一种预测钙拮抗剂药物药效的方法及其应用

摘要

本发明涉及一种预测药物药效的方法。通过测定基因的多态性基因型，预测钙拮抗剂类药物药效的方法及其应用。该方法通过测定受试者同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性基因型，预测钙拮抗剂药物的药效；同时根据同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性基因型对钙拮抗剂类药物药效的影响，制备出通过调节同型半胱氨酸代谢通路的制剂以增强钙拮抗剂药效的复方药。本发明可指导医生根据个体差异进行药物选择，提高临床药物治疗的有效率和临床用药的安全性，降低药物毒副作用的发生和经济负担。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预测药效的方法及其应用，特别用于通过测定基因多态性位点基因型，来预测钙拮抗剂类药物药效的方法及其应用，属于医药领域。

背景技术

高血压病是我国及全球最常见的慢性疾病之一。近期研究结果表明，我国18岁以上居民高血压的患病率为18.8％，估计全国患病人数为1.6亿。高血压是引起危及生命的心、脑血管病如心肌梗死、脑卒中、肾脏功能不全等的主要原因。血压水平与心血管病发病率呈线性相关。流行病学研究显示，血压升高是脑卒中和冠心病发病的独立危险因素。因此，有效控制血压对防止高血压患者心脑血管并发症的发生具有重大的临床意义。临床上用于治疗高血压的药物大致分为六类，其中包括：利尿剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂、钙拮抗剂和α-肾上腺素受体阻滞剂等。在我国和美国，高血压的血压控制率分别仅为8.1％和34％。这种血压的低控制率不仅与降压药物本身有关，更重要的是与临床上缺乏有效的药物疗效预测系统有关。

临床上用于预测降压药物疗效的方法主要有两种：一种是医生经验性预测，医生首先会根据患者常规的临床检查，经验性地选择一种降压药，治疗一段时期之后，发现疗效不佳或副作用较大时才会考虑调整药物治疗，即增加药物剂量或联合用药或更换其它降压药物治疗。这种预测方法具有明显的滞后性及盲目性，往往需要患者事先经受一段时间的痛苦；另一种预测方法是血压监测，而且已经由静态发展为动态血压监测，可以实时有效监测血压。有资料提示动态血压监测反映的血压水平、昼夜节律与心、脑、肾靶器官损害程度之间有较好的相关性，但目前动态血压监测技术本身还有不少局限性，仍不是严格意义上的动态检测，动态血压值尚无统一标准，且检查费用较高，因此若在临床上广泛使用这项检查方法仍需积累更多的经验，并且这种监测只能粗略评价，而不能真正预测某一药物的降压作用，更不能给医生选择药物提供准确的个体化信息，医生用药仍然存在一定盲目性。因此，基于目前临床的预测方法，医生在用药时仍不能根据患者个体差异进行药物极其剂量的选择以及药物的配伍，不能迅速有效地控制血压和降低或者避免毒副作用的发生，而且不同程度地增加患者的痛苦和经济负担。

药物疗效和副作用的个体差异与遗传因素有关。在家系和双生子研究中发现，约30％～60％的血压变异是由遗传因素造成的[Lancet，1994；344：169-71]，并且存在小部分的单基因遗传性高血压。药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异[Science，2000；287：1977-8][J Clin Invest，1994；94：1872-82]。药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，是从基因水平揭示这些差异的遗传特征，鉴别基因序列中的差异，在基因水平研究药效的差异，并以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。药物基因组学的研究不同于一般的基因学研究，不是以发现新的基因、探明疾病的发生机制、预见发病风险及诊断疾病为目的，而是研究遗传因素对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应的个体多样性。

药物基因组学是继人类基因组计划完成之后，新兴的功能基因组学研究的一个分支，它是基于基因多态性的DNA检测手段，如对一些疾病相关基因的单核苷酸多态性(SNP)检测，或对特定药物具有敏感性或抵抗性的患病人群进行SNP检测，能够预测患者将对某一特定的药物产生怎样的反应(疗效或副作用方面等)，进而优选出最佳的治疗方法，指导医生为患者拟定个体化的给药方案；另外，还有助于减少临床用药不当，提高疗效，降低毒副作用，降低医疗费用，具有极高的社会效益和卫生经济学意义。

许多与药物作用有关的基因已经被克隆和功能鉴定。目前研究最详细的是药物代谢相关的细胞色素酶P450(CYP)基因，它具有四种多态形式CYP1A1、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6，其对药物的影响各不相同。例如异烟肼治疗结核病患者[BMJ，1960；2：485-91]，由于编码N-乙酰转移酶的基因具有多态性(NAT1和NAT2)，NAT2等位基因会造成“慢乙酰化”的表型，使药物代谢缓慢，药物分子在体内停留的时间延长，以致发生肢端疼痛、麻痹和虚弱等不良反应；而对N-乙酰转移酶活性较高的“快乙酰化”的患者，因能快速将异烟肼转化，则不会发生这些毒副反应。硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)[ClinPharmacol Ther 1989；46：149-54.]是药物代谢酶中多态性的另一个典型的例子，TPMT影响硫嘌呤类药物的代谢，包括抗白血病药物6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤和免疫抑制剂硝基咪唑硫嘌呤等。TPMT活性对这些药物的代谢十分重要，它决定这些药物的功效和毒性。如果患者遗传性地缺乏硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)，那么即使是服用标准剂量的硫嘌呤类药物，也会对他们产生严重的、甚至危及生命的白细胞毒性。

药物基因组学研究已经阐明一些药物靶向基因的多态性与特定药物作用之间的关系。如胆固醇酯酰基转运蛋白(CETP)基因中的一个多态性对冠心病患者服用普伐他汀的临床疗效起着决定性的作用。β-肾上腺素受体基因多态性可以影响哮喘患者对于β-受体激动剂(如舒喘宁)的敏感程度，即携带有甘氨酸-16密码子的哮喘患者与携带精氨酸-16密码子者相比，他们对β-受体激动剂的反应要强；5-羟色胺神经递质受体基因中的多态性与氯氮平的药效相关，即在该受体基因核苷酸序列中，第12位上有胸腺嘧啶-胞嘧啶转化的患者尤其容易对氯氮平产生应答。

第一批DNA水平的检测方法已经进入临床，为新药推广而设计的检测方法，许多医药公司正在开发中。这些检测方法的建立，代表了人类向个体化治疗方案迈进的第一步。在急性淋巴细胞性白血病(ALL)的有效临床治疗方面，基因学试验已经证实硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)的重要作用。把TPMT缺乏者的6-巯基嘌呤的量降至常用量的1/10～1/15以下，其临床疗效与TPMT活性正常者服用常规剂量相近，既安全又有效，极大地减少了这部分患者因服用6-巯基嘌呤造成的毒副反应。St.Jude儿童医院已经开发了此种药物基因组学预测方法，该方法使得医生们能根据患者是否具有与TPMT相关的等位基因遗传性缺陷，预测到该患者TPMT的活性水平。并根据TPMT活性水平的正常、不足和缺乏，将患者进行分类。基因型和表型的一致性接近100％。患者中，大约90％的白种人和黑种人被划为TPMT正常活性者，他们接受传统的治疗剂量；其余10％的患者属于TPMT活性不足和缺乏者。为了避免对他们产生毒性，针对性地降低了用药剂量。TPMT基因预测方法在St.Jude儿童研究医院已被列为常规性检查项目。

根据药物基因组学研究开发出的乳腺癌相关基因检测试剂盒(Oncotype DX^TM)已在美国加利福尼亚州批准上市。该试剂盒由Genomic Health公司生产，用于诊断乳腺癌的复发率和患者对化疗药物的反应性(Science 2004，303：1754-1755)。它是转移性乳腺癌接受化疗药物trastuzumab(Herceptin)治疗前的一个必需检测的项目。此外，人表皮生长因子受体2蛋白(HER2)的过度表达会加速肿瘤的形成与转移，并影响患者对化疗药物的耐药性。通过检测HER2受体基因多态性，也可作为预测某个患者是否会对trastuzumab产生反应的方法。

目前发现原发性高血压涉及到的相关基因已超过70个，不同的基因导致的药物疗效对高血压患者有差别。多数研究集中于观察基因多态性对降压药物治疗引起的心血管反应的影响。例如，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者[Lancet，1997；349：1353-7]，与应用其他类降压药治疗相比，利尿剂治疗出现心肌梗死和中风的几率降低。在降压作用方面[Drugs，2004；64：1801-1816]，发现一氧化氮合酶(NOE)基因多态性和利尿剂、α-adducin基因多态性和利尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性和β-肾上腺素受体阻滞剂、ACE基因多态性和血管紧张素II受体(AT1-R)拮抗剂等都存在相互作用。ACE插入缺失的多态性与ACEI存在相互作用，表现为不同基因型在AT1受体蛋白的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。

钙拮抗剂用于治疗高血压已经有30年的历史，通过降低血管平滑肌细胞内的游离钙浓度，使血管扩张，血压下降，还能抑制血小板聚集，增强红细胞在缺氧的情况下的变形能力，对脂代谢无不良影响。临床上有效治疗各种程度高血压，尤其是老年高血压或合并心绞痛的患者。常用钙拮抗剂分为二氢吡啶类和非二氢吡啶类，前者包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、拉西地平(lacidipine)；后者包括苯噻氮卓类钙拮抗剂地尔硫卓(diltiazem)和苯烷基类钙拮抗剂维拉帕米(verapamil)。

钙拮抗剂在临床应用上存在一定问题。在对6321例患者为期三年的INSIGHT研究显示，钙拮抗剂拜新同^R(硝苯地平控释片)有效率为73％，在心血管病事件死亡率和发病率上拜新同组并不比利尿剂组好；心衰、癌症发病率在拜新同组显著高于利尿剂组。(Hypertension，2003，41：431-6)。1995年美国Furberg研究认为钙拮抗剂尤其是短效的钙拮抗剂可增加冠心病发病甚至死亡的危险，也可增加癌症和消化道出血的危险(Circulation，1995，92：1326-31)。钙拮抗剂对糖尿病患者和肾脏保护没有明显益处。2002年Pahor等(Lancet，2000，356：1949-54)荟萃分析9项试验，以钙拮抗剂与其他一线降压药物对总共27743例患者达到同样收缩压、舒张压控制水平，认为急性心肌梗死、心力衰竭及主要心血管事件危险，钙拮抗剂明显高于利尿剂、β-受体阻滞剂、ACEI或可乐定。钙拮抗剂常见不良反应为下肢(主要是胫前、踝部)水肿；由于血管扩张作用，可有头痛、颜面潮红、多尿；反射性心率加快多见于短效二氢吡啶类钙拮抗剂，在用长效二氢吡啶类钙拮抗剂时少见；体位性低血压，主要与其它降血压药物合用时发生，多发生于老年患者。另外还出现血压升高，肝功能异常，味觉缺失，齿龈增生，耳鸣，耳痛，阳萎，尿潴留，全身性瘙痒等[张家口医学院学报，2003，04：48～49]。目前钙拮抗剂仍然是临床常用降压药物之一。因此，对钙拮抗剂的副作用或存在的一些问题应当予以高度重视。钙拮抗剂的临床疗效和副作用表现出明显的个体差异性。由于缺乏可预测药物疗效及副作用的指示系统，所以医生在用药时不能根据个体差异进行药物选择、配伍和确定剂量，相对降低了临床用药、治疗的有效率和安全性，增加了发生毒副作用风险，增加了经济负担。

已有药物基因组学研究中，有三项涉及钙拮抗剂。一项研究发现[Hypertension，1996；28(1)：98～103]ACE基因多态性与钙拮抗剂有相互作用，携带I等位子的患者，AT1受体蛋白的mRNA表达降低。又一项研究发现[Hypertension，1996；28：1081～4]，服用钙拮抗剂后2个月，带有血管紧张素1型受体(AT1R)基因1166A/C多态性中的A等位子的患者，其动脉硬化的发生率降低。另外，没有发现血管紧张素基因M235T多态性与钙拮抗剂在降压作用方面的相互作用[J Hypertens，1996；14：259～62]。

人体内同型半胱氨酸(Hcy，homosysteine)作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。蛋氨酸分子含有S甲基；在与三磷酸腺苷(ATP)作用生成S腺苷蛋氨酸后，可通过各种转甲基作用，为体内已知的约50多种具有重要生理活性的物质提供甲基。S腺苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成S腺苷同型半胱氨酸，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸。同型半胱氨酸主要通过两条途径进行代谢：再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径：约有50％同型半胱氨酸在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸，参加体内蛋白质的代谢。这一反应中的甲基供体(N-5甲基四氢叶酸)是由N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylene tetrahydrofolatereductase)作用于N-5，10-亚甲基四氢叶酸形成的；而甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR，Methionine synthase reductase)是蛋氨酸合成酶的辅助因子。另外，约50％的同型半胱氨酸经也可通过转硫途径在胱硫醚β合成酶(CBS，cystathionine β-synthase)的催化下，与丝氨酸缩合成胱硫酶，后者近一步生成半胱氨酸和α酮丁酸，此过程需要磷酸吡哆醛(活性维生素B6)作为辅助因子。[TIPS，1990，11：411-416]

血浆中的Hcy大部分通过二硫健与蛋白质结合，约占70％。由于Hcy与蛋白质的结合常成饱和状态，最大的结合力为140μmol/L，所以血浆中只有少量的游离Hcy。不论是结合形式或者游离形式的Hcy，都统称为总Hcy(tHCY，total homocysteine)。近年来基础与临床研究均显示，它是心脑血管疾病独立的危险因素。高tHCY血症可促发所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等[心血管病学进展，2000，21：29]。大量的事实表明轻微到中度tHCY血症(tHCY浓度≥12umol/L，但≤100umol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的、独立的危险因素。

Sutton等[Circulation，1997，96：1745.]测量了179名单纯收缩期高血压(SBP≥160mmHg，DBP≤90mmHg)的老年患者和171名对照者(SBP＜160mmHg，DBP＜90mmHg)的血Hcy水平。发现前者血Hcy水平显著高于后者。在排除了混杂因素后，Hcy与SBP呈正相关。认为血Hcy水平与单纯收缩期高血压独立相关。Lim等[Am JEpidemiol，2002，156：1105-13]对Hcy和血压进行了一项1994-1998的横断面调查，发现在调整了心血管危险因素后(肾功能、维生素B状况、年龄、种族、收入、社会经济地位、体重指数、吸烟、绝经后状况、绝经后激素替代治疗、饮酒、咖啡摄入、血脂、C-反应蛋白水平、维生素C、维生素E)，Hcy水平仍然与血压独立正相关，Hcy每升高5umol/L，相应地，血压在男性升高0.7/0.5mmHg，在女性升高1.2/0.7mmHg。在最高、最低Hcy水平间作进一步比较后发现，高水平Hcy使女性患高血压的危险性增加3倍，男性患高血压的危险性增加2倍，认为高水平的Hcy可增加发生高血压的危险性。

高血压病患者中tHcy水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、VB12水平与tHcy呈现负相关提示高血压患者补充叶酸、VB12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者，特别是tHcy水平较高者，有规律地补充叶酸、VB12可能会降低tHcy水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。一项为期2年的随机、对照的临床实验证实，长期给予叶酸(5mg/日)及维生素B6(250mg/日)以降低血液中同型半胱氨酸tHCY的含量，可以协同降低血压[Arterioscler Thromb VascBiol，2001，21：2072-2079.]。

Hcy代谢关键酶活性改变是血中Hcy水平升高的重要因素。MTHFR是N5-甲基四氢叶酸形成的关键酶，MTHFR基因C667T突变可致酶活性下降，使蛋氨酸循环障碍，血中Hcy水平升高。有报道认为，Hcy代谢关键酶的基因多态性与单纯收缩期高血压的发生关系密切。MTHFR可能是单纯收缩期高血压的易感基因，tHcy是单纯收缩期高血压的重要中间表型[中华心血管病杂志，2003，31：269-273]。在已经发现的人类MTHFR基因突变中，多数是可以导致酶活性严重下降甚至酶活性缺失的突变，在人群中罕见，而第677位核苷酸的基因突变(C→T)引起该酶活性轻中度降低，同型半胱氨酸浓度增高[Circulation，1996，94：3074-3078.]。而高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，引起血管舒缩因子平衡紊乱，导致妊娠高血压综合征(PIH)。因此，多数研究认为MTHFR基因是PIH的主要候选基因[中国公共卫生，2004，20，6：762-764]。MTRR是蛋氨酸合成酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生[J Cardiovasc Risk，2000；7：197-200]，人类的编码序列包含2094个碱基对，编码698个氨基酸的多肽，对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持Hcy在无毒性浓度水平有重要作用，若MTRR发生变异，可能会引起Hcy血浆浓度升高。

高血压患者的降压疗效与Hcy通路的基因多态性有关。有研究表明[ThrombosisResearch 2004，113：361-369]MTHFR C677T的基因多态性与ACEI类降压药疗效有关。对于444名中国的原发性高血压患者进行为期2周的ACEI类降压药物苯那普利的降压治疗，结果提示MTHFR C677T基因型为TT的原发性高血压患者与基因型为CT或者CC的患者相比较基础血压值明显增高，而且对于ACEI类降压药物的降压效果较好，尤其对于舒张压的降压效果较好。

一项用于预测ACEI类降压药药效的方法已于2002年申请专利，专利申请号为02123875.8，公开号为CN1465712A。药物基因组学研究发现，携带MS基因919Asp等位子的高血压患者，服用苯那普利后的降压幅度大，通过测定受试者的MS基因Asp919Gly多态性位点基因型，可以预测ACEI类降压药降压作用。

由于存在药物反应的个体差异，医生选药时无法量体裁衣地进行药物选择和药物配伍，不能提高药物疗效并且降低毒副作用的发生，由此可能延误治疗时机，造成患者经济损失。

发明内容

本发明克服上述不足，尤其克服临床选择钙拮抗剂用药时的盲目性，为个体化用药提供一种预测钙拮抗剂类药物药效的方法，即通过测定同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态性位点基因型来预测钙拮抗剂类降压药的药效。

为实现上述发明目的，采取以下技术方案：

本发明提供一种预测钙拮抗剂药效的方法。由于钙拮抗剂可以阻止血管平滑肌细胞的钙离子内流，降低细胞内钙离子浓度，从而使血管扩张，临床常用于降压治疗。本发明提供的预测钙拮抗剂的药效优先为降压作用。

该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶基因的多态性基因型，预测钙拮抗剂药物的药效。

所述同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶的基因优先为N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylene tetrahydrofolate reductase)基因和/或者甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR，Methionine synthase reductase)基因。

一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因Glu429Ala(AC，rs 1801131)的多态性，预测钙拮抗剂药效：

a)N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为429Glu/Glu(AA)纯合型或者429Glu/Ala(AC)杂合型时，预测钙拮抗剂的药效差；

b)N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为429Ala/Ala(CC)纯合型时，预测钙拮抗剂的药效好。

一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因Ala222Val(CT，rs 1801133)的多态性，预测钙拮抗剂药效：

a)N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为222Val/Val(TT)纯合型或者222Ala/Val(CT)杂合型时，预测钙拮抗剂的药效差；

b)N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为222Ala/Ala(CC)纯合型时，预测钙拮抗剂的药效好。

一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的甲硫氨酸合成酶还原酶基因His595Tyr(CT，rs 10380)多态性，预测钙拮抗剂药效：

a)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为595His/His(CC)纯合型时，预测钙拮抗剂的药效差；

b)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为595His/Tyr(CT)杂合型或者595Tyr/Tyr(TT)纯合型时，预测钙拮抗剂的药效好。

一种预测钙拮抗剂药效的方法，该方法通过采集受试者的生物样本，测定受试者的甲硫氨酸合成酶还原酶基因Ile22Met(AG，rs 1801394)的多态性，预测钙拮抗剂药效：

a)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)

杂合型时，预测钙拮抗剂的药效差；

b)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为22Met/Met(GG)纯合型时，预测钙拮抗剂的药效好。

上述测定同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶的多态位点基因型所采用的方法选自PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描、Taqman生物检测方法，或选自试剂盒、试纸检测载体中的一种。PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列测定、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法。Taqman技术是一种运用荧光技术进行实时定量PCR的方法，具体操作过程见本发明实施例1。其中优选的检测方法为PCR、PCR-RFLP或者Taqman技术。

所述受试者的生物样本为血液样本、口腔粘膜试子、唾液样本、尿液样本等体液样本或者组织样排泄物样本中的一种。其中，优选的生物样本为血液样本。

所述的钙拮抗剂类降压药为二氢吡啶类钙拮抗剂包括氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼索地平、尼群地平、拉西地平；苯噻氮卓类钙拮抗剂地尔硫卓；苯烷基类钙拮抗剂维拉帕米；其他类钙拮抗剂以及上述各类钙拮抗剂的活性代谢产物或可药用盐类中的一种。其中硝苯地平和氨氯地平是钙拮抗剂类降压药中常用的、具有代表性的药物。

上述预测钙拮抗剂药效的方法可以进一步在药物研发中应用。可以根据同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶的多态性基因型对钙拮抗剂类降压药药效的影响，设计出通过调节同型半胱氨酸代谢通路的制剂以增强钙拮抗剂药效的复方药，所述复方药由能调节同型半胱氨酸代谢通路的制剂和钙拮抗剂组成。

所述的能调节同型半胱氨酸代谢通路的制剂包括涉及同型半胱氨酸代谢通路中及其上游、下游和旁路的各种代谢酶、辅助因子、辅酶、中间产物以及它们的替代剂、激动剂或者阻滞剂。

本发明是基于多年的药物基因组学研究，对于参与研究的高血压患者给予拜新同进行降压治疗。拜新同是硝苯地平控释片，硝苯地平为二氢吡啶类L型电压依赖性钙拮抗剂，它可阻止钙离子流入血管的平滑肌细胞，使细胞内钙降低，血管扩张，临床用于降压治疗。拜新同可在24小时内恒速释放硝苯地平(持续释放)，因此适用于每日服药一次，常用剂量为30mg-60mg，临床广泛用于治疗轻、中度高血压病。

本发明中研究的基因多态性是同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶的基因多态性。本发明中研究的同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶为N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因和/或者甲硫氨酸合成酶还原酶基因。

MTHFR基因定位于染色体1p36.3上，cDNA全长2.2kb，编码一种黄素蛋白，其生化功能是催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应。5-甲基四氢叶酸是一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中同型半胱氨酸的复甲基化有关，MTHFR酶活性降低，会导致HCY在体内蓄积，而HCY不仅与心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。

高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、VB12水平与HCY呈现负相关，提示高血压患者补充叶酸、VB12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者特别是tHCY水平较高者有规律地补充叶酸、VB12可能会降低tHCY水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。

本发明涉及的研究发现：

在已知MTHFR基因的Glu429Ala(AC)多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，基因型为429Glu/Glu(AA)纯合型或者429Glu/Ala(AC)杂合型的等位基因携带者与基因型为429Ala/Ala(CC)纯合型的等位基因携带者相比较，降压作用较差。提示MTHFR基因Glu429Ala(A1337C)多态性基因型和钙拮抗剂类的降压作用有关。在已知MTHFR基因的Ala222Val(CT)多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，基因型为222Val/Val(TT)纯合型或者222Ala/Val(CT)杂合型的等位基因携带者与基因型为222Ala/Ala(CC)纯合型的等位基因携带者相比较，降压作用较差。提示MTHFR基因Ala222Val(CT)多态性基因型和钙拮抗剂类的降压作用有关。MTHFR基因的基因型，作为预测钙拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测钙拮抗剂类降压药的药效，指导临床医生个体化用药。

MTHFR基因的基因型，作为预测钙离子拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一：可以指示MTHFR基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择钙离子拮抗剂类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。

甲硫氨酸合成酶还原酶是蛋氨酸合成酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生，基因定位于5P 15.2～15.3，该基因包含15个外显子，大小从43bp到1213bp不等，含14个内含子，大小从108bp到5kb不等。人类的编码序列包含2094个碱基对，编码698个氨基酸的多肽，对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持同型半胱氨酸在无毒性浓度水平有重要作用，若MTRR发生变异，可能会引起同型半胱氨酸血浆浓度升高。

高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、VB12水平与HCY呈现负相关，提示高血压患者补充叶酸、VB12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者特别是tHCY水平较高者有规律地补充叶酸、VB12可能会降低tHCY水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。

本发明涉及的研究发现：

在已知MTRR基因的His595Tyr(C/T)多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，基因型为595His/Tyr(CT)杂合型或者595Tyr/Tyr(TT)纯合型等位基因携带者的降压作用较基因型595His/His(CC)纯合型等位基因携带者的降压作用好，提示MTRR基因His595Tyr(C/T)多态性和钙拮抗剂类的降压作用有关。在已知MTRR基因的Ile22Met(A145G)多态性情况下，高血压病人经钙拮抗剂类药治疗后，在服药后第16天，基因型22Met/Met(GG)等位基因携带者的降压作用较基因型22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型等位基因携带者的降压作用好，提示MTRR基因Ile22Met(A145G)多态性和钙拮抗剂类的降压作用有关。MTRR基因的基因型，作为预测钙拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测钙拮抗剂类降压药的药效，指导临床医生个体化用药。

MTRR基因的基因型，作为预测钙离子拮抗剂类抗高血压药物的指示系统之一：可以指示MTRR基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择钙离子拮抗剂类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。

本发明提供了利用功能基因预测钙拮抗剂类抗高血压药物疗效的一种方法，可作为钙拮抗剂类降压药药效的指示系统，通过测定同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态位点基因型，预测钙拮抗剂类降压药疗效。根据同型半胱氨酸代谢通路上关键酶基因的多态性基因型，设计出通过调节同型半胱氨酸代谢通路上关键酶的功能，明显增强钙离子拮抗剂药效的复方药，便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的有效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。本发明通过测定基因型，指导新药研发形成一组钙离子拮抗剂类复合新药，特别对于目前治疗效果不佳的患者，提供了更好的选择。应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。

具体实施方式

实施例1：测定MTHFR基因的Glu429Ala(AC)多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用

(一)测定MTHFR基因的Glu429Ala(AC)多态性位点基因型：

(1)提取宿主细胞的基因组DNA：

(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；

(b)于4℃、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；

(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；

(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。

(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；

(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；

(2)使用Taqman方法检测MTHFR基因的Glu429Ala(A1337C)多态性位点基因型

(a)用PCR仪扩增MTHFR功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的Taqman 2X Universal PCR Master Mix No AmpEraseUNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，PassiveReference，以优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM.

引物序列为

正向引物：5’GGAGGAGCTGCTGAAGATGTG 3’

反向引物：5’TGGTTCTCCCGAGAGGTAAAGA 3’

等位基因特异性探针的序列为：

VIC-5’CCAGTGAAGAAAGTGTC 3’-NFQ，

对应于“A(或Glu)”等位基因，携带VIC荧光报告集团。

FAM-5’CAGTGAAGCAAGTGTC 3’-NFQ

对应于“C(或Ala)”等位基因，携带FAM荧光报告集团。

PCR反应条件：

95℃  10min，1个循环；

92℃  15s，

60℃  1min，

50个循环.

(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为Ala/Ala纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为Glu/Glu纯合子；

发出两种荧光者的基因型为Ala/Glu杂合子。

(二)、预测药效：

基因型为429Glu/Glu(AA)纯合型或者429Glu/Ala(AC)杂合型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较小；

基因型为429Ala/Ala(CC)纯合型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较大。

以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：

在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果在429Ala/Ala(CC)等位子携带个体中显著高于429Glu/Glu(AA)纯合型和/或429Glu/Ala(AC)杂合型，提示MTHFR基因Glu429Ala(AC)多态性和拜新同的降压作用有关(见表1)。

表1拜新同的降压作用与MTHFR基因Glu429Ala(AC)多态位点的关系

  因型  例数  均值  标准差  P值              服药后收缩压的下降值  AA(Glu/Glu)  AC(Glu/Ala)  CC(Ala/Ala)  526  221  29  23.90  23.43  30.39  19.00  18.64  16.97  .  0.255  0.130              服药后舒张压的下降值  AA(Glu/Glu)  AC(Glu/Ala)  CC(Ala/Ala)  528  222  30  9.70  9.46  14.69  9.70  9.46  7.97  .  0.818  0.001

注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。AA，代表429Glu/Glu纯合型；CC，代表429Ala/Ala纯合型；AC，代表429Glu/Ala杂合型。

实施例2：测定MTHFR基因的Ala222Val多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用

(一)测定MTHFR基因的Ala222Val多态性位点基因型：

(1)在标准的操作方法和操作规程上采用同实施例1中所述的常规方法提取宿主细胞的基因组DNA

(2)使用PCR和限制性酶切片断长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测MTHFRAla222Val多态位点：

根据MTHFR Ala222Val基因序列设计PCR特异性引物，包括PCR正向引物和PCR反向引物，按如下条件进行常规PCR扩增。

引物序列：

Sense：5’-CAAAGG CCA CCC CGAAGC-3’

Antisense：5’-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3’

PCR反应体系：

基因组DNA 45ng，上下游引物10pmol(20umol/L)，dNTPs 2.0mmol/l，10×buffer(without Mg2+)1.0ul，Gold Taq DNA polymerase 3U，ddH2O补足总体积至10ul.

PCR反应条件：

95℃预变性10min后；94℃变性30sec，59℃退火45sec，68℃延伸45sec，35个循环周期；最后68℃延伸7min。；得到245bp的片断。

酶切条件及体系(15ul)：

PCR产物10ul，10×NEBuffer#2 1.5ul，HinfI内切酶4U(0.4ul)，和3.1ul ddH2O，37℃过夜。

基因型分析：

将DNA酶切后的产物点样在2.5％琼脂糖胶上，200V电压下电泳1小时后，在紫外灯下读取胶图并进行基因型分析。个体基因型鉴定如下：

酶切片断为245bp，MTHFR基因型为Ala/Ala；

酶切片断为245+175+70bp，MTHFR基因型为Ala/Val；

酶切片断为175+70bp，MTHFR基因型为Val/Val。

(二)、预测药效：

基因型为222Val/Val(TT)纯合型或者222Ala/Val(CT)杂合型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较小；

基因型为222Ala/Ala(CC)纯合型时，钙拮抗剂类降压药药效的降压作用较大。

以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：

在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果在222Ala/Ala(CC)携带个体中高于222Val/Val(TT)纯合型或者222Ala/Val(CT)杂合型，提示MTHFR基因Ala222Val(CT)多态性基因型和拜新同的降压作用有关(见表2)。

    表2拜新同的降压作用与MTHFR基因Ala222Val(CT)多态位点的关系

  基因型  例数  均值  标准差  P值               服药后收缩压的下降值  CC(Ala/Ala)  CT(Ala/Val)  TT(Val/Val)  302  354  116  25.92  23.11  22.50  18.20  19.39  18.90   0.051  0.677               服药后舒张压的下降值  CC(Ala/Ala)  CT(Ala/Val)  TT(Val/Val)  302  354  116  10.15  9.36  9.98  9.00  10.40  10.13  .  0.251  0.780

注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。CC，代表222Ala/Ala纯合型；TT，代表222Val/Val纯合型；CT，代表222Ala/Val杂合型。

实施例3：测定MTRR His595Tyr  (CT)多态性位点并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用

(一)测定MTRR基因的His595Tyr(CT)多态位点基因型：

(1)提取宿主细胞的基因组DNA：

在标准的操作规程的基础上，用盐沉淀法，抽提唾液细胞中基因组DNA。DNA放-20℃保存。

(2)使用TaqMan方法检测MTRR His595Tyr(C1894T)多态位点基因型。

(a)用PCR仪扩增MTRR His595Tyr基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中含有基因组DNA 10ng，2.5ul的TaqMan 2X Universal的PCR Master Mix NoAmpErase UNG(组成成份包括：AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs with Dutp，Passive Reference，以优化的缓冲液)，及0.72uM的正向引物、0.72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基因特异性探针各0.16uM。剩下用ddH₂O补足反应体系。

对应于“C(或His)”等位基因，特异性探针携带VIC荧光报告基团。

对应于“T(或Tyr)”等位基因，特异性探针携带FAM荧光报告基团。

PCR反应条件：PCR反应条件：

95℃预变性10min；94℃变性15sec，60℃退火加延伸60sec，50个循环周期扩增。

(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为Tyr/Tyr纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为His/His纯合子；

发出两种荧光者的基因型His/Tyr杂合子。

(二)、预测药效：

MTRR基因型为595His/His(CC)纯合型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；

MTRR基因型为595His/Tyr(CT)杂合型和/或者595Tyr/Tyr(TT)纯合型时，预测钙拮抗剂的降压作用好。

以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合子型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：

在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果595His/Tyr(CT)杂合型和/或者595Tyr/Tyr(TT)纯合型等位子携带者的降压作用较595His/His(CC)纯合型等位基因携带者有增强趋势，提示MTRR基因His595Tyr(CT)多态性和拜新同的降压作用有关(见表3)。

表3拜新同的降压作用与MTRR基因His595Tyr(CT)多态位点的关系

  基因型  例数  均值  标准差  P值             服药后收缩压的下降值  CC(His/His)  CT(His/Tyr)  TT(Tyr/Tyr)  CT+TT  166  75  6  81  17.77  19.90  20.44  19.94  21.88  21.89  29.66  22.32  .  0.362  0.532  0.310             服药后舒张压的下降值  CC(His/His)  CT(His/Tyr)  TT(Tyr/Tyr)  CT+TT  164  75  6  81  7.51  10.65  17.56  11.16  12.22  13.26  11.14  13.18   0.062  0.048  0.030

注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。CC，代表595His/His纯合野生型；CT，代表595His/Tyr杂合子；TT，代表595Tyr/Tyr纯合突变型。

实施例4：测定MTRR基因Ile22Met(AG)多态性位点基因型并预测钙拮抗剂类降压药硝苯地平的降压作用

(一)DNA提取同实施例1，多态位点基因型测定方法与实施例1相似，其中

用PCR仪扩增MTHFR Ile22Met基因多态位点及其侧翼序列。对应于“A(或Ile)”等位基因，特异性探针携带VIC荧光报告基团；对应于“G(或Met)”等位基因，特异性探针携带FAM荧光报告基团。

将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用“AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断：

发出FAM荧光者的基因型为Met/Met纯合子；

发出VIC荧光者的基因型为Ile/Ile纯合子；

发出两种荧光者的基因型Ile/Met杂合子。

(二)、预测药效：

MTRR基因型为22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型时，预测钙拮抗剂的降压作用差；

MTRR基因型为22Met/Met(GG)纯合型时，预测钙拮抗剂的降压作用好。

以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组：纯合野生型组、杂合型组、纯合突变型组，分别给予拜新同16天，观察其降压作用，结果如下：

在高血压病人服用拜新同后第16天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压效果22Met/Met(GG)纯合型等位基因携带者的降压作用较22Ile/Ile(AA)纯合型或者22Ile/Met(AG)杂合型等位基因携带者的降压作用有增强趋势，提示MTRR基因Ile22Met(AG)多态性和拜新同的降压作用有关(见表4)。

     表4拜新同的降压作用与MTRR基因Ile22Met(AG)多态位点的关系

  基因型  例数  均值  标准差  P值              服药后收缩压的下降值  AA(Ile/Ile)  AG(Ile/Met)  GG(Met/Met)  135  95  16  16.35  19.28  22.17  24.49  19.28  22.17  .  0.312  0.118              服药后舒张压的下降值  AA(Ile/Ile)  AG(Ile/Met)  GG(Met/Met)  303  196  31  27.35  25.97  28.38  16.42  16.23  13.82   0.605  0.168

注：调整了性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、血药浓度和基线血压等因素。AA，代表Ile/Ile纯合野生型；AG，代表22Ile/Met杂合子；GG，代表Met/Met纯合突变型。

实施例5.硝本地平联用叶酸的协同降压作用

用0.2mm银夹狭窄Wistar大鼠左肾动脉，8～10周后大鼠血压升高超过150mmHg以上为高血压动脉模型。将高血压大鼠随机分组，分别为模型组(给溶媒)、硝苯地平组(2.0mg/kg)、硝苯地平+叶酸组(2.0+0.5)mg/kg、叶酸组(0.5mg/kg)，另设正常对照组。灌胃给药，连续2周，分别测定给药前和给药后第14天大鼠血压，计算降压百分率：(SBP给药前-SBP给药后)/SBP给药前×100。(结果见表5)。

结果表明：叶酸单独应用对二肾一夹型高血压大鼠有轻度降压作用，降压率为3.5±4.4％，硝苯地平2.0mg/kg灌胃给药，对二肾一夹型高血压大鼠有显著降压作用，降压率为15.2±5.6％；与叶酸合用后，降压率为25.3±7.4％。结论：叶酸与硝苯地平合用，可以增强硝苯地平的降压作用。

               表5硝苯地平+叶酸灌胃给药连续2周，

           对二肾一夹型高血压大鼠的降压作用(x±s，n＝12)

  组别  剂量  (mg/kg)  给药前血压(mmHg)  第14天降压百分率(％)  正常组  模型组  硝苯地平  叶酸  硝苯地平+叶酸  -  -  2.0  0.5  2.0+0.5  108.0±7.7  179.0±33.5  176.4±31.2  175.5±22.1  181.2±31.7  2.5±1.7  -2.0±5.2  15.2±5.6^**  3.5±4.4^**  25.3±7.4^**

与模型组比较，^**P＜0.01；与硝苯地平组和/或叶酸组比较P＜0.01

实施例6.氨氯地平联用叶酸的协同降压作用

用0.2mm银夹狭窄Wistar大鼠左肾动脉，8～10周后大鼠血压升高超过150mmHg以上为高血压动脉模型。将高血压大鼠随机分组，分别为模型组(给溶媒)、氨氯地平组(1.0mg/kg)、氨氯地平+叶酸组(1.0+0.1)mg/kg、叶酸组(0.1mg/kg)，另设正常对照组。灌胃给药，连续2周，分别测定给药前和给药后第14天大鼠血压，计算降压百分率：(SBP给药前-SBP给药后)/SBP给药前×100，结果见表6。

结果表明：叶酸单独应用对二肾一夹型高血压大鼠有轻度降压作用，降压率为4.5±2.4％，氨氯地平1.0mg/kg灌胃给药，对二肾一夹型高血压大鼠有显著降压作用，降压率为18.2±5.1％；与叶酸合用后，降压率为28.3±6.4％。结论：叶酸与氨氯地平合用，可以增强氨氯地平的降压作用。

                  表6氨氯地平+叶酸灌胃给药连续2周，

            对二肾一夹型高血压大鼠的降压作用(x±s，n＝12)

  组别  剂量  (mg/kg)  给药前血压(mmHg)  第14天降压百分率(％)  正常组  模型组  氨氯地平  叶酸  氨氯地平+叶酸  -  -  1.0  0.1  1.0+0.1  110.0±7.9  181.0±33.5  179.4±31.2  173.5±21.3  180.5±30.6  2.4±1.7  -2.9±5.0  18.2±5.1^**  4.5±2.4^**  28.3±6.4^**

与模型组比较，^**P＜0.01；与氨氯地平组和/或叶酸组比较P＜0.01