抑制表皮调节素EREG基因表达的反义寡核苷酸的结构和用途

摘要

本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒靶标及相应的反义寡核苷酸药物。具体说是一种作为抗乙型肝炎病毒感染的药物作用靶标的表皮调节素及靶向该表皮调节素的抗乙型肝炎病毒的反义寡核苷酸的结构以及这些反义寡核苷酸在制备治疗乙型肝炎及其相关性疾病的药物中的用途。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向表皮调节素(epiregulin)治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。

背景技术：

病毒性肝炎是严重威胁人类健康的世界性传染病。其中，HBV感染造成的乙型肝炎是一种会引起慢性感染的严重病毒性肝炎类型，转为慢性乙肝的患者存在着极高的患肝硬化及肝癌的危险。目前，人类仍然没有找到有效的药物能彻底清除体内HBV并最终治愈乙型肝炎，因此新型抗HBV药物具有重大的社会和经济效益。

epiregulin是表皮生长因子(EGF)家族中最新发现的一个因子，在各种上皮细胞来源的正常组织及肿瘤组织中发挥了一定的作用。本实验室通过筛选和验证发现epiregulin在抗HBV感染中具有很好的特异性和可药性，可发展成为抗HBV治疗的潜在作用靶点。

ASODN是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于ASODN作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。

本发明的目的是，根据已公开的epiregulin基因mRNA序列，设计针对epiregulin的ASODN，通过抑制epiregulin的表达，阻止HBV感染，抑制HBV复制和表达，为治疗慢性HBV感染提供新的特效的药物。

发明内容：

本发明的主要内容是：通过检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的epiregulin mRNA参考序列NM_001432，采用本实验室专利的，基于靶基因多能级预测结构的人工神经网络预测算法及本实验室设计的反义在线设计软件AODesigner(软件著作权号：2005SR12155)设计了5条靶向epiregulin的ASODN序列。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达。在自动DNA合成仪上合成硫代反义寡核苷酸序列(S-ASODN)。采用转染有HBV DNA，可稳定表达HBV蛋白和完整Dane氏颗粒的HepG2.2.15细胞模型，对上述ASODNs进行活性筛选和评价。结果显示5条ASODNs中，E3在0.8μmol/L时对HBV DNA，HBsAg，HBeAg，epiregulin蛋白具有明显的抑制作用，且对HBV DNA，HBsAg，HBeAg的抑制活性大于拉米夫定的抑制活性。在0.2-1.6μmol/L浓度范围内，E3对HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及epiregulin蛋白具有特异性的剂量依赖性抑制活性。

硫代反义寡核苷酸序列及性质

编号名称    靶位(nt) 长度(nt)  性质    反义序列(5’-3’)    1    2    3    4    5    6    E1    E2    E3    E4    E5    E3s    1147-1166    787-806    692-711    2901-2920    3257-3276    692-711    20    20    20    20    20    20    A    A    A    A    A    S CTA ATT GCA TTA TTG TTT TA TTT TTC AAG TAC ATT AAA AT ACT GTT ATC CCT GCC CAT AA AGT TTG GGA GGC TGT GGA GG TTG AGA GGC TTA CAA TAA AT TT ATG GGC AGG GAT AAC AGT

A：反义；  S：正义

根据本发明，抑制epiregulin的表达可特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，epiregulin有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物作用靶点。

根据本发明，针对epiregulin mRNA的ASODNs能特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，有可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型生物工程药物。

根据本发明，反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性，与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关，E3的长度根据实验确定，本发明包含了与E3具有相同序列的任何长度寡核苷酸。

根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了E3的硫代修饰。

根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。

根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他反义寡核苷酸及其衍生物形式。

根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。

本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。

附图说明：

图1epiregulin mRNA在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况

图2epiregulin蛋白在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及HepG2.2.15细胞经药物处理前后的表达变化情况

图3硫代epiregulin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用

图4硫代epiregulin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制作用

图5硫代epiregulin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用

图6硫代epiregulin反义寡核苷酸序列对HepG2.2.15细胞中epiregulin蛋白的抑制作用

图7硫代epiregulin反义寡核苷酸序列E3对HepG2.2.15细胞增殖的影响

图8硫代epiregulin反义寡核苷酸序列E3对HepG2.2.15细胞中epiregulin蛋白的抑制作用呈剂量依赖性及其正义序列E3s对HepG2.2.15细胞中epiregulin蛋白的抑制作用

图9硫代epiregulin反义寡核苷酸序列E3及其正义序列对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用

图10硫代epiregulin反义寡核苷酸序列E3对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg、HBVDNA的抑制作用呈剂量依赖性

具体实施方式：

实施例一

材料与方法

1.药物配制

拉米夫定用PBS溶解至终浓度为10mmol/L。

2.细胞培养

所用细胞为肝癌细胞系HepG2细胞株以及转染有HBV DNA的HepG2.2.15细胞株。HepG2.2.15细胞来源于HepG2细胞，含有整合的HBV DNA，在细胞培养过程中可持续稳定地向培养液中分泌Dane氏颗粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2细胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM细胞培养液培养，HepG2.2.15细胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液培养。

3.细胞加药

待HepG2.2.15细胞长满后1∶3传代，48小时后换用含2％FBS的MEM培养液，加入拉米夫定。拉米夫定终浓度为25μmol/L，同时设立相应的对照组细胞。加药后4天换含有等浓度药物的细胞培养液，第8天收集细胞。

4.RT-PCR检测epiregulin mRNA在HepG2、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况

待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，按照Trizol试剂盒(Invitrogen)说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量，OD260/280在1.8-2.0之间，RNA甲醛变性电泳显示无降解。然后进行逆转录，具体方法如下：各取总RNA1μg，OligodT(15)0.5μg，RNA酶抑制剂(40U)0.1μl，共10.3μl，混匀，70℃温育10min，立即冰上冷却。加入第一链反应缓冲液5μl，DTT2.5μl，RNA酶抑制剂0.7μl，dNTP(A、G、C、T10mM)1.0μl，混匀，42℃反应2min，加入逆转录酶superscriptII0.5μl，42℃温育1h，最后70℃变性15min。反转录产物取0.5μl作为PCR扩增的模板，以看家基因GAPDH作为内标进行双重PCR。靶基因epiregulin上游引物为5′-TCCATCTTCTACAGGCAGTCC-3′，下游引物为5′-TCACGGTCAAAGCCACATA-3′，扩增片断长度为300bp。GAPDH的上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增片断452bp。PCR反应体系总体积20μl，上下游引物终浓度为1μM，Mg²⁺浓度1.5mM，加入反转录产物0.5μl，Taq 1U。PCR循环参数为94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃30s，72℃30s，循环30次，最后72℃延伸2min。2％琼脂糖凝胶(Sigma)电泳检测。

5.Western印迹方法检测epiregulin在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况

待HepG2细胞、HepG2.2.15细胞长满或HepG2.2.15细胞加药后第8天，吸去培养液，用PBS清洗两遍后，RIPA-PICT(Pharmacia)法提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。每孔30-50μg总蛋白，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(PROTRAN^ BA-S 83 Reinforced NC，Schleicher & Schuell)上。4℃封闭过夜，封闭液组成：5％脱脂奶粉，1×TBST。然后与羊抗人epiregulin抗体(Santa cruz)或兔抗人β-actin抗体(Sigma)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗羊二抗(中山)、抗兔二抗(中山)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。

结果

1.Epiregulin mRNA在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况

等量的HepG2细胞、HepG2.2.15细胞总RNA反转录PCR后，2％琼脂糖凝胶电泳检测表达情况，看家基因GAPDH作为内标。结果如图1中所示，在HepG2细胞中几乎检测不到epiregulin mRNA的表达，而在HepG2.2.15细胞中其表达水平与GAPDH表达水平接近。在25μmol/L拉米夫定处理后，HepG2.2.15细胞中epiregulin mRNA表达明显下调。图1中control代表epiregulin mRNA在对照组细胞中的相对表达情况；lamivudine代表epiregulin mRNA在拉米夫定处理组细胞中的相对表达情况；HepG2、HepG2.2.15代表epiregulin mRNA在HepG2、HepG2.2.15细胞中的相对表达情况。

2.Epiregulin蛋白在HepG2细胞、HepG2.2.15细胞以及经药物处理的HepG2.2.15细胞中的表达情况

图2中显示，epiregulin蛋白在HepG2.2.15细胞中相对表达量较高，而在HepG2细胞中几乎检测不到epiregulin蛋白的表达。25μmol/L拉米夫定处理HepG2.2.15细胞后epiregulin蛋白明显下调。

结论

Epiregulin在HBV感染后表达上调，而在药物干预后表达明显下调，因此可能成为治疗及预防HBV相关疾病的新型药物作用靶点。

实施例二

材料与方法

1.S-ASODN的设计和合成

检索GeneBank中的核酸序列数据库，选择NCBI公布的epiregulin mRNA参考序列NM 001432，采用本实验室专利的，基于靶基因多能级预测结构的人工神经网络预测算法及本实验室设计的反义在线设计软件AODesigner(软件著作权号：2005SR12155)设计了5条靶向epiregulin的ASODN序列。通过与GeneBank联机blast序列比对，所选择的靶序列均具有很好的特异性，不会干扰人类其它正常基因的表达(见序列表中1-5)。所有寡核苷酸均采用ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰，过程如下：将硫代试剂(Beaucage regent，Transgenomic)溶于无水乙腈中使其终浓度为1g/100ml，置于DNA合成仪的AUX位置处，采用合成仪上提供的DNA硫化程序进行自动合成硫代寡核苷酸。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Oligo PrepOP120，SAVANT)纯化，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。

2.ASODN转染

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种6孔板，1.5×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸的浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.8μM并设细胞对照、脂质体对照。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时。收集细胞培养液，-20℃保存备用。提取Hep2.2.15细胞总RNA(Trizol RNA提取试剂盒，Invitrogen)以及Hep2.2.15细胞总蛋白，-20℃保存备用。

3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用检测

取细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6：376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为：P1：5’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P2：5’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；荧光探针序列F：5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q：5’-GTA GTTTCC GGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg²⁺，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为：94℃ 30s，55℃30s，72℃ 30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。

4.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用检测

取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg ELISA检测试剂盒(华美公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入显色液A50μl，再加入显色液B50μl，37℃孵育15min，加入终止液50μl，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTOR^TM Wallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR＝(A450_对照-A450_给药)/A450_对照计算抑制率。

5.ASODN对Hep2.2.15细胞中epiregulin蛋白的抑制作用检测

RIPA-PICT(Pharmacia)提取细胞总蛋白，蛋白定量后将各提取物调至相同浓度。然后进行western印迹实验。实验方法参考实施例一。

结果

1.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用

靶向epiregulin mRNA的五条反义序列E1-E5，分别以0.8μmol/L给药处理Hep2.2.15细胞，同时设立细胞对照，脂质体对照以及阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，按照公式IR＝(C_加药组-C_{细胞对照组})/C_{细胞>计算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表检测出的细胞培养液中HBV DNA拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。图3中C代表细胞对照组，LIP代表脂质体对照组，其对HBV DNA的抑制率接近0，没有明显的抑制作用。LAM25分别代表25μmol/L拉米夫定对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用。E1-E5代表五条反义序列在0.8μmol/L时对HBV DNA的抑制作用，从图中可显示，E3对HBV DNA的抑制作用与25μmol/L拉米夫定对细胞培养液中HBV DNA的抑制作用相近。}

2.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用

靶向epiregulin mRNA的五条反义序列E1-E5，分别以0.8μmol/L加药处理HepG2.2.15细胞，同时设立细胞对照、脂质体对照以及阳性药拉米夫定对照组，72小时后收集细胞培养液，HBsAg ELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBsAg的表达情况，根据公式IR＝(A_加药组-A_{细胞对照组})/A_{细胞对照组}计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值，见图4。图中LIP代表脂质体对照组对细胞分泌HBsAg的抑制作用，显示没有明显抑制作用。LAM25代表25μmol/L拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制作用，抑制率小于25％。E1-E5代表五条反义序列对细胞分泌HBsAg的抑制作用，其中E3的平均抑制率大于50％，且大于25μmol/L拉米夫定对细胞分泌HBsAg的抑制作用。

3.ASODN对Hep2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制作用

靶向epiregulin mRNA的五条反义序列E1-E5，分别以0.8μmol/L给药处理Hep2.2.15细胞，72小时后收集细胞培养液，HBeAg ELISA检测试剂盒检测Hep2.2.15细胞培养液中HBeAg的表达情况，根据公式IR＝(A_加药组-A_{细胞对照组})/A_{细胞对照组}计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值，见图5。图中，LIP代表脂质体对照组对细胞分泌HBeAg的抑制作用，显示没有明显抑制作用。LAM25代表25μmol/L拉米夫定对细胞分泌HBeAg的抑制作用，抑制率小于25％。E1-E5代表五条反义序列对细胞分泌HBeAg的抑制作用，其中E3的平均抑制率大于35％，且大于25μmol/L拉米夫定对细胞分泌HBeAg的抑制作用。

4.ASODN对细胞epiregulin蛋白的抑制作用

靶向epiregulin mRNA的五条反义序列E1-E5，分别以0.8μmol/L给药处理Hep2.2.15细胞，72h后提取总蛋白，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以β-actin(43kD)为对照，通过Western Blot方法检测硫代反义寡核苷酸对靶蛋白epiregulin表达量的影响。由图6可见，E3可显著抑制epiregulin蛋白的表达，E1，E2，E4对epiregulin蛋白无明显抑制作用，E5对epiregulin蛋白无抑制作用。

结论

1.抑制epiregulin的表达可以抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达

2.五条硫代epiregulin反义寡核苷酸序列中，E3具有明显的抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制和表达的作用。

实施例三

材料与方法

1.ASODN的设计与合成

根据实施例二结果，选择效果较好的反义寡核苷酸序列E3，合成其正义寡核苷酸(见序列表中6)。所有硫代寡核苷酸的合成同实施例二。

2.硫代反义寡核苷酸序列E3的细胞毒性检测

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至40-60％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(Invitrogen，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行转染。反义寡核苷酸E3的浓度为0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、5μM并设细胞对照，每浓度重复三孔。转染22小时后，换正常细胞培养液(含10％FBS的MEM细胞培养液)，37℃，5％CO2孵育72小时后，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，37℃避光孵育1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，转染ASODN后每日在倒置显微镜下观察细胞形态。

3.硫代反义寡核苷酸序列E3的特异性考察

硫代反义寡核苷酸序列E3及其正义序列E3s分别以0.8μmol/L转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例二。收集培养液，提取总RNA和总蛋白，参照实施例一、例二的方法，检测E3及其正义序列对细胞培养液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用，E3及其正义序列对epiregulin蛋白的抑制作用。

4.硫代反义寡核苷酸序列E3的剂量依赖性检测

硫代反义寡核苷酸序列E3以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM转染HepG2.2.15细胞，转染方法同实施例一。收集培养液，提取总蛋白，参照实施例一、例二的方法，检测E3不同浓度对细胞培养液中HBsAg，HBeAg，HBV DNA的抑制作用以及对epiregulin蛋白的抑制作用。

结果

1.硫代反义寡核苷酸E3对HepG2.2.15细胞增殖的影响

硫代反义寡核苷酸E3以0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、5μM处理细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有显著变化。细胞增殖实验检测结果见图7。图中显示，在0.2μM-5μM范围内，E3各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。

2.硫代反义寡核苷酸序列E3的特异性

硫代反义寡核苷酸序列E3及其正义序列E3s分别以0.8μmol/L转染HepG2.2.15细胞，收集培养液，ELISA检测试剂盒检测培养液中HBsAg、HBeAg的表达情况，荧光定量PCR检测培养液中HBV DNA的拷贝数。设对照细胞培养液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的含量为100％，实验组中HBsAg、HBeAg的含量则为：A_实验组/A_{细胞对照组}×100％，其中A表示在450nm的吸光度。实验组中HBV DNA的含量则为：C_实验组/C_{细胞对照组}×100％，其中C表示细胞培养液中HBV DNA的拷贝数，结果见图9。图中显示E3的正义硫代寡核苷酸序列(E3s)处理组细胞培养液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA与正常细胞对照无显著差异(P≥0.05)。而硫代反义寡核苷酸序列E3具有很好的抑制作用(HBsAg、HBV DNA抑制率≥50％，HBeAg抑制率≥35％)。同样，在硫代反义寡核苷酸序列E3及其正义序列E3s分别以0.8μmol/L转染HepG2.2.15细胞后72小时，提取总蛋白，western检测结果显示E3s处理细胞组epiregulin蛋白表达与对照组基本一致，而E3显示出很好的抑制epiregulin蛋白表达的作用(见图8)。

3.硫代反义寡核苷酸序列E3对HBV复制和表达影响的剂量依赖性。

硫代反义寡核苷酸序列E3以0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L给药处理HepG2.2.15细胞后，收集培养液，荧光定量PCR检测培养液中HBV DNA的拷贝数，ELISA检测试剂盒检测培养液中HBsAg、HBeAg的表达情况，根据实施例二中的公式分别计算抑制率。重复三次实验，计算抑制率的平均值。如图10，E3对细胞培养液中HBsAg，HBeAg，HBV DNA的抑制作用随着硫代反义寡核苷酸序列E3浓度的增加而递减，显示出很明显的剂量依赖关系。同样，在0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.6μmol/L E3处理细胞后72小时，提取总蛋白，western印迹技术检测epiregulin蛋白的表达情况，结果如图8所示，随着E3浓度的增加，epiregulin蛋白表达量逐渐减少，0.8μmol/L、1.6μmol/L时，E3处理细胞组几乎检测不到epiregulin蛋白的表达。

结论

1.硫代反义寡核苷酸序列E3对HepG2.2.15细胞的增殖没有明显的影响

2.硫代反义寡核苷酸序列E3具有序列特异的抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达的作用

3.在0.2-1.6μmol/L浓度范围内，E3对HBV DNA，HBsAg，HBeAg以及epiregulin蛋白具有特异性的剂量依赖性抑制活性。

                         序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>抑制表皮调节素EREG基因表达的反义寡核苷酸的结构和用途

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>1

ctaattgcat tattgtttta                                       20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>2

tttttcaagt acattaaaat                                       20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>3

actgttatcc ctgcccataa                                       20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>4

agtttgggag gctgtggagg                                       20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>

<400>5

ttgagaggct tacaataaat                                       20

<210>6

<211>20

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