具雌激素活性的红车轴草提取物的制备方法及其提取物

摘要

一种具雌激素活性的红车轴草提取物的制备方法及其提取物。其制备工艺，是以动物模型雌激素药效学实验的结果为导向。该工艺包括下列步骤：(1)用含水乙醇提取红车轴草地上部分，过滤提取液蒸馏浓缩滤液至10－30％醇浓度；(2)向浓缩液中加入浓度为10－30％的乙醇溶液及澄清剂，搅拌混匀，放置沉淀；(3)取上清液通过苯乙烯型大孔吸附树脂柱，水洗柱后，用含水乙醇洗脱；(4)部分回收洗脱液中的乙醇后，加入蒸馏水对该浓缩液稀释至含醇量10－20％，该溶液通过聚酰胺层析柱，水洗柱后，用含水乙醇洗脱，浓缩洗脱液并真空干燥，粉碎得土黄色粉末。该粉末主要成分为异黄酮、香豆素类，以紫外分光光度法测定在260nm处有最大吸收的成分含量超过50％。该提取物具有雌激素活性。

说明书

技术领域

本发明涉及中药领域，更具体地说是涉及一种从豆科车轴草属植物红车轴草中提取的有效部位，以及该提取物制备方法的改进技术。

背景技术：

红车轴草(Trifolium pratense L.)为豆科车轴草属多年生草本植物，又名红三叶、红花苜蓿和三叶草等，为优良的饲料和牧草，广泛分布于世界各地，我国新疆、吉林、云贵高原、湖北鄂西山地都有野生，江淮流域、华南、西南等地均有栽培，是我国长江流域以南地区优良的豆科牧草。民间主要用作治疗更年期综合症、骨质疏松症、抗肿瘤(乳腺癌、子宫癌、前列腺癌等)，国外已有多种红车轴草制剂产品上市，是国际上公认的治疗更年期综合症疗效确切的植物药，其销量在美国多年以来一直名列植物药的前十位，非常受欢迎，我国每年均有其大量提取物出口。中国专利CN1566108A和CN1439367A也公开了二种红车轴草提取物的制备工艺。为充分挖掘和利用我国这一宝贵植物资源，很有必要对这一植物进行深入研究，特别是以动物药效学结果为导向，制订完全符合工业化生产的有效部位制备工艺。

现代化学研究表明，红车轴草中主要含有(异)黄酮类、香豆素类及酚羧酸类成分，均属于植物雌激素范畴，显然，红车轴草雌激素活性有效部位应是上述三类成分的总和，而非单一的异黄酮类成分，雌激素有效部位的筛选依据应是动物药效学实验结果，并非单纯提高异黄酮的含量。

植物雌激素(phytoestrogens PE)是指某些能结合并激活哺乳类动物及人类的雌激素受体，从而具有雌激素活性的植物成分，主要存在于豆类植物和齿状植物中。植物雌激素为杂环多酚类化合物，依据分子结构的不同主要包括以下三类成分：异黄酮类(isoflavones)、香豆素类(coumestans)、木脂素类(lignans)，上述三类成分其结构与哺乳类动物雌激素17β-雌二醇相似，在植物中广泛存在。自Bennetts HW1946年首次报道植物雌激素活性以来，由于植物雌激素对人类有明显的保健作用，而无明显的毒副作用，且资源丰富，因而受到世界上许多科学家的重视，上世纪90年代欧美国家政府纷纷主动拨款以资助该项研究。

现代科学研究的成果证实植物雌激素对与雌激素水平相关的许多疾病有很好的保健和治疗作用，主要体现在骨质疏松、更年期综合症、癌症及心血管病症方面。植物雌激素可看成是对传统激素替代疗法(hormonereplacement therapy，HRT)的潜在替代治疗物，主要是因为如果长期服用化学激素类药物可产生明显的副作用，如：易促发子宫内膜癌、乳腺癌、阴道出血等。有调查表明，由于女性担心化学激素类药物改变了其自然的生理过程，出于对副作用的恐惧，仅有35-49％的女性接受传统的激素替代疗法，其中仍有一部分不能长期坚持应用，根据一些非专业的报告，许多女性擅自使用一些中草药治疗更年期综合症，常有明显的效果，其中起作用的成分是植物雌激素。

植物雌激素较化学类雌激素药物的一大明显优势是其可长期服用，而无明显副作用，其原因是天然植物雌激素具有选择性雌激素受体(estrogenreceptor，ER)调节剂的作用，1997年Kuiper发现了一种新雌激素受体，与以前已知的ER(现在称为ERα)不同，称为ERβ，植物雌激素分别可与ERα和ERβ受体结合，但与二者的亲合力不同，资料显示，植物雌激素对ERβ的亲合力高于ERα，而内源性的甾醇雌激素则没有这种差异，其植物雌激素作用可能由ERβ介导，由于ERα和ERβ在不同组织和细胞的表达不同，因而植物雌激素与内源性雌激素雌二醇有着不同的组织特异性而发挥不同的作用。同时植物雌激素也可与雌二醇竞争性地结合ER产生雌激素拮抗作用，当体内雌激素水平过高时，植物雌激素则可与ERα结合发挥拮抗作用，故具有双向性，可以有效地避免由于体内雌激素水平过高所产生的副作用。一般低剂量时，与内源雌激素竞争结合ER，主要表现为抗雌激素活性；中剂量时，它可以产生一定的雌激素活性；高剂量时，它可以活化因雌激素水平限制未能活化的ER，产生雌激素强效应，所以，植物雌激素可通过与不同受体的结合实现对人体内雌激素水平的自控平衡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备具雌激素活性的红车轴草提取物的方法。本发明的另一个目的是提供一种具有较好雌激素样作用的红车轴草提取物。

本发明的解决方案是从干燥红车轴草中提取具雌激素活性的红车轴草提取物，所述提取物的制备方法，包括以下主要步骤：

(1)红车轴草地上部分，粉碎，用含水的乙醇溶液提取。所说的红车轴草地上部分，是指干燥药材；用于提取红车轴草的含水乙醇溶液，其乙醇浓度为50-95％；用量为药材重量的5-15倍；加热回流提取2-3次，每次2-3小时为较佳。

(2)过滤提取液，浓缩滤液并回收乙醇，滤液浓缩至10-30％醇浓度。当提取用乙醇浓度较高时，为防止浓缩后期的焦糊现象，可向滤液中加入适量的蒸馏水。

(3)浓缩液加入浓度为10-30％的乙醇溶液和澄清剂，搅拌混匀后放置沉淀。10-30％的乙醇溶液的加入量为药材重量的5-15倍，最终药液量为药材重量的8-12倍为佳，加入量太小，溶液浓度太大，沉降效果不好，加入量太大，则增加劳动强度。澄清剂的加入量为药材重量的0.05-0.5％，加入量太小，沉降效果不好，加入量太大，则造成不必要的浪费。为提高提取物得率，沉淀部分可用适量10-30％的乙醇溶液洗涤2次，上清液合并后也通过大孔吸附树脂柱。所说的澄清剂选自甲壳素类、101果汁类及ZTCl+1类澄清剂，加入时应按照每类澄清剂的使用说明，配成溶液使用，边加边搅，混合均匀。

(4)取上清液通过苯乙烯型大孔吸附树脂柱，水洗后用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。所说的苯乙烯型大孔吸咐树脂柱，是指已用酸、碱、有机溶媒、蒸馏水等处理好的苯乙烯型大孔吸附树脂柱，为保证有效成分在柱上的充分吸附，滤液通过柱的流速不宜过快，以三氯化铁试剂检查流出液为阴性反应为宜，滤液全部通过柱后，用蒸馏水洗柱去除杂质，柱流速可适当快些，蒸馏水洗至流出液颜色较浅后，采用50-95％的乙醇溶液将柱上吸附的成分洗下，此时可看到柱上有明显的棕红色的色带随着洗脱的进行逐渐向下移动，待该色带接近柱底端或出现三氯化铁阳性反应时，开始收集洗脱液，收集至洗脱液三氯化铁阴性反应。

(5)蒸出洗脱液中的部分乙醇，浓缩液再加入蒸馏水稀释，控制溶液中乙醇含量至10-20％。其目的是为了大孔吸附树脂乙醇洗脱液中的成分能够全溶，10-20％的乙醇浓度不会影响异黄酮、香豆素类成分在聚酰胺柱上的吸附。为保证有效成分在聚酰胺层析柱上的吸附效果，10-20％乙醇溶液的量应为药材重量的10-20倍，浓度太大，有效成分在聚酰胺层析柱上的吸附效果不好，必要时，在上聚酰胺层析柱前，用10-20％的乙醇稀释。

(6)将稀释后的溶液通过聚酰胺层析柱，用蒸馏水洗柱后，以乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。该聚酰胺柱使用前亦是已用酸、碱、有机溶媒、蒸馏水等处理好，为保证有效成分在柱上的充分吸附，滤液通过柱的流速不宜过快，以三氯化铁试剂检查流出液为阴性反应为宜，滤液全部通过柱后，用蒸馏水洗柱去除杂质，柱流速可适当快些，蒸馏水洗至流出液颜色较浅后，采用50-95％的乙醇溶液将柱上吸附的成分洗下，此时可看到柱上有明显的棕红色的色带随着洗脱的进行逐渐向下移动，待该色带接近柱底端或出现三氯化铁阳性反应时，开始收集洗脱液，收集至洗脱液三氯化铁阴性反应。

(7)浓缩洗脱液，并回收乙醇，得到的稠膏经真空干燥后，微粉化成300目以下的微粉，以提高该提取物的生物利用度。

按照本发明所述的红车轴草提取物的制备方法所制得的红车轴草提取物显示以下特性：

(1)土黄色粉末，微粉粒径为300-400目；

(2)该粉末主要成分为异黄酮、香豆素类；

(3)紫外分光光度光谱特征吸收峰(nm)：260，206；

(4)红外光谱特征吸收峰(cm^-1)：3520，3080，2920，1720，1680，1610，1280，1050，960；

(5)显色化学反应如下：

A：三氯化铁反应显墨绿色，阳性。说明含有酚羟基类化合物，异黄酮及香豆素类成分结构中一般也含有酚羟基。

B：浓硫酸反应显黄色-浆红色，说明含有异黄酮类成分。浓硫酸是强氧化剂，几乎对所有的成分均可产生反应，但对每类成分的显色不同。

C：钠汞齐反应显黄色-红紫色，说明含有异黄酮类成分。

D：异羟腭酸-铁反应显红色，说明含香豆素类成分。

(6)本发明与原发明提取物的雌激素作用(子宫系数)比较，小、中、大三个剂量组的小鼠子宫系数均有明显提高，是由于在本发明的提取物中含有香豆素类等其它雌激素活性成分的缘故。

本发明制备方法与CN1566108A及CN1439367A工艺的关键差别在于采用了澄清剂及大孔吸附树脂和聚酰胺柱的组合对提取液进行纯化处理；按本发明方法制得的红车轴草提取物既含有异黄酮类成分，也含有香豆素类成分；该提取物具有雌激素样作用。

本发明的一个重要特点是在对红车轴草提取液进行纯化处理时，加入了一种澄清剂。

我们对红车轴草的乙醇提取液浓缩并加水稀释后发现，上清液仍较浑浊，沉降效果不好，这样无疑会使得过滤困难，且滤液很容易“毒化”树脂柱，影响纯化效果且缩短树脂柱寿命，所以我们采用了澄清剂以助沉。澄清剂是近些年来发展起来的一种适合于中药工业化生产的有效方法，它是通过吸附、架桥、絮凝等作用使提取液中的较大分子杂质沉降下来，达到纯化有效成分的目的。在该工艺中，向加水稀释后的浓缩液加入适量的澄清剂后，可使上清液澄清透明，使得有效成分与大分子杂质充分分离。

本发明的另一个重要特点是采用了澄清剂及大孔吸咐树脂和聚酰胺柱的工艺组合对提取取液进行纯化处理。

在澄清剂处理过的溶液中，还含有较多的小分子或中等大小分子的其它杂质，需要进一步处理，一般可有两种处理方案，一是采用乙酸乙酯萃取，二是进行大孔树脂柱层析。若采用乙酸乙酯萃取处理，尽管乙酸乙酯萃取部分中的异黄酮及香豆素类成分含量有明显提高，但母液中异黄酮及香豆素类成分的残留量也较大，大大降低提取物最终的得率，且萃取过程极易产生乳化，劳动强度又大，又考虑到环保、安全及生产成本等因素，所以采用大孔树脂柱层析更为合理，事实上，目前药厂实际生产中也基本采用此法。大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，具有交联立体结构，因而物理、化学性能稳定，机械强度好，经简单处理后可反复循环使用。随着近些年来大孔树脂的不断推广应用，适合于吸附分离各类成分的不同规格型号的大孔树脂应运而生，根据所分离成分的类别不同可分别采用不同规格型号的树脂，树脂的选择原则应对有效成分针对性强，选择性高，分离效果好，如：DM130、D101、D201、HPD100、HPD600、AB-8、NKA-9适用于吸附分离黄酮(苷)、蒽醌(苷)、香豆素类成分；D301、HPD300、NKA-9适用于吸附分离皂苷、生物碱类成分；D301、HPD600、NKA-9适用于吸附分离环烯醚萜苷类成分；JKS-30适合于洁霉素及其它抗菌素类成分的吸附分离等。

在大孔树脂的乙醇洗脱液中仍还有如异黄酮及香豆素分子大小，结构中不含酚羟基的其它杂质，为进一步纯化，需采用针对异黄酮及香豆素类成分更强的分离手段，在已有文献中采用了有机溶媒分级或萃取处理法，但该法消耗的有机溶媒体积较大，劳动强度及生产成本较高，在本发明的制备方法中我们考虑到异黄酮及香豆素分子中一般均含有酚羟基结构，所以采用了对酚羟基结构类成分有特异性吸附作用的聚酰胺柱层析，它是利用酚羟基可与聚酰胺中的酰胺键产生缔合这一性质，将异黄酮及香豆素类化合物吸附在聚酰胺柱上，该法较有机溶媒分级处理法劳动强度及生产成本低，有机溶媒用量小，利于环保。

本发明的再一个重要特点是采用动物药效学结果作为追踪有效部位的指标。

众所周知，植物中的成分类别众多且复杂，不同类别的成分与成分之间对某一病症可产生协同作用，某一植物对某一病症有效是该植物中的所有有效成分共同作用的结果；由于目前的科技水平所限，绝大多数植物中的成分还知之甚少，已知成分中的药理活性成分相对于植物中的所有成分来讲，更是凤毛麟角，所以采用动物药效学结果作为追踪有效部位的指标更加科学合理，本发明即是如此。现代化学研究表明，红车轴草中主要含有(异)黄酮类、香豆素类及酚羧酸类成分，均属于植物雌激素范畴，显然，红车轴草雌激素活性有效部位应是上述三类成分的总和，而非单一的异黄酮类成分，雌激素有效部位的筛选依据应是动物药效学实验结果，并非单纯提高异黄酮的含量，本发明即是遵照这一原则，在制备方法的研究中，以动物药效学的实验结果作为导向和基础，再结合工厂生产的成本低、污染小等具体要求，而不是单纯地侧重如何提高异黄酮类成分的纯度和得率，与开发新药的结合更加密切。

(1)由本发明制备方法制得的红车轴草提取物与现有技术制备的提取物的比较见表1

表1

  样品   性状   主要成分   主成分含量  (％，w/w)  提取物得率  (％，w/w)  粗提物   墨绿-棕褐色，易  吸潮结块  异黄酮、植  物色素等  异黄酮含量  10-20  5-10   原发明  淡黄色粉末  异黄酮  ≥50  0.80  本发明   土黄色粉末   异黄酮、香  豆素  ≥50   0.91 

本发明与原发明比较提取物得率增加了13.85％，在工业生产中具有重要意义。

(2)由本发明制备方法制得的红车轴草提取物与原发明制备的提取物的雌激素作用(子宫系数)比较

实验方法按原发明对未成熟雌性小鼠子宫发育的影响项下进行：选取健康雌性小鼠40只，体重11-13g，分为空白对照组和给药组。三个小、中、大剂量给药量分别为250、500、750mg/kg(以异黄酮、香豆素计)，空白对照组给予相同体积的蒸馏水，一次/日，连续七天，末次给药后第二天，小鼠称重，颈椎脱臼处死动物，解剖取子宫，精密称重，计算子宫系数，并与原发明有关数据比较，见表2

表2

  组别  N(只)  剂量  (mg/kg)  子宫系数(X±S)mg/10g  原发明  本发明  蒸馏水  10  -  14.53±5.35  14.45±4.67   提取物   10  10  10  250  500  750  16.70±3.10  24.60±7.80  32.68±9.13  17.02±2.70  26.55±5.02  34.80±6.52

子宫增重作用与对照组比较差异显著(P＜0.01)。

本发明与原发明提取物的雌激素作用(子宫系数)比较，小、中、大三个剂量组的小鼠子宫系数均有明显提高，是由于在本发明的提取物中含有少量香豆素类等其它雌激素活性成分的缘故。

总之，本发明的优点是很明显的，本发明制备方法与上述制备工艺的关键差别在于采用了加澄清剂及大孔吸附树脂和聚酰胺柱的组合对提取液进行纯化处理，按本发明方法制得的红车轴草提取物既含有异黄酮类成分，也有香豆素类成分，总含量超过50％，本发明与现有技术比较提取物得率增加了13.85％，主要原因是以聚酰胺柱层析代替了有机溶剂的分级或萃取处理，降低了有效成分的损耗，在工业生产中具有重要意义；本发明制备的提取物的雌激素作用(子宫系数)与现有技术比较，小、中、大三个剂量组的小鼠子宫系数均有明显提高，动物实验证实，由本发明制得红车轴草提取物具有较好的雌激素样作用。本发明制备方法成本低廉、操作简单、没有采用一、二类有机溶媒，绿色环保，完全适合于工业化大生产。

具体实施方式

实施例1

取红车轴草地上部分1kg，粉碎，用药材重量10倍的50％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并乙醇提取液，蒸馏回收乙醇至10％醇度，加入10％乙醇溶液稀释药液，搅匀后，加入2gZTCl+1 II型澄清剂B组分配成的1％醋酸溶液200ml，搅拌混匀，0.5小时后再加入1gZTCl+1 II型澄清剂A组分配成的1％醋酸溶液100ml，搅拌混匀，放置6小时自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分别用4倍药材重量的10％乙醇溶液洗涤沉淀2次，上清液合并，将下部沉淀过滤，滤液与上清液合并后通过已处理好的DM130大孔吸附树脂柱(12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用70％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，可看到明显的棕红色色带向下移动，当色带移至层析柱的底端，流出液颜色开始加深且三氯化铁试剂反应阳性时，开始收集洗脱液，至流出液颜色较浅且三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇洗脱液，蒸馏回收乙醇至1/3体积，冷至室温，加入适量的蒸馏水(控制药液乙醇含量10％)，搅拌混匀，通过已处理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用70％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，收集洗脱液至三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇液，蒸馏回收乙醇并浓缩成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黄色粉末，重7.8g，紫外分光光度法在260nm处测定，异黄酮、香豆素类成分的含量为57％。

实施例2

取红车轴草地上部分1kg，粉碎，用药材重量15倍的95％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并乙醇提取液，蒸馏回收乙醇约2/3体积时，加入与剩余药液等体积的蒸馏水，继续浓缩至20％醇度，加入20％乙醇溶液稀释药液，搅匀后，加入3g甲壳素澄清剂配成的1％醋酸溶液300ml，搅拌混匀，放置8小时自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分别用4倍药材重量的20％乙醇溶液洗涤沉淀2次，上清液合并，将下部沉淀过滤，滤液与上清液合并后通过已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱(12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用95％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，可看到明显的棕红色色带向下移动，当色带移至层析柱的底端，流出液颜色开始加深且三氯化铁试剂反应阳性时，开始收集洗脱液，至流出液颜色较浅且三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇洗脱液，蒸馏回收乙醇至1/3体积，冷至室温，加入适量的蒸馏水(控制药液乙醇含量15％)，搅拌混匀，通过已处理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用95％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，收集洗脱液至三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇液，蒸馏回收乙醇并浓缩成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黄色粉末，重9.1g，紫外分光光度法在260nm处测定，异黄酮、香豆素类成分的含量为65％。

实施例3

取红车轴草地上部分1kg，粉碎，用药材重量10倍的70％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并乙醇提取液，蒸馏回收乙醇至30％醇度，加入30％乙醇溶液稀释药液，搅匀后，加入5g101果汁澄清剂配成的水溶液100ml，搅拌混匀，放置8小时自然沉淀，吸取上清液，沉淀部分分别用4倍药材重量的30％乙醇溶液洗涤沉淀2次，上清液合并，将下部沉淀过滤，滤液与上清液合并后通过已处理好的HPD100型大孔吸附树脂柱(12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用70％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，可看到明显的棕红色色带向下移动，当色带移至层析柱的底端，流出液颜色开始加深且三氯化铁试剂反应阳性时，开始收集洗脱液，至流出液颜色较浅且三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇洗脱液，蒸馏回收乙醇至1/3体积，冷至室温，加入适量的蒸馏水(控制药液乙醇含量20％)，搅拌混匀，通过已处理好的聚酰胺柱(80-100目；12×120cm；流速：15ml/min)，蒸馏水洗柱(流速：40ml/min)至流出液颜色不再变浅，用70％乙醇洗柱(流速：20ml/min)，收集洗脱液至三氯化铁试剂检测阴性，合并乙醇液，蒸馏回收乙醇并浓缩成流浸膏，真空干燥(90℃)，粉碎并微粉化，得土黄色粉末，重8.8g，紫外分光光度法在260nm处测定，异黄酮、香豆素类成分的含量为71％。