抗人CD40突变体分子单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人CD40突变体分子单克隆抗体，其制备方法及其在特异性地识别多发性骨髓瘤细胞膜表面CD40蛋白突变体分子，并改变所说的细胞的生长周期中的应用。

说明书

发明的领域

本发明涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，更具体地说，本发明涉及抗人CD40突变体分子单克隆抗体，其制备方法及其在特异性地识别多发性骨髓瘤细胞膜表面CD40蛋白突变体分子，并影响多发性骨髓瘤细胞株细胞生长周期的生物学作用。本发明进一步涉及所说的单克隆抗体在诊断和治疗多发性骨髓瘤的中的潜在应用。

发明的背景

特异性免疫应答是由多种免疫细胞和分子(膜分子和可溶性因子)参加并受到严格调控及制约的复杂生理过程。已知有许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应。为了有效地激活T细胞反应，通常至少需要两个信号。其中除T细胞抗原受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)上的MHC-抗原复合物以提供第一信号即抗原特异性信号外，还必须获得T细胞与APC表达的共刺激分子相互作用后产生的非抗原特异性、非MHC限制性的第二信号。第二信号即为共刺激信号或协同刺激信号。如果仅有抗原特异性信号而缺失共刺激信号，T细胞将表现为无反应或免疫耐受状态，甚至导致凋亡。可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。因此可以认为，第一信号决定了T细胞活化的特异性，而第二信号则决定T细胞介导的免疫应答能否有效进行(Noelle RJ，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：6550，1992；Allen RC et al.，Science.259：990，1993)。近年来的研究表明，一组细胞膜分子——共刺激分子的调节性表达、相互作用及信号传递在复杂的免疫应答过程中发挥着极其重要的作用。其中CD40和CD40配体(CD40L，CD154)是一对重要的共刺激分子，它们分别属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族和肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，参与细胞和体液免疫应答并发挥调控作用。

正常生理条件下，表达于抗原递呈细胞(APC)上的CD40分子与活化的CD4⁺T细胞上的CD40L相互作用，介导了一系列细胞免疫反应。CD40/CD40L的信号传递在不同细胞上可产生截然不同的效应：可以是促进细胞的增殖或分化的正向调节，也可以是导致细胞的生长抑制和/或凋亡的负向调节。大量的实验研究表明，CD40可介导B细胞的增殖、分化、抗体的分泌和类型转换、树突状细胞(DC)的激发、分化和成熟、T淋巴细胞活化和细胞免疫功能的调节，以及对CD40阳性肿瘤细胞生长的抑制和/或促凋亡等活性。

因此，对CD40和CD40L相互作用的分子机制的研究有助于深入了解参与B细胞激活过程中的信号分子及其信号通路。利用基因定向突变研究的结果显示，CD40与CD40L相互作用过程中直接接触的CD40氨基酸残基为位于CD40分子胞外段第2、3结构域中的S65，E66，T70，R73，E74，H76，C77，H78，479，K81，Y82，D84，N86，T112，E114，A115，E117(Bajorath J，Marken J S，Chalupny N J et al.Biochemistry，1995；4：9884)。这些位点的突变将直接影响CD40与CD40L的相互作用。另有文献报道(Tong A W，Seamour B，Chen J et al.Leuk Lymph，2000；36(5-6)：543)，多发性骨髓瘤(MM)细胞株8226细胞上CD40分子第3结构域上仅1个氨基酸的突变(密码子TCA→TTA，即氨基酸Ser→Leu)即可显著地影响CD40L激发CD40分子后的信号传导。

研究发现，几乎所有新鲜分离的多发性骨髓瘤(MM)均表达CD40。而且知道MM的发生和发展除了与细胞增殖失控和细胞分化异常有关外，还与转化的细胞不能正常凋亡有关。已有研究表明，虽然大多数多发性骨髓瘤(MM)细胞均表达CD40，但发现使用常规的CD40单克隆抗体并不能检测出某些MM细胞株细胞(例如8226细胞)上的CD40分子。这可能是由于编码CD40分子的基因发生了突变，表达了CD40突变体分子。因此，发现并深入研究信号转导分子可能出现的突变，制备针对这些突变分子的抗体或其他结合蛋白，进而研究CD40信号对MM生物学行为的影响及其分子机制，必将为拓展MM的治疗思路，最终治愈MM提供依据。

发明目的

本发明的一个目的是提供抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1的重链和轻链分别具有如SEQ ID NO：1(重链)和2(轻链)所示的推测的氨基酸序列。

根据本发明的优选实施方案，如上限定的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1是由保藏编号为CGMCC No.1164的杂交瘤细胞产生的。

本发明的再一个目的是提供如上限定的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1在诊断和治疗多发性骨髓瘤中的应用。

附图简要说明

图1显示以免疫印迹法分析单克隆抗体3B1与多发性骨髓瘤细胞株XG2细胞表面膜蛋白的特异性结合。其中1是XG2细胞抽提的膜蛋白，2是Jurkat细胞抽提的膜蛋白(阴性对照)。

图2显示用流式细胞术分析单克隆抗体3B1对多株多发性骨髓瘤细胞表面CD40突变体分子的特异性识别。

发明的具体内容

本发明是基于我们首先发现了多发性骨髓瘤细胞膜表面上表达的CD40突变体分子这一事实。在这一发现的基础上，我们成功地制备了抗所说的CD40突变体分子的单克隆抗体，并通过对多发性骨髓瘤细胞膜表面上突变CD40受体/CD40配体相互作用途径的阻断实验研究，证实有可能使用本发明的单克隆抗体作为诊断剂，提供能够在T细胞激发期间特异地结合多发性骨髓瘤细胞表面上CD40受体的特异性结合分子，用于多发性骨髓瘤的实验室诊断。或者，也可以使用本发明的单克隆抗体作为治疗剂，用于提高T细胞对多发性骨髓瘤抗原的识别能力并切断其第二信号传递，增强CD4⁺T细胞对瘤细胞的免疫反应，从而达到抑制多发性骨髓瘤细胞的生长和增殖并促使其向正常细胞逆转的目的。

因此，本发明的一个目的是提供抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1。所说的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1具有如SEQ ID NO：1所示的推测的氨基酸序列，并且该抗体是由保藏编号为CGMCC No.1164的杂交瘤细胞分泌产生的。

本发明的另一个目的是提供如上限定的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1在诊断多发性骨髓瘤，以及改变多发性骨髓瘤细胞生长周期，进而促进恶性成长的瘤细胞向正常细胞转化中的应用。

本说明书中所说的“CD40受体”是指B细胞表面上表达的蛋白质；CD40配体是活化的T细胞表达的可与CD40受体特异结合的蛋白质。

术语“CD40”包括完整的CD40、可溶性CD40及包括CD40之功能活性部分的融合蛋白。术语“CD40突变体”是指由于CD40基因第234位碱基由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(A)，由此导致其所转录后翻译的CD40蛋白的78位组氨酸突变为谷氨酰胺的CD40蛋白分子。术语“抗CD40突变体分子抗体”可以是CD40突变体分子特异性单克隆或多克隆抗体或它们的免疫学活性部分。本发明中，优选的是单克隆抗体，特别是小鼠抗人CD40突变体分子抗体。

本发明人在长期从事免疫细胞受体/配体相互作用研究的实践中，首先发现了多发性骨髓瘤细胞表面上的CD40突变体(其基因在Genebank上的登记号为ss23134804)。我们对该CD40突变体基因及其表达产物的序列分析显示，其突变在于基因第234位碱基由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，由此导致其所转录后翻译的CD40蛋白的78位组氨酸突变为谷氨酰胺。由于CD40分子上的78位氨基酸是CD40与CD40L相互作用过程中直接接触的CD40氨基酸残基，它的改变将直接影响CD40分子的信号传导，进而引起一系列CD40分子生物学功能的改变。因此，不仅可能使用高表达该突变体分子的XG2等多发性骨髓瘤细胞株作为免疫原免疫动物，制备特异性单克隆抗体，用于多发性骨髓瘤的体外免疫诊断，而且有可能使用该抗体作为治疗剂，用于提高T细胞对多发性骨髓瘤抗原的识别能力并切断其第二信号传递，增强CD4⁺T细胞对瘤细胞的免疫反应，从而达到抑制多发性骨髓瘤细胞的生长和增殖并促使其向正常细胞逆转的目的。

可以按照本领域已知的常规方法制备本发明的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1(参见Kohler and Milrtein，Nature 256：495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要时，也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗CD40单克隆抗体。

因此，本发明进一步提供了生产如上限定的抗人CD40突变体分子的单克隆抗体的方法，该方法包括：

(1)用预制备的高表达人CD40突变体分子的XG2细胞作为免疫原免疫动物；

(2)分离被免疫动物的脾淋巴细胞并在适于产生杂交瘤细胞的条件下与适当的骨髓瘤细胞融合；

(3)筛选并培养如上得到的杂交瘤细胞；

(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的动物的腹水液中分离并纯化所需的单克隆抗体。

根据本发明的优选实施方案，最好使用高表达CD40分子(包括CD40突变体分子)的多发性骨髓瘤细胞株XG2细胞作为制备本发明单克隆抗体的免疫原。

因此，为了制备本发明的抗人CD40单克隆抗体，最好选择具有强免疫原性的生物学材料如细胞作为免疫原，并且希望该细胞所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。

可以按照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein，Nature 265：495-497，1975)制备能够生产本发明抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1的杂交瘤。简单地说，首先用XG2细胞免疫BALB/C小鼠。当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞。例如，可以将脾细胞悬液加到CD40抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达CD40多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。然后可以收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，并在适当的融合剂例如聚乙二醇的诱导下与骨髓瘤融合以形成杂交瘤。然后可以在选择性培养基例如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。于体外(例如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(作为小鼠腹水)培养所选择的分泌抗人CD40抗体的杂交瘤，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化所需的抗人CD40突变体分子单克隆抗体。

流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的抗人CD40突变体分子单克隆抗体能够特异地识别多个多发性骨髓瘤细胞株(XG2，XG6，8226，U266)表面上表达的CD40突变体分子。该抗体被定名为3B1。

进一步的核苷酸和氨基酸序列分析结果显示，纯化的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1的重链和轻链多肽分别具有如序列表SEQ ID NO：1和2所示的推测的氨基酸序列。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的标准单字母缩写符表示的。

本发明的杂交瘤细胞株被命名为3B1(Hybridoma SI CD40.1(3B1))，并已按照布达佩斯条约和中国专利法实施细则第25条的规定，于2004年6月2日将这些杂交瘤细胞系样品保藏在中国北京中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1164。

我们的研究表明，本发明的单克隆抗体能够特异性识别多发性骨髓瘤细胞表面表达的、其他常规CD40单克隆抗体不能识别的CD40突变体分子。例如，使用本发明的单克隆抗体以流式细胞分析术检测多发性骨髓瘤细胞株XG6、U266和8226等的细胞表面CD40突变体分子的表达水平，结果显示阳性表达率分别为51.9％、66.7％和72.8％％。相反，使用目前已知的其他多种CD40单克隆抗体(例如mAb89，3B2，5C11等)检测上述靶细胞表面表达的CD40突变体分子，结果均为阴性(参见实施例1)。因此，有可能使用本发明的单克隆抗体或建立在该抗体基础上的免疫检测试剂盒，检测多发性骨髓瘤细胞膜表面CD40突变体分子的存在及其水平，借以作为多发性骨髓瘤的实验室诊断或预后的指标。

另一方面，我们用本发明的单克隆抗体3B1处理多株表达CD40突变体分子的多发性骨髓瘤细胞株细胞(包括的XG6，U266，8226)，结果可见，该单克隆抗体可显著地影响XG6，U266，8226等多发性骨髓瘤细胞的生长周期，导致XG6细胞的生长周期阻滞在G2期，并使U266和8226细胞的生长周期阻滞在G1和G2期(参见实施例1)。因此，有可能使用本发明的单克隆抗体作为治疗剂，用于提高T细胞对多发性骨髓瘤抗原的识别能力并切断其第二信号传递，阻断多发性骨髓瘤的生长周期并增强CD4⁺T细胞对瘤细胞的免疫反应，从而达到抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖并促使其恶性生长发生逆转的目的。我们的初步动物实验也已证实，本发明的CD40突变体分子单克隆抗体3B1可以有效地抑制多发性骨髓瘤动物模型的肿瘤的生长(数据未示出)。

因此，本发明的抗CD40突变体分子单克隆抗体有可能作为一种诊断和/或治疗剂，用于体外诊断或者体内治疗细胞表面高表达突变CD40分子的多发性骨髓瘤。

以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节。但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1：抗人CD40突变体分子单克隆抗体的制备

本实施例描述本发明的抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1的制备。

(1)分泌抗人CD40突变体分子单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

使用高表达CD40分子(包括CD40突变体分子)的XG2细胞作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠(10⁷/500μl/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共10块96孔板)。以高表达CD40分子的XG2为阳性对照并以不表达CD40分子的XG7为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(图1)。阳性克隆经3次有限稀释后，使克隆的阳性率达到约95％。经复筛和克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人CD40的杂交瘤细胞株，并被命名为3B1。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。

(2)抗人CD40突变体分子单克隆抗体的制备与特性鉴定

(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞(1×10⁷/只)，同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。5-10天后收获腹水，并离心取上清于-80℃保存。

(b)腹水型单抗的纯化和定量。收集宿主动物的腹水液，经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8～10mg/ml。间接免疫荧光法分析显示，纯化后单抗的效价为1∶1000以上。

(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定Ig亚类，结果显示3B1为IgG1型。

(d)CD40突变体分子在多种肿瘤细胞上的表达。收集培养的多发性骨髓瘤细胞株XG2，XG6，8226，U266，加入单抗3B1(每管2μg)，4℃孵育30分钟。洗涤后用FITC标记的羊抗鼠IgG处理细胞，4℃孵育30分钟后进行流式细胞分析。结果可见，单克隆抗体3B1能够特异地识别XG2、XG6、8226、U266等多种肿瘤细胞上表达的CD40突变体分子。其他多种已知的单克隆抗体(mAb89，3B2，5C11)均不能识别只表达CD40突变体分子的XG6、8226、U266细胞系，但能识别共表达正常CD40分子和CD40突变体分子的XG2细胞表面的正常CD40分子。结果(以CD40突变体分子的阳性表达率表示)如下列表1和图2所示。

表1：单克隆抗体3B1对肿瘤细胞表面的膜蛋白分子的识别

细胞系  XG2  XG6  8266  U266  CD40突变体分子的阳性表达率99.8％51.9％66.7％72.8％

由表1所示的结果可以看出，单克隆抗体3B1除了能识别其免疫原-超高表达CD40分子的多发性骨髓瘤细胞株-XG2以外，还可以中等强度识别另外三株多发性骨髓瘤细胞株XG6，8226，U266，阳性率分别是51.9％，66.7％，72.8％；而其他多种CD40单克隆抗体(mAb89，3B2，5C11)均不能识别XG6、8226、U266表面CD40突变体分子的抗原位点。

图2显示用流式细胞术分析单克隆抗体3B1识别多种多发性骨髓瘤细胞株细胞表面的CD40突变体分子。其中，第一行显示：3B1识别XG2细胞表面的CD40突变体分子，并且该分子在XG2细胞上高表达(表达率高达99.8％)；第二行显示：3B1识别XG6细胞表面的CD40突变体分子，并且该分子在XG6细胞上中度表达(表达率达51.9％)；第三行显示：3B1识别8226细胞表面的CD40突变体分子，并且该分子在8226细胞上中度表达(表达率为66.7％)；第四行显示：3B1识别U266细胞表面的CD40突变体分子，并且该分子在U266细胞上中度表达(表达率为72.8％)。相反，抗体5C11则不识别三株只表达CD40突变体分子的多发性骨髓瘤细胞株XG6，8226，U266表面的膜分子，只识别共表达CD40正常体和突变体的XG2细胞表面的正常CD40分子。

(f)单抗的Western印迹鉴定。收集XG2和Jurkat细胞(不表达CD40分子的T淋巴细胞株)，经破膜处理后抽提膜蛋白。经12％SDS-PAGE电泳将所得膜蛋白电转移(0.65mA/cm²)至硝酸纤维膜上，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。24小时后加入纯化的抗体，室温孵育1小时。然后用TBST溶液洗去未结合的抗体，并加入碱性磷酸酶(AP)标记的二抗保温30分钟。孵育后加入底物显色并记录结果。结果如图1所示。

由图1可以看出，本发明的3B1抗体能够与XG2细胞表面的CD40突变体分子特异地结合而形成一条清晰的阳性条带。

实施例2：抗人CD40突变体分子单克隆抗体3B1对多发性骨髓瘤细胞生长的影响

本实施例描述本发明的单克隆抗体3B1对多株多发性骨髓瘤细胞系的生长影响。

(1)抗CD40突变体分子单克隆抗体3B1诱导多种多发性骨髓瘤细胞株细胞生长周期的改变：收集生长良好的多发性骨髓瘤细胞株XG6，U266，8226细胞，加入24孔培养板中(每2×10⁵/孔)。向各小孔中加入3B1(10ug/ml)，培养48小时后再加入PI(5ug/ml)。37℃反应30分钟后用流式细胞仪检测。其中使用同型IgG作为阴性对照。结果如下列表2所示。

表2单克隆抗体3B1对多发性骨髓瘤细胞的长周期的影响

  XG6+同型IgGXG6+3B1  8226+同型IgG8226+3B1  U266+同型IgGU266+3B1  G1(％)  53.5±5.3  52.0±3.7  52.4±4.5  54.6±4.9  63.2±4.9  67.5±4.1  S(％)  33.2±3.4  29.1±2.2  22.6±2.0  18.5±2.0  27.1±2.6  22.9±2.4  G2(％)  12.9±1.6  16.8±1.1  24.1±2.1  27.0±2.3  11.2±1.0  15.8±1.3

由表2所示的结果可以看出，本发明的单克隆抗体明显影响了XG6，8226和U266细胞的生长，并使其生长停滞在G2期。相似地，本发明的单克隆抗体同样可阻断8226和U266细胞的生长，并使其生长周期阻滞在G1和G2期。

                    序列表

<110>苏州大学生物技术研究所

<120>抗人CD40突变体分子单克隆抗体及其应用

<140>

<141>

<160>1

<210>1

<211>135

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的单克隆抗体3B1的重链核甘酸编码序列推测的氨基酸序列。

<400>1

ACMPAGRRLG VKLQESGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTS YVIQWVKQKP

GQGLEWIGSI NPYNDYTKYN EKFKGKATLT SDKSSITAYM EFSSLTSEDS

ALYYCARWGD GNYWGQGTTL TVSSAKTTPP SVYPL

<210>2

<211>120

<212>氨基酸

<213>人工序列

<220>

<223>根据合成的单克隆抗体3B1的轻链核甘酸编码序列推测的氨基酸序列。

<400>2

PSLHACRSTI EIQMTQSPAS LAVSLGQRAT ISYRASKSVS TSGYSYMHWN QQKPGQPPRL

LLYLVSNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHIRELTR SEGGPSWRSN