用于获得菊苣属重组植物的方法以及用该方法获得的植物

摘要

本发明涉及用于获得菊苣属重组植物的方法，该植物适合于促成栽培并具有通过表达分别源于菊苣和苦苣的表型性状的组合而确定的表型。

说明书

本发明涉及用于获得菊苣属重组植物的方法，其中所述植物适合于促成栽培并具有通过分表达别源于菊苣(Cichorium intybus L)和苦苣(Cichorium endivia L)的表型性状的组合而确定的表型。

适合促成栽培的菊苣种植物也叫做莴苣菜(endives)，在整个欧洲和亚洲的温和地区广泛栽培。它是一种十分多枝的植物，坚硬的分枝相互间隔开。较低的叶通常是全裂的，裂片或节片排列在两边，间隔开且通常倒生，有一个末端裂片；上部的叶是全缘的，其基部环绕着茎干，较高处的叶简化为相对小的苞叶。根薄壁组织细胞从一些物质中产生多糖(淀粉、菊粉等)，其中所述物质源于合成它们的绿色器官。在生长期间，随着多糖在其中聚积，根的薄壁组织增生而导致不断向外膨胀，以致形成块茎状根(tuberous root)。

菊苣种以及更具体地该种的一些品种如Witloof品种产生块茎状根的能力使这类植物适合在黑暗中通过“促成”栽培。21天的促成栽培包括将莴苣菜在装有营养液的盆中培养，该营养液处于约18℃至21℃的温度，同时空气温度比营养液温度低1℃到3℃。通过在黑暗中促成培育莴苣菜以便使得叶萎蔫以产生叶的外缘仅有轻微黄色的基本上是白色的成熟植物。

莴苣菜生产者正在寻找新的产品以便使他们的产品多样化以及使他们能向最终消费者提供多种莴苣菜。

传统上通过大规模地在堆满盆的室内促成生产莴苣菜，其中盆内置有浸没在营养液中的莴苣菜根，处于黑暗条件、在溶液和室温条件下，并处于精确控制的湿度测定条件下进行。因此，莴苣菜的促成栽培在设备和劳力上都需要重大的经济投资来完成播种、根收获以及在培养室内促成的多个分别的步骤以便大规模地生产莴苣菜。

通过促成栽培莴苣菜的目的在于生产用于销售的菊苣。菊苣基本上由在黑暗中萎蔫、源于根颈的叶组成。促成培养周期处于高度精确的且计划了的培养条件、周期以及进度表的控制下以便优化生产成本。

为了给消费者提供新颖而多样的能以合理价钱销售的源于莴苣菜的植物，要求新颖的植物应适于目前传统上用于莴苣菜的生产条件。实际上，特定地适用于菊苣种新植物生产的新工业投资将不能与市场在经济上达到一致。因而，任何想通过促成生产的新品种应该能够整合进已开发的莴苣菜生产体系。

据申请人所知，在现有技术中从来没有描述过任何这样的在具有块茎状根的菊苣与苦苣之间进行重组的方法，其中所述的方法可用于商业实用性植物的生产并且该植物具有由每个初始亲本品系的遗传特征表达的表型特征的组合。

菊苣和苦苣的F1代种间杂种已经在现有技术有描述，尤其可注意到由Charles RICK在1953年实现的杂交(1953年，Proceedings of theAmerican Society for Horticultural Science，61卷，459-466页)，CharlesRICK已经描述在这两个物种之间在田间的杂交事件。RICK也描述了在田间通过F1代植物的自体受精生产获得F2代植物。RICK观察到F2代植物表达的表型特征特别是关于它们的壮实性有很大的可变性。上面所提到的作者从中推断，因为它们相当大地减少了致育性和壮实水平，分别源于菊苣及莴苣菜的基因的许多组合不是“协调的”。据RICK所说，在菊苣和苦苣之间有几乎不能逾越的基因障碍，虽然在这两物种之间能例外地观察到一些基因交换(见Rick中的464页，1953年)。RICK也观察到菊苣和苦苣两者基因组的不同，从而它们在通过自体受精的后代中产生了不完全的减数分裂和不育。

第16世纪在意大利通过偶然杂交(Annemieke M Kiers：Endive，Chicory and their wild relatives，Gorteria Supplément 5，2000年7月)，“Castel Franco”型F1代杂种植物长期以来已经被视为在那些物种之间基因交换的唯一实例。最近的分子研究(Kiers，2000年)显示两物种并不是相关的，而且Castel Franco型与菊苣相关。

在现有技术也已经描述了将菊苣和苦苣的F1代杂种随后通过克隆专门在体外繁殖，特别是用于胚胎发育研究的目的(Blervaq A.S.等，1995年，Protoplasma，186卷：163-168页)。也已经公开了菊苣和苦苣的F1代杂种植物具有对芜菁花叶病毒(TuMV)有抗性的表型特征，该特征可能是通过源于菊苣的TuMV抗性基因的显性而获得的(Providenti等，1979年，J.Amer.Soc.Hort.Sci，104(6)卷：726-728页)。

根据申请者所知，从前述分析可以了解至今都未曾公开促成培养的源于菊苣和苦苣之间基因重组的菊苣。本领域的那些熟练技术人员甚至对在那些物种两者之间成功获得重组植物并更特别地获得易于由中间产品组成以为了选择有块茎状根、适合促成培养和具有使得它们能作为蔬菜植物进行工业栽培的壮实性和致育性的技术特征的重组植物有技术偏见。

至今尚未公开任何用于获得来自这些种之间杂交的重组菊苣属植物的方法，而本发明公开的方法步骤可达到此目的。

本发明提供了这种获得有块茎状根并适合促成培养的菊苣和苦苣之间的重组植物的方法。

更特别地，申请者已试图研发一种用于获得这种菊苣种重组植物的方法，该方法包括杂交育种和田间栽培步骤及体外培养和体外克隆步骤。特别地，对实现本发明方法必要的培养和体外克隆步骤使得能克服第一代重组植物由于细菌和真菌病原体大规模感染而遭遇的许多技术问题。

因此，本发明的一个目的是获得有块茎状根的菊苣属重组植物的方法，该方法特征在于其包括以下步骤：

a)在一批有块茎状根的多个菊苣种的雌株和一批多个苦苣种的雄株之间实施杂交育种并获得由所述杂交育种产生的F1代杂种植物群；

b)对由步骤a)产生的F1代杂种植物实施自体受精并获得源于所述杂交育种的F2代重组植物；

c)选择芽或根无任何由病毒、细菌或真菌特别是由胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、核盘菌(Sclerotinia Sclerotiorum)或甚至由隐地疫霉(Phytophtora cryptogea)感染引起的明显变化的F2代重组植物。

d)在以下促成条件下促成培养于步骤c)中选择的F2代重组植物10-18天：

-营养液温度：15℃至17℃；

-室温：15至17℃；

e)克隆在步骤d)末期获得的F2代植物并获得再生芽；

f)移植再生芽至合适的培养基直至获得重组幼株。

在该方法的步骤a)中，在一批有块茎状根并适合促成培养的多个菊苣种雌株和一批多个苦苣种雄株之间实施“人工”杂交育种。

菊苣种的任何品种都能用于在该方法的步骤a)。

特别地，本领域的那些技术人员能方便地利用适合水培促成的称为《VIDENA》的菊苣品种。VIDENA品种可从Collection Nationale duGroupe d’Etudes et de contrle des Variétés Et des Semences(GEVES，Domaine de la Boisselière，49250，Brion，France)在参考《Ref 500》及在获取号n°925下公开获得。

该方法的步骤a)中，可使用苦苣的任何品种。然而，本领域那些技术人员能有利地使用《Grosse Pommant Seule》品系，该品系从the CollectionNationale du GEVES(Brion，法国)在参考《Ref 13746》和获取号n°693下公开获得。

在步骤a)末期，获得由上文描述的种间杂交育种产生的一批F1代杂种植物。

本方法的步骤b)中，通过步骤a)中获得的F1代杂种植物自体受精完成杂交育种。

自体受精有利地按常规在封闭的场地并存在昆虫如两翼昆虫时进行，随后自体受精通过所述昆虫将取自F1代杂种植物的花的雄配子传播至邻近的F1代杂种植物的雌性生殖器而得以进行，由此雌性生殖器接触到雄配子。本领域的那些技术人员能有利地使用如Hayes等(Methods of plantbreeding，Mc Grow-Hill Book公司，1955年，第5章，80-93页)描述的用于洋葱的常规自体受精技术，这种技术能直接应用于菊苣种植物的自体受精。

获得由F1代杂种植物自体受精产生的F2代种子。

在本方法的步骤b)的末期，从上述的F2代种子获得F2代重组植物。

在步骤b)的末期，申请者观察到：许多的F2代重组植物很快有缺陷并死亡。发现许多的其它F2代植物对多种细菌或真菌病原体特别是对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)和对核盘菌(SclerotiniaSclerotiorum)及隐地疫霉(Phytophtora cryptogea)真菌非常敏感。

确实，在该方法步骤b)末期获得的F2代植物掘根显示苦苣的根和源于种间杂交育种的材料都比菊苣的根对核盘菌更敏感。菊苣的根接下来遭受邻近有病的植物污染。

因此，该方法步骤c)由选择在步骤b)末期获得的其芽或根没有显示出任何肉眼能看到的由病毒、细菌或真菌感染特别地由胡萝卜软腐欧文氏菌、核盘菌或甚至是由隐地疫霉感染引起的改变的F2代重组植物组成。

在步骤d)中，将在步骤c)中选择的F2代重组植物的根在经特别改变的非经典条件下通过促成培养以便在促成步骤d)末期获得完全没有任何细菌或真菌感染的小的F2代重组植物。

促成培养步骤d)中的特定条件在于结合了持续时间和温度的技术特性。

在规定的温度条件下，申请者观察到促成步骤d)能实施周期为10-18天的促成，这一周期使得能获得充分发育的幼株以用于在下一步骤e)中克隆而保持基本上没有任何由病原体更特别是由细菌或真菌感染引起的肉眼可见的改变。当促成步骤d)的持续时间为11-17天时获得最好的结果，甚至促成周期为12-16天时获得更有利的结果。为了获得没有任何由细菌或真菌感染引起的重大变化的重组幼株的最适宜生长条件，促成步骤的持续时间优选为13-15天并且最优选地是14天，而不是常规的21天促成周期。

用维持在15℃至17℃，优选15.5℃至16.5℃的温度，最适宜的温度是16℃而不是用于常规促成培养的温度18℃至21℃的促成营养液完成促成步骤d)。同时，室温即环境温度与营养液保持的温度即15℃至17℃相同，有利地是15.5℃至16.5℃并且最优选地为16℃。

令人惊讶地是，用于促成培养步骤d)的短的持续时间和特别低的温度使得能获得具有满意卫生质量特性的幼株以便随后在体外克隆该幼株。

促成步骤d)的其它条件特别是营养液成分是经典的。这些特别是由Leteinturier等(L’endive-Guide Pratique.édition du CTIFL，1991年9月，71页)描述。

优选地，根据本发明的方法，在步骤c)选择F2代杂种植物后，在促成步骤d)之前进行步骤c1)，该步骤中将在步骤c)选择的根通过浸没在含有抗细菌剂和抗真菌剂混合物的消毒液中进行处理。有利地，那些本领域技术人员使用腐霉利(procymidon)(液态Sumisclex，SOPRA公司出售)，特别是以60g/hL的终浓度用于抑制核盘菌生长，以及对于mancozebe(Dithane DG，ROHM&HAAS公司出售)，特别是以400g/hl的浓度，用以抑制疫霉的生长。

在上文促成培养步骤d)之后，因而获得的幼小菊苣有利地在随后的克隆步骤e)之前基于在非常多样且几乎不均质的F2代重组植物种群中的表型特征的表达标准而进行选择。

因此，在促成步骤d)末期获得的F2代幼株群是非常异质的。该F2代重组群包含具有非常多样的表型特征的幼株，一些幼株具有的表型特征使它们与亲本品系菊苣更相关，一些幼株具有的表型特征使它们与亲本品系苦苣更相关。

然而，所有选择后接受促成培养步骤d)的F2代重组幼株均具有块茎状根，使得它们适合促成培养，这是本发明要达到的目的。拥有块茎状根的重组特征最初由亲本品系菊苣的基因组提供。所有选择的F2代重组幼株也均具有锯齿状叶。拥有锯齿状叶的重组特征最初由亲本品系苦苣的基因组提供。根据本发明方法获得的所有经选择F2代重组植物具有的这种表型特征的组合一般而言使得能定义在该方法步骤f)末期获得的重组植物和在本说明书后面描述的本发明的额外步骤如步骤g)-j)而能够获得的重组植物。

早至根据本发明方法步骤b)末期获得的F2代植物是重组植物，即在源于菊苣的DNA和源于苦苣的DNA之间的多个重组事件后，具有与两亲本植物各自倍性相同倍性的重组基因组的植物。根据本发明的F2代植物的重组基因组因此表达表型特征的组合，一些表型特征原来是在菊苣中存在的，并且一些表型特征原来是在苦苣中存在的。

因此根据本发明方法，促成步骤d)后紧随着步骤d1)，其中将得到的幼小菊苣根据下列三种表型类型在克隆步骤e)之前得以选择：

(i)    PPI：板状根颈上有许多窄叶；

(ii)   GPI：表型与莴苣菜相似，但有窄且锯齿状的叶；并且

(iii)  TFR和SCA：有很多锯齿的分支叶。

上面描述的表型类型(iii)的所有F2代重组植物具有次于叶主轴的轴，这在图1的总图中有图解，这是在菊苣上从未观察到的特征。在一些莴苣菜基因型中，例如莴苣菜“Barbe de Capucin”(野生菊苣)，可以观察到冠檐(limb)的边缘能出现浅锯齿，即它的(i)锯齿深度与(ii)锯齿尖和叶轴之间长度这两者之间的比率不超过0.25(见图1)，而该比率在根据本发明的F2代重组植物中相当地高。同时，在莴苣菜基因型如Barbe deCapucin中，锯齿只存在于上面的第三叶。

在根据本发明方法的步骤d)末期以可再生的方式获得的F2代重组植物的三种类型进一步在下面描述，该描述涉及测定使得能定义它们的几种表型特征，这在图1中描述，并且分别是以下特征：

-主轴(1)和叶的二级轴(secondary axis)(2)；

-叶基(leaf basis)的宽度(3)；

-叶的高度(4)；

-锯齿深度(5)和锯齿尖到叶轴之间的长度(6)

-存在二级锯齿列(7)。

PPI重组植物类型的描述：

-在促成完成时每根有100多片叶(重组特征源于苦苣)，而传统莴苣菜的最大量为20-35。

-无二级轴；

-每片叶的叶基非常窄：

叶基宽度/叶高度的比率为0.06-0.10，而传统莴苣菜的最小值为0.10；

-冠檐深的锯齿：

锯齿深度/锯齿尖到叶轴的长度的比率为0.60-0.85，相较于菊苣的一些基因型的比率为0-0.25。

-锯齿的边缘包含或不含二级锯齿列；

-叶脉颜色是白色或红色；

-冠檐(limb)的颜色是黄色或红色；

GPI重组植物类型的描述：

-对于传统的莴苣菜而言，在促成完成时每根获得20到35片叶；

-无二级轴；

-从冠檐直到叶基的深的锯齿：

锯齿深度/锯齿尖到叶轴的长度的比率为0.60-0.85，相较于菊苣的一些基因型的比率为0-0.25。

-锯齿的边缘包含或不含二级锯齿列；

-叶脉颜色是白色或红色；

-冠檐的颜色是黄色或红色；

TFR和SCA重组植物类型的描述：

TFR产品类型的描述：

-对于传统的莴苣菜而言，在完成促成时每根获得20到35片叶；

-次于主轴的2到5个始于叶的基部部分(the basal halfofthe leaf)的轴；

-冠檐的深的锯齿：

锯齿深度/锯齿尖到叶轴的长度的比率为0.60-0.85；

-锯齿的边缘包含或不含二级锯齿；

-叶脉颜色是白色或红色；

-冠檐的颜色是黄色或红色；

SCA产品类型的描述：

该定义与TFR类型重组植物的定义相似。

锯齿浅并且锯齿列几乎不存在。

对于TFR，其主要特征是存在二级轴(该特征只在一些苦苣中出现而从未在菊苣中出现)。

F2代重组植物群和根据上文描述的三种表型类型(i)-(iii)而选择的F2代重组植物亚群在除那些上文提到的那些以外的表型特征的表达中都不是均质的。例如，F2代重组植物的亚群(i)-(iii)在它们本身之间依次包含广泛的表型种类，然而这可以理解为它们共同拥有作为将它们分为同一类的基础的表型特征。

而且，申请者观察到除了那些作为选择不同F2代植物的基础的表型特征外，其它表型特征的表达在贯穿连续世代即贯穿连续生殖周期(包括通过上面定义的(i)-(iii)亚群的自体受精)是不稳定的。

在本发明方法的步骤e)中，克隆F2代重组植物群或甚至上文定义的表型类型(i)-(iii)的亚群以便获得再生芽。

在促成培养和任意地表型选择后，F2代重组植物的表型选择和克隆按照常规进行，例如在适合再生芽的培养基如在“ER”培养基上，从来自在促成步骤d)末期获得的幼小菊苣的叶脉片段，任选地用事先于表型类型(i)-(iii)中选择的F2代植物的叶脉片段进行，例如，根据Margara描述的技术(Margara J，1989年，Bases de la multiplication végétative，INRA编著)进行选择和克隆。优选地，叶脉片段在培养前用次氯酸钙消毒以为了在合适的培养基中再生芽。

F2代重组植物的克隆步骤，任选地根据上面提到的(i)-(iii)表型类型选择它们后，考虑对由于细菌或真菌病原体对由促成产生的幼株的可能感染进行预防控制。确实，甚至如在上文中描述在促成步骤之前通过用包含抗细菌剂或抗真菌剂化合物的营养液处理根，该申请者能观察到在促成步骤d)末期获得的幼小菊苣对核盘菌感染相当敏感，

克隆步骤e)，更特别地当它包括于在培养基中培养之前对叶脉片段消毒以为了再生芽时，使得能相当地提高克隆的植物材料的卫生条件。

克隆步骤e)之后是在常规的芽移植(prick out)条件下将得到的再生芽在适合的培养基中的移植步骤，直到F2代杂交幼株得以获得、克隆并移植。移植步骤f)本身是常规的并且能通过本领域技术人员使用任何这类已知的技术如在以0.2mg/l终浓度的AIA浓缩的《M4》特定的培养基(Murashige T和Skoog F，1962年，Physiol Plant，15卷：473-497页)进行。

例如，本领域技术人员能有利地使用如本说明书实施例中描述的移植技术。

然后如在实施例中描述的那样，将在步骤f)末期获得的经克隆并移植的F2代重组幼株适应，随后使其生根并种于温室或田地。

形成本发明方法步骤f)的最终产品的经克隆并移植的F2代重组植物就它们的表型特征的表达而论包括根据表型类型(i)-(iii)中的表型特征最初选择的经克隆并移植的F2代重组植物的亚群，分别形成非常异质的群体，或三种非常异源的亚群。例如，根据本发明在实施例中详细说明的方法执行的具体说明，经克隆并移植的F2代重组植物、本发明方法步骤f)的最终产品如下组成：

-十种在板状根颈上共同具有非常多而窄的叶的(i)PPI亚类的F2代重组植物，但之间通过许多其它表型特征区别；

-八种共同具有类似于有窄且锯齿状叶的莴苣菜的表型的(ii)GPI表型亚类的F2代重组植物，但之间通过许多其它表型特征区别。

-四种共同具有分支叶的属于(iii)SCA表型亚类的F2代重组植物，但之间通过许多其它表型特征区别。

-三种共同具有锯齿非常多的有分支叶，但之间通过许多其它表型特征区别的(iii)TFR表型亚类的F2代重组植物；并且申请人发现，来自根据本发明方法在步骤f)末期获得的25种F2代重组植物中，只有19种在自体受精后生产种子，也就是说在该方法步骤f)末期获得的19种F2代重组植物中只有6种是高度自交不育的。

用于获得菊苣种杂种植物的方法，根据本发明该方法特征在于它进一步包括另外的下列步骤：

g)地面培养在步骤f)末期获得的幼小重组植物；

h)将在步骤g)末期获得的F2代重组植物自体受精并且通过在地面培养获得F3代重组植物。

F3代重组植物群通过它们共同产生块茎状根的能力即发育适合促成培养的根从表型观点而得以表征。

有利地，将在上述步骤h)获得的F3代重组植物接受促成步骤(i)，如果可能，在与本方法步骤d)中执行的那些促成条件相同的促成条件，即营养液温度为15℃至17℃，进行为期10-18天的促成步骤i)，营养液和室温优选地为相同。

有利地，在上面提到的促成步骤i)之后是F3代重组幼小菊苣的克隆步骤j)，所述的克隆步骤无差别地用由促成培养产生的F3代重组幼株的叶脉片段或终芽(end bud)进行。

根据第一有利地可供选择的方法，克隆步骤j)包括在促成步骤(i)末期获得的幼株的叶脉片段的克隆步骤，接下来是F4代重组幼株的再生步骤。

根据第二有利地可供选择的方法，克隆步骤j)包括在促成步骤(i)末期获得的幼株的终芽的克隆和F4代重组幼株的再生的步骤。

至于本方法步骤d)和e)，上面描述的步骤i)和j)考虑控制植物材料的卫生条件：促成步骤的持续时间和温度的技术特性的结合和用于克隆的植物材料的灭菌，如用次氯酸钙以重量为2.5％的终浓度灭菌的可能性具有限制、甚至完全抑制细菌或真菌对所述重组植物材料可能的感染作用。

优选地，根据完成上述克隆步骤.j)的第一模式，通过在如实施例中描述的“NF”特定培养基中培养幼株叶脉片段产生F4代重组幼株。

优选地，根据上述克隆步骤j)的一个实施方案，在本方法步骤k)中再生F4代重组幼株，其如实施例中的描述通过在M4特定培养基中培养终芽进行。

虽然保持高度的表型多样性，在上面提到的步骤j)末期获得的F4代重组植物有极好的卫生质量。更优选地，它们不受核盘菌、疫霉菌或胡萝卜软腐欧文氏菌的感染。

在每一F4代重组植物的表型亚类中存在本说明书中定义的不同表型亚类(i)-(iv)。

根据本发明已经显示F4代重组植物能够在与常规上用于Witloof型菊苣的那些促成培养条件相同的促成培养条件下很容易地通过促成进行培养。本发明方法的效果因此显示为获得了具有块茎根(tuberized roots)并适于促成培养的重组菊苣属植物，从而产生的最终植物材料拥有原始植物至今未知的表型，具体而言，最终植物材料具有以下植物表型：

-有深锯齿叶的菊苣，该菊苣看上去不像莴苣菜也不像卷叶莴苣菜。

-具有与莴苣菜的块茎状根一样的块茎根，这种块茎根因而使得能满足莴苣菜(菊苣)生产者常规使用的生产和促成方法。

而且，也考虑了通过常规的自体受精确定F4代重组植物的表型特征，上述的F4代重组植物根据本发明方法通过本方法完成时获得的每一种F4代植物的几个连续再生周期获得，这着眼于获得能稳定表达由基因型或基因型组合产生的特征的组合的重组植物品系，所述特征是均质表达的，以便赋予源于Fn代重组植物(其中n表示一个至少等于6的整数)的一些重组植物稳定且均质的植物品系特征。

本发明的另一目的包括使用如本说明书中上文所述的方法获得的重组植物，所述的重组植物其特征在于它们由来自多个有块茎状根的菊苣种的雌株和来自多个苦苣种的雄株之间最初杂交育种产生，并且在于它们有4种下面表型类型中的一种：

(i)PPI：板状根颈上有许多窄叶；

(ii)GPI：表型与莴苣菜相似，但有窄的锯齿状叶；或

(iii)TFR和SCA：非常多锯齿的分支叶。

根据本发明的重组植物包括，更特别地是：

1)在本方法步骤f)末获得的F2代重组植物；

2)在本方法步骤h)末获得的F3代重组植物；

3)在步骤i)末获得的F3代重组植物；

4)在本方法步骤f)末获得的F4代重组植物；

通过下面的图表和实施例进一步阐述本发明。

附图：

图1表示根据本发明的菊苣种重组植物萎蔫叶(wilted leaf)的理论图示。这种理论图示说明不同表型特征，所述特征使得能定义本发明重组植物或它的一种亚型。

图2是PPI表型亚类的板状根颈上有许多窄叶的F4代重组植物的照片。

图3是有SCA表型亚类具有分支叶的F4代重组植物的照片。

图4是具有代表TFR表型亚类的有很多锯齿的分支叶的F4代重组植物的照片。

图5是表型与具有代表GPI表型亚类的窄锯齿状叶的莴苣菜相似的F4代重组植物的照片。

图6是显示根据本发明的4种F4代GPI型菊苣种重组植物(垂直地排列，在附图的上部)和菊苣种植物也叫莴苣菜(水平地排列，在附图的下部)之间的比较的照片。

图7是详细显示根据本发明的F4代GPI型菊苣种重组植物的叶的锯齿的照片。

图8是阐明适合促成培养的根据本发明的F4代GPI型菊苣种重组植物的照片。

实施例

实施例1：根据本发明方法的步骤a)-f)获得F2代植物

A.材料和方法

A.1.培养基

在实施例中使用的《NF》和《M4》培养基的定性和定量组分在以下表I和表II中分别给出。

      表I：《NF》培养基

  NF(1升)  MS常量元素(×10)  100ml  MS微量元素(×1000)  1ml  Gamborg维生素(×1000)^*  1m1  NaFeEDTA(×100)  10ml  酪蛋白水解物  1g  蔗糖  40g  肌醇  50mg  BAP(溶于NaOH 1N)  0.2mg  pH＝5.6  琼脂  10g

^*无肌醇的Gamborg维生素

    表II：《M4》培养基

  M4(1升)  MS常量元素(×10)  100ml  MS微量元素(×1000)  1ml  MS维生素(×1000)^*  1ml  NaFeEDTA(×100)  10ml  蔗糖  30g  肌醇  100mg  AIA(溶解于95°纯醇)  0.2mg  pH＝5.6  琼脂  8g

^*无肌醇的MS维生素

A.2.用菊苣叶脉的体外克隆重组幼株的方法。

1)采样

-选择内部的菊苣叶；

-获取叶脉；

-将得到的叶置于无菌器皿中；

2)消毒

用终浓度为2.5％的次氯酸钙溶液+几滴Tween溶液进行10分钟的消毒步骤。随后，在层流净化罩下用无菌水进行三次连续的漂洗步骤。

3)培养-再生

-将叶脉置于无菌吸水纸上；

-切取约1cm²表面积的叶脉片段；

-于合适的玻璃管中在NF培养基上培养；

-将管置于培养室中，处于下列的温度和亮度：

-等效于白天光照16小时的亮度，温度为25℃；

-夜间时间为16小时的黑暗条件，温度为20℃。

4)生根

于NF培养基上培养约3周后，一旦再生的芽发育完全后，将芽分开并将每个幼株移植至管中的M4培养基上以使它们生根。

-将管置于培养室中，处于下列的温度和亮度条件下：

-等效于白天光照16小时的亮度，温度为25℃；

-夜间时间为16小时的黑暗条件，温度为20℃。

5)适应

一旦长出根，将幼植株于直径为4cm的蜂窝板的堆肥(在袋中)在湿润环境且温度为20℃进行适应。

B.用于获得根据本发明的菊苣种的F2代重组植物的方法。

在温室中将菊苣《1089》品系与苦苣《Grosse pommant seule》品系人工杂交育种以便获得F1杂种。

将30株F1代植物播种并种植直到3叶阶段，随后于5℃进行8周的春化阶段以便获得结果能力。

b)在两翼昆虫存在时结果实并自体受精(在热的温室内)以获得F2代种子。

c)在田间播种20,000粒F2代种子。

然后掘根除去可见的病害或非正常植物(不定芽、根破裂...)

处理10,000个经选择的根(60g/hl腐霉利和400g/hl Mancozebe)

在促成之前将根储存于0℃冰箱中。

d)16℃下进行短的14天促成。

该促成完成时，系统几乎全部都受到污染。

因此，不可能在它们的根上获得能生存的植物。

e)观察叶部分后，基于4种不同的类型选择了25种植物：

PPI：选择10个

SCA：选择4个

TFR：选择3个

GPI：选择8个

为了再生这些经选择植物，用次氯酸钙将萎蔫的叶脉片段(1cm²)消毒并在NF培养基上体外培养。每个经选择的植物培养24个片段。

f)三周后，在将感染的片段除去后，将再生的芽移植到M4培养基上生根。

该步骤之后在20℃下在湿润环境进行适应步骤。

实施例2：根据本发明方法的步骤g)和h)获得根据本发明的F3代植物

除非另外说明，材料和方法是在实施例1中描述的那些。

g)于5℃下进行8周的春化作用后，将植物在热的温室栽培。

植物在4月分别地开花，植物在布质套筒下以为了将两翼昆虫置于其中，并完成自体受精。

总共，选择的19种植物得到F3代种子。其它植物是不育的。

在步骤h)获得的F3代重组植物的处理和适应

F3代的播种是在田间进行。

1)当观察植物在田间生长时，发现TFR类型十分有缺陷(叶干...)。所选择的SCA早在田间阶段显示出有核盘菌感染。

当一批根作为接种物时，又将进行简短的促成操作。

掘根。

处理所选择的根(60g/hl腐霉利和400g/hl Mancozebe)。

在促成之前将根储存于0℃冰箱中。

2)在十二月，于16℃在两周内再次将根进行促成。

3)极少的植物得以保留：

PPI：选择了1个

GPI：选择了2个

SCA：选择了3个

为了再生这些经选择的植物，用次氯酸钙将萎蔫的叶脉片段(1cm²)消毒并在NF培养基上体外培养。

每个选择的植物培养24个片段。

4)三周后，在将感染的片段除去后，将再生的芽移植到M4培养基上生根。

该步骤后进行适应步骤。

实施例3：根据本发明方法的步骤i)-i)获得本发明的F4代植物。

除非另外说明，材料和方法是在实施例1中描述的那些。

a)于5℃下进行8周的春化作用后，将植物在热的温室栽培。

植物在1997年4月分别地开花，并在布质套筒下以为了将两翼昆虫置于其中，并完成自体受精。

b)然后将F4代在田间播种。

在该F4阶段，得到的植物在田间没有表现出缺陷并且将收获的根按照常规的生产方案(19℃下3周)进行促成。难以处理的F2代和F3代阶段得以完成。

c)在促成培养期间，所选择的子代显示出好的可促成培养能力和好的表型特征，作为用于促成培养菊苣而使其多样化的起始点。