快速鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法

摘要

快速鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法，涉及一种运用革兰氏阳性和阴性灭活病原菌快速分离纯化与之互作的宿主蛋白的方法。提供一种快速可靠检测鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法。利用甲醛灭活病原菌；用洗脱液去除病原菌菌体外膜上易脱落成分；让病原菌与宿主蛋白孵育，让宿主蛋白中能与病原菌互作的蛋白黏附到病原菌表面；用洗脱液收集互作的宿主蛋白。由于利用灭活病原菌捕捉宿主体内相互作用蛋白，采用灭活的病原菌吸附宿主蛋白，避免因活菌而使互作的宿主蛋白受到病原菌外膜或者分泌蛋白污染的问题。所得蛋白全来源于宿主，无病原菌污染物，是一种高效可靠的检测宿主中参与针对病原菌的防御系统中的首道防线中的蛋白组成情况的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种宿主蛋白，尤其是涉及一种运用革兰氏阳性和阴性灭活病原菌快速分离纯化与之互作的宿主蛋白，特别是其中微量蛋白的方法。

背景技术

多细胞生物如果无法感知并消除微生物的入侵将无法生存，由于微生物分子的异质性和高速度的进化，辨别它们是很困难的。但生物已经进化出几种策略来完成该任务，模式识别策略(pattern-recognition strategy)就是其中一个，生物通过模式识别受体(PRRs)与病原的模式相关的分子模式(PAMPs)结合识别病原，启动信息传递机制。Toll-like receptor(TLR)家族是最具代表性的PRRs，1996年Hoffmann的研究小组在果蝇中发现了作为模式识别受体的Toll受体。1年后，又从人体内找到了可激发获得性免疫的Toll同源物(即Toll-like receptor 4，TLR4)。到20世纪90年代，发现鼠的TLR4是识别脂多糖的受体，此后，许多哺乳动物的TLRs受体陆续被发现，它们分别识别特异的PAMPs。TLR的发现使人们意识到先天性的免疫反应不仅是机体抵抗微生物的第一道防线，而且也是激发获得性免疫反应的关键步骤。通过病原菌与动物的宿主体液蛋白互作，然后洗脱黏附在病原菌表面的宿主蛋白，有望获得宿主体液防御体系中参与识别入侵病原菌的某些蛋白，甚至可能找到一些新的PRRs，以进一步阐明宿主启动免疫反应的信息传递机制。新加坡国立大学的Zhu等人(Zhu Y，Thangamani S，Ho B and Ding JL.The ancient origin of the complement system.TheEMBO Journal.2005，24：382-394.)用活葡萄球菌(Staphylococcus aureus)吸附宿主鲎的血清，从中分离出了与病原菌互作的与脊椎动物补体C3功能类似的CrC3，然而其葡萄球菌的阴性对照组中出现了许多来自病原菌的杂带，很难与来自宿主的蛋白区分开，这对后续的研究带来了许多不便，特别是无法鉴定出低丰度的蛋白质。

发明内容

本发明的目的在于针对宿主中与病原菌互作的蛋白，存在使用活菌时来自病原菌的蛋白污染样品的不足之处，提供一种快速可靠检测鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法。

为此本发明所采用的技术方案是采用灭活的病原菌与宿主蛋白在体外互作，其步骤为：

1)利用甲醛灭活病原菌；

2)用洗脱液去除病原菌菌体外膜上易脱落的成分；

3)让病原菌与宿主蛋白孵育，让宿主蛋白中能与病原菌互作的蛋白黏附到病原菌的表面；

4)用洗脱液收集互作的宿主蛋白。

在步骤1)中所述的灭活病原菌是将用生理盐水洗过至少1遍的病原菌用0.5％-1％的甲醛溶液重悬；在70～90℃灭活30～90min。

在步骤2)中所述的去除病原菌外膜上易脱落的成分是以4000～15000g离心至少2min，去除甲醛溶液；然后用含4～5M urea(以4.5M为佳)的pH为7.4～8.5(以8.0为佳)的0.01M Tris-HCl溶液重悬菌体，震荡60～120min(以90min为佳)，以4000～15000g离心至少2min，去上清，至少重复1次；最后用生理盐水洗至少1遍，离心至少2min，去除上清。

在步骤3)中所述的病原菌与宿主蛋白孵育是把宿主蛋白和病原菌混匀，震荡30～120min(最好为90min)，以4000～15000g离心至少2min，去上清；最后用生理盐水洗至少1遍，4000～15000g离心至少2min，去除上清。

在步骤4)中所述的用洗脱液收集互作的宿主蛋白是用4～5M urea的Tris-HCl溶液(以4M urea为佳)重悬菌体，以4000～15000g离心至少2min，所得的菌体待用；上清加入3～5倍体积的丙酮，置于低于-20℃的温度下至少30min，在3～6℃的温度下以10000～30000g离心至少10min，沉淀干燥，用pH为7.4～8.5(以pH8.0为佳)的0.01MTris-HCl溶液或者0.01M PBS溶液重悬，用Bradford检测法测定蛋白浓度，然后进一步用SDS-PAGE分析，最后进行质谱鉴定。

在步骤4)中，所得的菌体用生理盐水洗至少1遍后，可以与在步骤3)中的宿主蛋白上清重新混匀，然后按上述步骤3)和4)洗脱所需的蛋白。所述的菌体和宿主蛋白上清可以重复利用至少3次。

与现有的采用活菌捕捉的方法相比，由于本发明利用灭活病原菌捕捉宿主体内相互作用蛋白，采用灭活的病原菌来吸附宿主蛋白，避免了因为活菌而使互作的宿主蛋白受到病原菌外膜或者分泌蛋白污染的问题。因此本发明的突出优点在于所得到的蛋白全是来源于宿主，无病原菌污染物，是一种高效可靠的检测宿主中参与针对病原菌的防御系统中的首道防线中的蛋白组成情况的方法。

附图说明

图1为与大肠杆菌K12相互作用的文昌鱼体液蛋白的SDS/PAGE分析。在图1中，1.活病原菌的阴性对照(灭活葡萄球菌与生理盐水孵育)；2.与活病原菌互作的宿主蛋白(灭活葡萄球菌与文昌鱼体液蛋白孵育)。

图2为本发明与金黄色葡萄球菌相互作用的文昌鱼体液蛋白的SDS/PAGE分析。在图2中，1.为与病原菌互作的宿主蛋白(灭活K12与文昌鱼体液孵育)；2.为病原菌的阴性对照(灭活K12与生理盐水孵育)。

图3为本发明与嗜水气假单胞菌相互作用的文昌鱼体液蛋白的SDS/PAGE分析。在图3中，1.为与病原菌互作的宿主蛋白(灭活金黄色葡萄球菌与文昌鱼体液孵育)；2.为病原菌的阴性对照(灭活金黄色葡萄球菌仅与生理盐水孵育)。

图4为本发明与大肠杆菌K12相互作用的果蝇体液蛋白的SDS/PAGE分析。在图4中，1.为与病原菌互作的宿主蛋白(灭活大肠杆菌K 12与果蝇体液孵育)；2.为病原菌的阴性对照(灭活大肠杆菌K12仅与生理盐水孵育)。

图5为本发明与金黄色葡萄球菌相互作用的小白鼠体液蛋白的SDS/PAGE分析。在图5中，1.为与病原菌互作的宿主蛋白(灭活金黄色葡萄球菌与小白鼠血清孵育)；2.为病原菌的阴性对照(灭活金黄色葡萄球菌仅与生理盐水孵育)。

具体实施方式

实施例1

1、病原菌灭活：

实验采用的大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)为本实验室保存菌种。挑取该菌株的单菌落，接种于500ml培养基中37℃，200rpm，12h摇菌，5000g室温，离心10min，去上清；菌体用生理盐水洗过3遍，5000g室温，离心10min；所得菌体分别用1％的甲醛溶液重悬；80℃灭活90min。

2、去除病原菌表面易脱落的成分：

12000g，室温5min离心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬菌体，轻摇90min，12000g，室温5min离心，去上清，重复3次；最后用8.5％的生理盐水洗3遍(12000g，5min离心，室温去上清)。

3、病原菌与宿主蛋白孵育：

把病原菌平分成两组，一组与文昌鱼体液混匀，另一组作为对照组与等体积生理盐水混匀；都置于室温，轻摇60min；12000g 4℃离心5min；文昌鱼的血清4℃暂时保存；最后两组都用8.5％的生理盐水洗3遍。

4、蛋白洗脱

用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分别重悬菌体，室温轻摇60min，分别于12000g，4℃，5min离心，菌体分别都收于4℃；上清分别加入4倍体积的丙酮，置于-20℃，过夜，12000g，4℃，离心20min，沉淀风干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重悬，然后进一步用SDS-PAGE分析结果见图1，最后进行质谱鉴定发现1号蛋白为histone h4，并且蛋白得分具有显著性。检测结果见图1。

实施例2

1、病原菌灭活：

实验采用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)为本实验室保存菌种。挑取该菌株的单菌落，接种于500ml培养基中37℃，200rpm，12h摇菌，5000g室温，离心10min，去上清；菌体用生理盐水洗过3遍，5000g室温，离心10min；所得菌体分别用1％的甲醛溶液重悬；70℃灭活90min。

2、去除病原菌表面易脱落的成分：

12000g，室温5min离心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬菌体，轻摇90min，12000g，室温5min离心，去上清，重复3次；最后用8.5％的生理盐水洗3遍(12000g，5min离心，室温去上清)。

3、病原菌与宿主蛋白孵育：

把病原菌平分成两组，一组与文昌鱼体液混匀，另一组作为对照组与等体积生理盐水混匀；都置于室温，轻摇60min；12000g 4℃离心5min；文昌鱼的血清4℃暂时保存；最后两组都用8.5％的生理盐水洗3遍。

4、蛋白洗脱

用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分别重悬菌体，室温轻摇60min，分别于12000g，4℃，5min离心，菌体分别都收于4℃；上清分别加入4倍体积的丙酮，置于-20℃，过夜，12000g，4℃，离心20min，沉淀风干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重悬，然后进一步用SDS-PAGE分析结果见图2，最后进行质谱鉴定发现1号蛋白为pol protein，并且蛋白得分具有显著性。检测结果见图2。

实施例3

1、病原菌灭活：

实验采用的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为本实验室保存菌种。挑取该菌株的单菌落，接种于500ml培养基中37℃，200rpm，12h摇菌，5000g室温，离心10min，去上清；菌体用生理盐水洗过3遍，5000g室温，离心10min；所得菌体分别用1％的甲醛溶液重悬；80℃灭活90min。

2、去除病原菌表面易脱落的成分：

12000g，室温5min离心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬菌体，轻摇90min，12000g，室温5min离心，去上清，重复3次；最后用8.5％的生理盐水洗3遍(12000g，5min离心，室温去上清)。

3、病原菌与宿主蛋白孵育：

把病原菌平分成两组，一组与文昌鱼体液混匀，另一组作为对照组与等体积生理盐水混匀；都置于室温，轻摇60min；12000g 4℃离心5min；文昌鱼的血清4℃暂时保存；最后两组都用8.5％的生理盐水洗3遍。

4、蛋白洗脱

用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分别重悬菌体，室温轻摇60min，分别于12000g，4℃，5min离心，菌体分别都收于4℃；上清分别加入4倍体积的丙酮，置于-20℃，过夜，12000g，4℃，离心20min，沉淀风干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重悬，然后进一步用SDS-PAGE分析结果见图3，最后进行质谱鉴定发现1号蛋白为Actin，muscle，并且蛋白得分具有显著性。检测结果见图3。

实施例4

1、实验采用的大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)为本实验室保存菌种。挑取该菌株的单菌落，接种于500ml培养基中37℃，200rpm，12h摇菌，5000g室温，离心10min，去上清；菌体用生理盐水洗过3遍，5000g室温，离心10min；所得菌体分别用1％的甲醛溶液重悬；80℃灭活90min。

2、去除病原菌表面易脱落的成分：

12000g，室温5min离心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬菌体，轻摇90min，12000g，室温5min离心，去上清，重复3次；最后用8.5％的生理盐水洗3遍(12000g，5min离心，室温去上清)。

3、病原菌与宿主蛋白孵育：

把病原菌平分成两组，一组与果蝇体液混匀，另一组作为对照组与等体积生理盐水混匀；都置于室温，轻摇60min；12000g 4℃离心5min；文昌鱼的血清4℃暂时保存；最后两组都用8.5％的生理盐水洗3遍。

4、蛋白洗脱

用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分别重悬菌体，室温轻摇60min，分别于12000g，4℃，5min离心，菌体分别都收于4℃；上清分别加入4倍体积的丙酮，置于-20℃，过夜，12000g，4℃，离心20min，沉淀风干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重悬，然后进一步用SDS-PAGE分析结果见图4，最后进行质谱鉴定发现1号蛋白为glycogen phosphorylase；2号蛋白为ATP synthase beta subunit；并且蛋白得分都具有显著性。检测结果见图4。

实施例5

1、病原菌灭活：

实验采用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)为本实验室保存菌种。挑取该菌株的单菌落，接种于500ml培养基中37℃，200rpm，12h摇菌，5000g室温，离心10min，去上清；菌体用生理盐水洗过3遍，5000g室温，离心10min；所得菌体分别用1％的甲醛溶液重悬；70℃灭活90min。

2、去除病原菌表面易脱落的成分：

12000g，室温5min离心，去除甲醛溶液；然后用含4.5M urea的0.01M Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬菌体，轻摇90min，12000g，室温5min离心，去上清，重复3次；最后用8.5％的生理盐水洗3遍(12000g，5min离心，室温去上清)。

3、病原菌与宿主蛋白孵育：

把病原菌平分成两组，一组与小白鼠血清混匀，另一组作为对照组与等体积生理盐水混匀；都置于室温，轻摇60min；12000g 4℃离心5min；小白鼠的血清4℃暂时保存；最后两组都用8.5％的生理盐水洗3遍。

4、蛋白洗脱

用含4M urea的0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液分别重悬菌体，轻摇60min，分别于12000g，4℃，5min离心，菌体分别都收于4℃；上清分别加入4倍体积的丙酮，置于-20℃过夜；12000g，4℃，离心20min，沉淀风干，用0.01M Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶液重悬，然后用SDS-PAGE分析结果见图5，最后进行质谱鉴定发现1号蛋白为immunoglobulinheavy chain variable region，并且蛋白得分具有显著性。检测结果见图5。