用于确定生物活性分子之间结合的磁性粒子的使用

摘要

本发明公开了一种测定和工具以及因此也公开了一种设备，用于使用至少第一粒子或微载体例如珠子和也可以为微载体的第二粒子例如第二珠子，确定诸如生物活性分子的微生物实体之间的相互作用。至少第一微载体是磁性的。当使用两个珠子并且两个珠子都是磁性时，该珠子优选地在它们的磁矩大小上不同。本发明提供一种装置，用于将生物活性分子之间的结合置于机械应力下，来由此辨别不同强度的结合。一方面，使用该第二珠子(具有较大磁矩)用来磁性地去除联结到具有较小磁矩的珠子上的目标分子，该目标分子微弱地结合到捕捉分子上(捕捉分子本身通常耦合到可移动的或不可移动的表面)。可替换地，可以施加流体摩擦力到其中一个该粒子上来破坏微弱的结合。依赖于该实施例，该第一珠子和/或第二粒子可被用于检测目的。

说明书

本发明描述了用于确定微生物实体诸如病毒、原生动物、细菌、其细胞器、脂质体与诸如蛋白质或DNA的生物活性分子之间的相互作用的方法、设备和工具。本发明特别提供了辨别诸如生物活性分子的微生物实体与另一个实体之间的无特异性(a-specific)和特异性(specific)结合的解决方案。本发明具有在生物化学和医疗诊断测定(assay)诸如蛋白质微阵列(microarray)的设计和使用中的应用。

生物感应的难题是用高浓度的背景材料(例如，m摩尔/升的白蛋白)检测复杂混合物(例如，血液)中的小浓度特异性目标分子(例如，在p摩尔/升范围和更低范围中的肿瘤标记物)。最普通的生物感应方法是以捕捉分子(例如，抗体、核酸等)涂层表面。这些分子捕捉随后被检测的该目标。可以使用或不使用标记执行目标分子的检测。该标记步骤可以发生在该表面上的捕捉之前或之后。该标记可以直接地耦合到该目标，或间接地，例如通过另一个生物活性分子。检测最经常使用的是光学标记，例如荧光分子。

生物感应的重要问题是检测标记或目标分子到生物传感器的该表面或该捕捉分子的非特异性(non-specific)结合。这产生了背景信号，该信号降低了该生物传感器的分析灵敏度和特异性。在诊断测定中，可以使用严格步骤降低非特异性结合。严格性步骤的目的是放弃不想要的无特异性吸附结合，并只保留捕捉分子和(标记的)目标分子之间的该特异性相互作用。最普通的严格性方法是洗涤步骤。仔细调节该洗涤液的成分和温度来降低给定测定的背景。

集中于多重分析检测正日益增加，其中在称为生物芯片或(微)芯片的单一表面上同时测量许多不同的分子。该生物芯片表面由许多点组成(“捕捉点”)，每个点包含一个不同的捕捉分子或多个分子。难以开发多重分析传感器的严格性整体芯片洗涤步骤，因为需要抑制多个可能的背景信号，同时不同特异性相互作用的范围必须保持未受干扰，并且必须保持不同目标和捕捉分子的自然状态。其结果是较低的分析灵敏度和较低的分析特异性。该多重分析的严格性问题对于蛋白质检测是非常严重的，因为蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用是非常异质性的，并且某个洗涤步骤对蛋白质变性和对蛋白质-蛋白质相互作用的影响可以是非常明显的。

在Macbeatch和Schreiber(2000)发表在科学杂志第289期第1760-1763页的文章中已经意识到蛋白质阵列或微阵列的这个主要缺陷，其描述了在显微玻璃玻片上的自然蛋白质的应用。通过在该捕捉分子与目标分子结合之前添加BSA(胎牛血清)到该捕捉分子上，降低无特异性蛋白质-蛋白质结合。关于蛋白质微阵列技术的2002年12月(Macbeath(2002)发表在自然遗传学(Nature Genetics)第32期第526-532页)的综述性文章提出了评估特异性问题作为蛋白质微阵列技术的关键特征，而没有建议可能的解决方案。到目前为止，蛋白质阵列技术的最成功应用在免疫学领域获得。抗原和抗体之间的高结合强度允许严格性洗涤条件来克服抗原和抗体的无特异性相互作用。

处理该严格性问题的化学方式是通过设计能够与该目标更加强烈地和更加特异性地相互作用的捕捉分子。一个例子是光适体，能够携带光反应基的合成捕捉分子，光反应基能够在该目标分子(在Brody和Gold(2000)发表在生物工艺学第7期第5-13页的文章中所综述的)的特定点交联。当包含光适体的捕捉表面被暴露于该样本，并且应用光激活步骤时，适合该适体结合点的分子成为到那的共价键。随后，可以应用严格性的洗涤步骤来去除还没有光反应的分子。该光适体方法的缺点是：它需要针对每个目标的新的光适体设计，需要光激活步骤，光交联步骤本身不能辨别特异性和无特异性结合的分子，并且它是终点检测方法。

美国申请第2002/0001855号(Prentiss申请)描述了检测两个分子之间结合强度的方法，其中将一个分子耦合到第一表面并将该分子与被磁性标记的另一个分子接触。然后将该第一表面接近于具有磁场的第二表面，该磁场将对该磁性标记施加推力，并且依赖于该两分子之间的结合强度，该磁场导致它们的分离。这个系统的主要缺点是该第二表面和该磁性标记(提供在第一表面上)之间的物理距离，其限制该测定的灵敏度。该第二表面是在其产生磁场梯度的装置。该装置被制作为小磁体的栅极。结果，该装置具有接近于栅极表面的高磁场梯度区域。局部梯度的幅度和该高梯度区域延伸到该装置外的距离由组成该栅极的磁元的元件和尺寸产生的磁场确定。该装置的缺点是场梯度作为距离的函数快速下降。这样，高梯度只存在于非常接近该栅极表面的地方。因此，该装置不得不被放在非常接近于该生物结合表面的地方，而由于在该生物结合表面上面的样本液体的存在和带有盖板的液室的存在，这通常是不可能的。

需要用于确定微生物实体例如生物活性分子之间的相互作用或结合的改进方法、设备和工具的设计，特别是需要其中可以在不同强度的结合诸如特异性和无特异性结合之间进行区分的方法。利用多重分析传感器辨别特异性和无特异性结合是特别需要的，这里它能够同时适用于大范围的捕捉和目标分子。需要蛋白质多重分析传感器，因为只能够在很窄的限度内修改缓冲条件来改善该多重分析传感器上的严格性。而且，为了该方法在微阵列结构中是实用的，需要在不丢失灵敏度的情况下缩小规模。

本发明的一个目的是提供可替换的方法、设备和工具，用于确定微生物实体诸如生物活性分子，例如蛋白质或DNA之间的相互作用，或生物活性分子和微生物实体诸如病毒、细菌、原生动物、脂质体或其中的片段特别是那些满足如上所述的至少一个需要的实体之间的相互作用。

因此本发明公开了测定方法以及工具和设备，用于使用至少一个其为磁性的粒子或微载体例如珠子或微生物实体和也可以是微载体的第二粒子(例如第二珠子或微生物实体)，确定生物活性分子或其它微生物实体之间的相互作用。至少该第一粒子或微载体是磁性的。当使用两个珠子并且两个珠子都为磁性时，该珠子优选地在它们磁矩的大小上不同。提供装置以允许在液体中的环境，促进生物活性分子之间或生物活性分子和其它微生物实体之间或微生物实体之间的结合，和使得该结合处于机械应力下以由此辨别不同强度的结合。一方面，例如，使用该第二珠子(具有较大磁矩)来磁性地去除联接到具有较小磁矩的珠子上的目标分子，该珠子被微弱地约束到捕捉分子上(捕捉分子本身通常耦合到移动或不移动的表面)。依照其它的实施例，机械摩擦力例如由流体流动引起的力被施加到该至少一个粒子上，从而由此降低在该结合中的机械应力。依赖于该实施例，该第一个珠子和/或第二个粒子可以被用于检测目的。

明显地，该第一和/或第二个粒子可以是单独的粒子，但它也可以是粒子集合的一部分，例如一束粒子或一串粒子。

在存在磁场的情况下，成串的粒子容易形成。这些成串的粒子被容易地转移到液体中。而且，所述成串粒子在它们的末端具有强的场梯度，其对于紧急特性有利。

一方面，本发明提供一种方法，其在磁场中使用第一和第二个粒子辨别在液体中的微生物实体之间的结合的不同强度，至少其中的一个粒子是磁性的，该使用包含：提供在该液体中可移动的第一粒子和第一微生物实体之间的复合体(complex)，为该第一微生物实体和第二微生物实体之间的结合提供在该液体内的环境；将在该液体中可移动的第二个粒子接近于该复合体；并且作用于该第一和/或第二粒子以施加机械应力到该第一和第二微生物实体之间的该结合，同时施加该磁场以由此破坏第一强度的结合而不破坏第二更大强度的结合。在本发明的实施例中，将力直接施加到该第一和第二粒子以产生该粒子之间的相对推力。然后这个相对推力产生或引起该结合中的机械应力。该第一和第二粒子应该具有机械硬度，因此在粒子之间产生的该相对推力不会破坏该粒子而是破坏该结合。因此，该粒子可以包含刚性核心、支架或基体(matrxi)。结合强度的辨别可以用于辨别特异性和无特异性结合。该第一个微生物实体可以是目标分子，并且该第二个微生物实体是捕捉分子，例如，当两者都在液体中时，捕捉分子能够捕捉该目标。第一和第二粒子都可以是磁性粒子，或只有一个需要是磁性的。可以将该第一磁性粒子耦合到微生物实体，而不需要将该第二磁性粒子耦合到微生物实体。可以将该第一磁性粒子耦合到目标微生物实体。可以将该第一磁性粒子的该磁特性用于集中该目标，例如，通过施加场梯度到该液体，和将结合到该目标的该磁性粒子吸引到特定位置。该第一和/或第二磁性粒子可以是顺磁性的或任何其它磁性形式。

该第一磁性粒子可以具有较小的磁矩，例如，比该第二磁性粒子的磁矩小10倍。可替换地，该第一和第二粒子都是磁性的，并且具有相同的磁矩。该第一磁性粒子的尺寸可以小于该第二磁性粒子的尺寸。该第一磁性粒子优选地具有在1nm到1μm范围内的直径，例如，在10nm和200nm之间。该第二磁性粒子可以具有至少100nm的直径。

该第一或第二微生物实体可以是任何适当的实体，但在一些实施例中蛋白质或肽是优选的。典型地，多于一个的第一微生物实体和/或多于一个的第二微生物实体在该样本中出现。可以将该第一或第二微生物实体布置在阵列的捕捉点上。这对于检测目的来说是方便的。例如，该阵列可以包含至少10个在不同的捕捉点上的不同的捕捉微生物实体。捕捉点可以占据0、1和10⁴μm²的空间。

在本发明的一些实施例中，该第一和该第二粒子都被耦合到微生物实体。例如，该第一粒子可以被耦合到目标微生物实体，然后该第二粒子被耦合到捕捉微生物实体。可替换地，该第一粒子可以被耦合到第一目标微生物实体，该第二粒子可以被耦合到第二目标微生物实体。该第一或第二微生物实体可以是抗体。单克隆抗体可以提供高水平的特异性到某些蛋白质。

另一方面，只有该第一和第二粒子中的一个是磁性的，而另一个是非磁性的。该非磁性粒子可以大于该磁性粒子。本发明包括施加液体摩擦力到该第一或第二微生物实体。在这种情况下，由于尺寸的差异施加到该第二粒子上的该液体摩擦力远远大于施加到该第一粒子上的液体摩擦力。为了辨别结合的不同强度，可以使用不同尺寸的非磁性粒子。

施加的磁场可以在1.10^-4到10特斯拉之间，例如，在0.01到0.1特斯拉之间。在该第一和第二粒子是磁性的情况下，该磁场可以在该第一和该第二粒子之间产生吸引力或排斥力，或变化的、振荡的或交变的力。

本发明还包括将该结合的第一和第二微生物实体与第三磁性粒子接触，其中该第三磁性粒子的磁矩大于该第一或第二磁性粒子的磁矩。

本发明还提供了一种方法，其使用第一和第二粒子辨别在诸如捕捉和目标生物活性分子的捕捉和目标微生物实体之间的第一和第二结合，该第一结合具有与该第二结合不同的强度，其中至少一个粒子是磁性的，该方法包含：将带有至少一个捕捉微生物实体的样本与耦合到第一粒子的至少一个目标微生物实体接触，提供允许捕捉和目标微生物实体之间结合的条件，在未耦合的捕捉微生物实体的情况下，将该样本与未耦合的第二粒子接触或将该样本与耦合到微生物实体的第二粒子接触，施加磁场，辨别该目标和该捕捉微生物实体之间的该结合是第一还是第二结合。

本发明还提供了一种设备或工具，用于辨别液体中微生物实体之间的不同强度的结合，该工具包含：第一粒子和第二粒子，至少其中的一个是磁性的，第一和第二粒子在液体中都是可移动的；装置，其作用于该第一和第二粒子，并由此施加机械应力到该第一和第二微生物实体之间的结合上并且辨别不同强度的结合，该施加机械应力的装置包含至少磁场发生器。该施加机械应力的装置可以包括施加液体摩擦力到该第一或第二粒子上的装置。该工具可以进一步包含布置在基板捕捉点上的微生物实体的阵列。该工具还可以包含用于产生励磁的装置，该励磁推动该粒子相对于该阵列的横向移动。

该工具可以用于特异性结合的生物活性分子的识别、分离、提纯。该工具优选地制造为微流体设备。

从属权利要求限定了本发明的各个实施例。

现在将参考下列附图描述本发明。

图1-4示出了本发明的不同实施例，而图5-6指的是现有技术。在所有的图中，通过开圆(1)和密闭涂满的圆(2)表示珠子。捕捉分子(C)被划上点，目标分子(T)被划上线。所示出的配置指的情形是捕捉和目标分子彼此结合并且珠子已经移动到近得足以施加分裂力到该目标捕捉混合物上。

图1根据本发明实施例表示微阵列的细节，其中第二磁性珠子(2)施加吸引力到与目标分子耦合的该磁性珠子(1)上。

图2-4根据本发明实施例表示结合到捕捉分子的目标分子，其中第二珠子(2)施加排斥力到磁性珠子(1)上。在图2和图3中，分别是一个和两个目标分子被结合到捕捉分子。在图4中该第二珠子(2*)是非磁性的，而该排斥力是磁性力和液体摩擦力(以*表示)。

图5是依据本发明一个实施例能够执行图1或2的方法的设备示意图。

图6是依据本发明另一个实施例能够执行图4的方法的设备示意图。

相对于特定实施例，并参考某些附图将描述本发明，但本发明不限于此，而仅仅限于权利要求书。所描述的附图只是示意性的和非限制性的。在该附图中，为了说明目的，一些元件的尺寸被放大，并且没有按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使用属于术语“包含”的地方，不排除其它的元件或步骤。当指单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“a”或“an”的地方，这包括那个名词的复数，除非专门声明一些其它情况。

而且，在该说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三和类似的术语是用于区分相似的元件，而不是必须来描述有顺序的次序或年月日次序。能够理解，如此使用的术语在适当的环境下是可互换的，并且在此描述的本发明的实施例能够在除在此描述和说明的顺序之外的其它顺序中操作。

而且，在该说明书和权利要求书中的术语顶部、底部、在上方、在下方和类似的术语是为了描述性的目的而使用的，对于描述相对位置不是必须的。能够理解，如此使用的术语在适当的环境下是可互换的，并且在此描述的本发明的实施例能够在除在此描述和说明的方位之外其它方位中操作。

本发明是以观察为基础的，该观察在通常情况下是针对微生物实体之间(例如，在病毒、细菌、原生动物和诸如抗体的生物活性分子之间。该相互作用将通常是蛋白质-蛋白质或肽-肽相互作用)或生物活性分子之间(例如，肽-肽或蛋白质-蛋白质相互作用)的相互作用的检测，特别是针对多重分析传感器，通过物理(紧迫)力去除微弱地或非特异性地结合的分子是有优势的，该物理力独立于该捕捉分子-目标相互作用的精确物理化学本性。更一般地，本发明的目的是辨别生物活性分子或微生物实体之间的弱的和强的相互作用，或者辨别第一相互作用和第二较弱相互作用。

该方法应该能够施加的最小力可以从F_min＝E_min/w_max估计出，其中E_min是相互作用的最低能量，w_max是相互作用的最大长度规(length scale)。E_min由热能给定，在该热能上生物活性分子或其它微生物实体之间的相互作用发生。w_max的值由生物学相互作用(例如，离子键(ionic)、范德华力(van der Waals)、氢键(hydrogenbond)、疏水键(hydrophobic)/亲水键(philic)、空间(storic))的最大相互作用范围确定。以E_min＝k_bT，T＝300K和w_max＝40nm，结果为0.1pN的最小力，该结果是由本发明的实施例获得的。

本发明提供物理方法来抑制多重分析生物芯片中的背景信号。涉及两种类型的粒子，例如，在它们的磁矩上相差巨大的两种类型的磁性粒子，例如，一个或多个数量级：(i)第一珠子或微生物实体诸如类铁蛋白磁性蛋白质或作为检测标记一部分的在尺寸上较小的一些磁体；和(ii)第二珠子或微生物实体诸如类铁蛋白磁性蛋白质或一些磁体或磁单元诸如磁螺旋磁体结构(magnetospirrillummagnetotac-tum)。例如，当使用珠子时，该第二珠子可以在尺寸上较大以吸引和传送小珠子。该大和小粒子之间的力在皮可牛顿范围内，足以在强的和弱的生物分子相互作用之间进行辨别。该方法可应用于大范围的检测原理和设备设计。化学的和物理的严格方法可以与本发明结合。

根据本发明，施加物理力的实践方式依赖于至少一个磁性的或顺磁性的粒子或微载体，例如，珠子或微生物实体。依据本发明，粒子或微载体可以是任何形状，例如，以球形、圆柱形、杆状形、立方形、椭圆形等的形式，或可以具有变化的形状诸如细菌、磁小体(magnetosome)、脂质体或原生动物。当磁性微载体或粒子被耦合到生物活性分子时，可以经由磁场梯度施加力。施加到磁性微载体或粒子上的该力F等于：

$>>F>=>▿>>(>m>.>B>)>>\cong >m>▿>B>>>方程式(1)$

m是该微载体或粒子的磁矩，B是该磁场。该右手边的近似值应用于由例如磁性饱和引起的常量粒子力矩。

根据本发明的一个方面，使用第一微载体或粒子(例如诸如珠子的标记)和诸如第二珠子的第二微载体或粒子(例如第二磁性或非磁性珠子)的结合产生该磁力，可以将该第二磁性或非磁性珠子与该第一磁性珠子很近地接触。

接下来将主要参考珠子的使用描述本发明。然而，本发明不限于该珠子的使用。下面参考“第一珠子”和“第二珠子”，但对“第一”或“第二”还有术语“珠子”的解释都不应该有限制。在这个发明中所使用的“珠子”不意味着该珠子在形状上是球形的，而可以是任何适当的形状，例如，以球形、圆柱形或杆状形、立方形、椭圆形等的形式，或可以没有限定或恒定的形状。而且，尽管在下面使用了术语“珠子”，但本发明包括诸如微生物实体的粒子的使用，例如，磁小体、细菌、病毒、原生动物、脂质体、蛋白质混合物，作为上述珠子的等价物，它们是磁性的或非磁性的。例如，磁小体是在磁性的细菌中自然产生并从那里分离的磁性粒子，并且可以起磁性珠子的作用，然而，脂质体是典型的合成粒子，其可以用作为非磁性珠子。

相似的考虑适用于术语“生物活性分子”。在下面，将主要参考生物活性分子，然而，本发明包括微生物实体的使用，诸如磁小体、细菌、病毒、原生动物、脂质体、或它们中任何一个的片段，还有蛋白质混合物，作为上述分子的等价物。术语“微生物实体”应该被广义解释。它包括生物活性分子，诸如蛋白质、肽、RNA、DNA、脂质、磷脂和碳水化合物或相似物。该术语生物活性分子还包括细胞片段，诸如细胞膜的部分，特别是能够包含受体的细胞膜部分。该术语生物活性分子还涉及到小的化合物，其能够潜在地结合生物活性分子。这里的例子是配合体、促效剂(agonist)、对抗剂、抑制剂、或调谐剂。该生物活性分子可以是分离的或合成的分子。合成分子可以包括非自然产生的化合物，诸如被修改的氨基酸或核苷酸。可替换地，该生物活性分子可以出现在溶菌产物、细胞片段、细胞器、完整细胞或生物体(例如，病毒或细菌)内。该生物活性分子还可以出现在诸如血液或血清或其它体液或分泌物的介质内，或任何其它包含诸如血液、水标本和其它的生物活性分子的标本。该术语“微生物实体”还可以包括病毒、细菌、原生动物和其它细胞生物体，或它们的片段、或部分或诸如磁小体的细胞生物体器官、或诸如脂质体的合成的微生物体。

分子之间的相互作用指的是结合，并包括弱结合(通常是无特异性或非特异性)和强结合(通常是特异性结合)。该术语“弱的”、“无特异性的”和“强的”、“特异性的”结合不是必需涉及一定程度的或绝对强度的结合，而是限定相对的关系，也就是说该“强的”或“特异性的”结合比该“弱的”或“非特异性的”或无特异性的结合强。将生物活性分子之间的弱结合理解为其力低于0.1pN的结合。

在本发明中确定的称为“目标”和“捕捉分子”的生物活性分子之间的相互作用可以是在任何所提到的所列举的生物活性分子之间，并包括但不限于受体/配合体、受体/抑制体、酶/基底、抗体/抗原、DNA/RNA、RNA/RNA、病毒/分子、细菌/分子、脂质体/分子等组合。所确定的优选类型的相互作用是那些其中目标或捕捉分子中的至少一个是蛋白质或肽的相互作用。更优选的类型的相互作用是那些其中目标和捕捉分子都是蛋白质或肽的相互作用。

依据本发明应该给出涉及至少一个结合的分子和/或生物实体之间的相互作用以宽泛的解释。下列复合体仅作为例子给出：

-结合到捕捉分子上的目标分子，

-结合到与第二目标分子相结合的捕捉分子上的第一目标分子，

-结合到病毒的捕捉分子，

-结合到与第二捕捉分子相结合的病毒上的第一捕捉分子，

-病毒/细胞分子复合体。

通过为其中的一个粒子是磁性的两个粒子系统选择该恰当的环境，可以获得灵敏度的提高。使用磁性珠子来分离和集中生物活性分子是众所周知的(例如，B.Sinclair，“To bead or not to bead：Applications of magnetic bead technology(到珠子或不到珠子：磁性珠子技术的应用)”，Scientist 12(13)，第17页，1998年6月22日；或“The Immunoassay Handbook(免疫测定手册)”，DavidWild编写，(伦敦自然出版社，2001年，ISBN 1-56159-270-6)；或Urs Hfeli等编写的“Scientific and Clinical Applications ofMagnetic Carriers(磁性载体的科学和临床应用)”，纽约Plenum出版社，1997年，ISBN：0-306-45687-7)。在这些应用中，将捕捉分子耦合到磁性珠子，然后，施加磁力来去除或集中该结合的目标。通常以具有1μm或更大尺寸的珠子执行这些实验，该珠子显著大于蛋白质的10nm的平均尺寸。虽然在本发明的上下文中用到这些珠子，但由于位阻现象它们的尺寸会在微阵列结构中提供明显的缺陷。位阻现象限制了感应的动态范围和捕捉点规模的缩减。规模的缩减对于捕捉点来说是所需要的，因为具有较高浓度的捕捉分子的较小捕捉点将引起每单位面积较高的目标集中，并提供该感应的更大信噪比。从而，这将允许在微阵列中获得所需的灵敏度。

一方面，将至少该第一珠子附着到生物活性分子，并且不将该第二珠子附着到生物活性分子。然而，根据本发明的特定实施例，可以将生物活性分子附着到该第一和第二珠子。更加优选地，在这种情况下，该生物活性分子将是不同的。

至少其中之一是磁性的或顺磁性的珠子以这样一种方式被使用，即：磁场或其它类型的力场的应用将导致移去在目标-捕捉分子相互作用中的非特异性结合的目标。术语“磁性”包括任何适当形式的磁性粒子，例如，磁性的，顺磁性的，超顺磁性的，铁磁的，即在磁场中产生永久性或暂时性磁偶极子的任何形式的磁性。对于执行本发明，在该珠子的形状上没有限制，但球形粒子是目前以可靠方式最容易和最便宜地加工的。为了改善该磁引力，可以提供带有磁性不规则的珠子，例如加到该表面上的高弯曲率粒子、突出、针等。珠子也可以具有例如由于非球形形状的永久磁矩。本发明的优选磁性珠子是超顺磁性的粒子。这些粒子通常由一个或多个小的铁磁材料的球形核心(3-30nm)组成。由于它们的小尺寸，这些核心由单一磁畴组成。在超顺磁性珠子的情况下，磁矩由外部场产生。由于球形形状，该磁矩可以容易地在该粒子内旋转。超顺磁性粒子具有的优点是，它们的磁矩在缺少施加场的情况下消失，其然后最小化磁聚集。具有非球形形状和/或较大核心的粒子的优点是该磁矩通常很大，其便于磁性操纵。可以通过应用诸如交变磁场的励磁方法消除粒子的聚集。

根据本发明实施例，两个珠子都是磁性珠子，最优选地是带有不同磁矩的珠子。其中一个珠子是非磁性的(磁矩＝0)的一组珠子也被包括在本发明的这个方面内。根据本发明的另一个实施例(如在例子中所描述的)，这两个珠子可以具有相同的磁矩。

根据本发明的一个方面，将该相互作用的分子之一耦合到磁性珠子。优选地，将该目标链接到本发明的第一珠子。然而，能够理解在本发明范围内也设想了一些布置，其中将该捕捉分子耦合到该磁性珠子之一，或者其中将不同的捕捉分子每个都耦合到磁性珠子。

根据本发明的各个方面，该第一珠子可以具有小于、等于或甚至大于该第二珠子的尺寸。然而优选的是，当将该第一珠子附着到目标生物分子时，为了几个优点该第一珠子小于该第二珠子，该优点将进一步详细地解释。该第一和第二珠子可以具有相同的组成。在这种情况下，该能够获得的磁矩与该珠子的尺寸相关。然而，可以设想某些实施例，其中第一和第二珠子的组成是不同的。在这种情况下，尺寸和磁矩之间的相关性被分开。

该第一和第二珠子的尺寸本质上不是本发明的限制因素。然而，为了检测生物芯片上的相互作用，小尺寸化的珠子将有优势。当微米尺寸的珠子被用作标记时，它们限制规模的缩减，因为每个标记占据至少1μm2的面积。可以如下估计所得到的生物芯片尺寸：在每个捕捉点上，需要收集至少1000个粒子来得到3％(N^-1/2)的统计计算偏差。为了获得1000的动态范围，每个点需要至少1000×1000＝10⁶μm²的面积。1000丛生物芯片将需要针对该捕捉点的1000×10⁶μm²＝10cm²的总面积，加上这些点之间的开放面积等。这对于生物芯片来说是非常大的，为了具有成本效益，其必须在mm²范围内而不是在cm²范围内。进一步地，对于将通常在该表面上产生高于每平方微米一个的目标浓度的测定条件(例如，目标浓度，捕捉探测吸引力，该表面上的捕捉探测密度)，由于位阻现象微米尺寸的珠子不适合作为标记。而且，小粒子具有更好的扩散特性，并且通常显示比大粒子更低的沉降趋势。

根据本发明，该第一珠子优选地处于1和500纳米之间的尺寸范围，更优选地处于5和100纳米之间。根据本发明，该第二珠子优选地处于50nm和5微米之间的尺寸范围。然而，两个珠子可以具有在3nm到5微米范围的相同尺寸。

依据本发明的各个方面，在使用磁性或顺磁性珠子的地方，磁场的施加能够导致该第一和该第一珠子(其中两个珠子都是磁性的)之间的排斥和/或吸引，或由于磁场梯度导致该珠子之一移动。本发明的被用来构成珠子的粒子可以由磁化的或可磁化的材料组成，但也可以是实心的或多孔的材料诸如聚合物，磁性粒子可以被附着到或被结合到该材料上。在珠子中与另一种材料合成的磁性粒子的使用使得分离该珠子的磁矩和尺寸之间的直接关系成为可能。珠子中磁性粒子复合体的使用还允许该珠子重量的修正。珠子中磁性粒子复合体的使用还允许结合官能团，用于与蛋白质和/或检测标记反应，例如，发色团。包含磁性材料的珠子的众所周知的例子是Dynabeads^TM。Dynabeads^TMM450(直径4.5微米)可以被涂上单体环氧化物，导致环氧基和羟基的混合物。Dynabeads M-280(直径2.8微米)是具有羟基的聚苯乙烯珠子，该羟基可以通过与p甲苯磺酰氯化物反应被转换成tosyloxy(甲苯磺酰基)。

磁性珠子被广泛用于生物分析中，例如用于高生产量的临床免疫测定仪器、样本提纯、细胞萃取等。几个诊断公司(Roche、Bayer、Johnson&Johnson、Abbott、BioMerieux等)制造和销售带有磁性珠子的试剂，例如用于免疫测定、核酸萃取和样本提纯。磁性珠子以各种尺寸在商业上可利用，范围从纳米到微米。为了本发明中将该珠子附着或结合到该生物活性分子，该珠子可以携带官能团，诸如羟基、羧基、醛基或氨基。这些官能团的提供通常是，例如，通过处理未涂层的单分散性的、超顺磁性的珠子从而提供聚合物的表面涂层，该聚合物携带这些官能团之一，例如，聚氨酯结合聚乙二醇来提供羟基，或纤维素衍生物来提供羟基，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚体来提供羧基，或乙酰化氨基(aminoalkylated)聚合物来提供氨基。美国专利4654267描述了许多这些表面涂层的介绍。根据美国专利4336173、4459378和4654267，可以通过这些珠子的修改准备其它的涂层粒子。例如，以HNO₃处理从苯乙烯-二乙烯基苯和以3.15μm的直径准备的大网格多孔聚合物粒子，从而在该孔的表面引进亚硝酸(-NO₂)基。然后该粒子在Fe²⁺的水溶液中被分散。该Fe²⁺被亚硝酸基氧化，该亚硝酸基导致不能溶解铁和氢氧根的化合物在该孔中的沉淀。在加热之后，该铁作为磁铁氧化物的精细划分的颗粒存在于整个多孔粒子的容量中。该亚硝酸基通过与Fe²⁺反应被降低为NH₂基。为了填满该孔和在该表面引进所需的官能团，使不同的单体聚合在该孔中和在该表面。在优选类型粒子的情况下，该表面携带通过-(CH₂CH₂O)的8-10个键连接到该聚合主链的-OH基。其它优选例携带通过甲基苯烯酸的聚合获得的-COOH基。例如，最初存在于该珠子中的NH₂氨基可以与二环氧化物反应，如在美国专利4654267中所描述的，接下来与甲基丙烯酸反应来提供终端乙烯基。与甲基丙烯酸的溶液共聚合产生携带终端羧基的聚合物涂层，正如在下参考的R452珠子中。类似地，通过使二胺与上述与二环氧化物反应的产品反应，可以引入氨基，同时与诸如氨基甘油酯(aminoglycerol)之类的羟胺的反应引入羟基。

通过使用联结分子用于粒子和生物活性分子之间的交联，生物活性分子到珠子的耦合可以是不可逆的但也可以是可逆的。这种联结的例子包括带有某一蛋白分解识别部位的肽，用于某一限制性酶的带有识别部位的寡核苷酸序列，或如那些包含可还原的二硫化物基的化学可逆交联基。各种可逆交联基可以从Pierce生物技术公司(罗克福德市，IL，美国)获得。

根据本发明的优选实施例，根据该粒子的特性，完成目标和捕捉分子之间的特异性相互作用的检测(即，在去除非特异性结合的分子和/或标记之后)，该粒子被连接到该生物分子上，并且根据本发明大部分实施例该粒子为第一粒子。优选根据第一粒子的磁特性来完成所述检测。

根据本发明的各个方面，将磁场施加到包含本发明的第一和第二珠子的样品上。可以以本领域技术人员已知的几种方式施加磁场，从而提供对磁性珠子的不同效果，如在本发明中所描述的。磁场应当大到足以在一个或两个粒子中产生该磁矩的方位，优选地使两个粒子中磁矩饱和。所需要的场依赖于粒子的类型(例如，超顺磁性的，铁磁的，球形的或非球形的)。根据本发明，该场处于1.10^-4特斯拉到10特斯拉的范围内，优选地在0.01到1特斯拉之间的范围内。磁场可以由永久磁铁或由电磁铁例如螺线管产生。变化的场可以通过变化磁铁线圈中的电流产生，但也可以通过磁性材料(硬磁或软磁)的机械移动产生。

磁场梯度可以接近于电流电线产生，但也可以通过在磁性材料中具有弯曲的或尖锐的形状产生。施加到该磁性粒子的场梯度的范围从0.01T/m到10⁵T/m，优选地在0.1T/m和10⁴T/m之间。

结合的目标分子的检测或磁性珠子的检测可以通过任何适当的方法实现，例如，磁性地。例如，该检测的执行可以通过使用磁阻传感器或通过磁感应方法等，通过机械方法(表面波或体声波、石英微量天平、振动膜等)，光学方法(表面细胞质基因组共振、光干涉、衍射、表面加强的共振喇曼散射、光散射等)，电子方法(传导、借助于该粒子的化学显影等)，或者甚至使用其它的分析工具诸如质谱分析。该珠子为合成检测标记的一部分属于本发明的范围，例如，包含附加的光学活性成分、附加的电活性成分等。检测可以光学地(例如，通过荧光、渐消失场引起的荧光、荧光偏振、化学发光、电化学发光、表面加强的喇曼散射等)、电子地(例如，经由传导、通过氧化还原电流等)、机械地等产生。特别的标记设计包括在本发明的范围内，诸如：

-带有金属覆盖层的磁芯，例如用于加强的稳定性、传导特性、光学特性(例如，散射、细胞质基因组共振)等。

-被光学活性成份围绕的一个或多个磁芯。

-被(生物)化学活性分子例如酶类、氧化还原分子、氧化还原酶围绕的一个或多个磁芯。

-涂覆有有机层例如生物活性和/或其它官能化合物被耦合到其上的右旋糖酐(dextrane)的一个或多个磁芯。

-被封装在聚合物球体例如聚苯乙烯(通常称为橡胶)、PMMA内的一个或多个磁芯。在该聚合物矩阵中其它的信号分子(例如，荧光团)可以被嵌入或被共聚合。

-生物活性磁性粒子诸如铁蛋白。

-带有磁性和/或检测成分例如磁小体、脂质体的囊泡。

磁性纳米粒子(nanoparticle)和技术的应用的例子也可以在最近的参考文献中发现，诸如“Bioconjugated nanoparticles in mo-lecular diagnostics and therapy”，2003年5月22-24日，耶拿(德国)。参见www.ipht-jena.de/BEREICH_3/molnano/nanopar-ticles2003/和“2nd internation meeting on the diagnosticsapplications of magnetic microspheres(关于磁性微球的诊断应用的第二次国际会议)”，2003年6月12-13日，法国，巴黎。

在另一个实施例中，该第一珠子可以携带用于检测的附加标签，诸如，但不限制于抗原、生色团、亲和标记。当该珠子用于与检测标签反应的附加的官能团，正如对于聚合物金属珠子的情况的时候，可以容易地将用于检测的标签应用到磁性珠子上。在本领域中已知几项技术来耦合标签到珠子，例如，直接通过官能团，或间接通过交联剂或系链，或者使用中间分子诸如生物素/抗生蛋白链菌素。

第一实施例

根据图1示意性示出的本发明的第一实施例，执行生物分子之间相互作用的检测，由此该生物分子之一C(优选地指该捕捉分子)被直接地耦合到表面5，例如，当该表面5包含诸如该捕捉分子结合到其上的聚合物的材料时，或者间接地通过联结分子3耦合到表面5。如在此使用的表面5涉及适合用生物分子直接(例如，通过交联)或间接地涂层的固定基底、基质或网格，诸如玻璃、塑料、有机晶体或无机晶体(例如，硅)、无定形有机或无定形无机材料(例如，氮化硅、氧化硅、氮氧化硅、氧化铝)。适当的表面材料和联结化学对本领域技术人员来说是已知的，并且被描述在例如“Diagnostic BiosensorPolymers(诊断生物传感器聚合物)”，作者A.M.Usmani和N.Akmal，美国化学学会，1994年专题讨论会图书系列556，美国华盛顿DC，1994年，“Protein Architecture，Interfacing Molecular Assembliesand Immobilization Biotechnoloty(蛋白质结构、分界面分子组合和固定生物技术)”，Y.Lvov和H.Mhwald编辑(Marcel Dekker，纽约，2000年)，“The Immunoassay Handbook(免疫测定手册)”，作者David Wild(伦敦自然出版社，2001年，ISBN 1-56159-270-6)或“Handbook of Biosensors and Electronic Noses.Medicine，Foodand the Environment(生物传感器和电子鼻子手册。医学、食物和环境)”，Kress-Rogers(ISBN 0-8493-8905-4)。

本发明可以在平面传感器表面(例如，平面玻璃生物芯片)上执行，而且可以在流体通过的系统中执行(例如，由包含微珠子的多孔氧化铝、多孔硅或多孔圆柱组成的流体通过传感器)。

根据第一实施例的一个方面，将每个具有不同磁矩的两个珠子1、2用于调节，例如最小化捕捉分子-目标分子相互作用的检测中的非特异性结合，如图1示意性示出的。包含已知或一个(或多个)假定目标T的生物分子之一或混合物被联结(直接或间接地)到该第一珠子1。该第一珠子1具有比该第二珠子2小的磁矩。用一个或优选地选择的捕捉分子C涂层该表面5。该涂层的表面与该目标/混合物接触，并伴有或之前添加具有较大磁矩的该第二珠子2，该第二珠子本身没有被耦合到生物分子。施加充分的磁场M(该图表示平面外的磁场，但这不是必需的)将导致吸引该第一珠子1到该第二珠子2。选择该第一和第二珠子1、2的磁矩和该磁场M的强度，使得标记生物分子T与该捕捉分子C或与该表面5的较弱或非特异性的相互作用导致该分子T的去除，即，该目标和捕捉分子T、C之间结合的破坏。另一方面，选择该第一和第二珠子1、2的磁矩和该磁场M的强度，使得较强的例如特异性的目标-捕捉分子的相互作用将不会被该两个珠子1、2之间的磁引力破坏，并能够被检测到。

这个实施例的几个应用被包括在本发明的范围内。例如，将已知配合体的结构相关的类似物的集合或大量小化合物(捕捉分子)的集合应用到表面，由此将单一蛋白质(目标分子)用来测定该蛋白质到配合体类似物的弱、中和强的结合。这使得发现被测定蛋白质的显效剂和对抗剂的假定导向化合物。可以以几个蛋白质使用相似的测定。这里，弱或强地结合的蛋白质将给出可能副作用的指示。

可以执行相似的测定，其中将蛋白质成份连接到表面，并且该小的化合物处于溶液中，这依赖于是否容易地联结小的化合物到该表面或到该磁性珠子。

本发明的这个实施例也可以用于蛋白质工程。被引导的或随机诱变处理的蛋白质位置的集合定位在网格表面，用于筛选某一化合物(小分子或其它单个或多个蛋白质)的结合。以这种布置，蛋白质可以被确定与它的标准配合体具有小的或修改的结合亲合力，但也会显示突变体，其表示修改的结合特性或修改的配合体特异性。根据在前例子的教导，可以为蛋白质和DNA、RNA、碳水化合物、类脂、磷脂、其它细胞成分之间的相互作用设计相似的实验。也可以检测细胞、囊泡、病原体和其它生物体。本发明的这个实施例适合检测生物活性分子，但也可以用于生物活性分子的分离和提纯。

依据本发明的这个实施例，所确定的优选类型的相互作用是那些该捕捉和目标分子都是蛋白质的相互作用。关于这个的应用是所谓的蛋白质阵列，其中已知蛋白质(捕捉分子)的集合被耦合到网格。包含目标分子的生物样本被该第一磁性珠子标记，并被测定用于目标分子和捕捉分子之间的结合。然后将该第二粒子用来识别或去除那些更加微弱地例如无特异性地结合到该捕捉分子的目标分子。

为了辨别特异性结合和无特异性结合，本发明允许在不需要改变缓冲条件的情况下执行这个方法。

当在蛋白质微阵列中工作时，该第一磁性珠子的尺寸是重要的。微米尺寸的磁性珠子可以被用作阵列传感器中的标记(例如，Baselt D.R.和Lee G.U.等，“A biosensor based on magnetroresistancetechnology(基于磁阻技术的生物传感器)”，Biosensor and Bio-electronics 13(1998)，731-739)。尽管由于大的磁矩，可以容易地将磁力施加到大的珠子，但在诸如蛋白质-蛋白质微阵列的实验中大珠子具有许多重大的缺陷：

-为了具有结合到该表面的良好机会，该标记需要在相当长的时间周期内与该传感器表面相互作用。该珠子与该表面的相互作用效率相当一部分是由该标记的分散速度确定的。微米尺寸的粒子的分散是非常慢的(D～10^-12m²/s，大约1秒内1μm)，其增加了整个测定时间。

-该慢的分散速度、与该表面长的相互作用时间和该粒子大的接触面积增加了该大珠子以非特异的方式粘到该表面的机会。

-微米尺寸的粒子显示对该测定有害的沉淀速度。

-微米尺寸的粒子对于流体流动是敏感的。在测定期间，溶液经常被补充或被搅拌(例如，在潜伏期)，并且不同的流体可以被连续应用。当大珠子被用作标记时，通过这样的流体运动它们可以以一种不可控的方式从该传感器中裂开。结果，微米尺寸的标记只能用作终点检测，并且即使如果是那样的话，流体操纵需要小心翼翼地执行。

-小珠子可以以比大珠子更高的浓度分散在流体中(按照每单位体积内的珠子数目)。这样，小珠子产生较高的与该目标分子和传感器表面的相互作用速率。

这样，使用具有低于微米尺寸的珠子是有优势的。这样，根据本发明的优选实施例，使用亚微米磁性第一珠子，尺寸在500纳米下至几个纳米的范围。

当使用小的粒子时，珠子的磁矩降低的问题产生。该磁矩与该珠子的体积成比例，也与该珠子半径的三次幂成比例。例如，尺寸为35nm和磁芯大约为10nm的超顺磁性珠子具有大约10^-18A.m²数量级的磁矩。即使以10³T/m大的外部梯度，只能获得1fN[方程式(1)]的力。这远不足以将生物活性分子之间的弱结合从强结合中分开。因此，这些小的粒子只有当该场梯度有力地增加时被使用。

增加该磁性梯度的已知方式是通过使用具有非常强的弯曲或尖锐形状的磁性材料。例如，顶点曲率为100微米的磁针在顶点产生大约1T/100微米＝10⁴T/m的场梯度(假定磁性材料的饱和磁化值大约为1T)。然而，这个梯度快速下降，特别是当从该顶点进一步移动超过100微米时。换句话说，高的场梯度总是空间不均匀的，并且仅仅被局部应用。因此，应当将产生该场梯度的该磁性材料尽可能接近需要被激活的该第一珠子。同时，该梯度产生方法不应该扰乱在该传感器两端的该流体流动(流体槽典型地具有50微米和更高的高度)和允许及时对该场的尺寸和方位以及该场梯度进行简单地控制。

本发明在一方面提出了施加磁力到第一珠子的新方法，即通过该流体内的第二磁性珠子动态接近该第一珠子。该第二珠子的磁矩在该第一珠子上局部产生大的磁场梯度。这转化成该第一和第二珠子之间强的磁相互作用。同时，由于它们较大的磁矩，可以以相对小的场梯度磁性激活该第二珠子，或者可以通过不同的方法激活它们。

该粒子的磁矩将确定该珠子之间的力和因此确定严格性。为了以捕捉和目标分子之间渐增的结合强度逐步去除被标记的捕捉分子，可以以带有至少一种类型的第三磁性粒子的连续洗涤步骤执行本发明的该方法，该第三磁性粒子具有渐增磁矩，这些磁矩大于第二磁性珠子的磁矩。这个逐步的洗涤也使得能够在较窄的范围内评估捕捉和目标分子之间的结合强度。产生渐增结合强度的逐步去除的另一方式，是通过在使用其磁矩随着该施加场增加的珠子的同时连续施加较大的外部场。

根据上述实施例，有可能重新使用该第二珠子。可以将它们接近该第一珠子，然后去除微弱地结合的第一珠子，然后从接近的初始点移开，接下来重新使用它们来去除该表面上其他地方的微弱地结合的第一珠子。

根据上述实施例，也有可能重新使用联结到那些生物活性分子的第一珠子，该生物活性分子没有被特异性地结合，并且通过结合到该第二珠子被去除。

可以以几种方式设计根据上述实施例的目标检测：

-通过在该目标结合到该传感器表面之前将它们与小的磁性珠子耦合可以标记该目标。可以以普通的方式(例如，该珠子在它们的表面具有普通的蛋白质结合化学性质)或以对捕捉分子(例如，携带磁性珠子的抗体)具有特异性结合的生物活性分子执行该预标记。

-在这些目标已经结合到该传感器表面上之后可以再次以普通或特殊的方式将小的磁性珠子连接到该目标。

-该测定可以是结合测定、竞争测定、置换测定等。磁力施加到多分子复合体增加了分子分裂的机会。这可以帮助提高置换测定的速度，由于捕捉分子的高亲和力和低分裂率该置换测定的速度通常是很低的。

第一实施例的例子1：

磁性珠子之间力的确定。

可能有几种珠子的结合。需要在该珠子的尺寸(越小越好)和磁性特性(磁矩、磁性弛豫)之间寻找好的平衡。根据本发明的优选实施例这个例子提供了对两对粒子的不同参数的对比研究。

下面我们将考虑两种情形。

在下面的例子中，该第一和第二珠子在尺寸上不同因此磁矩也不同。为了实践原因，本发明的第一珠子和第二珠子称为“小”和“大”珠子。

例子A.

第一(小)珠子：直径100nm，m＝10^-16A.m²，超顺磁性的。

第二(大)珠子：直径1-μm，m＝10^-13A.m²，超顺磁性的。

例子B.

第一(小)珠子：直径35nm，m＝10^-18A.m²，超顺磁性的。

第二(大)珠子：直径100nm，m＝10^-15A.m²，高密度磁性材料

在数例中，m表示该珠子的饱和磁矩。该例子已被选择使得该第二珠子能够在该第一珠子上产生大的场梯度，同时在该两个珠子之间产生高于0.1pN的力。在下面的计算中，该粒子接近球形。

大和小珠子之间的力

为了计算第一和第二珠子之间的吸引力，两个磁化的珠子之间的力由磁矩的大小、磁矩的相对定位和该珠子的相对位置确定。对于沿着从外部施加的磁场方向的珠子到珠子的接近(磁极到磁极的接近)，该吸引的偶极-偶极力由下式给定：

$>>F>=>>>\mu >0>>>4>\pi >>>>>6>>m>1>>>m>2>>>>x>4>>>>>方程式(2)$

其中m₁和m₂是各个珠子的磁矩，x是中心-中心的距离。

当该珠子处于最近接触时第二珠子能够施加最大磁力到第一珠子上。

对于例子A，对于50nm(x＝0.6μm)的表面-表面距离计算出吸引力为46pN，在接触的情况下(x＝0.55μm)吸引力为66pN。

对于例子B，对于10nm(x＝77.5nm)的表面-表面距离计算出吸引力为17PN，在接触的情况下(x＝67.5nm)吸引力为29pN。

从而，根据这个实施例的方法提供了辨别具有几十皮可牛顿数量级的极限力的较强和较弱生物分子的相互作用的可能性。

大珠子的速度

由于它们的大磁矩，可以通过外部施加的磁场梯度在该流体内操纵该第二珠子。使用针对在粘性介质中球形粒子的流阻的方程式可以估算第二粒子(大珠子)的操纵速度：

F＝6πηrv                                  方程式(3)

其中η为该流体的粘性度，r为该粒子的半径，v为关于远离该珠子的周围流体的粒子速度。

以10³T/m的梯度，该例子A的第二珠子经受100pN的力[方程式(2)]和10mm/s的速度[方程式(3)]。在相同的梯度，例子B的该第二珠子具有1pN的力和1mm/s的速度。这意味着，当施加磁场时可以将在100nm到1μm范围内的该第二珠子快速地(mm/s)移向该传感器表面和从该传感器表面移开。而且，可以利用尺寸和磁矩的这个范围来获得力，该力在本发明的该方法中(也参见实施例2和3)足以实现辨别较弱和较强的例如特异性和无特异性的结合。

重复的严格性

能够显示，当它们都存在于溶液中时，溶液中的第一和第二珠子几乎彼此没有影响：

(i)在该两个给定的情形，该第一和第二珠子的磁矩之比是10或更大，例如10³。结果，各个分离的珠子上的磁力和它们的速度也相差几个数量级。这意味着当溶液中的该第一珠子几乎不能被激活时，可以将该第二珠子磁性地移向该传感器和从该传感器移开。

(ii)仅当第二珠子非常接近时该第一珠子感受到有效的粒子-粒子力[该力如同方程式(2)中的x^-4下降]。在该第一珠子被固定的表面容易地实现如此近的接近，但当两个珠子都在溶液中时具有非常低的概率。

结果，可以重复该两珠子的严格性步骤，定期从该表面去除宽松结合的第一珠子。然后，该传感器状态可以被定期监控而不是仅在该测定的终点被检验。在该传感器上动态和动力的最终记录给出了该生物测量的改进的可靠性、精度度和速度的优点。

大珠子的横向操纵

到现在为止，已经假定将该第二珠子以它们的轨道基本垂直于该表面移向该传感器表面和从该传感器表面移开。可以通过在传感器表面之上再创建该第二珠子的横向移动提高效率，第二珠子以该效率拾取微弱结合的第一珠子。可以通过任何适当的剪切流体流动的工具装置创建该横向移动，声激励或磁激励仅是例子。后者可以通过外部场梯度和通过在该芯片上创建的梯度，例如将电流通过芯片内电流电线来产生。芯片内电流电线具有该梯度以非常小的能量消耗被产生以非常接近该结合表面的优点。在芯片内电流电线周围产生的磁场梯度等于：

$>>>dB>dR>>=>>>>\mu >0>>I>>>2>\pi >>r>2>>>>>>方程式(4)$

其中I是穿过该电线的电流，r是相距该电线的距离。作为例子，在10μm的距离10mA的电流产生20T/m的场梯度。假定该珠子被外部施加的均匀磁场磁性饱和，并且附加的非均匀场由芯片内电流电线创建。20T/m的梯度对于例子A的大珠子给出0.2mm/s的速度，对于情形B的第二珠子给出21μm/s的速度。当该传感工具有10μm的宽度时，该第二珠子能够每秒钟许多次或几次移动越过该传感器。这个横向移动可以增加了传感器表面受该第二珠子的影响，并且增加拾取微弱结合的第一珠子的机会。

大珠子的聚合

这个两珠子严格性的实施例相对来说不受磁性聚合的影响，出于两个原因：

(i)具有较低磁矩的该第一例如小珠子可能在磁场中具有小的聚合趋势。

(ii)固定的第一珠子上的该严格性力由单个最接近的第二珠子[参看方程式(2)中的x^-4]确定。距离珠子更远的力是可以忽略的，所以第二珠子的潜在群集不会改变施加到该第一珠子上的力。

然而，优选地可以避免该第二珠子(具有更高的磁矩)非常大的聚合，因为该聚合可能具有到该传感器表面降低的可达性。聚合的降低可以通过部分时间切断该磁场，通过使用具有非常低的残余磁矩的珠子(例如，由于紧的磁性弛豫、小的磁畴、超顺磁性)，通过使用抗粘附的涂层，通过流体剪切力，通过使用中等浓度的第二珠子，和通过改变该磁场的方位(例如，使用变化的磁场大小和方向)。

注意到该检测的执行是在该目标分子上或在该第一珠子上。为了避免可能存在于该灵敏检测区的来自第二珠子的错误信号，该第二珠子优选地在测量期间不产生信号影响。例如，通过具有荧光标签的第一珠子完成该检测，而那些标签不存在在该第二珠子上。

例子2

将参考图5描述根据本发明优选实施例的严格性步骤。

图5的设备可以作为微流体设备而实现。

1.将具有较低磁矩和随意较小尺寸的第一珠子1连接到目标分子，并提供在源11中。在阀1和泵13的控制下将那些第一珠子1引入测量室15，在该测量室中有带有捕捉点即耦合到基底16的传感器表面的捕捉分子的基底16。可以加强珠子朝向该表面的传送，例如，通过流体流动，搅拌，或通过施加磁场梯度。

2.连接到该目标分子的该第一珠子1通过它们到捕捉分子的结合被固定到该传感器表面上。这个实施例的修改是在生物芯片16上提供在生物活性分子之间具有不同强度相互作用的不同捕捉点。因此，可能有利的是，为具有微弱生物分子相互作用的捕捉点选择具有稍微较低磁矩的第一珠子1，并且为具有强的相互作用的捕捉点选择具有稍微较高磁矩的第一珠子1。

3.通过操作阀2和泵13从源10提供具有较大磁矩的第二珠子2。该第二珠子可以具有比该第一珠子1随意较大的尺寸。将第二珠子2移向该第一珠子1被固定的该传感器表面。该移动由例如由诸如一个或多个永久磁铁或电磁铁的磁场发生器14产生的磁力驱动。也可以通过操作阀3和泵13从源12提供液体流。为了该第二珠子2轨道的最优控制，应当优先考虑和同步在该传感器表面之上的磁力和该流体的强制流动。

4、当该第二珠子2接近该第一珠子1时，该第一珠子1经受朝向该第二珠子2的吸引磁力。从该传感器表面分离的微弱结合的第一珠子1被吸向该第二珠子2，并且被磁性连接到那里。强结合到该传感器表面的第一珠子1停留在该传感器表面上。

5、由于磁引力有可能形成第一珠子-第二珠子的复合体，但是该两珠子复合体不会立刻从该传感器表面移开。在该情况下，可以施加附加的激励来从该表面去除该复合体，例如从该表面拖开该形成的复合体的磁场梯度，沿着该传感器表面产生剪切力的剪切流，超声波激励等。这些激励去除复合体，其中该第一珠子微弱地结合到该表面。

6、将带有或不带有连接的第一珠子1的该第二珠子2从该传感器表面移开到出口19，例如通过使用源12中的该流体洗涤。结果，最初微弱地结合到该传感器表面的该第一珠子1现在被从该传感器去除。

7、可以通过任何适当的技术检测现在保持连接到该捕捉分子的该第一磁性珠子1，例如，通过使用传感器电路18定位在该基底16下面的磁传感器17。如果以光学活性材料例如染料或荧光材料标记该第一珠子1，那么可以光学地检测该第一珠子1的存在。如果以改变电化学电压或使得电化学电荷转移的材料标记该第一珠子1，那么可以通过使用合适的电极检测该第一珠子的存在。如果该珠子包含放射性材料，那么可以通过放射性发射检测它们。

可以以相同组的第二珠子2重复上述序列几次。该方法可以在井盘(例如微滴定盘)中或者在微流体盒中实施。井盘高度适合自动化的高生产量应用；盒能够实现该传感器周围的高次函数积分和流体小型化。

第二实施例

根据在图2中示意性地示出的本发明的第二实施例，使用了两个珠子1、2，该两珠子的每一个被耦合到生物活性分子。该珠子1、2随意地具有相同的磁矩。在一个实验装置中，该两珠子1、2可以分别被耦合到目标T和捕捉C分子。在一个可替换的装置中，该两珠子1、2被耦合到两个不同的目标分子T1、T2，该两个目标分子结合到捕捉分子C的不同部分(参见图3)。例如，该两个不同的目标分子T1、T2可以是抗体，每一个是单克隆或多克隆的，指向为捕捉分子的同一抗原的不同抗原决定基。

在两个装置中，将该捕捉分子C，其或者被涂层在表面上或者处于溶液中，与一个或两个耦合珠子的目标分子T1、T2接触，该目标分子T1、T2将结合到它们各自的结合位点或抗原决定基。然而，珠子1、2的其它结合也可以因为非特异性结合而被创建。带有磁矢量方向快速变化的磁场M的施加将引起该两个珠子1、2之间的磁排斥或磁吸引，例如，依赖于该瞬时磁场是垂直于将该两珠子结合的轴，还是与之平行。选择该两个珠子1、2的磁矩大小和变化的磁场M的幅度，以使得在该目标分子T1、T2之一或两个没有特异性结合的情况下，该吸引力和排斥力导致该分子T1、T2的去除，即，该珠子-珠子相互作用被破坏。还要选择该两珠子1、2的磁矩大小和该变化的磁场M的幅度，以使得在一个或多个目标分子T1、T2特异性结合的情况下，例如两个多克隆或单克隆抗体特异性结合到它们备自的抗原决定基，它们将不会被去除。可以例如光学地检测紧密靠近在一起的两个珠子1、2的存在。由于如果两个选择性结合存在的情况下两个紧密靠近的珠子的结合才发生的事实，例如，通过施加该变化的磁场的两个抗体结合加上严格性的控制，紧密结合的珠子1、2的存在是该捕捉分子C存在的清楚指示。特别地，当使用多克隆抗体时，无特异性结合或到其它抗原决定基的可交叉反应的机会增加，并且可以使用该施加的变化磁场和由此在该结合上的力来消除与所需的结合不同特异性的结合。因此，在使用如目标分子T1、T2的两个被耦合的抗体的情况下，可以获得抗原(捕捉分子C)的特异性检测，不需要提纯的单克隆抗体，即，不需要高水平的特异性。

该磁场可以导致吸引力，即将两个珠子1、2推向彼此，或者可以是排斥性的，使两个珠子1、2彼此远离。当两个珠子1、2经由该目标和捕捉分子T1、T2、C耦合到一起时，它们非常接近地在一起，并且当产生垂直于该两珠子的轴的磁场时，该珠子1、2彼此抵制。由于该磁性珠子1、2在磁场中趋向对齐，并且最初在液体中通常具有随机取向，因此该磁场必须经常地改变以保持排斥性。通过旋转的磁场来改变该磁矢量的方向，例如，通过为彼此正交的三个线圈提供电流控制器用于控制在该线圈中AC电流的相位和振幅，从而产生在三维中快速旋转或随机或伪随机移动的磁场。这个磁场应当大到足以在两个珠子1、2中产生该磁矩的定位，优选地使在该珠子中的磁矩饱和。所需要的场M依赖于粒子的类型(例如，超顺磁性的、铁磁性的、球形或非球形珠子)。两个磁性珠子1、2之间的偶极相互作用的势能U由下式给出：

$>>U>=>>>\mu >0>>>4>\pi >>>>>ver>>m>\to >>1>>ver>>m>\to >>2>>->3>>(>ver>>m>\to >>1>>.ver>>r>\to >>)>>>(>ver>>m>\to >>2>>.ver>>r>\to >>)>>>>r>3>>>>>方程式(5)$

其中分别表示每个珠子的磁矩，r＝该两珠子中心之间的距离。

该珠子到珠子的力F由该能量的梯度给出：

F＝-U                                         方程式(6)

该磁力依赖于该珠子磁矩(其受该外部施加场的影响)和该珠子到珠子的轴的相对定位。当该珠子磁矩相互对齐并且定位在垂直于该珠子到珠子的轴上时，有如下大小的相互排斥力：

$>>F>=>>>\mu >0>>>4>\pi >>>>>3>|>>m>1>>|>|>>m>2>>|>>>r>4>>>>>方程式(7)$

当该珠子磁矩相互对齐，并且同时定位与该珠子到珠子的轴平行时，那么存在如下大小的相互吸引力：

$>>F>=>>>\mu >0>>>4>\pi >>>>>6>|>>m>1>>|>|>>m>2>>|>>>r>4>>>>>方程式(8)$

上述实施例可以用于需要从身体去除捕捉分子的测定。一个例子就是从口中去除蛋白质。将标记有第一磁性珠子的目标分子T1引入口中，并将其与在口腔中的蛋白质合成。然后使用磁铁将这些复合体从口中去除来清除所有的珠子。然后将标记有另一个目标分子T2的第二磁性珠子添加到该回收的第一珠子，并且允许形成该两个珠子之间的复合体。然后施加快速旋转的磁场，以便破坏没有被牢固地结合在一起的第一珠子-第二珠子复合体。剩余的两个珠子的复合体具有特异性的结合。然后可以通过任何适当的装置例如光学地确定剩余第一和第二珠子复合体的存在。

第三实施例

根据本发明的第三实施例，使用了两个珠子1、2，其中只有其中的一个具有磁矩-参见图4。两个生物活性分子C、T之间的无特异性结合被两个力的结合破坏，该两个力为：(1)在该非磁性珠子2上产生的流体力，将该非磁性珠子2通过置于流体流F中而被连接到一个分子上(或者C或者T，但在图4中所示的是捕捉分子C)和(2)作用到该磁性珠子上相反的磁力，该磁性珠子通过施加磁场梯度MG被连接到另一个分子上。这种应用也允许在溶液中执行本发明，不需要将捕捉分子C连接到诸如微阵列的固体基底上。

非磁性珠子在商业上是可以得到的。可以使用任何适当的非磁性材料，例如，固体的或半固体的材料。例子包括：橡胶、聚苯乙烯、交叉右旋糖苷、甲基苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺。

例如，以半径为0.5μm的非磁性珠子2，流体为粘性度η＝1.10^-3Pa.s的水，并且水流v＝大约1mm/s，将9，4pN的流体摩擦力施加到该非磁性珠子2上。其中m＝1.10^-15Am²的磁性珠子和为dB/dz＝1.10⁴T/m的磁场梯度MG，施加10pN的磁力到该磁性珠子1上(假定该磁性珠子非常小，并且不受该流体流动的影响)。因此，通过操纵该珠子1的磁矩、磁性和非磁性珠子1、2的大小和该流体的流动，可以创建其中对抗的流体力和磁力处于平衡的情形。当该生物活性分子T、C之间的结合是强壮的(例如，特异性的)时，该复合体将保持在该流体流中的同一位置。对于弱(例如无特异性的)结合的情况，该结合将由该反向力引起的张力破坏，并且该生物活性分子C、T或者将沿着该磁场移动，或者将随着该流体流而漂浮。

也可以以生物细胞、病毒或其它生物体例如脂质体或囊泡执行这个测定。这些生物体可以是被置于压力或张应力下的部分生物复合体，或者这些生物体起第二珠子的作用。因此，依据本发明的各个方面，不需要使用珠子但使用的珠子可以由包括生物体的任何合适的粒子组成。

可以例如光学地确定或测量在流体流中结合的捕捉和目标分子C、T复合体的准确位置。一个例子是在该磁性和/或非磁性珠子上使用发色团，其允许光学地检测在该装置中特定位置的该珠子的存在。可以修改流和/或磁场，以便在该流体流中保持该复合体在固定位置，或者沿某一方向以某一速度移动该复合体。以这个实施例，有可能提纯和/或丰富具有特异性结合的捕捉-目标分子复合体。

可替换地，可以使用该系统分馏包含耦合到磁性和非磁性珠子1、2上的捕捉和目标分子C、T的样品。由于选择的该尺寸，大的非磁性珠子将遇到比较小的磁性珠子1更大的流体力。在将样品与耦合的目标和捕捉分子C、T接触之后，施加磁场梯度，该磁场梯度吸引结合的和非结合的目标分子，而其它的分子保持在适当的位置，并且能够被除去。当后来施加渐增的相反的流体力时，首先将破坏无特异性捕捉和目标结合，并且将用该流体流动去除捕捉分子，其次将用该流体流动去除特异性结合的复合体，而非结合的目标分子将保持被该磁场所吸引。

在这个实施例的修改版本中，使用了不同类型的捕捉分子，每一个具有不同大小的非磁性珠子。操纵流速和/或磁场，以便根据该非磁性珠子的大小分离该目标-捕捉分子复合体。

可以在任何系统中执行上述结合分子的识别和/或提纯，其中可以产生流体流动和磁场；磁场可以在外部或内部产生(例如，线圈或磁性材料)。使用例如在美国专利5,866,345中所描述的中等规模的流动系统，可以将样品的容量降低到其检测范围容量降到1nl的微升范围。

第三实施例的例子

将参照图6描述第三实施例的例子，其可以作为微流体装置实现。在区域28中提供磁流体动力瓶子。使得来自源20的流体流动，例如，通过可控制的泵21，穿过区域27、28、29，并从30中流出。修整区域27和29的形状，以致与在区域28中的流速相比分别提高和降低该流动。通过适当的磁场发生器24，例如一个或多个永久磁体或电磁体，在区域27-29中提供磁场梯度。该磁场沿着在图6中朝左的方向吸引磁性珠子。来自源20的该流体流动趋向于朝图6中的右方驱动珠子。以目标分子标记第一磁性珠子1(典型地在尺寸上比该第二非磁性珠子2小得多)，并将其与标记有捕捉分子的该第二非磁性珠子2接触。结果是珠子1、2的混合物，一些混合物通过生物分子结合而结合在一起。当将该力平衡时，经至少一个生物分子连接到彼此的第一和第二珠子的组合体保持固定，例如，在区域28中，其中可以通过适当的检测系统例如光学的或磁性的系统检测到它们。在25将珠子和生物分子的混合物注入例如区域27中。最初，来自源20的流体流动可能是低的或者该流体可能是静止的。该磁场梯度的效果将会是拖动该磁性第一珠子1朝向图6中的左方。为了防止该珠子1、2离开太远，可以提供可选择的过滤器23。然后激励该泵21来缓慢地提高该流速。最初，未耦合到该第一珠子1的非磁性珠子2和其它碎片将经由出口30被驱逐出系统。当珠子1、2组合体的流体流动力达到足够高的水平时，这些组合体将移动到右方。如果它们进入区域29，那么该流速降低并且由该磁场梯度产生的力将控制防止该珠子到达出口30。如果该流速稍微太低，该磁场梯度将趋向于移动一些该珠子组合体1、2朝向图6中的左方。然而，由于在区域27中存在较高的流速，该流体流动力将控制和防止该组合体进一步流向远处。结果是结合的珠子1、2的组合体将被诱入磁流体动力瓶28中。这里，珠子1和/或珠子2之间的结合将被置于由该对抗的磁力和流体力产生的压力下。如果该结合是非特异性的，那么该结合将被破坏，并且该磁性第一珠子1将朝向该过滤器23移动，非磁性粒子将从该系统流出。因此，保留在磁流体动力瓶28中的珠子组合体将具有特异性结合。