用于预防大肠杆菌病的禽类大肠杆菌疫苗

摘要

提供了适合于向家禽，包括鸡，大规模使用的一种遗传缺失突变活大肠杆菌疫苗。还提供了一种安全和有效的方法来保护家禽免于遭受大肠杆菌杆菌病感染和疾病，其中通过大规模使用途径，例如粗略的喷雾和饮用水，向鸡、火鸡等使用活的、突变的、aroA基因缺失的大肠杆菌免疫原。

说明书

发明领域

本发明涉及针对大肠杆菌感染的禽类疫苗。特别地，本发明涉及对家禽和特别是对鸡有用的突变株大肠杆菌疫苗。本发明还涉及一种新型的aroA基因缺失的大肠杆菌微生物免疫原，其作为通过喷雾或饮用水来对抗大肠杆菌诱导的大肠杆菌病-一种毁灭性的家禽疾病的疫苗是有用和有效的。

发明背景

大肠杆菌病是一种对于家禽有经济上的重要性和在世界范围内发生的常见全身性疾病。大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)感染发生的形式是急性致死性败血症或亚急性心包炎和气囊炎(airsacculitis)，以及肝周炎、关节炎、还有蜂窝织炎。在细菌性感染之中，大肠杆菌病常常是家禽发病和死亡的第一原因。由于粪便污染，在鸡舍中存在大量的大肠杆菌。当大量的致病大肠杆菌通过呼吸道或肠道进入血液时，会发生全身感染。菌血症发展为败血症和死亡，或感染蔓延到浆膜表面、心包膜、关节和其他器官。

文献表明，与大肠杆菌病相关的大肠杆菌的血清型O1、O2和O78是在鸡和火鸡中存在的最常见的血清型。许多分离的菌株也是无法分型的，被认为是特别致命的。

治疗策略包括对易感染或环境因素的控制，和抗生素的早期使用。遗憾的是，已经观察到对四环素、卡那霉素、新霉素、头孢噻酚、链霉素和红霉素的抗性的高发。许多菌株还对几种抗生素有抗性。也观察到对氨苄青霉素和氯霉素的广泛的敏感性。

尽管可获得用于火鸡的针对与大肠杆菌O78感染有关的大肠杆菌病的商售活大肠杆菌疫苗，但似乎没有完全安全和有效的大肠杆菌疫苗供鸡使用。特别地，似乎没有任何用于家禽的活的、减毒的、突变的aroA基因缺失的大肠杆菌疫苗是市场上可买到的。似乎也没有适合于大规模施用，例如通过气溶胶喷雾或饮用水施用的特别有效的大肠杆菌疫苗。

因此，本发明的一个目的是提供一种适合用于鸡的安全和有效的活大肠杆菌疫苗。

本发明的另一个目的是提供一种在用于鸡时是安全和有效的、用于预防或改善家禽的大肠杆菌病的方法。

本发明的一个特征是该大肠杆菌疫苗适合于大规模使用。

本发明的一个优点是，该活疫苗同时提供了在宿主体内的良好的细胞免疫反应和良好的体液免疫反应。

发明概述

本发明提供了基因缺失的大肠杆菌突变株，即具有在美国模式培养物保藏所保藏的、保藏号为PTA-5094的菌株的鉴定特征的大肠杆菌aroA-微生物。

本发明还提供了包含致免疫有效量的所述大肠杆菌aroA-微生物和药理学上可接受的载体的禽类疫苗组合物。

本发明更进一步提供用于预防或改善家禽的大肠杆菌病的方法，包括向所述家禽施用致免疫有效量的所述大肠杆菌aroA-微生物。

本发明的一部分更进一步提供的是一种用于鸡和其它家禽的针对大肠杆菌病的疫苗，其包含在药理学上可接受的载体中的致免疫有效量的大肠杆菌aroA缺失突变株。

根据以下的详细说明，本发明的其他特点将更为显而易见。

发明的详细说明

驯养的家禽中的禽类大肠杆菌病通常与大肠杆菌(E.coli)血清型O78有关。感染一般经由呼吸道，通常在暴露于其他家禽共患疾病、或被其它家禽共患疾病感染之后发生，其它家禽共患疾病例如支原体病、传染性支气管炎、新城疫、出血性肠炎或火鸡波氏杆菌病(bordetellosis)。在鸡中，大肠杆菌病一般影响3到10周龄之间的子鸡，并伴随高发病率和死亡率。禽类大肠杆菌病最严重的表现形式是败血症，其特征在于心包炎、肝周炎和气囊炎。蜂窝织炎是也一个可怕的问题。来自家禽的大肠杆菌分离物经常对药物，例如氨苄青霉素、氯霉素、土霉素、新霉素、庆大霉素、硝基呋喃、萘啶酮酸、多粘茵素B、磺胺等有抗性。此外，目前，似乎没有商业上可获得的用于鸡的大肠杆菌疫苗。

令人惊讶地，现已发现大肠杆菌aroA缺失突变株，于2003年3月27日在美国模式培养物保藏所(ATCC)保藏的、ATCC号为PTA-5094的大肠杆菌aroA-，用于对抗鸡的禽类大肠杆菌病是安全和有效的。有利地，当向鸡施用时，本发明的大肠杆菌aroA-PTA-5094提供了良好的细胞免疫反应和体液免疫反应，所述大肠杆菌aroA-PTA-5094可以很容易地生产和通过大规模使用来施用，例如通过粗略的喷雾或饮用水来施用。

在说明书和权利要求书中使用时，术语大肠杆菌aroA-PTA-5094是指大肠杆菌aroA缺失突变株微生物，其于2003年3月27日保藏在ATCC，指定的ATCC号为PTA-5094。这个术语也将包括按与在此阐述的基本上相同的方法制备的、具有其基本上相同的免疫原性特征的大肠杆茵aroA-基因缺失突变株的其它菌株。

本发明的aroA基因缺失的大肠杆菌突变株可进一步利用本领域技术人员可用的培养基和技术进行连续传代。连续传代可以进一步的将菌株减毒，使其更适合作为疫苗免疫原。在此，多至约10次的连续传代是可以的，约3到5次的连续传代是优选的。

本发明的大肠杆菌aroA缺失突变株具有独特的优点，被证明是对禽类大肠杆菌病的发病机理很重要的表面附属物，例如1型纤毛和鞭毛仍被表达。(LaRagione，R.M.；Sayus，A.R.；和Woodward，M.J.，Epidemiology and Infection，2000，124：351-363和LaRagione，R.M.；Cooly，W.A.；和Woodward，M.J.，Joumal of Medical Microbiology，2000，49：327-338)。完全定义的遗传缺失疫苗作为活疫苗的候选物是优选的，提供了在宿主中的组合的安全性和高度效力的可能性。特别可取的是那些不能回复为野生型表型的缺失突变株。在实际操作中，在致病性大肠杆菌菌株中构建有芳香族氨基酸生物合成缺陷的定义的大肠杆菌aroA-突变株，来产生本发明的大肠杆菌aroA-PTA-5094。所述大肠杆菌aroA-PTA-5094在鸡中对抗野生型大肠杆菌攻击是安全和有效的。因此，本发明还提供用于预防或改善家禽的禽类大肠杆菌病的方法，包括向所述家禽施用致免疫有效量的大肠杆菌aroA-PTA-5094。

根据宿主的年龄和大小、感染的严重度、病原体的繁殖力、施用的方法等，致免疫有效量可以变化。一般地，每剂量单位适合的有效量可以是约10²至10¹⁴菌落形成单位(cfu)，优选的约5.0×10²到5.0×10¹⁰cfu，更优选的约3.0×10⁶cfu至6.0×10⁶cfu，再更优选的约5.0×10⁶cfu至6.0×10⁶cfu。一个或两个剂量单位是本领域技术人员可预期的。如果选择两个剂量单位，则优选的在孵化后1天进行疫苗接种，在约一周到两周龄再次接种。剂量单位理想的是每只禽鸟约0.5到1mL，但可以优化这一数量以送递上文所述的致免疫有效量的微生物免疫原。

适用本发明的方法的家禽包括鸡、鸭、火鸡、鹅、矮脚鸡、鹌鹑、野鸡、鸽子等等，优选的是商业上重要的家禽例如鸡、鸭、鹅和火鸡，更优选的是鸡和火鸡，特别优选的是鸡。

本发明的大肠杆菌aroA-PTA-5094可以通过任何传统的方法施用，优选的是对于家禽业经济上可行的方法，例如通过喷雾或饮用水来大规模施用。完全预料不到的是，大肠杆菌，一种呼吸粘膜的天然病原体，可以通过喷雾(优选的气溶胶)途径应用，并仍然是安全和有效的。通常的预期是，针对这种强力致命的病原体，特别是细菌的疫苗只能通过注射或其他途径来提供。本发明的aroA-突变株对于喷雾施用是安全的。在实际操作中，将大肠杆菌aroA-PTA-5094与液体载体混合，作为喷雾或作为饮用水添加剂施用。因此，本发明进一步提供一种禽类疫苗组合物，其包含致免疫有效量的大肠杆菌aroA-PTA-5094和药理学上可接受的载体。

适合于在本发明的疫苗组合物中使用的药理学上可接受的载体可以是任何常规的、适合于兽医药物组合物的液体载体，优选的是适合于组织或细胞培养基的平衡盐溶液，例如无菌的磷酸盐缓冲盐水，更优选的是蒸馏水。其他适合的基质可以包括乳剂。本发明的疫苗也可由本领域技术人员添加佐剂。当通过饮用水应用该疫苗时，可以使用脱脂奶粉作为载体。脱脂奶粉似乎能稳定疫苗，有可能中和了可影响活力的某些痕量矿物质的作用。

除了大肠杆菌aroA-PTA-5094微生物作为活性成分之外，期望本发明的疫苗组合物还可含有其他的活性组分，例如针对禽白血病、网状内皮组织增殖、传染性支气管炎、传染性囊病、新城疫、禽类腺病毒病、禽类呼吸道肠病毒病、禽痘病、传染性喉气管炎、禽流感、鸡流感、鸡伤寒、球虫病、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)、鸡霍乱、等等的禽类免疫原性抗病原体化合物。

在本发明的一个实施方案中，可以利用已知的技术，例如在Nature，1974，252：252-254或Journal of Immunology，1978，120：1109-1113中描述的技术，将本发明的大肠杆菌aroA-PTA-5094微生物包含到脂质体中。在本发明的另一个实施方案中，可以利用本领域技术人员可用的方案使本发明的大肠杆菌aroA-PTA-5094微生物与适合的生物学化合物，例如多糖、肽、蛋白等等，或它们的组合缀合。

根据此处描述的实施方案的本发明的疫苗被认为是对所有血清型的大肠杆菌的大肠杆菌病的是有效的，包括血清型O1、O2和O78，以及特别是致命的未分型的血清型。在此描述的疫苗对于败血症、心包炎、气囊炎、肝周炎、关节炎和特别是蜂窝织炎是有效的。后者通常与大肠杆菌病相关，但本身也可能是重要的问题。

为了更清楚地了解本发明，以下给出下列实施例。这些实施例仅仅是举例说明性的，无论如何不能被理解为是限制本发明的范围或是本发明的基础。实际上，除那些显示出的和在此描述的之外，根据下文中阐述的实施例和以上的说明书，对本发明的各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。

                     实施例1

        aroA基因缺失的大肠杆菌突变株的构建

I)受体

亲本生物体是1995年从提交给兽医实验室机构(VLA)，Addlestone，Surrey，UK，并在VLA血清分型的禽类大肠杆菌病临床病例中分离的大肠杆菌禽类分离物。根据在一天龄SPF鸡中的群集现象、侵入、持久性和病原性，和通过其抗生素敏感性模式的体外特征选择亲本菌株。通过转化的供体(大肠杆菌K12 S17 λ pir，其带有具有aroA的PNG101，aroA带有100bp的缺失)和野生型亲本菌株(野生型大肠杆菌分离物EC34195)之间的接合，产生受体菌株。

II)缺失的表征

aroA基因位于serC-aroA操纵子中，邻近于serC并位于serC的启动子远端，编码3-磷酸烯醇丙酮酰基莽草酸-5-磷酸合成酶，一种普通芳香生物合成途径的酶。在受体中aroA基因功能的丧失产生了对芳香代谢产物的需求，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、对氨基苯甲酸(PABA)和2，3-二羟基苯甲酸。PABA是一种在脊椎动物组织中不存在的代谢产物，对于PABA的需求导致体内生长的减弱。

III)aroA缺失的大肠杆菌突变株的构建

a)设计包括SrfI和BglII限制性位点和终止密码子的PCR引物，从如上所述的家禽大肠杆菌O78分离物中扩增aroA基因的5′和3′末端的、约650bp的两个独立的PCR产物。

b)用BglII将两个PCR产物消化2小时，在100伏特下进行电泳1小时，切下条带，用SephaGlas条带制备试剂盒纯化各个条带。

c)混和等量的每个纯化的PCR产物，并连接到pCR2.1中。

d)将携带aroA的连接的质粒转化到DH5α最大感受态细胞中，通过限制性内切酶图谱和PCR确认克隆。

e)用EcorV和SpeI将带有缺失的完全aroA基因从pCR2.1切下，然后纯化并连接到预先消化(SpeI)的自杀载体(SacB，pKNG101)上，转化到感受态大肠杆茵K12 S17 λ pir内，通过限制性内切酶图谱和PCR确认克隆。

f)在供体(大肠杆菌S17 λ pir，其带有具有aroA的PNG101，aroA带有100bp的缺失)和野生型大肠杆菌分离物之间进行接合。

g)在37℃孵化48小时之后出现菌落，在补充有庆大霉素和链霉素和芳香族氨基酸(DL色氨酸、DL苯丙氨酸和DL酪氨酸每种20mg/l)的基本培养基上传代培养。通过PCR测试单个菌落。保留产生野生型PCR产物和小了100bp的突变PCR产物的菌落用于进一步的研究。

h)将单交换体在补充有10％蔗糖的LB-G肉汤中，于37℃，缓和搅动培养16小时。将连续稀释的过夜培养物置于补充有10％蔗糖的LB-G平板上，在37℃孵化16小时。

i)将在10％蔗糖LB-G平板上生长的菌落在LB-G、LB-G+庆大霉素和链霉素和基本培养基的每个上进行传代培养，在37℃孵化16小时。将仅在LB-G平板上生长(双交换体)的菌落在5％绵羊血琼脂上传代培养，维持在4℃。

IV)中间克隆载体

自杀载体(SacB，PNG101)是中间克隆载体。在供体(S17，其带有具有aroA的PNG101，aroA带有100bp的缺失)和野生型大肠杆菌分离物之间进行接合。

                        实施例2

                      主种的制备

大肠杆菌aroA-菌株(在实施例1中构建)在胰蛋白酶大豆琼脂平板上生长一次，在胰蛋白酶大豆肉汤中传代3次。将培养物分置在玻璃瓶中，密封并冻干。

                        实施例3

      大肠杆菌aroA活疫苗一次疫苗接种后在鸡中

           对抗禽类大肠杆菌病的效力的评估

在这个评估中，将96只SPF白色来亨(leghorn)鸡分成三组，每组32只。挑选禽鸟，放入任意分配的隔离装置中。每个测试组放在2个隔离装置中，每个包含16只禽鸟。

利用手持喷雾器粗略的喷雾来对1天龄的组A接种。在一天龄时，将测试组A中的禽鸟集中在小容器中，向禽鸟的头部喷出疫苗，直到给予了校准的剂量。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将实施例2的大肠杆菌aroA-微生物稀释到每剂(1mL每只禽鸟)5.0×10⁶cfu的滴度。

在6周龄时，用1.0mL剂量的1.0×10⁹cfu大肠杆菌O78气管内地(IT)攻击组A和组B(未接种)。

测试组C未接种和未攻击(阴性对照组)。接种的和对照禽鸟在独立的隔离装置中饲养，直到完成研究。

对所有禽鸟进行兽医级照料，随意取用饲料和水。攻击后7天每天观察禽鸟。在攻击后7天时间的结尾，所有存活的禽鸟进行尸检和检查典型大肠杆菌病病变的存在。非存活禽鸟和展现了任何非常明显的病变，例如肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎的禽鸟认为是大肠杆菌病阳性。

结果在表I中显示。

                                         表I

  测  试  组  接种途径  攻击  途径  死亡  率％             具有明显病变的存活禽鸟％  大肠杆  菌病阳性  ％  Hep^b  Card^c  Air^d  Cell^e  Arth^f  A  粗略的喷雾  IT  3.1^a  22.6  6.5  16.13  3.2  0  29.0  B  无  IT  28.1  91.3  82.6  86.9  47.8  17.4  96.9  C  无  无  0  0  0  0  0  0  0

^a一只禽鸟在疫苗接种后一天死亡。原因不能确定，但可能非特异性的早期小鸡死亡常常与卵黄囊或脐感染有关。

^b肝周炎

^c心包炎

^d气囊炎

^e蜂窝织炎

^f关节炎

从表I的数据可以看出，当在一天龄时施用所述疫苗，本发明的大肠杆菌aroA-疫苗对于在鸡中预防由大肠杆菌O78导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                      实施例4

     大肠杆菌aroA-活疫苗两次疫苗接种后在鸡中

          对抗禽类大肠杆菌病的效力的评估

在这个评估中，将96只SPF白色来亨鸡分成三组，每组32只。挑选禽鸟，放入任意分配的隔离装置中。每个测试组放在2个隔离装置中，每个包含16只禽鸟。

组A(接种)在一天龄如实施例B中描述的通过粗略的喷雾接种，在一周龄通过饮用水途径再次接种。在一周龄，使禽鸟禁止饮水3小时。稀释实施例2的大肠杆菌aroA-疫苗，与测定量的凉蒸馏水混和到最终滴度为5.0×10⁶cfu。蒸馏水的测定量是先前确定的一小时中消耗的量。

在6周龄时，用1.0mL剂量的1.0×10⁹cfu大肠杆菌O78气管内地(IT)攻击组A(接种)和组B(未接种)。

测试组C未接种和未攻击(阴性对照组)。接种的和对照禽鸟在独立的隔离装置中饲养，直到完成研究。

对所有禽鸟进行兽医级照料，随意取用饲料和水。攻击后7天，每天观察禽鸟。在攻击后7天时间的结尾，所有存活的禽鸟进行尸检和检查典型大肠杆菌病病变的存在。非存活禽鸟和展现了任何非常明显的病变，例如肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎的禽鸟认为是大肠杆菌病阳性。

结果在表II中显示。

                                      表II

  测  试  组  接种途径  攻击  途径  死亡  率％         具有明显病变的存活禽鸟％  大肠杆  菌病阳性  ％  Hep^a  Card^c  Air^d  Cell^e  Arth^f  A  粗略的喷雾/  饮用水  IT  6.3^a  10  23.3  20  0  0  36.7  B  无  IT  28.1  91.3  82.6  86.9  47.8  17.4  96.9  C  无  无  0  0  0  0  0  0  0

^a两只禽鸟在通过粗略喷雾途径疫苗接种后2天死亡。原因不能确定，但可能非特异性的早期小鸡死亡常常与卵黄囊或脐感染有关。

^b肝周炎

^c心包炎

^d气囊炎

^e蜂窝织炎

^f关节炎

从表II的数据可以看出，当在一天龄时通过粗略的喷雾施用疫苗、在一周龄通过饮用水再次施用，本发明的大肠杆菌aroA-疫苗对于在鸡中预防由大肠杆菌O78导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                     实施例5

     大肠杆菌aroA-活疫苗两次疫苗接种后在鸡中

  对抗禽类大肠杆菌病(血清型O78)的效力的进一步评估

这项研究考察了用大肠杆菌血清型O78的强毒株进行气管内攻击，大肠杆菌aroA-活疫苗在预防鸡的大肠杆菌病方面的效力。在测试组#1(32只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在一周龄用一只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗在饮用水中再次接种。在测试组#2(32只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#3(32只禽鸟)中的禽鸟没有接种，并未受攻击。组#1和组#2中的所有禽鸟在六周龄气管内地用每剂1.5×10⁹cfu的大肠杆菌O78攻击。在攻击后7天，对所有存活禽鸟进行尸检和检查非常明显的典型大肠杆菌病病变的存在(肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎)。

不存在可归因于施用FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗的不利反应(死亡或其他临床病征)，这是其对于大规模施用的安全性的表现。

大肠杆菌O78强毒株在未接种的受攻击对照(组#2)中，在攻击后7天期间导致了28.1％的死亡率(32只禽鸟中9只死亡)。大肠杆菌O78强毒株在FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗接种的禽鸟中，在攻击后7天期间导致的死亡率是0％(32只禽鸟中0只死亡)。

统计学地分析在接种的受攻击禽鸟和未接种的受攻击对照禽鸟之间的大肠杆菌病比率。在接种的和未接种的受攻击禽鸟之间典型的大肠杆菌病显著病变存在着显著差异(p＜0.0001)。预防分数为72.4％(95％ Cl 53.7，83.6)。

根据当前的研究可以断定，当在一天龄时通过粗略的喷雾施用和在一周龄通过饮用水再次施用，每剂3.2×10⁶cfu滴度的FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗对于在鸡中预防由大肠杆菌O78导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                      实施例6

      大肠杆菌aroA-活疫苗一次疫苗接种后在鸡中

  对抗禽类大肠杆菌病(血清型O78)的效力的进一步评估

这项研究考察了用大肠杆菌血清型O78的强毒株进行气管内攻击，大肠杆菌aroA-活疫苗在预防鸡的大肠杆菌病方面的效力。在测试组#1(32只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄用一只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗通过粗略的喷雾进行接种。在测试组#2(32只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#3(32只禽鸟)中的禽鸟没有接种，并未受攻击。组#1和组#2中的所有禽鸟在六周龄气管内地用每剂1.5×10⁹cfu的大肠杆菌O78攻击。在攻击后7天，对所有存活禽鸟进行尸检和检查非常明显的典型大肠杆菌病病变的存在(肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎)。

不存在可归因于施用FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗的不利反应(死亡或其他临床病征)，这是其对于大规模施用的安全性的表现。

大肠杆菌O78强毒株在未接种的受攻击对照中在攻击后7天期间导致了28.1％的死亡率(32只禽鸟中9只死亡)。大肠杆菌O78强毒株在FDAH大肠杆菌aroA活疫苗接种的禽鸟中，在攻击后7天期间导致的死亡率是0％(32只禽鸟中0只死亡)。

统计学地分析在接种的受攻击禽鸟和未接种的受攻击对照禽鸟之间的大肠杆菌病比率。在接种的和未接种的受攻击禽鸟之间典型的大肠杆菌病显著病变存在着显著差异(p＜0.0001)。预防分数为76.5％(95 ％Cl 57.9，86.9)。

根据当前的研究可以断定，当在一天龄时通过粗略的喷雾施用，含每剂3.2×10⁶cfu的FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗对于在鸡中预防由大肠杆菌O78导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                        实施例7

       大肠杆菌aroA活疫苗两次疫苗接种后在鸡中

对抗禽类大肠杆茵病(致命的未分型血清型)的效力的进一步评估

这项研究考察了用致命的未分型大肠杆菌进行气管内攻击，大肠杆菌aroA-活疫苗在预防鸡的大肠杆菌病方面的效力。在测试组#1(32只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在一周龄用一只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗在饮用水中再次接种。在测试组#2(32只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#3(32只禽鸟)中的禽鸟没有接种，并未受攻击。组#1和组#2中的所有禽鸟在六周龄气管内地用每剂2.5×10¹⁰cfu的致命的大肠杆菌攻击。在攻击后7天，对所有存活禽鸟进行尸检和检查非常明显的典型大肠杆菌病病变的存在(肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎)。

不存在可归因于施用FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗的不利反应(死亡或其他临床病征)，这是其对于大规模施用的安全性的表现。

致命的大肠杆菌在未接种的受攻击对照中或在FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗接种的禽鸟中在攻击后7天期间没有导致死亡。

统计学地分析在接种的受攻击禽鸟和未接种的受攻击对照禽鸟之间的大肠杆菌病比率。在接种的和未接种的受攻击禽鸟之间典型的大肠杆菌病显著病变存在着显著差异(p＜0.0001)。预防分数为87.1％(95％ Cl 61.9，95.6)。

根据当前的研究可以断定，当在一天龄时通过粗略的喷雾施用和在一周龄通过饮用水再次施用，每剂3.2×10⁶cfu滴度的FDAH大肠杆菌aroA活疫苗对于在鸡中预防由致命的大肠杆菌导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                      实施例8

大肠杆菌aroA-活疫苗一次疫苗接种后在鸡中对抗禽类大肠杆菌病

        (致命的未分型血清型)的效力的进一步评估

这项研究考察了用致命的未分型大肠杆菌进行气管内攻击，大肠杆菌aroA-活疫苗在预防鸡的大肠杆菌病方面的效力。在测试组#1(32只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄用一只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗通过粗略的喷雾进行接种。在测试组#2(32只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#3中的禽鸟未接种并未受攻击。组#1和组#2中的所有禽鸟在六周龄气管内地用每剂2.5×10¹⁰cfu的致命的大肠杆菌攻击。在攻击后7天，对所有存活禽鸟进行尸检和检查非常明显的典型大肠杆菌病病变的存在(肝周炎、心包炎、气囊炎、蜂窝织炎或关节炎)。

不存在可归因于施用FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗的不利反应(死亡或其他临床病征)，这是其对于大规模施用的安全性的表现。

致命的大肠杆菌在未接种的受攻击对照中或在FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗接种的禽鸟中在攻击后7天期间没有导致死亡。

统计学地分析在接种的受攻击禽鸟和未接种的受攻击对照禽鸟之间的大肠杆菌病比率。在接种的和未接种的受攻击禽鸟之间典型的大肠杆菌病显著病变存在着显著差异(p＜0.0001)。预防分数为66.6％(95％ Cl 39.8，81.5)。

根据当前的研究可以断定，当在一天龄时通过粗略的喷雾施用，每剂3.2×10⁶cfu滴度的FDAH大肠杆菌aroA-活疫苗对于在鸡中预防由致命的大肠杆菌导致的大肠杆菌病是安全和有效的。

                     实施例9

                    比较试验A

在这项研究中，本发明的疫苗与商售的GARAVAX-T疫苗进行比较，这是竞争者的产品，是含有大肠杆菌的致命的温度敏感突变株，被推荐用于火鸡，目的在于预防与大肠杆菌血清型O78感染有关的大肠杆菌病。

根据本发明的一个实施方案，在测试组#1(30只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在2周龄用一只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗在饮用水中再次接种(传代水平X+5；5.0×10⁶cfu每1mL剂量)。根据推荐的标签指示，在测试组#2(30只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在2周龄用一只禽鸟剂量的GARAVAX-T疫苗在饮用水中再次接种。在测试组#3(30只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#4(30只禽鸟)中的禽鸟没有接种并且未受攻击。在组#1、#2和#3中的所有禽鸟在6周龄用每剂(1.0mL/剂)5×10⁹cfu的目标剂量的致命的大肠杆菌O78进行气管内的攻击。在攻击后7天，记录死亡禽鸟的数目，对所有存活禽鸟进行尸检和检查典型大肠杆菌病的显著可见病变的存在。

结果在以下的表III中列出，确定患有特定气囊炎和整体大肠杆菌病病变的鸡的百分比，其中：

                                     表III

         活大肠杆菌aroA-疫苗在鸡中对抗大肠杆菌O78攻击在预防气囊炎

                                  方面的效力

  组  号  接种途径  攻击途径  总禽  鸟数  气囊炎  大肠  杆菌  病  气囊炎阳性％¹  大肠杆菌病阳  性％²  1  CS/DW  气管内  30  2  2  6.6(2/30^a)  6.6(2/30^a)  3  无  气管内  30  16  19  53.3(16/30^b)  63.3(19/30^b)

                                表III(续)

         GARAVAX-T疫苗在鸡中对抗大肠杆菌O78攻击在预防气囊炎方

                                面的效力

  组  号  接种  途径  攻击  途径  总禽  鸟数  气囊炎  大肠  杆菌  病  气囊炎阳性％¹  大肠杆菌病阳性  ％²  2  CS/DW  气管内  30  8  10  26.7(8/30^a)  33.3(10/30^a)  3  无  气管内  30  16  19  53.3(16/30^b)  63.3(19/30^b)

¹气囊炎阳性％＝患有气囊炎的禽鸟总数/禽鸟总数

²大肠杆菌病阳性％＝有大肠杆菌病病变的禽鸟和死亡禽鸟总数/禽鸟总数

CS＝粗略的喷雾

DW＝饮用水

同一栏中不同字母之前的数值显著不同(χ²测验法：p＜0.05)

                     实施例10

                    比较试验B

在这项研究中，本发明的疫苗与商售的GARAVAX-T疫苗进行比较，这是竞争者的产品，是含有大肠杆菌的致命的温度敏感突变株，被推荐用于火鸡，目的在于预防与大肠杆菌血清型O78感染有关的大肠杆菌病。

根据本发明的一个实施方案，在测试组#1(31只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在2周龄用-只禽鸟剂量的大肠杆菌aroA-疫苗在饮用水中再次接种(传代水平X+5；5.0×10⁶cfu每1mL剂量)。根据推荐的标签指示，在测试组#2(29只禽鸟)中的每只禽鸟在一天龄通过粗略的喷雾进行接种，在2周龄用一只禽鸟剂量的GARAVAX-T疫苗在饮用水中再次接种。在测试组#3(31只禽鸟)中的禽鸟作为未接种的受攻击对照。在测试组#4(30只禽鸟)中的禽鸟没有接种并未受攻击，这些当中没有死亡。在组#1、#2和#3中的所有禽鸟在6周龄用每剂(1.0mL/剂)5.0×10⁹cfu的目标剂量的致命的大肠杆菌624(未分型的血清型)进行气管内的攻击。在攻击后7天，记录死亡禽鸟的数目，对所有存活禽鸟进行尸检和检查典型大肠杆菌病的显著可见病变的存在。

结果在以下的表IV中列出，确定患有特定蜂窝织炎的鸡的百分比，其中：

                         表IV

   活大肠杆菌aroA-疫苗在鸡中对抗大肠杆菌624(未分型的血清型)

                 攻击在预防蜂窝织炎方面的效力

  组号  接种途径  攻击途径  总禽  鸟数  蜂窝织炎  死亡  禽鸟数  蜂窝织炎阳性％¹  1  CS/DW  气管内  31  6  8  45.2(14/31^a)  3  无  气管内  31  4  20  77.4(24/31^b)

                             表IV(续)

        GARAVAX-T疫苗在鸡中对抗大肠杆菌624(未分型的血清型)

                  攻击在预防蜂窝织炎方面的效力

  组号  接种途径  攻击途径  总禽鸟数  蜂窝织炎  死亡禽鸟数  蜂窝织炎阳性％¹  2  CS/DW  气管内  29  7  12  65.5(19/29^a)  3  无  气管内  31  4  20  77.4(24/31^a)

¹蜂窝织炎阳性％＝患有蜂窝织炎的禽鸟和死亡禽鸟的总数/禽鸟总数

CS＝粗略的喷雾

DW＝饮用水

同一栏中不同字母之前的数值显著不同(χ²测验法：p＜0.05)