多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料及其制备方法

摘要

本发明涉及多孔、分层、三维空间多级结构组织支架材料及其制备方法。利用生物可吸收聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚己内酯等和壳聚糖、硫酸软骨素、胶原、硫酸肝素、海藻酸钠、透明质酸等作为基体原料。制备方法是采用纳米自组装技术将壳聚糖、硫酸软骨素等具有正或负电荷的医用高分子材料组装到特定圆柱芯材表面，经真空干燥、冷冻干燥制成一种结构、尺寸、形状可调的高度仿生人体管状组织的支架材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于纳米自组装技术制备的多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料。特别涉及选择具有良好生物相容性、生物可降解性和生物诱导性，已在国内外广泛使用的生物医用材料，制备成仿生人体管状组织的多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架及制备方法。

背景技术

组织工程学(tissue engineering)是一门将细胞生物学和材料学相结合进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。当具有特定功能的种子细胞(seed cell)与可降解生物材料(biodegradable polymer)混合并在体外培养一段时间或植入体内后，随着种子细胞的不断增殖、细胞外基质分泌和生物材料的逐渐降解、吸收，最终形成具有正常结构和功能的特定组织或器官。组织工程技术的产生是外科修复技术的一项创新，它的深入发展将有可能改变传统“以创伤修复创伤”的治疗模式，使外科创伤与病损的治疗从组织器官移植走向组织器官制造，实现外科治疗领域的一次重大变革。

人体组织(如神经、血管、食管、气管、肛门等组织)损伤及缺损在临床上多见，迄今为止，其治疗效果尚不能令人满意。提供性能优异、结构高度仿生的人工材料是目前急待研究解决的重要课题。实验证明任何材料的表面化学结构和表面形态结构都可作为生物信号，这类信号能在分子水平上有效地和特异性地调节人体附着细胞功能性基因的表达、信息核糖核酸的结构稳定、基因产物的合成与功能，从而有效地产生“材料的诱导性生物效应”。此类生物效应不仅决定了生物材料的安全性，也决定了生物材料用于重建人体生理功能的特异性。这类材料表面信号对人体细胞的调节作用是功能特异性的和极其敏感的，在基因水平的有效调节可在细胞与材料接触的几小时内即出现。这一现象的发现为生物材料的研究和开发提出了全新的要求。

理想的组织支架材料具有仿生特点，即组成成分应该与神经细胞合成分泌的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分最大限度地接近，其结构应与人体组织结构相似，有利于组织的再生。

理想的组织支架材料应具备以下条件：①内部空间结构应具有定向、平行排列的微孔。②应适时地在体内降解和被机体吸收，即材料的降解速度和代谢吸收速度应与组织再生修复的速度相匹配，③具有理想的结构：即具有分级分层多孔结构。④应保证组织修复所需的营养供应：即提供受损组织再生所需的可起到调节种子细胞生长、分化并促进组织修复和组织再生的生长因子。

发明内容

本发明的目的在于提供多孔、分层、三维空间多级结构的组成、孔径及尺寸、形状可调的复合高分子组织支架材料及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：将生物可吸收聚乳酸、壳聚糖、硫酸软骨素、胶原、硫酸肝素、海藻酸钠、以及透明质酸作为基体材料，利用纳米自组装技术、冷冻干燥及专用模具制备多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料。

主要部分为芯材和组装材料，其中芯材包括可被胺化的可降解医用高分子材料及其改性材料：聚乳酸、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等。组装材料包括天然的、人工合成的具有良好生物相容性、可降解的具有正或负电荷的医用高分子材料：壳聚糖、硫酸软骨素、胶原、硫酸肝素、海藻酸钠、以及透明质酸。

其结构特点为多孔、分层、多极结构，每一层分布有均匀连通的孔隙、大孔或微孔，其结构及孔径可调。

为实现上述结构，本发明利用有机胺化合物—二胺化合物对芯材进行胺解反应使芯材表面引入带有正电荷的氨基，然后用适当的酸溶液进行酸化，再将带有正、负相反电荷的组装材料交替按顺序一层一层组装，组装完毕后采用不同冷冻温度进行冷冻，或采用交联剂进行交联即可得到多孔、分层、多极结构，每一层分布有均匀的连通的孔隙、大孔或微孔，在芯材及组装材料中加入致孔剂及使用能制孔的模具，使其结构和孔径可调。

本发明的具体方案如下

一种组织支架材料，包括多孔的支架芯材和芯材外组装材料，为多孔、分层、三维空间多级结构，每一层分布有均匀连通的孔隙。

该组织支架材料的芯材包括可被有机二胺化合物胺化的生物可吸收高分子材料及其改性材料：聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚己内酯；组装材料包括天然的、人工合成的具有良好生物相容性、可降解的具有正或负电荷的医用高分子材料：壳聚糖、胶原、硫酸软骨素、硫酸肝素、海藻酸钠、以及透明质酸。

本发明的组织支架材料，其组装层数为5～5000层，每层厚度1～100纳米；孔径为100～600微米的大孔。

本发明的组织支架材料，其组装层数为5～5000层，每层厚度1～100纳米，孔径为1～100微米的小孔。

本发明的组织支架材料，其组装层数为5～5000层，每层厚度1～100纳米，孔径为1纳米～1000纳米的微孔。

本发明的组织支架材料的制备方法：先用芯材材料聚乳酸、或聚乙醇酸及其共聚物、或聚己内酯制成多孔的支架，然后用带有正电荷的壳聚糖或胶原，与带有负电荷的硫酸软骨素或硫酸肝素组装材料交替按顺序一层一层自组装在多孔支架芯材外层，重复自组装步骤直到设计的组装层数，而后快速冷冻和真空冷冻，即得到多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料。

本发明的组织支架材料的制备步骤为：

步骤1、芯材的制备：将芯材材料聚乳酸、或聚乙醇酸及其共聚物、或聚己内酯溶于有机溶剂乙酸乙酯、或丙酮、或氯仿、或1，4-二氧六环中，注入具有多针模具中，于室温干燥至恒重，去模，转入真空烘箱干燥至恒重，浸入乙醇与水体积比为1∶1溶液中去除油脂及杂质，用水充分漂洗；

步骤2、胺化反应：将步骤1制备的芯材浸入己二胺-异丙醇，或乙二胺-异丙醇，或丁二胺-异丙醇，己二胺-正丙醇，或乙二胺-正丙醇，或丁二胺-正丙醇中，进行胺解反应，用去离子水充分漂洗去掉未反应的己二胺，乙二胺，丁二胺，在室温真空干燥箱中烘干至恒重；

步骤3、酸化反应：将步骤2胺解后的芯材于室温下在0.02摩尔/升盐酸溶液中酸化，用三蒸水冲洗以去除吸附的盐酸；

步骤4、层层静电自组装：将步骤3酸化后的芯材在硫酸软骨素或硫酸肝素溶液中浸泡以吸附一层硫酸软骨素或硫酸肝素，并使表面带上负电，用含0.5摩尔/升NaCl的三蒸水冲洗以去除多余的硫酸软骨素或硫酸肝素。然后浸入到壳聚糖或胶原的乙酸溶液中浸泡(其乙酸溶液为含乙酸2％，含NaCl 0.2摩尔/升的水溶液)，使芯材表面吸附一层带正电的壳聚糖或胶原，先用质量浓度0.6％的乙酸溶液洗，该乙酸溶液含NaCl 0.2摩尔/升，再用含NaCl0.2摩尔/升的三蒸水冲洗去除多余的壳聚糖或胶原，重复上述组装步骤5～5000次，制备得到硫酸软骨素或氨基酸-壳聚糖或胶原多层膜；

步骤5、将步骤4制得的组装有硫酸软骨素或硫酸肝素-壳聚糖或胶原多层膜芯材，浸入液氮或放入低温冰箱中迅速深度冷冻，真空冷冻干燥，即得到多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料。

所述的制备步骤2的胺化反应，将芯材浸入0.07～0.1克/毫升的己二胺-异丙醇，或乙二胺-异丙醇，或丁二胺-异丙醇，己二胺-正丙醇，或乙二胺-正丙醇，或丁二胺-正丙醇中，在37±2℃反应2～3小时，用去离子水充分漂洗去掉未反应的有机二胺化合物，于20±1℃真空干燥箱中烘干至恒重。

所述的制备步骤3的酸化反应，将胺解芯材于室温下在0.02摩尔/升盐酸溶液中酸化1～2小时，用三蒸水冲洗以去除吸附的盐酸。

所述的制备步骤4的层层静电自组装，将酸化芯材在含硫酸软骨素溶液或硫酸肝素2-50毫克/毫升的NaCl溶液中浸泡30～60分钟以吸附一层硫酸软骨素溶液或硫酸肝素，并使表面带上负电，溶液中NaCl浓度为0.5摩尔/升，用含NaCl 0.5摩尔/升的三蒸水冲洗3次以去除多余的硫酸软骨素溶液或硫酸肝素；然后浸入到含壳聚糖或胶原2～50毫克/毫升的质量浓度1％-5％乙酸溶液中浸泡30～60分钟，使芯材表面吸附一层带正电的壳聚糖或胶原，先用质量浓度为0.6％的乙酸溶液洗(乙酸溶液含0.2摩尔/升NaCl)，再用含NaCl 0.2摩尔/升的三蒸水冲洗去除多余的壳聚糖或胶原。

所述的制备步骤5中的材料组装冷冻温度为-20±0.5℃。

附图说明

图1、组织支架材料制备主要工艺流程

图2、支架材料截面多层结构、形貌(AFM)

图3、支架材料多孔结构、形貌(SEM)

本发明的组织支架材料制备工艺如图1所示，先将医用高分子材料溶解于有机溶剂中，注入模具，自然干燥，制得组织支架芯材，将该组织支架芯材用有机二胺化合物胺解、使芯材表面引入带有正电荷的氨基，真空干燥，然后用盐酸酸化，制得酸化芯材，再将带有正、负相反电荷的组装材料按顺序一层一层组装，组装完毕后采用不同冷冻温度进行冷冻干燥，即可得到多孔、分层、三维空间多级结构的组织支架材料，

具体实施方式

实验所需主要材料和仪器

壳聚糖(不同脱乙酰度)、聚乳酸(不同分子量)、聚乙醇酸(分子量12万)、聚己内酯、硫酸软骨素、胶原、硫酸肝素、海藻酸钠、透明质酸、己二胺、丁二胺、乙二胺、1，4-二氧六环、NaCl、盐酸、醋酸、原子力显微镜(AFM)(扫描探针显微镜(SPM))，型号：DI NanoscopeIV型，美国维易科精密仪器有限公司(Veeco，USA)，付里叶变换红外光谱仪，型号：Nexus，美国热电尼高力公司、FD-80型真空冷冻干燥机(北京博医康仪器厂)、数码相机、真空干燥箱。

实施例1

1.支架材料的制备

①芯材的制备：将3克重均分子量为3万的聚乳酸溶于10毫升1，4-二氧六环中，注入模具上，于室温干燥24小时，去模，转入真空烘箱(20℃)干燥至恒重，浸入1∶1的乙醇-水中去除油脂及杂质，用水充分漂洗；

②胺化反应：将上述芯材浸入0.07克/毫升的己二胺-异丙醇中，37℃反应2小时，用水充分漂洗去掉未反应的己二胺，20℃真空干燥箱中烘干至恒重；

③酸化反应：将胺解PDLLA芯材于室温下在0.02摩尔/升盐酸溶液中酸化1小时，用大量三蒸水冲洗以去除吸附的盐酸；

④层层静电自组装：将酸化芯材在含硫酸软骨素2毫克/毫升的0.5摩尔/升NaCl溶液中浸泡30分钟以吸附一层硫酸软骨素，并使表面带上负电，用含0.5摩尔/升NaCl的三蒸水冲洗3次以去除多硫酸软骨素.然后浸入到2毫克/毫升壳聚糖的2％乙酸溶液中浸泡30分钟，使聚乳酸表面吸附一层带正电的壳聚糖；先用0.6％的乙酸溶液洗，再用含0.2摩尔/升NaCl的三蒸水冲洗去除多余的壳聚糖；

⑤材料组装：重复上述步骤，可制备理想层数(10层)的硫酸软骨素-壳聚糖多层膜，-20℃冷冻，去掉模具，冷冻干燥，即得。

2.支架材料的组成、形貌、结构和性能测试

利用付里叶变换红外光谱仪，型号：Nexus，美国热电尼高力公司、D/MAX-IIIA型x射线衍射仪：(日本理学Rikagu)及日立S-450型扫描电镜、美国维易科扫描探针显微镜(SPM，DI Nanoscope IV型)(原子力显微镜，AFM))观察支架材料形貌。体外实验是将样品置于磷酸缓冲溶液中，测定材料的溶胀性和降解性，pH值的变化情况。

扫描电镜观察到内层膜孔径较小约为3纳米，外层孔径较大约为3微米；原子力显微镜观察支架材料截面具有明显的纳米级层状结构、每层有均匀孔隙分布，层与层间孔隙连通，且孔隙孔径呈分级变化。植入体内后，随时间延长，材料降解。体外实验观察，材料在15天发生溶胀、2个月外形完整，溶液pH值变化微小。

实施例2

与实施例1相同的方法与步骤，但芯材采用聚乙醇酸(分子量12万)，自组装材料采用硫酸软骨素与壳聚糖-胶原混合物进行材料制备，组装层数为20层，-70℃冰箱冷冻。

原子力显微镜观察导管截面具有明显的纳米级层状结构、每层有均匀孔隙分布，层与层间孔隙连通，且孔隙孔径呈分级变化。植入体内后，随时间延长，材料降解。体外实验观察，材料在15天发生溶胀、2个月外形完整，溶液pH值变化微小。

扫描电镜观察到内层膜孔径较小约为3纳米，外层孔径较大约为15微米；原子力显微镜观察导管截面具有明显的纳米级层状结构、每层有均匀孔隙分布，层与层间孔隙连通，且孔隙孔径呈分级变化。植入体内后，随时间延长，材料降解。体外实验观察，材料在15天发生溶胀、2个月外形完整，溶液pH值变化微小。

实施例3

与实施例1相同的方法与步骤，但芯材采用聚己内酯，自组装材料采用硫酸软骨素与壳聚糖-胶原混合物进行材料制备，组装层数为200层，-70℃冰箱冷冻。

原子力显微镜观察导管截面具有明显的纳米级层状结构、每层有均匀孔隙分布，层与层间孔隙连通，且孔隙孔径呈分级变化。植入体内后，随时间延长，材料降解。体外实验观察，材料在15天发生溶胀、2个月外形完整，溶液pH值变化微小。

扫描电镜观察到内层膜孔径较小约为3纳米，外层孔径大约为3500纳米；原子力显微镜观察导管截面具有明显的纳米级层状结构、每层有均匀孔隙分布，层与层间孔隙连通，且孔隙孔径呈分级变化。植入体内后，随时间延长，材料降解。体外实验观察，材料在15天发生溶胀、2个月外形完整，溶液pH值变化微小。