PPAR－α和PPAR－γ基因多态性检测芯片的制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种PPAR－α和PPAR－γ基因多态性检测芯片的制备方法和用途。在载体上设有如右所示探针。本发明的优点是：实现了对PPAR－α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR－γ基因pro12ala多态性进行检测，具有快速、简捷、高通量的特点，有助于肥胖、糖尿病等易感者的筛选，推动基因诊断和治疗的发展，具有重要的社会和经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一种PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片的制备方法和用途。

背景技术

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)由Isseman等在1990年研究小鼠肝脏cDNA文库时首先发现，是一类由配体激活的核转录因子，属于核受体超家族的成员。PPARs超家族有三个亚型：PPARα、PPARγ、PPARβ/δ，均由不同的基因编码。PPARs各亚型在不同组织的表达程度不一样，PPARα主要分布在代谢活性较高的组织中，如肝、肾、心脏、肌肉组织。PPARγ主要表达于脂肪组织及免疫系统，与胰岛素抵抗关系密切。

Yamakawa-Kobayashi K等研究发现PPARα的Val227Ala多态性与血脂水平有关，Ala227携带者的总胆固醇水平明显低于非Ala227携带者[1]。Kolehmainen等对30例肥胖者进行PPARgamma2基因Pro12Ala多态性分析发现Ala12等位基因频率是13.3％，各基因型间体重、脂肪厚度及空腹血清瘦素水平没有区别[2]。Gonzalez Sanchez JL发现肥胖男性Ala12等位基因频率(15％)明显高于非肥胖男性(8％)[3]。携带Pro12Ala突变的患者的瘦素水平(31.4ng/ml)比非突变者(17.5ng/ml)更高[4]。

用于SNPs做基因分析是特指检测人类基因组中大量存在的单核苷酸变异，这与疾病易感性和毒物易感性有关[5]。SNPs不仅是人类种族和个体差异的标记，亦是决定不同人群种族和个体差异的标记，可以成为寻找疾病相关基因，进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。用于SNPs检测的常规方法有等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交，限制性内切酶法(RFLP)，位点特异性引物PCR(PCR-SSP)和直接测序等。基因芯片技术的发展为新的SNPs的检测方法提供了可能性[6]。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。

1.Yamakawa-Kobayashi K，Ishiguro H，Arinami T，et al.A Val227Ala polymorphism inthe peroxisome proliferator activated receptor alpha(PPARalpha)gene isassociated with variations in serum lipid levels.J Med Genet.2002，39(3)：189-191.

2.Kolehmainen M，Uusitupa MI，Alhava E，Laakso M，Vidal H.Effect of the Pro12Alapolymorphism in the peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)gamma2 gene

3.on the expression of PPARgamma target genes in adipose tissue of massively obesesubjects.J Clin Endocrinol Metab.2003 Apr；88(4)：1717-1722.

4.Serrano Rios M，Fernandez Perez C，Laakso M，Martinez，Larrad MT.Effect of thePro12Ala polymorphism of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma-2gene on adiposity，insulin sensitivity and lipid profile in the Spanish population.Eur J Endocrinol.2002；147(4)：495-501.

5.Simon I，Vendrell J，Gutierrez C，Fernandez-Real JM，Vendrell I，Gallart L，FontovaR，Richart C.Pro12Ala substitution in the peroxisome proliferator-activatedreceptor-gamma is associated with increased leptin levels in women with type-2diabetes mellitus.Horm Res.2002；58(3)：143-149.

6.Khner M K，Beerli P，Yamato J，et al.Usefulness of single nucleatide polymorphismdata for estimating population parameters.Genetics，2000，156：439-447

7.Hirschlhorn J N，Sklar P，Lindblad-Toh K，et al.SBE-TAGS：an array-based method forefficient single-nucleotide polymorphism genotyping.Proc Natl Acad SciUSA，2000，97：12164-12169

发明内容

本发明的目的是提供一种PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片的制备方法和用途PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片：在载体上设有如下探针：

  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  CAA GTG CAT TTC TGT C  CAA GTG CGT TTC TGT C  CAA GTG CCT TTC TGT C  CAA GTG CTT TTC TGT C  CCG GGA CAT CCT CT  CCG GGG CAT CCT CT  CCG GGC CAT CCT CT  CCG GGT CAT CCT CT  CTA TTG ACA CAG AAA G  CTA TTG ACG CAG AAA G  CTA TTG ACC CAG AAA G  CTA TTG ACT CAG AAA G

PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片制备方法步骤为：

1)芯片载体的处理：玻片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24～26％氨水中过夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4～4.5，95％乙醇超声清洗，150～160℃烘干3～5小时，9～11％戊二醛处理成醛基化；

2)引物及探针的合成：针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性设计了一组探针，它的长度范围在14~16个碱基(表1)，针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性设计合成了3对引物，它的长度范围在21-22个碱基(表2)，每条引物中各有一条Cy3信号分子标记，合成后用浓氨水50～60℃脱保护，切割13～17小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用；

3)基因芯片制备及后处理：将探针稀释至终浓度为100μmol/L；与点样液(750mmol/LNACl，75mmol/L 乙酸钠，5％ glycerol，1％ Ficoll and 0.1％)1∶1稀释，并取10μL至96孔板，用芯片点样仪点至醛基化玻片上，每点体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化。

PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片用于检测PPAR-α和PPAR-γ基因多态性。

本发明将经过选择的探针点样于玻片上，分别与经PCR扩增的PPAR-α和PPAR-γ基因片段进行杂交，一次性获得各位点的多态性情况，从而实现对PPAR-α和PPAR-γ基因多态性进行快速、简捷、高通量检测和分型。有助于肥胖、糖尿病等易感者的筛选，可以作为疾病的预防、诊断和药物筛选的基础，推动基因诊断和治疗的发展。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA扩增序列的互补序列相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。基于寡核苷酸芯片的方法为分析SNP提供了一种高通量的技术，为SNP或基因突变提供了一个高通量的检测平台，可用来平行分析已知基因在不同疾病样本中的突变或SNP位点，以获得疾病易感基因的遗传学改变，并作为线索加强临床上早预防、早发现、早诊断和早治疗，具有重要的社会和经济效益。

具体实施方式

本发明玻片上固相化的探针为寡核苷酸探针(表1)，其序列根据PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性特征设计。

所说引物是针对PPAR-α和PPAR-γ基因多态性特征设计合成引物(表2)，用于上述基因的扩增。

信号分子标记是针对PPAR-α和PPAR-γ基因序列扩增的引物。信号分子标记是荧光分子。

表1：PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片的探针

  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α leu162val  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-α val227ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  PPAR-γ pro12ala  CAA GTG CAT TTC TGT C  CAA GTG CGT TTC TGT C  CAA GTG CCT TTC TGT C  CAA GTG CTT TTC TGT C  CCG GGA CAT CCT CT  CCG GGG CAT CCT CT  CCG GGC CAT CCT CT  CCG GGT CAT CCT CT  CTA TTG ACA CAG AAA G  CTA TTG ACG CAG AAA G  CTA TTG ACC CAG AAA G  CTA TTG ACT CAG AAA G

表2：PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片的引物

  基因  正向引物  反向引物(或荧光标记反向引物)  PPAR-α  PPAR-α  PPAR-γ  5’-CTC AAG CTG GTG TAT GAC AAGT-3’    5’-CTC TGG CCA AGA GAA TCT ACG-3’    5’-GGA TAT TGA ACA GTC TCT GCTC-3’  5’-CGA ACT GGG AAA ATG TGC AGG-3’    5’-GTT CCA TGT TGC CAA GAG AAC C-3’    5’-GTT TGC AGA CAG TGT ATC AGT G-3’

实施例1：核苷酸基因芯片的制备

1)芯片载体的处理：玻片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，25％氨水中过夜，水洗。玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.5，95％乙醇超声清洗，160℃烘干4小时，10％戊二醛处理成醛基化。

2)引物及探针的合成：针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计了一组探针(见表1)。针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计合成了6条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cy3荧光标记。合成后用浓氨水55℃脱保护，切割15小时，OPC柱纯化。紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用。

3)基因芯片制备及后处理：将探针稀释至终浓度为100μmol/L，与点样液(750mmol/LNACl，75mmol/L乙酸钠，5％ glycerol，1％ Ficoll and 0.1％ SDS)1∶1稀释，并取10μL至96孔板，用芯片点样仪(Cartisan)点至醛基化玻片上，每点体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化。

实施例2：核苷酸基因芯片的制备

1)芯片载体的处理：载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24％氨水中过夜，水洗。玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.0，95％乙醇超声清洗，150℃烘干4小时，9％戊二醛处理成醛基化。

2)引物及探针的合成：针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计了一组探针，(见表1)。针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计合成了6条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cy3荧光标记。合成后用浓氨水50℃脱保护，切割13小时，OPC柱纯化。紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用。

3)基因芯片制备及后处理：将探针稀释至终浓度为100μmol/L，与点样液(750mmol/LNACl，75mmol/L乙酸钠，5％ glycerol，1％ Ficoll and 0.1％ SDS)1∶1稀释，并取10μL至96孔板，用芯片点样仪(Cartisan)点至醛基化玻片上，每点体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化。

实施例3核苷酸基因芯片的制备

1)芯片载体的处理：玻片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，26％氨水中过夜，水洗。玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.2，95％乙醇超声清洗，155℃烘干5小时，11％戊二醛处理成醛基化。

2)引物及探针的合成：针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计了一组探针，(见表1)。针对PPAR-α基因leu162val、val227ala多态性和PPAR-γ基因pro12ala多态性位点设计合成了6条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cy3荧光标记。合成后用浓氨水60℃脱保护，切割17小时，OPC柱纯化。紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用。

3)基因芯片制备及后处理：将探针稀释至终浓度为100μmol/L，与点样液(750mmol/LNACl，75mmol/L 乙酸钠，5％ glycerol，1％ Ficoll and 0.1％ SDS)1∶1稀释，并取10μL至96孔板，用芯片点样仪(Cartisan)点至醛基化玻片上，每点体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化。

PPAR-α和PPAR-γ基因多态性的使用方法为：

1)载有寡核苷酸探针的玻片使用前用0.2％SDS和清水各洗两次，空气干燥后1％NaBH₄溶液还原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用，完成将探针共价固相化于玻片表面。

2)为产生单链的目标片段采用不对称PCR扩增的方法，正向引物与反向引物(或荧光标记反向引物)的比例优化为1∶10。20μL反应体系中含有1.5mM MgCl₂，dNTP各200μmol/L，正向引物0.1μmol，反向引物1μmol，DNA 50ng，1×PCR缓冲液和1U Taq酶。PCR扩增条件为：预变性94℃ 5min；变性94℃ 30sec，退火58℃ 30sec，延伸72℃ 30sec，共30循环；最后延伸72℃ 5min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。

3)Cy3标记的不对称PCR产物与杂交液(750mmol/L NACl，75mmol/L乙酸钠，0.1％SDS，1ug/ml鲑精DNA，2.5％甲酰铵)按2∶8混合，将10μL混合液转移至芯片的杂交区域。芯片置于杂交盒中在42℃水浴中保温1小时。杂交后取出芯片依次在洗液A(150mmol/L NACl，15mmol/L乙酸钠，0.2％SDS)，洗液B(30mmol/L NACl，3mmol/L乙酸钠)和洗液C(15mmol/L NACl，1.5mmol/L乙酸钠)中各洗涤1分钟。待干后芯片用激光共聚焦扫描仪GenePix4000(Axon Instrument)在激发波长532nm，发射波长570nm(Cy3)扫描，产生并分析精度为10μm的16位TIFF图象。

PPAR-α和PPAR-γ基因多态性检测芯片使用实例：

在浙江大学医学院附属第一医院接受体检180例成年人，根据脂肪肝的诊断标准，分成2组：(1)脂肪肝组117例，男77例，女40例，年龄47.97±13.46岁；(2)对照组63例，男32例，女31例，年龄55.13±10.92岁。同时测定身高、体重、臀围、腰围、腹壁脂肪厚度、体脂含量、血压。所有入选对象均签署知情同意书。试验对象进行空腹采血，部分血标本用于检测总蛋白、白蛋白、丙基氨酸转移酶、甘油三酯、高密度脂蛋白和血糖水平。部分血标本用Genomic DNA purification kit(Promega公司)提取基因组DNA，经PCR扩增后，PCR产物与制备好的寡核苷酸芯片杂交、洗涤与扫描，检测PPAR-α和PPAR-γ基因多态性。结果为：(1)PPAR-α基因162位核苷酸均为野生型，未发现PPAR-α基因leu162val突变。

(2)PPAR-α基因第227位核苷酸CC(Ala227)、CT(Val227Ala)和TT(Val227)基因型在63例正常人群中分别为为：1、12和50例，而在117例非酒精性脂肪性肝病患者中，CC(Ala227)、CT(Val227Ala)和TT(Val227)基因型分别为2、7和108例，两组之间等位基因C和T的分布频率具有显著性差别(P≤0.01)。(3)PPAR-γ基因第227位核苷酸pro12ala63例正常人群中CC(pro12)和GC(pro12ala)基因型分别为57例和6例，117例非酒精性脂肪性肝病患者CC(pro12)和GC(pro12ala)基因型分别为104例和13例。

PCR产物测序验证

PCR产物测序根据CEQ^TM TDCS试剂盒(BECKMAN COULTER _TM，USA)说明书操作，在CEQ^TM2000XL测序仪(BECKMAN COULTER_TM，USA)上进行。测序结果与寡核苷酸微阵列技术检测结果一致。