逆转录病毒包装细胞系和肝细胞靶向性导入方法

摘要

本发明涉及一种逆转录病毒包装细胞系和肝细胞靶向性导入方法。该方法是组建新的逆转录病毒包装细胞系，该细胞系能表达病毒包装所必备的GAG－POL，以及ENV－PHSA－R融合蛋白，同时，env上对病毒感染起关键作用的基因被定点突变。由于肝细胞表面存在PHSA－R，逆转录病毒可通过PHSA介导，借助肝细胞表面的相应受体特异性地感染肝细胞，实现基因定向转移，使基因能够被特异运送至靶器官和靶细胞。因此，通过肝细胞靶向性系统可能成为肝炎基因治疗中确实有效的方法之一。

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗和生物技术领域，具体涉及一种靶向性的逆转录病毒包装细胞系的构建和肝细胞靶向性的导入方法。

背景技术

乙型肝炎是乙型肝炎病毒感染引起的一种严重危害人类健康的传染病。全世界大约有20亿人感染过HBV，特别是在我国约有1.2亿HBsAg的携带者，而持续HBV感染会导致肝硬化和原发性肝癌，死亡率很高。尽管国内外医学家采用全身抗病毒和调节免疫功能的方法，但治疗效果尚不理想，其主要原因可能是药物在HBV复制的部位-肝脏中分布较少。虽然可通过肝动脉或门静脉给药来提高药物在肝脏的分布，但有一定的创伤性。

反义技术是依赖反义寡核苷酸(ODN)、反义RNA和核酶(ribozyme)等手段进行基因治疗、基因调控研究的技术。它在基因水平上考虑如何选择性的关闭或修饰靶基因使其丧失活性而达到对疾病的特异性治疗，或研究特定基因的功能及基因的调控机制等。HBV在复制过程中经历了从前基因组mRNA逆转录到DNA的过程，利用反义技术能直接抑制病毒的复制。因此HBV的基因治疗为乙型肝炎的治愈开辟了新的途径。这些反义小分子物质在细胞水平上都能抑制HBV特定基因的表达，其中针对S基因起始区的反义ODN的抑制率最大可达到93.4％。但由于这些小分子物质的跨膜能力较差，非特异导向性转移载体等问题，限制了它们用于HBV感染的基因治疗。

在基因治疗的转移载体中，逆转录病毒载体应用最广。它的主要优点有：①感染效率高，对分裂期细胞的感染率可达100％；②于宿主基因组整合后可十分稳定地表达外源基因；③宿主范围广；④对细胞潜在的危害性低。鉴于此，大多数基因治疗研究的学者都选择逆转录病毒作为基因治疗用的转移载体。然而，目前逆转录病毒载体尚待解决的问题还很多，主要有无转移靶向性、导入细胞后病毒基因表达的自限性较差以致存在恢复为复制型野生型病毒(RCR)的潜在危险性等。目前基因治疗必须解决的关键问题即是基因导入系统的靶向性等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种逆转录病毒的包装细胞系，所包装的病毒能够特异地靶向肝细胞。

本发明的技术方案如下：

一种逆转录病毒的包装细胞系，含有Mo MLV和HBV的gag-pol、env-pres2基因的载体，其中env基因为嵌合基因，它含有pit1和pit2受体，可与靶细胞表面的pit1和pit2结合且相互影响，介导逆转录病毒感染靶细胞，其中逆转录病毒表面糖蛋白的第60位Tyr和第61位Val氨基酸残基对受体的识别起着决定性的作用，在其基因序列中引入限制性内切酶位点Sal I使其定点突变。将上述两个质粒共转染NIH3T3细胞，加压筛选得到稳定转染细胞系。将逆转录载体转染此细胞系后，可以包装出逆转录病毒，此病毒能够特异性地感染肝细胞。

一种肝细胞靶向性导入方法，其特点在于，利用上述包装出的逆转录病毒颗粒感染人肝癌细胞HepG2215。

通过向上述细胞培养液中加入聚合人血清白蛋白PHSA，重组逆转录病毒载体靶向结合到肝细胞表面。

上述重组逆转录病毒载体的包膜蛋白基因是经过定点突变改造的。改造方法包括：

(a)突变所用的引物：

上游：5’CTGTCGACTATGTCGGGTATGGCTGC 3’

           Sal I

下游5’TGGTCGACTGGTTCCTGGTCTGAAG 3’

           Sal I

(b)突变的位点，逆转录病毒表面糖蛋白的第60位Tyr和第61位Val氨基酸残基；

(c)靶向分子PHSA-R基因与包膜蛋白基因的融合；

优选的，上述重组逆转录病毒载体的包膜蛋白基因融合有肝细胞的靶向分子。

优选的，先用逆转录病毒包装细胞系包装生产靶向性的逆转录病毒。

本发明的肝细胞靶向性导入方法是通过聚合人血清白蛋白PHSA耦连靶向分子从而介导逆转录病毒特异性地感染人肝癌细胞HepG2215。

本发明针对现有技术的不足，开展肝细胞靶向性系统抗乙型肝炎的研究。逆转录病毒的包装细胞系能表达病毒包装所必备的GAG-POL，以及ENV-PHSA-R融合蛋白。包膜蛋白基因(env)上有pit1和pit2的受体，通过受体与靶细胞上的配体反应使病毒感染靶细胞，其中有对病毒感染起关键作用的基因，通过特异性引物将它们定点突变，阻断逆转录病毒通过此途径感染靶细胞。乙型肝炎病毒颗粒的包膜蛋白是由大蛋白、中蛋白、小蛋白以不同的比例和不同的方式装配而成的复合物，其中前S2基因的编码产物由55个氨基酸组成，含有聚合人血清白蛋白受体(PHSA-R)。血液中的PHSA可与肝细胞膜上的相应受体以及HBV包膜上的特异性受体相结合，这样，HBV颗粒通过PHSA就可以与肝细胞膜结合在一起，从而介导HBV进入肝细胞中，实现定向转移。我们重新组建新的逆转录病毒包装细胞系，使该细胞系能表达融合有HBV前S2基因表达产物-含聚合人血清白蛋白受体(PHSA-R)的逆转录病毒包装蛋白-ENV-PHSA-R。由于肝细胞表面存在PHSA-R受体，逆转录病毒载体经此包装细胞包装后形成的病毒颗粒由于其ENV蛋白融合有PHSA-R，可借助肝细胞表面的相应受体特异性地感染肝细胞，实现目的基因定向转移，即使目的基因能够被特异运送至靶器官和靶细胞，较好地达到了小剂量、高效应、低毒副反应的目的。因此，通过肝细胞靶向性系统可能成为肝炎治疗中确实有效的方法之一，具有巨大的潜在社会效益和经济效益。

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1重组表达载体pcDNA3.1(-)-env-preS2构建示意图。

图2重组表达载体pcDNA4/Hi sMaxA-gag-pol构建示意图。

图3琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，a、b分别为env、preS2的RT-PCR扩增电泳图谱，扩增大小分别为1983bp、165bp。c、d、e是gag-pol基因分段RT-PCR扩增电泳图谱，其中c、d、e分别代表gag-pol基因的扩增的三个片段，大小分别为2243bp、1226bp、1768bp。

图4重组表达载体酶切鉴定图谱。其中，a是重组载体pcDNA3.1(-)-env-preS2的酶切鉴定结果，1.DL15000；2.DL2000；3.pcDNA3.1(-)-env-preS2/XbaI+KpnI；4.pcDNA3.1(-)-env-preS2/NheI+XbaI；5.pcDNA3.1(-)-env-preS2/Nhe I+KpnI；6.pcDNA3.1(-)-env-preS2/Kpn I。b是重组载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol酶切鉴定结果，1.DL2000；2.DL15000；3.pcDNA4/HisMaxA-gag-pol/EcoRI+NotI；4.pcDNA4/HisMaxA-gag-pol/EcoRI。

图5重组表达载体PCR鉴定图谱。其中，a是重组表达载体pcDNA3.1(-)-env-preS2PCR鉴定结果，1.DL2000；2.env-preS2融合基因PCR扩增产物。b是重组表达载体pcDNA3.1(-)-preS2-env PCR鉴定结果，1.DL2000；2-3.preS2-env融合基因PCR扩增产物。

图6部分测序结果。a：gag-pol基因的部分测序结果；b：env-preS2融合基因中env基因的部分测序结果；c：env-preS2 env-preS2融合基因中preS2基因的部分测序结果；d：preS2-env融合基因中preS2基因的部分测序结果；e：preS2-env融合基因中env基因的部分测序结果。

图7G418抗性的pcDNA3.1(-)-env-preS2稳定表达的NIH3T3细胞克隆的筛选。其中，a、b、c、d分别为转染前、G418作用3天、14天后和稳定NIH3T3细胞系。

图8Zeocin抗性的pcDNA4/HisMaxA-gag-pol稳定表达的NIH3T3细胞克隆的筛选。其中，a、b、c、d分别为Zeocin作用3天、7天、14天后和稳定NIH3T3细胞系。

图9RT-PCR检测preS2、env和gag-pol mRNA。其中，a、b、c分别为preS2、env和gag-pol(2)的RT-PCR产物。

图10SDS-PAGE检测ENV-PHSA-R融合蛋白。其中，1.NIH3T3细胞，2-6.阳性克隆，7.标准蛋白.

图11SDS-PAGE检测表达蛋白。其中，1.阴性对照，2-3.非阳性克隆组，4-5.阳性克隆，6.标准蛋白。

具体实施方式

一、重组真核表达载体的构建

(1)细胞培养

DMEM加10％FBS培养HepG2215、PT67细胞，每3天换液1次，0.25％的胰酶消化传代，显微镜下观察。

(2)总RNA的提取

收集培养细胞(约5×10⁶个)加入1ml TRIzol试剂，吹匀后室温放置5min；

加入氯仿0.2ml，剧烈摇晃15s，室温放置3min，12000×g 4℃离心15min；

转移上清至DEPC处理的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇室温沉淀10min，12000×g 4℃离心10min；

弃上清，加入1ml 75％冷乙醇摇振洗涤后7 500×g 4℃离心5min；

弃上清，室温干燥5min，加入40μl DEPC水溶解，以紫外分光光度发检测其纯度和浓度，分装后保存于-70℃冰箱中。

(3)引物的设计

根据GenBank上的PT67细胞嵌合的包膜蛋白(env)、核心蛋白(gag)、聚合酶蛋白(pol)序列以及HBV前S2基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计相应的PCR扩增引物。其中，gag与pol基因全长5.2kb，利用该序列中的两个单酶切位点EcoR V和Kpn I分三部分扩增。对于env和preS2的融合表达，根据env和preS2的前后位置，分别在相应的引物5’端连有Nhe I与Xba I或是Xba I与Kpn I的组合。然后，于GenBank上进行BLAST比对检测其特异性。

Mo MLV的env基因为嵌合基因，它含有与pit1和pit2受体，可与靶细胞表面的pit1和pit2结合且相互影响，介导逆转录病毒感染靶细胞，其中逆转录病毒表面糖蛋白的第60位Tyr和第61位Val氨基酸残基对受体的识别起着决定性的作用，为此在其基因序列中引入限制性内切酶位点Sal I将其定点突变。

扩增引物序列如下：

重组载体pcDNA3.1(-)-env-preS2的env、PreS2引物如下：

env上、下游引物

5`GCGCTAGCATGGAGGGTCCAGCGTTCT 3`

      Nhe I

5`GCTCTAGACTATGGCTCGTACTCTA 3`

       Xba I

PreS2上、下游引物：

5`GATCTAGAATGCATGCAGTGGAATTCC3`

       Xba I

5`TAGGTACCTTCAGCGCAGGGTCCCCAA 3`

       Kpn I

引入的突变引物：

上游：5’CTGTCGACTATGTCGGGTATGGCTGC 3’

            Sal I

下游5’TGGTCGACTGGTTCCTGGTCTGAAG 3’

          Sal I

gag-pol三区段的上、下游引物分别为：

I：5`GCGAATTCTGATGGGCCAGACTGTTAC 3`

         EcoR I

5`GCGGTACCAGTATTCCCTGGTCCAAC 3`

      Kpn I

II：5`TAGGTACCCTGCCAGTCCCCCTGGAAC3`

         Kpn I

5`GCGATATCAAGGCAGTTGTGTTGCAGC 3`

       EcoR V

III：5`GCGATATCCTGGCCGAAGCCCACGGAA3`

          EcoR V

5`ATGCGGCCGCTTAGGGGGCCTCGCGGGTTAAC 3`

     Not I

(4)重组载体构建策略

1)重组表达载体pcDNA3.1(-)-env-preS2构建示意图见图1。

2)重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol构建示意图见图2。

(5)碱裂解法提取纯化质粒

复苏冻存的菌株，分别在含Amp的LB平皿上划线接种，37℃培养过夜，观察菌落形成情况，分别挑选状态好的单菌落接种到5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中过夜培养。

取1.5ml菌液，10000×g离心1min，弃上清。

加入250μl溶液I，盖紧管口，缓慢颠倒离心管4次。

加入250μl溶液II，盖紧管口，缓慢颠倒离心管4次，室温放置5min。

加入350μl溶液III，盖紧管口，快速颠倒离心管4次，12000×g离心10min。

取上清，加入套在离心管上的小柱子中，10000×g离心1min。

弃液体，加500μl HB Buffer，10000×g离心1min。

弃液体，加750μl Wash Buffer，10000×g离心1min。

重复洗柱一次。

弃液体，10000×g离心空柱子1min。

加50μl去离子水，10000×g离心1min，即为提取的质粒。紫外分光光度计测定质粒的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀值。-20℃保存备用。

(6)RT-PCR和PCR反应扩增gag、pol、env、前S2基因

PT67细胞嵌合的env、gag、pol序列以及HBV前S2基因序列的扩增：

于DEPC处理过的0.2ml Eppendorf管中，按下表加入所示试剂：

           表1RT-PCR反应体系

  试剂  用量  2×反应混合液  总RNA  上游引物(10mM)  下游引物(10mM)  RT/Platinum Taq HiFi Mix  无RNA酶的灭菌水  12.5μl  ≤1μg  0.5μl  0.5μl  1μl  至25μl

     表2RT-PCR反应体系

 试剂  用量 10×RNA PCR缓冲液 Mgcl₂(25nM) dNTP(10mM) 总RNA 上游引物P1 下游引物P2 逆转录酶 Taq酶 无RNA酶的灭菌水  2.5μl  5μl  2.5μl  ≤1μl  0.5μl  0.5μl  0.5μl  0.5μl  至25μl

离心混匀，进行逆转录反应。

env、gag、pol的扩增反应条件(表1)为30℃10min，45℃30min，99℃2min，5℃5min，退火55℃-60℃30Sec，68℃延伸1min/Kb经35个循环后，在72℃延伸10min。

HBV前S2的扩增反应条件(表2)为30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。然后在同一EP管内进行PCR反应。PCR反应条件为94℃预变性2min进行PCR扩增，经35个循环后，在72℃延伸10min。取5μl PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

(7)琼脂糖凝胶电泳

称取0.3克琼脂糖溶于30ml 1×TAE中，在微波炉中加热使之溶解，待熔化的凝胶冷却到60℃，向胶中加入3μl溴化乙锭，混匀，并将凝胶倒入制胶板中，室温放置20min，待凝胶凝固后，小心移去梳子，取5μl样品与上样缓冲液混合，用微量移液器将样品缓缓加入加样孔中，75V恒压电泳20min，电泳完成后，紫外灯下观察结果并拍照。

(8)重组质粒的酶切

用限制性内切酶双酶切重组质粒载体，建立如下酶切反应体系：

表3限制性内切酶酶切重组载体

  试剂  用量  10×buffer  重组质粒  内切酶  内切酶  去离子水  2μl  10μl  1μl  1μl  6μl

酶切反应体系共20μl，37℃2h。

(9)目的片段的回收与纯化

按常规的操作制备普通的1％琼脂糖凝胶，并将PCR产物或酶切产物进行电泳，电泳20min后，在紫外灯下观察结果，发现目的DNA带已经与溴酚兰和杂带充分分开。

在长波紫外灯下切下含所需DNA片段凝胶，移入一个1.5ml Eppendorf管中，加入0.2ml Binding Buffer，50℃保温7min熔化凝胶，期间颠倒试管2-3次。

将凝胶与Buffer的混合液转移至2ml装在离心管上的纯化柱中，1000×g离心1min。

加300μl Binding Buffer洗涤纯化柱，1000×g离心1min。

加入无水乙醇稀释的SPW Buffer 700μl，放置2-3min；1000×g离心1min；弃取液体离心空柱，1000×g 1min。

将纯化柱装到1.5ml Ep管中，加入30μl去离子水，放置1-2min，1000×g离心1min，将微量核酸定量仪调零，吸取1μl DNA样品至比色杯中，加水至50μl，混匀后分别读出DNA样品的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值。-20℃储存备用。

(10)载体和目的基因的连接

将双酶切后回收的目的基因与经同样双酶切后回收的载体按摩尔数之比3∶1混合，建立如下反应体系：

  表4重组载体和目的基因的连接

  试剂  体积  目的基因  载体  2×连接酶缓冲液  T₄DNA连接酶  3μl  1μl  5μl  1μl

总体积10μl，4℃过夜。

(11)CaCl₂处理法制备感受态细菌

从低温冰箱中取出冻存的大肠杆菌DH5α，待菌液融化后，用无菌接种环沾取少量菌液，采用三段划线法接种到LB固体培养基上，37℃培养过夜。

用无菌接种环挑取一个状态好的单菌落接种到5ml LB液体培养基中，37℃摇振培养过夜(摇振速度200r/min)，取菌液1ml接种到100ml LB液体培养基中，37℃摇振培养2-3h(摇振速度250r/min)，至OD₆₀₀值达到0.3-0.4之间时将烧瓶取出，立即冰浴15min。

从该步骤起均需无菌操作。将细菌转移到已灭菌的用冰预冷的50ml离心管中。

4000g离心10min，4℃，弃上清，倒置滤纸1min。

用加冰预冷的0.1M CaCl₂ 10ml重悬菌体，冰浴30min。

4000g离心10min，4℃，弃上清，倒置滤纸1min。

再加4ml冰预冷的0.1M CaCl₂轻轻重悬菌体。

置4℃冰箱12-24h，即可用于转化。

将感受态细菌分装成200μl一份，每份各加10％体积的甘油，置-70℃冰箱保存。

(12)细菌转化、蓝白斑及氨苄抗性克隆的筛选

无菌取新鲜感受态300μl，加入连接产物10μl，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热休克90sec(不要摇动试管)，冰浴2min。加无抗生素的LB液体培养基700μl，37℃150rmp培养45min。

制备含Ampicillin的琼脂平板，室温放置30min，于平板表面加X-gal(20mg/ml)40μl和IPTG(200mg/ml)4μl。用无菌涂布棒将试剂均匀涂布于整个平板表面，室温放置直到所有液体消失。

将培养45min后的菌液，3000g离心1min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LA平板上，37℃平放20min，然后倒置培养过夜。同时设对照组，一组为空的大肠杆菌，另一组为不含目的基因的空质粒载体。

(13)DNA测序和分析

选取鉴定阳性的克隆菌株，进行序列测定，委托上海博亚生物技术有限公司进行正反向测序，然后利用DNAstar软件分析序列。

二细胞系的筛选

(1)转染质粒的制备(无菌操作)

取纯化后质粒200μl加1/10体积的10M NH₄AC和2倍体积的无水乙醇沉淀质粒DNA，-20℃放置10min后，4℃12000g离心10min，弃上清，70％乙醇漂洗沉淀，在超净工作台中让乙醇挥发，每管各加入200μl水溶解沉淀。-20℃保存待用。

(2)分光光度法测定核酸浓度

将微量核酸定量仪调零，吸取1μlDNA样品至比色杯中，加水至50μl，混匀后分别读出DNA样品的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值

(3)MTT法测定G418和Zeocin的最低致死量

将培养瓶中的细胞用0.25％胰蛋白酶消化为单细胞悬液后计数，均匀铺于96孔板内。

待细胞汇片长至80％左右时，向孔内加入浓度为100mg/ml的G418或Zeocin，使其终浓度分别为：100mg/L、300mg/L、500mg/L、700mg/L、900mg/L同时每个浓度梯度平行做3个。

此后观察细胞，发现细胞数慢慢变少，2周后，有些孔内几乎没有活细胞。

将待测孔内分别加入20μl MTT，混匀后于37℃孵箱内孵育4h。

将上清弃去，各加入150μl DMSO以终止反应。

10-15min后，将96孔板放在酶标仪上，在490nm处读出结果。

(4)利用脂质体法将重组质粒转染入NIH3T3细胞及阳性克隆筛选

NIH3T3细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，按每孔4×10⁵细胞的量在六孔板中接种指数生长期的NIH3T3细胞，37℃5％CO₂培养至细胞约80％汇片。

取重组质粒2μg，加入100μl无血清DMEM培养基溶解DNA(溶液A)；溶液B：取10μl lipofecamine2000加入100μl无血清DMEM/F-12培养基混匀。

将溶液A、B混合，轻轻混匀，置室温20min，加0.8ml无血清DMEM培养基至脂质体混合物中，混匀。用无血清DMEM培养基洗NIH3T3细胞一次。

在每孔细胞上加1ml DNA/脂质体复合物，37℃5％CO₂培养5h。

将培养液换为新鲜含血清DMEM培养基，37℃5％CO₂培养24h。

吸去旧培养基，换新鲜完全DMEM培养基，加入500mg/L G418或Zeocin，37℃5％CO₂培养2周后，将单克隆用含0.25％胰蛋白酶的微膜滤片，消化后计数，按每孔0.5-1个细胞的浓度稀释到96孔板内。

2-3天后挑选只有单克隆的孔，用胰蛋白酶消化后加入500mg/L G418或Zeocin进行加压筛选。

待细胞长满后转移至24孔板中，再转移至六孔板中培养，最后转移至培养瓶中培养，同时将筛选压力改为维持剂量200mg/L。

(5)培养细胞的总RNA和蛋白提取

培养细胞的总RNA提取同前。

蛋白提取：

取10cm细胞培养皿中培养至约80％汇片的细胞，弃去培养基，用冰预冷的1×PBS洗两遍。

弃去PBS，往细胞培养皿中加1ml 1×PBS，用预冷的细胞刮子将细胞从壁上刮下，移入离心管中1000×g 4℃离心1min。

弃去PBS，加入20μl Buffer C，4℃冰浴20min。

1000×g 4℃离心3min，收集上清液进行蛋白分析。

(6)RT-PCR

于DEPC处理过的0.5ml Eppendorf管中，按表5所示加入所示试剂：

离心混匀，50℃30min进行逆转录反应，94℃预变性2min，扩增参数为：94℃30s，45℃30s，72℃2min，循环40次。末次延长7min。

(7)SDS-PAGE分析重组蛋白的表达

洗净玻璃板，装好电泳槽；配制浓度为7.5％或5％的分离胶，轻轻混匀，加入两层玻璃板之间，顶部用1-2ml双蒸水隔绝空气。

待分离胶聚合后，倒掉顶部的水，放好梳子，配制5％的浓缩胶，将浓缩胶加到分离胶的上面。

待胶凝固后，轻轻拔掉梳子，将样品与等体积2×Sample Loading Buffer混合，100℃煮沸5min。

将电泳槽加入足量的电泳缓冲液；用上样器轻轻将处理好的样品缓缓加入上样孔中，每孔加20μl样品，120V电压进行电泳，1.5h后取下凝胶。

       表5RT-PCR反应体系

 试剂  用量 10×RNA PCR缓冲液 Mgcl₂(25nM) dNTP(10mM) 总RNA 上游引物P1 下游引物P2 逆转录酶 Taq酶 无RNA酶的灭菌水  2.5μl  5μl  2.5μl  ≤1.0μg  0.5μl  0.5μl  0.5μl  0.5μl  至25μl

三肝细胞靶向性的测定

(1)引物的设计

针对绿色荧光蛋白基因设计一对引物，用于定量PCR。

(2)转染质粒的制备

方法同前。

(3)分光光度法测定核酸浓度

将微量核酸定量仪调零，吸取1μlDNA样品至比色杯中，加水至50μl，混匀后分别读出DNA样品的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值。

(4)利用钙磷沉淀法将重组质粒pLEGFP转染入包装细胞

已稳定表达ENV-PHSA-R和GAG-POL的NIH3T3细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，按1.0×10⁵细胞的量在10cm细胞培养皿中接种指数生长期的NIH3T3细胞。

37℃5％CO₂培养至细胞约80％汇片。

将10μg pLEGFP与终浓度为250mM CaCl2混匀，至混合物为500μl。

缓慢滴入等体积的2×HBS Buffer，轻轻吹打混合物1min。

室温培育混合物20min。

弃去细胞皿内液体，将DNA-磷酸钙沉淀物轻轻吹打混匀，缓慢均匀地将其加到细胞表面，轻轻地将培养皿摇动几次。

37℃5％CO₂培养5h；加10ml新鲜含血清DMEM培养基，37℃5％CO₂培养24h。

将培养液换为新鲜含血清DMEM培养基，48小时后收获病毒。

(5)逆转录病毒的收获

将细胞在-70℃和室温反复冻融3次，1000×g 4℃离心3min，除去细胞碎片；用孔径为0.22μm的无菌过滤器将病毒液进行过滤，分装入EP管中，-70℃保存。

(6)病毒滴度的测定

以NIH3T3细胞为受体细胞，根据标准滴度测定方法进行滴度测定。病毒滴度(CFU/ml)＝细胞克隆数×稀释倍数×20。

(7)RT-PCR检测辅助病毒env基因

先将病毒悬液在4℃条件下40000g×1h，提取RNA进行RT-PCR检测。引物序列为，上游5`TAGGTACCTTCGAGGGTCCAGCGTTCT3`，下游5`GCTCTAGACTATGGCTCGTACTCTA3`。于DEPC处理过的0.5ml Eppendorf管中，按表1.1加入所示试剂。

(8)逆转录病毒靶向性的检测

分别将培养瓶中的HepG2215及293T细胞用0.25％胰蛋白酶消化为单细胞悬液后计数，按每孔2×10⁴细胞的量在96孔板中接种指数生长期的细胞，37℃5％CO₂培养至细胞约80％汇片；

取病毒液按10^-1、10^-2、10^-3倍数进行稀释，并加入8μg/ml的Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)；

弃去细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞一次；一组培养基中加入人血清白蛋白，对照组中只加无血清培养基。

将稀释后的病毒液小心滴入细胞表面，轻轻混匀；，37℃5％CO₂培养3h，加入完全培养基，继续培养后即可用于荧光显微镜观察。

(9)定量PCR检测病毒靶向性

提取有逆转录病毒感染的HepG2215及293T细胞总RNA，RT-PCR后应用设计的pLEGFP引物对进行荧光定量PCR反应。反应条件为94℃预变性3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环后，在72℃延伸5min。荧光收集设定在退火阶段。

(10)统计学分析

检测结果用SPSS10 One-way ANOVA和T-Test统计软件方法进行统计分析。

实验结果

(一)重组表达载体的构建

(1)总RNA提取取两种细胞株各约1×10⁶细胞，提取总RNA，经微量核酸定量仪测得结果如表6：

            表6总RNA测定结果

  浓度(μg/ml)  OD₂₆₀/OD₂₈₀  PT67总RNA  HBV总RNA  830  760  1.81  1.93

(2)扩增结果

分别以提取的MLV和HBV的mRNA反转录，然后扩增，1％琼脂糖电泳检测扩增片段(图3a，3b)，扩增的片段与预期的大小一致。以ptVHRZ为模板，扩增后1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段(图3c，3d，3e)。

(3)目的基因与载体的连接、转化

将用限制性内酶酶切的质粒、同样酶切的回收目的基因，以T4DNA连接酶连接后，将产物转化感受态大肠杆菌DH5α，同时设阳性对照：未重组有目的基因的空载体；阴性对照：空大肠杆菌DH5α。将菌铺于含有100μg/ml Ampicillin的LB平皿上，过夜培养后，观察克隆形成情况，结果见表7。

表7重组载体转化宿主菌后克隆形成情况

  组别  克隆形成数  DH5α菌  空载体组  连接反应组  -  有大量单菌落  有大量单菌落

(4)重组质粒的酶切鉴定

随机挑选连接反应组中4个单菌落，提取质粒后酶切。重组质粒的酶切鉴定结果见图4。

(5)重组质粒的PCR鉴定

以env的上游引物和preS2下游引物，对重组质粒pcDNA3.1(-)-env-preS2、pcDNA3.1(-)-preS2-env进行PCR扩增，电泳呈现约2200bp的特异条带(图4-1)。

以HDV核酶的上下游引物，对重组质粒pMSCV/u6-HDVRZ进行PCR扩增，电泳呈现约73bp的特异条带(图5)。

(6)序列测定结果

测定的序列(图6)均与GenBank报道的一致。

(二)细胞系的筛选

(1)转染质粒的制备

质粒除菌后在微量核酸定量仪上测定浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，结果如表8：

                  表8质粒DNA提取纯化结果

  重组质粒  浓度(μg/ml)  OD₂₆₀/OD₂₈₀  pcDNA3.1(-)-env-preS2  pcDNA4/HisMaxA-gag-pol  821  836  1.74  1.72

(2)MTT法测定G418和Zeocin的最低致死量

G418和Zeocin作用14天后，利用MTT法测定其最低致死量均为500μg/L。

(3)脂质体转染条件的优化

参考Invitrogen公司脂质体转染的建议条件，在六孔板中细胞汇片为80％左右、质粒DNA的量为2.0μg的条件下，分别加入7.5μl、10μl和12.5μl的脂质体，使细胞在脂质体-DNA复合物中暴露5h，最后摸索出最佳转染条件：7.5μl脂质体、2.0μg质粒pcDNA3.1(-)-env-preS2六孔板中细胞80％汇片、细胞在脂质体-DNA复合物中暴露5h。

结果见表9。

                            表9脂质体转染条件的优化

  pcDNA3.1(-)-env-preS2  (μg)  脂质体  (μl)  细胞汇片  暴露时间  (h)  抗性克隆数  (个/4×10⁵)  2  2  2  7.5  10  12.5  80％  80％  80％  5  3  5  10  7  5

(4)阳性克隆筛选

1)重组质粒转染NIH3T3细胞

转染分以下五组进行：

pcDNA3.1(-)-env-preS2突变质粒组；

pcDNA3.1(-)-env-preS2转染组；

pcDNA3.1(-)-env突变质粒组；

pcDNA3.1(-)-env质粒组。

单纯脂质体对照组

转染前NIH3T3细胞和转染后G418抗性细胞克隆见图7。

2)重组质粒pcDNA4/HisMaxA-gag-pol转染已稳定表达ENV-preS2的NIH3T3细胞

转染分以下三组进行：

稳定表达pcDNA3.1(-)-env-preS2突变质粒组；

稳定表达pcDNA3.1(-)-env-preS2转染组；

稳定表达pcDNA3.1(-)-env突变质粒组；

稳定表达pcDNA3.1(-)-env。

重组质粒pcDNA4/HisMaxA-gag-pol转染已稳定表达ENV-S2的NIH3T3细胞出现阳性克隆。

转染后Zeocin抗性细胞克隆见图8。

(5)总RNA提取

取约1×10⁶细胞，TRIzol法提取总RNA，经微量核酸定量仪测得结果如下表；

           表10总RNA测定结果

浓度(μg/ml)  OD₂₆₀/OD₂₈₀  总RNA840  1.71

(6)RT-PCR结果

以preS2的上游引物和preS2下游引物，对重组质粒pcDNA3.1(-)-env-preS2转染细胞株进行RT-PCR扩增鉴定，电泳呈现约扩出170bp左右的特异条带(图9a)。

以env的上游引物和preS2下游引物，对重组质粒pcDNA3.1(-)-env-preS2、转染细胞株进行RT-PCR扩增鉴定，电泳呈现约2200bp的特异条带(图9b)。以gag-pol第二部分的上下游引物，对重组质粒pcDNA4/HisMaxA-gag-pol转染已稳定表

达ENV-preS2的NIH3T3转染细胞株进行RT-PCR扩增鉴定，电泳呈现约1226bp的特异条带(图9c)。

(7)SDS-PAGE分析重组蛋白的表达

1)SDS-PAGE分析重组蛋白ENV-preS2的表达

在蛋白分子量标准97.4-66.2KD之间出现一条特异性的带，证明重组质粒pcDNA3.1(-)-env-preS2在NIH3T3细胞中实现了表达(图10)。

2)SDS-PAGE分析重组蛋白GAG-POL的表达

将提取的蛋白进行SDS-PAGE，凝胶经考马斯亮蓝染色，结果可见在相对分子质量

(Mr)215×10³～120×10³之间有蛋白条带，而对照组未见反应条带(图11)。

(三)肝细胞靶向性的测定

(1)病毒生产

用钙磷沉淀法将逆转录病毒载体pLEGFP转染已稳定表达ENV-PHSA-R和GAG-POL的细胞系中，48h后收获其上清中的重组逆转录病毒。

(2)病毒滴度的测定

以NIH3T3细胞为受体细胞，测得其上清重组逆转录病毒滴度为4.0×10⁶CFU/ml。

(3)辅助病毒的检测

以转导的N1H3T3细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增，逆转录病毒转导的NIH3T3细胞未扩增出1983bp的env基因产物，对照组构建的包装细胞系则为阳性，这表明体系中病毒反式结构基因env无转移，没有辅助病毒的产生。在标记基因的补救分析中，包装细胞系所生产的病毒均为复制缺陷型病毒，仅能将HDVRZ基因转移至NIH3T3细胞，而后者不能将HDVRZ基因转移至NIH3T3细胞，经嘌呤霉素选择后未见抗性克隆生长，从功能方面证实无辅助病毒产生，表明所构建的转移系统是安全可靠的。

(4)重组逆转录病毒靶向性测定

分别以重组表达载体pcDNA3.1(-)-env突变-preS2、pcDNA4/HisMaxA-gag-pol、pLEGFP组为实验组；重组表达载体pcDNA3.1(-)-env突变、pcDNA4/HisMaxA-gag-pol、pLEGFP组；重组表达载体pcDNA3.1(-)-env-preS2、pcDNA4/HisMaxA-gag-pol、pLEGFP组；重组表达载体pcDNA3.1(-)-env、pcDNA4/HisMaxA-gag-pol、pLEGFP组均为对照组，转染后产生的逆转录病毒感染HepG2215细胞、293T细胞，分别于24h、48h、72h、96h经荧光显微镜观察。

(5)定量PCR检测病毒靶向性

应用定量PCR对绿色荧光蛋白进行定量检测病毒载体的靶向性。以pcDNA3.1(-)-env-S2为基础构建的逆转录病毒在人血清白蛋白藕联作用下能够靶向性感染HepG2215细胞。