一种乳腺生物反应器的建立方法

摘要

本发明涉及一种乳腺生物反应器的建立方法，该方法是将目的基因通过转染液导入动物的乳腺管或者乳腺组织中，使目的基因在乳蛋白特异性调控序列控制下在乳腺中表达，其特征是所述的转染液中加入干细胞支持因子；在动物性发育期或者性成熟期或者妊娠早期或者断奶期导入含有目的基因的转染液，转染动物体内乳腺干细胞。本发明所述乳腺生物反应器的建立方法，不但成功率高(50％－80％)，操作难度低，生产周期短、成本低，而且可在动物的育龄期内反复使用，具有较高的商用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和组织工程领域，进一步涉及使用转染液引入目的基因制备突变体的方法，具体涉及使用转染液引入目的基因建立乳腺生物反应器的方法。

背景技术

乳腺生物反应器是利用动物乳房具有非常强的合成蛋白质的能力，通过生物工程的手段，使其产生珍贵的天然生物活性物质。通俗地说，就是用动物乳腺细胞作为细胞工程生产珍稀药用蛋白的天然发酵罐，使在自然情况下存在非常微量但又非常有效的生物活性物质源源不断的从动物乳汁中产生。该项生物高新技术以其安全、环保、符合自然规律及低成本、高效益而倍受世人的关注。由于乳腺生物反应器具有巨大的经济价值，许多国家都投入了相当大的资金和人力。从目前的趋势看，在不久的将来乳腺生物反应器将形成一项重要的产业，获得巨大的经济、社会效益。

目前，乳腺生物反应器的建立方法主要有两大类，一类如公开号为1269133公开的中国发明专利申请。该专利申请公开了一种体内胚胎干细胞转染法，即将载有目的基因的转染液引入胚胎干细胞发育所在部位，转染动物的体内胚胎干细胞，并参与胚胎发育。但是由于外源基因经过受精卵带入新的个体中需要经过漫长的个体发育过程才能在乳腺中得以表达，在这期间影响的因素很多、情况复杂，尤其是外源基因的随机插入及其位置效应，往往造成胚胎的早期死亡或发育畸形，成功率较低。这些因素严重限制了乳腺生物反应器的开发和应用。其次是该专利申请所述方法的难度大，费用高，周期长。第二类如公开号为1278008公开的本发明人提交的发明专利申请。该专利申请公开了将转染液在动物的发育期从动物的乳腺管或乳腺组织直接注入，从而使目的基因引入乳腺上皮细胞并在泌乳时得以表达。但是由于该方法转染外源基因的对象是所有的乳腺上皮细胞，包括导管上皮细胞、腺泡上皮细胞以及肌上皮细胞等，这些细胞属于终末分化细胞，其携带外源基因的效率极低，这种细胞也不具备分裂增殖能力，故外源基因得不到扩增和大量的表达。另外，由于这些终末细胞的退化，外源基因随即消失，外源基因不能在动物反复的泌乳中多次表达，所以这种直接注入的方法存在较大的盲目性和随机性，因此采用该方法建立乳腺生物反应器的成功率仅5％-10％，难以达到产业化的标准获得商业上的成功。

公开号为1695570公开的中国发明专利申请中披露了用巴斯德吸管吸取小鼠乳腺原基并移植于小鼠已清除乳腺组织的脂肪垫中建立小鼠再生功能性乳腺的方法，进而还公开了在小鼠乳腺原基还转有外源基因的应用，使外源基因在小鼠乳腺中表达。该专利申请所述方法用于乳腺组织的移植无可厚非，但是用于建立乳腺生物反应器，并通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白，就显得手术难度高，工作量大。尤其是，该方法对动物造成的创伤大，建立乳腺生物反应器的成功率难以提高，且技术方法复杂，生产成本高，难以推广应用，对于适合建立乳腺生物反应器的大动物来说就更是如此。此外，该专利申请在背景技术中提及从乳腺组织中分离乳腺干细胞移植再生乳腺的方法，但未涉及将外源目的基因直接引入动物体内乳腺干细胞。

发明内容

鉴于现有技术存在上述不足，本发明的目的是提供一种将外源目的基因直接引入动物体内乳腺干细胞建立乳腺生物反应器的方法，该方法具有成功率高、操作简便、生产成本低的优点。

本发明实现上述目的的技术解决方案是：

一种乳腺生物反应器的建立方法，该方法是将目的基因通过转染液导入动物的乳腺管或者乳腺组织中，使目的基因在乳腺特异性调控序列控制下在乳腺中表达，其特征是所述的转染液中含有干细胞支持因子；在动物性发育期或者性成熟期或者妊娠早期或者断奶期导入含有目的基因的转染液，转染动物体内乳腺干细胞。

本发明所述转染液的配制方法是，先将制备好含目的基因的重组质粒与促转染剂混合，然后加入生理盐水，再加入干细胞支持因子，使其浓度为5-50ng/ml即可。

本发明中所述的干细胞支持因子作用是维持干细胞的生物特性并促进干细胞分裂增殖。因此，所述的干细胞支持因子可以是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibirblastgrowth factor bFGF)和白血病细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor LIF)、干细胞因子(stem cell factor SCF)、表皮生长因子(epidermal growth factor EGF)的一种或两种以上，也可以是成纤维细胞生长因子(bFGF)一种。本发明所述干细胞支持因子中，bFGF是必须的，LIF、SCF和EGF均为备选因子，对bFGF有协同的作用，可选择一种或二种以上的备选因子与bFGF共同使用。

本发明所述的目的基因是生物活性蛋白基因，如组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator tPA)、人白蛋白(Albumin)、表皮生长因子(epidermal growthfactor EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin EPO)、人乳铁蛋白(human lactoferrin hLF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、乙肝疫苗、胰岛素、肿瘤疫苗、肿瘤标记物抗体、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等。

本发明所述的乳腺生物反应器的建立方法详述如下：

一、转染液的制备

(一)仪器设备：主要有；超速离心机(日本Hitachi)、高速离心机(日本Hitachi)、高速台式冷冻离心机(德国Sigma3k30型)、紫外分光光度计(BIO-RAD3000美国)、电泳仪(BIO-RAD美国)、电泳槽(BIO-RAD美国)、超净工作台(苏州净化设备厂)。

(二)试剂：目的基因片段(t-PA、EPO、乳铁蛋白、EGF、干扰素、肝炎疫苗、肿瘤疫苗、诊断用单克隆抗体，由各实验室、生产厂家制备和保存)、真核蛋白表达载体(pBC1、pcDNA6、pcDNA-DEST53、pcDNA-DEST47，为invitrogen产品)、促转染剂(磷酸钙、DEAE、Lipofectamine2000)、干细胞支持因子(bFGF、Lif、SCF、EGF)。以上试剂均可在英伟创津生物科技有限公司、晶美生物工程有限公司等国内生物试剂代理公司购得。

(三)转染液的配制方法与步骤：

1.构建乳腺定位表达载体：按照分子生物学实验室的常规方法，取上述目的基因片段插入启动子序列(WAP，β-casein或BLG)，然后再将连接有启动子的目的基因片段插入真核表达载体，用常规方法鉴定并扩增、纯化。

2.配制转染液：

(1)将上述重组质粒与促转染剂混合，并在室温下作用15-30min(按照市面上购得的促转染剂试剂盒的说明书要求的比例、方法和步骤进行操作)；

(2)然后按目的基因为5-20μg/100ml的浓度加入生理盐水；

(3)再加入干细胞支持因子，使其浓度为5-50ng/ml。可根据目的基因和动物的种类不同加入一种干细胞支持因子，也可以同时加入2种或3种干细胞支持因子。

二、转染液的导入

本发明所述的转染液可采用公知的乳腺管注射、乳腺组织注射或乳腺组织注射结合体内电穿孔技术导入。

正确选择注射的时间和注射的部位是实现本发明所述方法的关键之一。本发明所述方法的注射的时间和部位，根据不同受体的生理特征有以下三种选择：

1.在动物性发育期或性成熟期，乳腺组织刚刚开始发育或已发育成熟的时候，用适当的导管或针头，将转染液通过乳头管注入到乳腺组织内，从而将外源基因直接导入到乳腺干细胞存在的部位，随着乳腺组织的生长发育，尤其是妊娠后的发育，外源基因转染乳腺干细胞。在泌乳期，外源基因由泌乳细胞表达，乳汁中产生目的蛋白。

2.在动物妊娠早期进行转染液乳头管注入，一般是在妊娠期的前1/3时间里，如牛是在妊娠后的3-4个月左右，此时的乳腺腺泡在体内激素的作用下迅速发育，随着细胞的分裂增殖，外源基因很容易转染到乳腺干细胞内，待到泌乳期乳汁中便可含有目的蛋白。

3.注射的时间是在断奶期，通过乳头管将外源基因导入到乳腺组织中，使其转染乳腺上皮细胞和乳腺干细胞，待到再一次妊娠期，乳腺发育，在泌乳期乳汁中也可含有目的蛋白。

三、乳腺生物反应器的鉴定标准和方法

目的蛋白的表达及表达量是评定所建乳腺生物反应器优劣的一项重要指标。该指标的检测可采用常规的蛋白质水平的检测方法，即Western印迹分析、原位免疫组织化学染色、免疫沉淀、化学发光和酶联免疫吸附实验(ELISA)等。但是，对于一些特殊的目的蛋白，要根据表达的目的蛋白的特性选用相应的检测方法，例如，采用琼脂糖平板溶圈实验检测乳汁中tPA的表达和表达量。这些都是本领域普通技术人员很容易做到的，这里就不一一列举了。

本发明的关键是将外源基因直接导入到乳腺干细胞中，为了达到这一目的，我们选择了乳腺发育特定的时期，为了使乳腺干细胞的数量增多并能延长其增殖状态，在转染液中加入了干细胞支持因子，并达到了提高转染率的效果。本发明所述的方法以乳腺和乳腺干细胞生物学特性为依据，设计出含有干细胞支持因子的转染液，并根据各种动物(小鼠、大鼠、家兔、山羊、奶牛等)乳腺的正常发育过程，以及该过程中乳腺干细胞定性、定位、定量与发育规律，选择乳腺发育期、妊娠早期、断乳期进行乳腺管注射，使外源基因转染和整合到乳腺干细胞，并在其发育的终末泌乳细胞中表达，从而产生目的蛋白。因此，本发明较现有技术具有下述优点和效果：成功率高，操作难度低，生产周期短、成本低，且在育龄期内反复使用。

下表以建立一头牛乳腺生物反应器为例，将本发明所述方法与现有技术进行比较，进一步说明本发明所能达到的技术效果。

  受精卵显微注射法  乳腺管内转染法  乳腺干细胞转染法  生产周期(月)  25-29  6-12  3-12  设备  显微操作系统  兽用注射器材  兽用注射器材  操作难度  复杂  简单  简单  试剂耗量  少  多  较多  建成率  0.1％-2％  5％-10％  50％-80％  建立成本(万元)  50-100  20  1-5  目的蛋白表达量  20mg-5g/L  100mg-5g/L  1g-5g/L

上表显示，本发明所述方法较现有技术不仅建成率高、成本低，而且表达量高而稳定。

具体实施方式

以下结合具体实施例详细描述本发明所述方法，以期公众更好地掌握本发明的实施手段，充分理解本发明所能达到的技术效果，但本发明不受所述实施例限制。

实施例1：小鼠tPA乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。配方：WAP-tPA基因片段溶液50μl，按20ng/ml的浓度分别加入bFGF、lif和EGF；脂质体1μl，其中WAP为乳腺特异性表达启动子，tPA为目的基因，脂质体为促转染剂。

(2)乳腺管注射。选定小鼠妊娠后的5-8天为乳腺管注入时间。为了操作方便，可适当地麻醉，如腹腔内注射0.5-1ml的水合氯醛；操作时，将其固定于操作台上，将经过处理并尖端钝化的直径约0.25mm的Pasteur玻璃吸管插入到小鼠的乳腺管中，通过此导管将转染液注入到乳腺组织中，一次注射量为30μl-50μl。

(3)检测目的基因的表达。当小鼠泌乳时采集乳汁进行检测。采用琼脂糖平板溶圈实验检测乳汁中tPA的表达量为4g/L。

实施例2：家兔人白蛋白乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。β-casein-白蛋白质粒20μg，加入5μl脂质体，15分钟后按10ng/ml的浓度将bFGF、lif和SCF的加入到100μl生理盐水中。

(2)乳腺管注射。选定家兔妊娠后8-12天和断奶1-3天的母兔的乳腺管注入时间。注射时采用少量多点注射的方法，将转染液注入到乳腺组织和乳腺的导管中。

(3)检测目的基因的表达。母兔产子后4天，采集乳汁，采用化学发光法或免疫沉淀法检测乳汁中的乳铁蛋白含量为1g/L。

实施例3：表皮生长因子(Epidermal growth factor EGF)乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。BLG-hEGF质粒5～15mg，加入200～350μl脂质体，15～20分钟后加入含5ng/ml的bFGF和lif的生理盐水10～100ml。

(2)乳腺管注射。选定山羊4月龄和和妊娠40-60天的乳腺管注入时间。由于山羊的乳头管粗大，肉眼即可观察到，采用兽医用的注射器和针头便可进行注射，操作十分方便。操作时无需麻醉动物，为了安全起见，可适当地对山羊加以固定。每次注入的转染液量约为20～30ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为10-15ml，这样可有利于提高目的基因的表达量。

(3)检测目的基因的表达。母山羊产子后4天，采集乳汁，采用免疫沉淀法检测乳汁中EGF的表达量为2g/L。

实施例4：红细胞生成素(EPO)牛乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。乳腺特异性表达启动子为乳球蛋白(BLG)启动子。按5∶1的比例将pBLG-hEPO溶液与脂质体混合，30分钟后加入50倍的含10ng/ml的EGF和lif的生理盐水。

(2)乳腺管注射。选定牛乳腺管注入时间。操作方法与羊基本相同，奶牛的乳头管更加粗大，操作起来更为方便。每次注入的转染液量约为30～60ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为20～30ml，以便提高目的基因的表达量。

(3)检测目的基因的表达。母牛产子后4天，采集乳汁，用免疫沉淀法和ELISA法检测牛乳汁中EPO的表达量为1g/L。

实施例5：γ-干扰素(γ-interferon γ-IFN)牛乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。乳腺特异性表达启动子为乳球蛋白(BLG)启动子。按5∶1的比例将pBLG-γIFN溶液与脂质体混合，30分钟后加入50倍的含40ng/ml的EGF和lif的生理盐水。

(2)乳腺管注射。选定牛乳腺管注入时间。操作方法与羊基本相同，奶牛的乳头管更加粗大，操作起来更为方便。每次注入的转染液量约为30～60ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为20～30ml，以便提高目的基因的表达量。

(3)检测目的基因的表达。母牛产子后4天，采集乳汁，用免疫沉淀法和ELISA法检测牛乳汁中γ-IFN的表达量为1.2g/L。

实施例6：胰岛素样生长因子-1(IGF-1)牛乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。乳腺特异性表达启动子为β-酪蛋白(β-casein)启动子。按5∶1的比例将β-casein-γIFN溶液与脂质体混合，30分钟后加入50倍的含50ng/ml的bFGF的生理盐水。

(2)乳腺管注射。选定牛乳腺管注入时间。操作方法与羊基本相同，奶牛的乳头管更加粗大，操作起来更为方便。每次注入的转染液量约为30～60ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为20～30ml，以便提高目的基因的表达量。

(3)检测目的基因的表达。母牛产子后4天，采集乳汁，用免疫沉淀法和ELISA法检测牛乳汁中IGF-1的表达量为2g/L。

实施例7：人乳铁蛋白(human lactoferrin hLF)牛乳腺生物反应器的建立。

(1)配制转染液。乳腺特异性表达启动子为β-酪蛋白(β-casein)启动子。按5∶1的比例将β-casein-hLF溶液与脂质体混合，30分钟后加入50倍的含50ng/ml的bFGF的生理盐水。

(2)乳腺管注射。选定牛乳腺管注入时间。操作方法与羊基本相同，奶牛的乳头管更加粗大，操作起来更为方便。每次注入的转染液量约为30～60ml，也可根据情况，在第一次注射后的第二和第三天各追加注射一次，每次注射的量为20～30ml，以便提高目的基因的表达量。

(3)检测目的基因的表达。母牛产子后4天，采集乳汁，用免疫沉淀法和化学发光法检测牛乳汁中hLF的表达量为2g/L。