6Hz，2H)，3.32(br，8H)，2.94(br，2H)，2.87(br，8H)，1.70(m，4H)，1.44(m，4H)，0.97(t，J＝7.4Hz，6H).

                              实施例4

将P-3-1112mg(0.234mmol)、氨基乙氧基乙醇11mg(0.104mmol)加入至30ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热流约6h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得金黄色固体(P-4)。熔点：80.5～81.8℃，产率：67％(69mg)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(*10^-6)：8.57(d，J＝7.6Hz，2H)，8.50(d，J＝8.0Hz，2H)，8.39(d，J＝7.6Hz，2H)，7.70(t，J＝8.0，2H)，7.67(t，J＝8.0，2H)，7.53(d，J＝7.6Hz，2H)，7.38(d，J＝7.2Hz，2H)，7.20(d，J＝8.0Hz，2H)，4.16(t，J＝7.6Hz，4H)，3.99(br，4H)，3.82(s，4H)，3.72(t，J＝3.6Hz，2H)，3.68(t，J＝4.8Hz，2H)，3.54(t，J＝4.0Hz，2H)，3.31(br，8H)，2.89(br，10H)，1.70(m，4H)，1.44(m，4H)，0.97(t，J＝7.4Hz，6H).

                              实施例5

取NBD-P 200mg(0.80mmol)和143mg(0.81mmol)2，6-二氯甲基吡啶，溶于60mL乙腈中，在N₂气下回流反应8h。减压蒸出溶剂，硅胶柱层析分离，得红色粉末(P-5-1)，熔点：190℃分解，产率56％(174mg)。

取上述中间体P-5-1174mg(0.45mmol)、单乙醇胺13mg(0.21mmol)加入至30mL乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约6h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得红色固体(P-5)。熔点：146.9～148.3℃。，产率：60％(96mg)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：8.48(d，J＝9.2Hz，2H)，7.76(t，J＝7.6Hz，2H)，7.41(d，J＝9.2Hz，2H)，7.35(d，J＝9.2Hz，2H)，6.65(d，J＝9.2Hz，2H)，4.16(br，8H)，4.01(s，4H)，3.74(t，J＝4.6Hz，2H)，3.70(s，4H)，2.93(br，2H)，2.70(br，8H).

                              实施例6

将0.324g(1.15mmol)Nap-A和0.22g(1.25mmol)2，6-二氯甲基吡啶加入到70mL乙腈中，氮气保护下搅拌回流，经TLC分析，当反应混合物不再明显变化时，将反应液旋干，用硅胶柱色谱分离得到中间体(P-6-1)。然后直接将P-6-1中间体溶溶于50mL乙腈与18mg(0.30mmol)乙醇胺混合，回流反应，经TLC分析，当反应混合物不再明显变化时，将反应液旋干，用硅胶柱色谱分离，得到目标产物(P-6)，淡黄色粉末。熔点：138～140℃，产率：32％(80m)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.30(d，J＝9.2Hz，4H)，8.24(d，J＝10Hz，4H)，7.38(m，8H)，7.06(t，J＝7.6Hz，2H)，6.81(d，J＝7.6Hz，2H)，6.53(d，J＝7.6Hz，2H)，5.43(s，4H)，4.60(s，4H)，3.98(s，4H)，3.73(d，J＝5.0Hz，2H)，3.56(d，J＝5.0Hz，4H)，2.94(d，J＝5.0Hz，2H)，2.82(d，J＝5.0Hz，4H)

                         实施例7

将N-丁基-4-(2-羟乙氨基)-1，8-萘酰亚胺120mg(0.38mmol)、2，6-二氯甲基吡啶70mg(0.40mmol)及15mg(0.38mmol)60％的氢化钠溶于50ml乙腈，回流约8h。蒸出溶剂。经硅胶柱色谱分离得中间体(P-7-1)为黄色固体，产率：57％(98mg)。

将上述中间体P-7-1 98mg(0.217mmol)、单乙醇胺6mg(0.10mmol)加入至50ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约7h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得黄色固体(P-7)，熔点：87.0～88.5℃，产率：69％(61mg)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.57(d，J＝7.2Hz，2H)，8.45(d，J＝7.6Hz，2H)，8.17(d，J＝8.4Hz，2H)，7.6(m，4H)，7.42(d，J＝7.6Hz，2H)，7.39(d，J＝7.6Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，4.16(t，J＝7.6Hz，4H)，3.8-4.1(br，12H)3.73(t，J＝4.6Hz，2H)，3.62(br，4H)，2.94(br，2H)，1.70(m，4H)，1.44(m，4H)，0.97(t，J＝6.9Hz，6H).

                         实施例8

将上述实施例3中合成的中间体P-3-1 320mg(0.671mmol)、Na2S 26mg(0.33mmol)加入至50ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热回流约8h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得黄色固体(P-8)，熔点：137.1～138.5℃，产率：35％(106mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.56(d，J＝7.2Hz，2H)，8.50(d，J＝8.0Hz，2H)，8.39(d，J＝8.4Hz，2H)，7.7(m，4H)，7.39(d，J＝7.6Hz，2H)，7.20(m，4H)，4.16(t，J＝7.4Hz，4H)，4.0(br，4H)，3.32(br，8H)，2.87(br，8H)，1.70(m，4H)，1.44(m，4H)，0.97(t，J＝7.4Hz，6H).

                         实施例9

将N-丁基-4-(2-氨乙氨基)-1，8-萘酰亚胺50mg(0.161mmol)和P-2-1 180mg(0.353mmol)加入至30mL乙腈溶剂中，N₂保护，加热搅拌，回流12h，冷却至室温。将反应液旋干后，进行柱色谱分离，将所得产物溶液旋干，得黄色状固体(P-9)。熔点：113.6-114.7℃，产率：47.26％(95mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(*10^-6)：8.61(d，J＝7.2Hz，1H)，8.56(d，J＝6.8Hz，2H)，8.47(m，3H)，8.40(d，J＝8.4Hz，1H)，8.32(d，J＝8.4Hz，2H)，7.68-7.58(m，5H)，7.36(d，J＝7.2Hz，4H)，7.21(s，1H)，7.13(d，J＝8.0Hz，2H)，6.54(d，J＝8.0Hz，1H)，4.43(t，J＝5.2Hz，4H)，4.14(t，J＝7.2Hz，2H)，4.02(s，4H)，3.84(t，J＝5.6Hz，4H)，3.77(s，4H)，3.68-3.66(m，8H)，3.43(s，2H)，3.21(s，8H)，3.09(s，2H)，2.74(s，8H)，1.68(m，2H)，1.42(m，2H)，0.94(t，J＝7.2Hz，3H).

                         实施例10

将乙二胺9mg(0.149mmol)、P-2-1 350mg(0.687mmol)、加入至30ml乙腈溶剂中，N₂保护，加热搅拌，回流约8h后停止加热，冷却至室温。将反应液旋干后，进行柱色谱分离，得黄色固体(P-10)。熔点：93.1-94.3℃，产率：26％(75mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(*10^-6)：8.53(d，J＝6.8Hz，4H)，8.47(d，J＝8.0Hz，4H)，8.33(d，J＝8.4Hz，4H)，7.65-7.59(m，8H)，7.45(d，J＝7.6Hz，4H)，7.33(d，J＝6.4Hz，4H)，7.13(d，J＝8.4Hz，4H)，4.42(t，J＝5.6Hz，8H)，3.85-3.83(m，16H)，3.76(s，8H)，3.68-3.65(m，16H)，3.26(s，16H)，2.86(s，4H)，2.80(s，16H).

                         实施例11

将P-2-1 242mg(0.475mmol)、哌嗪20mg(0.232mmol)加入至30mL乙腈溶剂中，N₂保护，加热搅拌，回流6h，冷却至室温。将反应液旋干后，用硅胶柱色谱分离，得黄色固体(P-11)。熔点：108.3-109.0℃，产率：81％(194mg)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ(*10^-6)：8.53(d，J＝6.8Hz，2H)，8.47(d，J＝8.0Hz，2H)，8.33(d，J＝8.4Hz，2H)，7.65-7.59(m，4H)，7.45(d，J＝7.6Hz，2H)，7.33(d，J＝6.4Hz，2H)，7.13(d，J＝8.4Hz，2H)，4.42(t，J＝5.6Hz，4H)，3.82-3.88(m，20H)，3.74(b r，8H)，2.85(br，16H).

                         实施例12

将Pery-A 50mg(0.069mmol)与P-2-1 86mg(0.17mmol)加入至20mL DMF中，N₂保护，80℃下反应10h，冷却至室温，将反应液旋干，用硅胶柱色谱分离，得红色固体(P-12)。熔点：132.1～133.8℃，产率：26％(30mg)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.40(d，J＝3.2Hz，2H)，8.77(s，2H)，8.58(d，J＝8.4Hz，2H)，8.49(d，J＝7.2Hz，2H)，8.42(d，J＝8.0Hz，2H)，8.25(d，J＝8.4Hz，2H)，7.58(t，J＝8.0Hz，2H)，7.32(d，J＝5.2Hz，2H)，7.14(d，J＝7.2Hz，4H)，7.09(d，J＝8.0Hz，2H)，4.39(t，J＝5.6Hz，4H)，4.33(t，J＝5.6Hz，4H)，3.93(s，4H)，3.82(t，J＝5.6Hz，4H)，3.70-3.65(m，16H)，3.19(s，8H)，3.06(t，J＝5.6Hz，4H)，2.93(s，4H)，2.72(s，8H).

                         实施例13

将实施例2中的荧光分子探针P-2溶于含三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(0.01mol/L)缓冲溶液(pH＝7.3)的乙醇和水的混合溶剂(1∶1)中，配制成浓度为1.0×10^-5mol/L的测定其荧光(激发波长为410nm，最大发射波长为540nm)。加入不同量的钴盐(CoCl₂·6H₂O)时溶液的荧光强度随之增加，请参照图1。

                         实施例14

在实施例13中的测试条件下，研究荧光分子探针P-2识别各种常见金属离子的选择性。荧光分子探针P-2的浓度为1.0×10^-5mol/L，分别加入Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Hg²⁺和Pb²⁺的溶液，使其浓度为5.0×10^-5mol/L。通过与不加金属离子的对比实验相比较发现，除Co²⁺以外的其它离子对荧光强度的影响在一倍以内，Co²⁺使溶液的荧光强度增加到原来的十倍，请参见图2。由此可见本发明的荧光分子探针对Co²⁺具有的良好选择性识别性能。

                         实施例15

以下是荧光探针P-4在细胞生物学研究中的应用。以培养的人Hela细胞系为研究对象，将Hela细胞(1×10⁴)接种于24孔细胞培养板，每孔含1mL RPMI1640培养基。置于CO₂孵箱，37℃培养24小时或70％以上细胞贴壁。加入CoCl₂水溶液，至终浓度分别为0.01、0.1、0.5和1.0mg/mL。对照孔加入等体积生理盐水。继续培养30分钟后，加入荧光探针P-4，使其浓度达到1μM。用荧光倒置显微镜观察，试验孔细胞内出现明显荧光，对照未见细胞的荧光影像。将培养板置于Genious(TECAN，Swiss)多功能读板机，在410nm激发下，记录540nm荧光发射强度。结果表明，0.01、0.1、0.5和1.0mg/mL培养孔细胞的荧光强度明显高于对照孔，达到1-10倍，并呈现浓度依赖关系。

                         实施例16

将实施例10中的荧光分子探针P-10溶于乙醇和水(1∶1)的混合溶液中，含三羟甲基氨基甲烷-盐酸(0.01mol/L，pH＝7.9)。P-10的浓度为5×10^-6mol/L，金属离子浓度为5×10^-5mol/L，在多种金属离子中(如Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺)，对Co²⁺表现出选择性荧光增强识别。测得其荧光(激发波长为410nm，最大发射波长为545nm)强度分别比空白值增加约10倍，其它金属离子的影响在1倍以内。

                         实施例17

将实施例11中的荧光分子探针P-11溶于乙腈、二甲基亚砜和水(4∶1∶15)的混合溶液中，含三羟甲基氨基甲烷-盐酸(0.01mol/L，pH＝8.6)。P-12的浓度为5×10^-6mol/L，金属离子浓度为5×10^-5mol/L，在多种金属离子中(如Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Al³⁺)，对Hg²⁺和Cd²⁺表现出选择性荧光增强识别。测得其荧光(激发波长为410nm，最大发射波长为553nm)强度分别比空白值增加10倍和2倍。

                         实施例18

将实施例12中的荧光分子探针P-12溶于乙腈、二甲基亚砜和水(4∶1∶15)的混合溶液中，含三羟甲基氨基甲烷-盐酸(0.01mol/L，pH＝8.6)。P-12的浓度为5×10^-6mol/L，金属离子浓度为5×10^-5mol/L，在多种金属离子中(如Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺)，对Hg²⁺和Cd²⁺表现出选择性荧光增强识别。测得其荧光(激发波长为410nm，最大发射波长为545nm)强度分别比空白值增加4.5倍和3倍。