与乳腺癌有关的基因DREE及其编码的蛋白与应用

摘要

本发明涉及与乳腺癌有关的基因DREE(down－regulated by ER inendometrium)及其编码的蛋白，该基因的表达载体，以及所述基因和蛋白在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

说明书

发明领域

本发明涉及与乳腺癌有关的基因DREE(down-regulated by ER inendometrium)及其编码的蛋白，该基因的表达载体，以及所述基因和蛋白在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重地威胁着女性的生命安全。发现与乳腺癌有关的新基因及其表达的蛋白并由此获得治疗乳腺癌的新的方法因此具有重要意义。

发明内容

本发明发现了一种与乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖有关的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可促进乳腺癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。

本发明的另一个目的提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。

本发明的又一个目的是提供含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。

本发明的另一个目的是提供由上述表达载体转化的宿主细胞。

本发明的再一个目的是提供生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。

本发明的另一个目的是提供针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。

本发明的还一个目的是提供检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。

此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的探针具有如序列表中的序列3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了用于PCR扩增的引物，该引物为：

ups 5’-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’

downs 5’-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3’。

本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

附图简述

图1是组织表达谱(MTN，Clontech)，提示DREE基因含有2个转录本，分别为2.4kb和4.5kb左右。组织表达谱证实DREE基因具有明显的组织特异性，在骨骼肌中表达最强，其次是心脏、胰腺和胎盘。

图2是肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)，分析表明：与正常组织相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等组织中的表达量降低；在子宫内膜癌、卵巢癌等组织中的表达量增加。

图3是肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)，分析表明：与正常组织相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等组织中的表达量降低；在子宫内膜癌、卵巢癌等组织中的表达量增加。

图4是显示DREE基因在多种肿瘤细胞系中表达的Northern blot结果图，显示DREE基因在多种肿瘤细胞系中表达。

图5是显示DREE基因在多种肿瘤细胞系中表达的RT-PCR结果图，显示DREE基因在多种肿瘤细胞系中表达。

图6是pGEX-4T-3-DREE原核表达载体的电泳图。

图7是DREE蛋白在大肠杆菌BL21中表达的SDS-PAGE电泳图。

图8是pEGFP-C₂-DREE真核表达载体的电泳图。

图9是显示DREE蛋白在MCF-7细胞中定位的荧光显微镜图，DREE蛋白主要定位于核膜。

图10是pcDNA3.1(-)-c-myc-DREE真核表达载体的电泳图。

图11是显示DREE蛋白对ECC-1细胞的增殖的影响的图(P＜0.05)。

图12是通过Clustal W program分析得到DREE的进化树图。

图13是非变性总RNA的电泳图。

本发明用雌二醇(E2)和Tamoxifen同时处理ECC-1和ISHIKAWA细胞(子宫内膜癌细胞)，基因芯片检测显示EST序列AI289489下调，利用该EST序列电子克隆得到一雌激素受体下调靶基因，全长1553bp序列，最长ORF为795bp。RACE和RT-PCR实验证实该基因存在，符合预测结果。将其命名为DREE(down-regulatedby ER in endometrium)。ORF：795bp。编码265个氨基酸。ORF如序列1所示。编码的氨基酸序列如序列2所示。

DREE基因生物信息学分析显示，该基因定位于1q32.3，编码227个氨基酸残基。有三个外显子，pI为8.0。蛋白质结构分析提示该基因含有多个PKC和CK2磷酸化位点，C端有CCR4结构域，可能与基因转录有关。此外还提示可能与RNA剪接有关。

在Unigene中同源比对分析得到其同源类似蛋白如下：

A.thaliana pir：T45678-T45678 hypothetical protein29.47％/341aaF14P22.170-Arabidopsis thaliana(see ProtEST)

C.elegans pir：T33226-T33226 hypothetical protein W02G9.536.84％/223aa-Caenorhabditis elegans(see ProtEST)

D.pir：S71925-S71925 angel protein-fruit fly 39.45％/213aamelanogaster(see ProtEST)

H.sapiens pir：T46340-T46340 hypothetical protein99.85％/673aaDKFZp434B0814.1-human(see ProtEST)

M.musculus sp：O35710-NOCT MOUSE Nocturnin 27.66％/226aa(see ProtEST)

R.norvegicus sp:Q9ET55-NOCT RAT Nocturnin 29.85％/192aa(see ProtEST)

S.cerevisiae sp：P31384-CCR4 YEAST Glucose-repressiblealcohol dehydrogenase transcriptional effector

通过ClustalW program分析得到其进化树，见图12。

进行了MTN分析和肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析。组织表达谱证实DREE基因具有明显的组织特异性，在骨骼肌中表达最强，其次是心脏、胰腺和胎盘。肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析表明：与正常组织相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等组织中的表达量降低；在子宫内膜癌、卵巢癌等组织中的表达量增加。

构建了pGEX-4T-3-DREE质粒，pGEX-4T-3-DREE在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-DREE的融合蛋白。SDS-PAGE电泳证实DREE基因在大肠杆菌BL21中表达。

构建pEGFP-C₂-DREE真核表达载体，confocol证实DREE在MCF-7细胞中表达，主要定位于核膜。

MTT法检测DREE过表达对乳腺癌细胞增殖的影响，结果发现DREE蛋白可以促进细胞增殖(P＜0.05)。

通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。

通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。

实施例1：用RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆DREE基因

1)细胞总RNA的提取：

对数生长期的MCF-7细胞中加入Trizol Reagent试剂(Invitrogen)1ml，转移至1.5ml EP管，室温静置5分钟。加入氯仿0.2ml，剧烈摇晃EP管15秒。室温静置2-3分钟，4℃，12,000rpm离心15分钟。转移上层水相至另一EP管中(约500-600μl)，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟，4℃，10,000rpm离心10分钟。弃上清，用1ml 75％乙醇漂洗沉淀，4℃，7,500rpm离心5分钟。弃掉75％乙醇液，尽量控干，并于空气中风干少量剩余乙醇，将RNA沉淀溶于20μl DEPC处理水中，于55℃-60℃水浴中孵育10分钟。紫外分光光度计定量RNA以及确定所提RNA纯度。以OD₂₆₀/OD₂₈₀≥1.8为符合要求。

2)反转录合成cDNA(Invitrogen kit)：

取所提取的RNA模板，用DEPC处理水配制成浓度为1μg/μl。制备20μl逆转录体系：MgCl₂(25mM)4μl，10x逆转录缓冲液2μl，dNTP(10mM)2μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，AMV逆转录酶(20U/μl)0.75μl，Oligo(dT)(0.5μg/μl)1μl，RNA模板2μl，最后加DEPC处理水补足20μl体系。42℃水浴90分钟。加热样品管至95℃，5分钟，冰浴5分钟，最后于-20℃保存。

3)PCR反应：

引物：pEGFP-C2-DREE

ups 5’-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’

downs 5’-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3’。

采用25μl PCR反应体系扩增DREE基因：取1.67μl cDNA做PCR模板，加10×PCR缓冲液2.5μl；2.5mM dNTP 2μl；上下游引物(10μM)各0.5μl；Taq DNA聚合酶(1U/μl)0.2μl；加去离子水补足25μl体系(酶购自TAKARA公司)。

PCR条件为94℃预变性3分钟；94℃变性30秒；54℃退火30秒；72℃延伸1分钟，共30个循环。再72℃延伸10分钟。取出储存于-20℃。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用EcoRI及BamHI双酶切后，克隆到相同酶切的pEGFP-C2真核表达载体中。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与预期相符。

实施例2：Northern blot杂交

1)细胞总RNA的提取(见RT-PCR)

2)RNA甲醛凝胶变性电泳

制胶：50ml

  琼脂糖  0.1％DEPC水  加热2min熔化，冷至60℃加入  10×MOPS凝胶电泳缓冲液  37％甲醛(pH＞4.0)  0.5g  36ml   5ml  9ml  混匀后灌胶，室温30min或更长

样品处理

RNA溶液(约30μg)甲酰胺10×MOPS凝胶电泳缓冲液甲醛(37％)  4.5μl  10μl  2μl  3.5μl混匀，65-70℃温育15min，冰浴15min10×上样缓冲液  2μl

电泳：

电泳槽中加入1×MOPS凝胶电泳缓冲液(没过凝胶1-2mm)预电泳10min，上样，稳压40伏电泳，待溴酚蓝走至胶长的三分之二时停止电泳，20×SSC含0.5μg溴化乙啶染色，紫外灯下观察并照相。结果见图13。图中28S与18S的比值约为2∶1且5S几乎看不到，说明所提取的RNA很少降解，可用于Northern blot分析。

3)变性RNA转膜

准备一大塑料饭盒，内置足够厚滤纸筑成平台，剪三张比胶略大的滤纸和一张硝酸纤维素膜，用20×SSC浸湿滤纸和膜至少5min(膜先用去离子水自上而下浸透)，并用DEPC水浸泡凝胶数次，换成20×SSC浸泡2min。

向盒内加入20×SSC，在平台上，自下而上依次铺滤纸——凝胶——硝酸纤维素膜——滤纸，期间注意各步都尽量排除所有气泡。封口膜围绕凝胶四周预防短路，最后于最后一层滤纸上放置足够高的吸水纸，上压500g重物，持续转膜18-24hr。

转移结束后，6×SSC漂洗纤维素膜，微干，夹于两张干燥滤纸间紫外交联5s。膜可以直接用也可用保鲜膜及锡箔纸包好置4℃保存。

4)探针制备：RT-PCR扩增DREE基因作为探针，方法同实施例1。引物：ups 5’-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’；downs 5’-TCCAGTTGGGCGACAGAGTGAGACC-3’参照Amersham Biosciences的Ready-To-Go DNA LabellingBeads(-dCTP)kit说明书。25ng-1μg DNA溶于45μl水中，90-100℃2-3分钟，迅速冰浴5分钟，加5μl[α-³²P]dCTP标记的Random Primersand Reaction Buffer Mix至50μL，37℃孵育20min。

5)预杂交

用6×SSC浸透硝酸纤维素膜，放入杂交袋中，加入10ml(0.2ml/cm²)预杂交液，排除气泡，封口，恒温摇床轻摇，42℃预杂交3-4hr或过夜。

6)杂交

探针95-100℃水浴5min，迅速冷却，加入杂交液中，恒温摇床轻摇

42℃杂交24hr。

7)洗膜：

弃去杂交液，迅速洗膜不要使膜干燥。

1×SSC/0.1％SDS            20min×2

0.2×SSC/0.1％SDS    68℃  30min×2

同位素监测直至在无DNA区域检测不出放射信号为止。

0.1×SSC  室温洗5min，然后取出，吸去多余液体，保鲜膜包好。

8)放射自显影

-20℃曝光24-48hr。显影，定影，照相分析结果。

实施例3、MTN分析和肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析

杂交操作参照Clontech公司MTN分析和肿瘤表达谱(multi-tissuetumor profile，Clontech)分析试剂盒说明书。过程如下：

(1)探针标记：方法同实施例2。

(2)杂交：68℃预热杂交液，将吸附有核酸的尼龙膜放入含有杂交液的杂交瓶中，加入含有100μg/ml的鲑精DNA的杂交液0.1ml/cm²，68℃预杂交30min。20ng/ml探针混入杂交液，95℃2-5分钟，冰浴5分钟。加入杂交瓶，68℃杂交1小时。

(3)洗膜：用Wash Buffer 1室温洗膜30-40分钟，用Wash Buffer 250℃洗膜40分钟。

(4)显色：用镊子取出膜，洗干Wash Buffer 2，用保鲜膜覆盖，-70℃曝光1-3天后显影，定影。

组织表达谱(MTN，Clontech)及Northern blot结果(图1、4)均提示DREE基因含有2个转录本，分别为2.4kb和4.5kb左右。组织表达谱证实DREE基因表达具有明显的组织特异性，在骨骼肌中表达最强，其次是心脏、胰腺和胎盘(图1)。

肿瘤表达谱(multi-tissue tumor profile，Clontech)分析表明：与正常组织相比，DREE基因在乳腺癌、胰腺癌等组织中的表达量降低；在子宫内膜癌、卵巢癌等组织中的表达量增加(图2、3)。

Northern blot(图4)及RT-PCR(图5)结果显示DREE基因在多种肿瘤细胞系中表达。

实施例4：DREE基因在原核细胞中的表达及纯化

构建pGEX-4T-3-DREE质粒：RT-PCR获取DREE目的基因，方法同实施例1。引物序列如下：pGEX-4T-3-DREE

ups 5’-GGAATTCCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’

downs5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3’

1)Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，EcoR I和Not I双酶切(50ul体系：10×EcoRI buffer 5ul、EcoR I酶2ul、Not I酶2ul，补水至50ul。37℃反应5hrs。试剂盒购自NEB公司)，Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，同EcoR I和Not I双酶切且纯化后的pGEX-4T-3连接(10ul体系：10×buffer 1ul、pGEX-4T-3100ng、DREE产物50ng、连接酶1ul，补水至10ul。15℃反应18hrs。试剂盒购自Promega公司)。连接后转化、筛选测序。

2)pGEX-4T-3-DREE可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-DREE的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞：挑取单克隆到适量培养基中，37℃ 250rpm培养至A₆₀₀ 0.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-DREE转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化步骤如下：

(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100ml的锥形瓶中生长过夜。

(2)转接到500ml的锥形瓶中培养3-5小时。

(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。

(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。

(5)用25ml PBS重悬细胞。超声10分钟。

(6)加1.25ml20％Triton X-100，混匀1小时。

(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。

(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。

(9)用0.5ml洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。

构建pGEX-4T-3-DREE原核表达载体如图6所示，SDS-PAGE电泳证实DREE在大肠杆菌BL21中表达(图7)。

实施例6：DREE在细胞内的定位

利用本实验室保存的pEGFP-C1 C末端蛋白融合载体构建了pEGFP-C2-DREE载体(构建方法同pGEX-4T-3-DREE)，

引物：

ups 5’-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’

downs 5’-CGGGATCCCGCTACTCAGGAAGCCGAAATG-3’。

它可以在真核细胞内表达GFP-DREE的融合蛋白。

1)用Lipofectin^TM方法瞬时转染该载体至MCF-7细胞

于转染前一天将MCF-7细胞接种于6孔板(已放置盖玻片)中，接种密度为8×10⁵个细胞/孔，每孔加入培养液2ml。24小时后，细胞长至覆盖培养孔底面积约70-80％时，可准备转染。在EP管中配制下述溶液：溶液A：4μg pEGFP-C2-DREE及对照表达质粒，分别溶于250ul无血清无双抗DMEM培养液。溶液B：将10μl脂质体溶液(lipofectamine 2000reagent)加入到250ml无血清无双抗DMEM培养液中。室温静置5分钟。然后将溶液A、B混合，室温静置20分钟。用无血清和不含双抗的DMEM培养液洗涤细胞。将上述溶液A、B的混合液中加入2ml无血清无双抗的DMEM培养液，混匀后加至细胞表面。37℃，5％CO2条件下孵育4-6小时后，再用正常含10％胎牛血清的DMEM培养液取代前述培养液，继续培养细胞至36小时。

2)DAPI染色：36小时后，用PBS洗三遍，用4％多聚甲醛/PBS进行固定，室温15分钟，然后用PBS洗三遍。用0.1％Triton X-100/PBS透化15分钟，然后用PBS洗三遍，加入200μL 2.5mg/ml的DAPI，室温作用30分钟，然后用PBS洗三遍，在荧光显微镜下分别用常规荧光波长和DAPI波长进行观察，并进行拍照。

实施例7：MTT法检测DREE过表达对乳腺癌细胞增殖的影响

利用本实验室保存的pcDNA3.1(-)载体构建了pcDNA3.1-c-myc-DREE融合蛋白表达载体(构建方法同pGEX-4T-3-DREE构建)，引物：ups 5’-GGAATTCGCCACCATGTTTCCCCATCACTCGA-3’downs 5’-CGGGATCCACAGGAAGCCGAAATGAGAGG-3’。

MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察DREE蛋白对MCF-7生长的影响。

具体操作方法如下：

将培养到对数生长期的ECC-1细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×10⁵个。次日转染100ng pcDNA3.1-c-myc-DREE及对照表达质粒(转染方法同pEGFP-C2-DREE载体转染)，重复6孔细胞，37℃，5％CO₂进行培养。分别培养1d、2d、3d后，在每个细胞培养孔内加入50μl 1mg/ml的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚枫150μl，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚枫中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。

                          DREE序~1

                SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>与乳腺癌有关的基因DREE及其编码的蛋白与应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>795

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(792)

<223>

<400>1

atg ttt ccc cat cac tcg agg agt ctg ggc aga gac tgg act aca ccg       48

Met Phe Pro His His Ser Arg Ser Leu Gly Arg Asp Trp Thr Thr Pro

1               5                   10                  15

tgg gag aat ctg caa agg tgt tgc tgg aac aga cat att tct agt tgt       96

Trp Glu Asn Leu Gln Arg Cys Cys Trp Asn Arg His Ile Ser Ser Cys

            20                  25                  30

atg agg tgg cct gga cat tac tct cga gct cct tac cca tac ttc agt      144

Met Arg Trp Pro Gly His Tyr Ser Arg Ala Pro Tyr Pro Tyr Phe Ser

        35                  40                  45

agt agg cat ttt tca cta aat tgg aga cca ccc tgt ttg ttt gag tct      192

Ser Arg His Phe Ser Leu Asn Trp Arg Pro Pro Cys Leu Phe Glu Ser

    50                  55                  60

aga act cag ttc cag tac tgt aac tgg aga cct gac aac ctg agc cag      240

Arg Thr Gln Phe Gln Tyr Cys Asn Trp Arg Pro Asp Asn Leu Ser Gln

65                  70                  75                  80

aca tct ttg att cat ctc tct agt tac gtc atg aac gct gag gga gat      288

Thr Ser Leu Ile His Leu Ser Ser Tyr Val Met Asn Ala Glu Gly Asp

                85                  90                  95

gag cct tca tca aaa cga aga aaa cac caa ggt gtg ata aag cgg aat      336

Glu Pro Ser Ser Lys Arg Arg Lys His Gln Gly Val Ile Lys Arg Asn

            100                 105                 110

tgg gaa tat ata tgt agc cat gat aaa gaa aaa acg aag atc cta gga      384

Trp Glu Tyr Ile Cys Ser His Asp Lys Glu Lys Thr Lys Ile Leu Gly

        115                 120                 125

gac aaa aat gtt gat ccc aaa tgt gaa gac agt gag aac aag ttt gac      432

                             DREE序~1

Asp Lys Asn Val Asp Pro Lys Cys Glu Asp Ser Glu Asn Lys Phe Asp

    130                 135                 140

ttt tca gtg atg tcc tat aat ata ctt tca caa gat tta ctg gaa gat    480

Phe Ser Val Met Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gln Asp Leu Leu Glu Asp

145                 150                 155                 160

aac tct cac ctt tat aga cat tgc cgg cgg cca gta tta cac tgg agt    528

Asn Ser His Leu Tyr Arg His Cys Arg Arg Pro Val Leu His Trp Ser

                165                 170                 175

ttt agg ttt ccc aat att ctg aaa gaa att aaa cat ttt gat gca gac    576

Phe Arg Phe Pro Asn Ile Leu Lys Glu Ile Lys His Phe Asp Ala Asp

            180                 185                 190

gta ctt tgt ttg caa gaa gtt caa gaa gat cat tat gga gca gag atc    624

Val Leu Cys Leu Gln Glu Val Gln Glu Asp His Tyr Gly Ala Glu Ile

        195                 200                 205

agg cca agt ttg gaa tca ctg ggt aca atg caa ctt ttt ttt ttt ttt    672

Arg Pro Ser Leu Glu Ser Leu Gly Thr Met Gln Leu Phe Phe Phe Phe

    210                 215                 220

ttt tct ttt ttg aga cag ggt ctc act ctg tcg ccc aac tgg agt gca    720

Phe Ser Phe Leu Arg Gln Gly Leu Thr Leu Ser Pro Asn Trp Ser Ala

225                 230                 235                 240

gtg gca caa tca tgg ctc act aca gcc tca acc tac tgg gct caa gta    768

Val Ala Gln Ser Trp Leu Thr Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Ala Gln Val

                245                 250                 255

atc ctc tca ttt cgg ctt cct gag tag                                795

Ile Leu Ser Phe Arg Leu Pro Glu

            260

<210>2

<211>264

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Phe Pro His His Ser Arg Ser Leu Gly Arg Asp Trp Thr Thr Pro

1               5                   10                  15

Trp Glu Asn Leu Gln Arg Cys Cys Trp Asn Arg His Ile Ser Ser Cys

            20                  25                  30

Met Arg Trp Pro Gly His Tyr Ser Arg Ala Pro Tyr Pro Tyr Phe Ser

        35                  40                  45

Ser Arg His Phe Ser Leu Asn Trp Arg Pro Pro Cys Leu Phe Glu Ser

                            DREE序~1

    50                  55                  60

Arg Thr Gln Phe Gln Tyr Cys Asn Trp Arg Pro Asp Asn Leu Ser Gln

65                  70                  75                  80

Thr Ser Leu Ile His Leu Ser Ser Tyr Val Met Asn Ala Glu Gly Asp

                85                  90                  95

Glu Pro Ser Ser Lys Arg Arg Lys His Gln Gly Val Ile Lys Arg Asn

            100                 105                 110

Trp Glu Tyr Ile Cys Ser His Asp Lys Glu Lys Thr Lys Ile Leu Gly

        115                 120                 125

Asp Lys Asn Val Asp Pro Lys Cys Glu Asp Ser Glu Asn Lys Phe Asp

    130                 135                 140

Phe Ser Val Met Ser Tyr Asn Ile Leu Ser Gln Asp Leu Leu Glu Asp

145                 150                 155                 160

Asn Ser His Leu Tyr Arg His Cys Arg Arg Pro Val Leu His Trp Ser

                165                 170                 175

Phe Arg Phe Pro Asn Ile Leu Lys Glu Ile Lys His Phe Asp Ala Asp

            180                 185                 190

Val Leu Cys Leu Gln Glu Val Gln Glu Asp His Tyr Gly Ala Glu Ile

        195                 200                 205

Arg Pro Ser Leu Glu Ser Leu Gly Thr Met Gln Leu Phe Phe Phe Phe

    210                 215                 220

Phe Ser Phe Leu Arg Gln Gly Leu Thr Leu Ser Pro Asn Trp Ser Ala

225                 230                 235                 240

Val Ala Gln Ser Trp Leu Thr Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Ala Gln Val

                245                 250                 255

Ile Leu Ser Phe Arg Leu Pro Glu

            260

<210>3

                                   DREE序~1

<211>715

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

atgtttcccc atcactcgag gagtctgggc agagactgga ctacaccgtg ggagaatctg     60

caaaggtgtt gctggaacag acatatttct agttgtatga ggtggcctgg acattactct    120

cgagctcctt acccatactt cagtagtagg catttttcac taaattggag accaccctgt    180

ttgtttgagt ctagaactca gttccagtac tgtaactgga gacctgacaa cctgagccag    240

acatctttga ttcatctctc tagttacgtc atgaacgctg agggagatga gccttcatca    300

aaacgaagaa aacaccaagg tgtgataaag cggaattggg aatatatatg tagccatgat    360

aaagaaaaaa cgaagatcct aggagacaaa aatgttgatc ccaaatgtga agacagtgag    420

aacaagtttg acttttcagt gatgtcctat aatatacttt cacaagattt actggaagat    480

aactctcacc tttatagaca ttgccggcgg ccagtattac actggagttt taggtttccc    540

aatattctga aagaaattaa acattttgat gcagacgtac tttgtttgca agaagttcaa    600

gaagatcatt atggagcaga gatcaggcca agtttggaat cactgggtac aatgcaactt    660

tttttttttt ttttttcttt tttgagacag ggtctcactc tgtcgcccaa ctgga         715