定量分析规定尺寸和大于规定尺寸分析物的生物传感器及其制备方法

摘要

本发明公开了一种定量分析生物材料的生物传感器及其制备方法。该生物传感器有一个纳米级的暴露传导区，此暴露传导区以期望的或随机的方式分布在绝缘金属基质上。本发明中，对蛋白的定量分析可用简化的工艺来进行，清除与待检测材料非特异性连接的信号产生材料这一步骤不是必需的。本发明所述的分析仪仅利用分子尺寸特点，因此可在分析生物材料中得到广泛应用。本发明可实现选择性分析和独立分析，分析时由其它材料造成的干扰被显著降低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量分析规定尺寸或大于规定尺寸材料的生物传感器及其制备方法。具体地，本发明涉及一种以期望的或随机的方式分布在绝缘金属基质上的纳米级结构，这个纳米级结构有一个暴露的传导区，传导区有确定的直径，还涉及用此纳米级结构定量分析生物材料的方法。

背景技术

通常，金属基质可通过各种与众所周知的半导体作用相关的技术在绝缘金属基质上形成具有微米级或更大面积的暴露传导区。但是，由于常规技术的局限性，纳米级的暴露传导区的形成会遇到很多障碍。人们尝试了很多方法来克服障碍。参见，例如，美国专利6,503,701、6,492,096、6,322,963、6,001,587和5,922,2146。

另一方面，单层的自装配分子(在下文中指一种“单层SAM”)可以描述为这样一种状态，即：一个含有巯基(-SH)或二硫键(-S-S)的有机化合物以单层的形式排列，这种排列是通过这种化合物的硫功能基团以共价键与金属电极相连来实现的，金属电极是由黄金或铂金或类似物制得的。例如：可通过如下步骤来形成单层SAM：制备自装配材料的水溶液，这种自装配材料可溶于水或各种有机溶剂，然后将此溶液与金属基质相连(将金属基质浸于溶液中或将溶液滴在金属基质上)，反应一段时间，清除没反应的试剂。这些单层SAM可用于修饰金属表面，如将疏水表面变为亲水表面，反之也可以。它们还可以充当生物材料和金属材料的连接剂。虽然有很多专利试图将SAM技术用于制作生物传感器，但目前尚无用SAM技术制备的商业化生物传感器的报道。

已报道的关于单层SAM的常规技术主要涉及以下几个方面：在传导金属材料如黄金或铂金或类似物上形成单层SAM的方法，将生物材料诸如蛋白和DNA与制备的SAM末端的功能基团相连，对与SAM单层相连的材料的描述。这些技术都已公开在例如美国专利4,964,972、5,652,059、5,686,549、5,725,788、5,827,417、5,922,214、6,031,756、6,114,099、6,127,127、6,156,393、6,183,815、6,270,946、6,287,874、6,312,809、6,322,979、6,346,387、6,432,723、6,436,699、6,444,318、6,444,321、6,492,096和6,114,099上。

可应用免疫反应来定量分析蛋白，其中典型的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)。在酶联免疫吸附试验中，与被分析蛋白特异性结合的一抗固定于底板上。然后将与一抗特异性结合的二抗固定于底板上。在二抗上连有一个标记物，此标记物有荧光或有放射性。因此，可以通过测定荧光信号或放射信号的强度来定量分析蛋白的浓度。

研究发现以上常规技术存在一些问题。典型地，常规技术需要有冲洗和清除步骤以去除非特异性吸附的酶或抗体，并需要单独的装置以检测由标记物发出的荧光或放射信号。这些缺陷导致了需要大型设备、分析时间长(如需数小时)以及设备费用增加(如增加了数万美元)等问题。这使得适用于小型医院或非专业人员的便携式分析仪的商业化受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用的可以分析各种生物分子的分析仪界面，，以及利用该界面定量分析生物分子的方法。

本发明的又一目的是提供一种用电化学法分析生物材料的系统，这个系统可用于生产便携式小型化的分析仪。

本发明的又一目的是克服现有技术的缺点和存在的问题，如省去清洗或清除步骤，缩短分析时间和提高操作的便利性。

本发明提供了一种用于定量分析规定尺寸或大于规定尺寸材料的生物传感器。这种生物传感器包括了一个电极层，大量的第一种单层分子形成在电极层上，其中第一种单层分子的直径要小于待分析的材料并具备电化学传导性；第二种单层分子形成在电极层上除第一种单层分子以外的区域，其中第二种单层分子具备电化学绝缘性。第一种单层分子形成了一个暴露的传导区，而第二种单层分子形成了一个绝缘区。这种生物传感器还包括一个信号介质，信号介质的大小要能够满足扩散至由第一种单层分子形成的暴露传导区的需要，其中信号介质由一种能与待测材料特异性结合的材料和另一种能产生电化学信号的材料组成。

优选地，由第一种单层分子形成的暴露传导区有恒定的直径或面积。而且，此暴露传导区由纳米级直径的自装配单层分子组成。在这里，纳米级指0.1-10纳米。第一种单层分子由包含巯基或二硫键的有机化合物组成，优选地，第一种单层分子由选自3-巯基丙酸、半胱胺和胱胺中的任一种组成。第二种单层分子也包含了自装配单层分子，由1-巯基癸烷系列化合物中的一种组成。电极层可以由黄金或白金组成。

本发明还提供了一种用于定量分析规定尺寸或大于规定尺寸材料的生物传感器的制备方法。此方法包括以下步骤：在电极基质上形成第一种自装配单层分子，其中自装配单层分子有一个与一部分分子的末端相连的功能基团，此功能基团能与巨大分子特异性连接，而巨大分子能决定待检测材料的尺寸。提供巨大分子，将巨大分子与功能基团连接，用第二种单层分子取代第一种单层分子，取代区不包括被巨大分子封闭的区域，其中第二种单层分子有电化学绝缘性，然后清除巨大分子。

根据本发明，我们可用简化的工艺来定量分析蛋白，清除与待检测材料非特异性连接的信号产生材料这一步骤不是必需的。本发明提供了一种通用的分析仪，此分析仪仅利用分子尺寸特点，因此在被检材料上没有限制。本发明可实现选择性分析和独立分析，分析时由其它材料造成的干扰被显著降低。

附图说明

下面对附图的详细描述将帮助我们进一步理解本发明的目的和优点：

图1根据本发明的一个实施方案，描述了混合自装配单层分子的形成步骤；

图2根据本发明的一个实施方案，描述了将抗生物素蛋白与脱硫生物素连接来测定暴露传导区的面积的步骤；

图3根据本发明的一个实施方案，显示了通过取代自装配单层分子来形成绝缘层的步骤；

图4根据本发明的一个实施方案，描述了运用生物素来清除抗生物素蛋白的步骤；

图5显示了运用本发明所述的生物传感器来定量分析糖化血红蛋白(HbAlc)的工艺和原理。

本发明的最佳实施方式

参考附图，下面详细描述本发明的实施方案。不同附图中的相同数字用来代表类似的或相同的组分。

根据本发明的一个实施方案，图1描述了混合自装配单层分子的形成步骤。在本说明书中，自装配单层分子指“单层SAM”或“SAM单层”。SAM单层由第一个巯基分子1和第二个巯基分子2的杂交分子组成。第一个巯基分子1能共价结合固定尺寸的蛋白分子，而此蛋白分子能确定暴露的传导区的面积。第二个巯基分子2有一个短的碳链，能防止蛋白的非特异性吸附，同时还能维持足够的电化学传导性。如图1a所示，制备含有不同化学性质的自装配分子的溶液，将金属基质3(也称之为“电极层”)浸入溶液。任选地，溶液可以滴在金属基质3上。反应一段时间后，如图1b所示，巯基分子的硫原子会与如金属基质的金原子共价结合，从而形成混合SAM单分子层5。

尽管很多材料都可以用于制造金属基质3，只要其能够形成SAM单分子层，但对本发明的电化学生物传感界面而言，用黄金或白金更好，因为它们具备良好的电化学性质。选用黄金更好一些，因为黄金的成本相对较低，处理过程简单，对塑料材料有很好的支持性，并且传导性高。

根据本发明，绝大多数含有巯基(-SH)或二硫键(-S-S)的有机化合物都可以用作形成混合SAM的分子。优选地，化合物的碳链长度要短，这样能够进行电化学氧化，从而减少还原反应的发生。例如，具备以上特性的材料包括了3-巯基丙酸、半胱胺、胱胺和类似物，半胱胺或胱胺是尤其优选地，它们的碳链只有两个碳原子。

本发明的特征之一是第一个巯基分子1能特异性的与一个巨大分子共价结合，此巨大分子有固定的尺寸，并能决定暴露传导区的面积。根据本发明的一个实施方案，第一个巯基分子1可以由第二个巯基分子2人工的共价结合分子4(在下文中指“功能基团”或“脱硫-生物素”)来生成，而分子4能特异性结合固定尺寸的巨大分子。优选地，将商品化的或预制成的分子4经纯化后，与第二个巯基分子2混合以制备如上所述的第一个巯基分子1。巨大分子用于确定暴露传导区的面积，且与其特异性键合的材料4可选自大量的连接对，只要选取的连接对能够反向连接。例如，反向连接对包括酶-抗体，抗生物素蛋白-生物素，或类似物。任何能以材料的静电力或吸引力的方式控制的连接对都可以使用。特定的，其中抗生物素蛋白-生物素有高的键能并可以反向连接。因此，抗生物素蛋白-生物素的例子将在下面参照图2进行阐述。

根据本发明的一个实施方案，图2显示了将抗生素蛋白与脱硫生物素连接以测定暴露传导区的面积的步骤。如图2a所示，巨大分子6被导入图1b中的电极层5，然后将巨大分子6与特殊功能基团4连接，功能基团4存在于SAM单层5的表面。巨大分子6可以溶液的形式导入到并在室温下保持一段时间，直至连接过程完成。如上所述，酶-抗体，抗生物素蛋白-生物素，或类似物都可作为材料4或6。本实施方案将以抗生物素蛋白-生物素作为连接对来描述，抗生物素蛋白-生物素可以反向连接。

抗生物素蛋白是一种有四个连接位点的蛋白，能以高键能与生物素特异性连接。但是，能对反向连接进行控制是本发明要求的特性之一，当用生物素做特殊功能基团4时，不容易反向控制抗生物素蛋白与生物素的连接。因此，在本实施方案中，键能较低的脱硫-生物素是更好的选择。脱硫-生物素是将生物素脱去一个硫原子得到的，因此它与抗生物素蛋白的特异性连接与生物素的方式是一样的，但是它连接的键能要稍弱于生物素。因此，脱硫-生物素与抗生物素蛋白的特异性连接能通过竞争性反应来反向控制，这是利用了生物素和脱硫-生物素的键能不同。根据以上描述的过程，制备了由SAM单层组成的混合界面7和巨大分子，如图2b所示。混合界面7用下面所述的方式被取代，参见图3。

根据本发明的一个实施方案，图3描述了通过取代SAM单层来形成绝缘区的步骤。绝缘区9用于绝缘除暴露的传导区以外的区域，暴露的传导区用图2的方式进行了封闭，因此能够选择性的检测信号，这取决于待检材料的尺寸。图3所示的过程可以通过取代反应的方式来进行。如前所述，取代反应可通过滴取代分子溶液的方式进行，并保持一段时间直至反应完成。在取代反应中，一种新的自装配分子8取代了混合界面7上除被巨大分子封闭的区域以外的区域的分子。完成反应后，清除未反应的分子和被取代的分子。优选地，用做绝缘自装配分子8的材料为那些有足够长度碳链可以阻止电流的分子。1-巯基癸烷系列化合物是更好的选择，它有长达十个碳原子的碳链。从而，根据如图3所示的工艺可以制备得到中间界面10。如图4，巨大分子6将根据如下所述从中间界面10中去除。

根据本发明的一个实施方案，图4描述了应用生物素来去除抗生物素蛋白的步骤。图3所示的中间界面10是完全绝缘的，没有任何允许电流通过的暴露传导区。因此，必须要有暴露传导区，以使本发明能包括一个电化学生物传感器界面。为了形成暴露传导区，可以应用竞争性反应。即：通过脱硫-生物素4与生物素11竞争性结合抗生物素蛋白6，将抗生物素蛋白6(巨大分子)从中间界面10中分离出来，这样就可以在抗生物素蛋白6被清除的位置形成暴露传导区。

类似的，竞争性反应可以通过如下方式来进行：将生物素溶液11与中间界面10接触，反应一段时间。因为生物素11与抗生物素蛋白6结合的键能要高于脱硫-生物素4与抗生物素蛋白6结合的键能，所以当生物素溶液11与中间界面10接触时，抗生物素蛋白6会被从中间界面10中清除。这样就可以制得如图4b所示的混合SAM界面12。混合SAM界面12包括了一个暴露传导区13，这是本发明的一个重要特征。暴露传导区13的宽度由巨大分子6如抗生物素蛋白来决定，这在本发明已阐明。

图5描述了用本发明所述的生物传感器来定量分析糖化血红蛋白(HbAlc)的工艺和原理。为了能应用混合SAM界面12来定量分析待测材料，还需要另外两种材料和界面12配合使用。其中一个是材料15(也称之为“连接材料”)，它能与待测材料特异性结合。另一种是材料16(也称之为“信号或电子传递材料”)，它能产生电化学或光信号。为阐述本发明，下面将描述对HbAlc 17的分析。

已知，HbAlc 17能与硼酸衍生物(可做连接材料15)连接。但是，已知的硼酸衍生物都不能产生本发明中需要的信号。因此，将一种电子传递介质16与硼酸衍生物15合成，以制得硼酸化合物14(也称之为“混合信号介质”)，硼酸化合物14能产生本发明所需要的电化学信号。这个合成工艺为本领域技术人员所熟知，这里不作阐述。为能在本发明中应用，混合信号介质14需要具备几个特性。例如，混合信号介质14的尺寸必须足够小，以便能轻松的扩散到暴露传导区；要能与待测材料有效结合；要能充当电化学氧化和还原反应的介质。

图5a显示的是没有结合任何待测材料的混合SAM界面12。如上所述，混合信号介质14有足够小的尺寸，能扩散到界面12上的暴露传导区13，能够向电极3如黄金电极导入或导出电子。因此，当待测材料没存在于界面12上时，产生的信号强度要高于待测材料存在于界面12上的情况。

图5b显示的是待测材料如HbAlc17存在时的混合SAM界面12。在这种情况下，混合信号介质14中的连接材料15与HbAlc17相连，混合信号介质14就不能像在单分子状态下那样自由的扩散。同时，因为待测材料HbAlc17的尺寸大于暴露传导区13，它不能到达电极基质3，也就不能在其中传递电子。因此，当待测材料存在于界面12上时，产生的信号强度要弱于待测材料没存在于界面12上的情况。因此，应用混合SAM界面12和本发明所述的分析原理可以实现对待测材料的定量分析。

工业适用性

如上所述，根据本发明，对蛋白的定量分析可用简化的工艺来进行，清除与待检测材料非特异性连接的信号产生材料这一步骤不是必需的。本发明提供了一种通用的分析仪，此分析仪仅利用分子尺寸特点，因此在被检材料上没有限制。本发明可实现选择性分析和隔离分析，分析时由其他材料造成的干扰被显著降低。

这些具体的实施方案仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围，本发明的保护范围由附上的权利要求书来限定。可以理解本领域的技术人员可以在不违背本发明的范围和精神的情况下改变或修饰本发明的实施方案。