银杏内生真菌代谢产物在防治植物真菌病害中的应用

摘要

本发明公开了银杏内生真菌代谢产物在防治植物真菌病害中的应用，属于微生物农药技术领域。该发明包括：银杏组织的准备、表面消毒与无菌检测，内生真菌的分离与培养，有效菌株的筛选、发酵及杀菌药物的制备等步骤。本发明首次将银杏内生真菌发酵代谢产物应用于植物真菌病害的防治，为农用杀菌剂的开发增添了一个新的途径。

说明书

                          技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，特别是涉及银杏内生真菌代谢产物在防治植物真菌病害中的应用。

                          背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)又名白果，是我国特有的世界珍稀名贵树种，是冰川运动遗留的孑遗植物，被称为活化石。属银杏科，是银杏属现存的唯一生存种。现为广泛栽培树种，具有极高的研究开发价值。银杏各组织含有抑菌物质，据报道，银杏根、茎、叶、果肉(外种皮)及果仁的提取物对供试植物病原菌有抑制作用。但植物资源量是限制植物源杀菌剂发展规模的主要因素之一。根据宿主植物与其内生微生物由于长期的共同生活而具有相同或相似的次生代谢产物合成途径的“内共生理论”，从银杏中分离筛选到产黄酮的内生真菌已有报道(王梅霞等，南京师大学报，2003，26(1))，这主要涉及医药方面的研究。但从银杏中分离筛选内生真菌，并将其代谢产物应用于防治植物真菌病害，这在国内外还未见有研究报道。

                          发明内容

本发明的目的是从银杏中分离筛选出代谢产物有抑菌作用的内生真菌，并将该菌发酵代谢产物应用于防治植物真菌病害。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现。

一种银杏内生真菌的分离筛选及其代谢产物在防治植物真菌病害中的应用，具体包括以下步骤：

(1)银杏组织的准备：采集银杏根、茎、叶、果肉、果仁；

(2)银杏组织的表面消毒与无菌检测；将步骤(1)银杏组织经表面消毒后，直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃～28℃恒温箱培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；

(3)银杏组织内生真菌的分离培养：将步骤(2)的无菌组织在无菌条件下切割成小片移植于PDA培养基上，置26℃～28℃恒温箱培养，至样品周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基，备用；

(4)内生真菌液体发酵培养基的配制：其各组分与每升所含的质量为蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麸皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黄豆饼粉1-9g、CaCO₃0.5-2.5g、NH₄NO₃0.1-1.2g、MgSO₄0.1-0.9g、KH₂PO₄0.1-0.9g；

(5)内生真菌发酵培养：将步骤(4)液体发酵培养基分装在三角瓶中，用接种钩挑取少许经步骤(3)分离纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置26℃～28℃摇床，200r/min，振荡培养4～5天，发酵液经5000r/min离心10min，取发酵上清液；

(6)有效菌株筛选：取步骤(5)各上清液与冷却至50℃的PDA培养基按毫升体积1∶9混匀于无菌培养皿内，凝固后在每个培养基平面放1个直径为4mm的供试菌饼，置28℃培养箱培养后，计算各菌株发酵液对供试病原菌的抑制率，从中筛选出高效抑制率的内生真菌菌株，备用；

(7)银杏内生真菌代谢产物在防治植物真菌病害中的应用：将步骤(6)筛选出的高效菌株，采用步骤(4)液体发酵培养基在发酵罐中发酵培养，以其上清液或发酵混合物，配以适量农用药物辅料，制备成多种剂型的农用药物。

所述的液体发酵培养基，其各组分与每升所含的质量为蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麸皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黄豆饼粉4g、CaCO₃1g、NH₄NO₃0.6g、MgSO₄0.1g、KH₂PO₄0.6g；

本发明步骤(2)和(3)所述培养基为PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)，其组分与含量为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L。

本发明步骤(6)所述供试菌饼的植物病原菌为番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)中的一种或一种以上(均系《病原植物真菌学》中描述的与农业植物病害关系密切的病原菌)。

本发明的有益效果，一是本发明根据“内共生理论”从银杏中筛选出其代谢产物与宿主植物提取物相同或相似的，对植物真菌病害病原菌具有抑制作用的内生真菌，这为实现由植物中提取杀菌活性物质到微生物发酵法生产杀菌活性物质的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法；二是本发明跟踪测定了分离到的各内生真菌菌株代谢产物对供试植物病原菌的抑制作用，从而获得有效菌株，为微生物农药的进一步研制和开发提供了一批出发菌株；三是本发明重视了对植物组织的前期无菌检测，并研制了银杏内生真菌适用的液体发酵培养基，提高了对内生真菌分离筛选的成功率与效率；四是本发明首次将银杏内生真菌发酵代谢产物应用于植物真菌病害的防治，效果与常规化学药剂相仿(见试验例)，为农用杀菌剂的开发增添了新的途径。

                        具体实施方式

下面结合实施例对本用途发明作进一步描述。

实施例1：

从浙江长兴银杏长廊采集银杏茎组织，按下列程序进行表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3次；表面消毒后的茎组织直接种植于PDA培养基平皿上，置28℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的茎组织；

将经无菌检测的茎(取韧皮部)组织，在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA培养基平板上，置28℃恒温箱培养；当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基备用；

将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养，其培养基各组分与每升所含的质量为：蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麸皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黄豆饼粉4g、CaCO₃1g、NH₄NO₃0.6g、MgSO₄0.1g、KH₂PO₄0.6g；

将500mL液体发酵培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于28℃摇床，200r/min，振荡培养4天；发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；

发酵液抑菌活性测定：取上述各菌株发酵上清液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置培养箱中28℃培养36h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率：

结果表明：编号为3、64、73、121、303、431、528、555、597、820、847、920、1012、1028菌株的代谢产物对黄瓜立枯病菌的抑制率分别为25％、36％、45％、26％、42％、47％、39％、41.5％、37.3％、54％、19.5％、59％、46％、68％。

实施例2：

取银杏叶，按下列程序表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3次；表面消毒后的叶片直接种植于PDA培养基平皿上，置27℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的组织；

将经无菌检测的叶片在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA平板上，置27℃恒温箱培养；当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基，备用；

将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养：液体发酵培养基其各组分与每升所含的质量为：蛋白胨5.5g、玉米粉1g、麸皮10g、葡萄糖8g、黄豆饼粉1g、CaCO₃0.5g、NH₄NO₃1.2g、MgSO₄0.4g、KH₂PO₄0.1g；将培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于27℃摇床，200r/min，振荡培养5天；发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；

发酵液抑菌活性测定：取上述各菌株发酵液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率，计算方法同实施例1。

结果表明：编号为256、383、604、618、918菌株的代谢产物对番茄早疫病菌的抑制率分别为56％、38％、67％、20％、42％。

实施例3：

取银杏果肉(外种皮)，按下列程序表面消毒：自来水冲洗，75％酒精漂洗5min，无菌水冲洗5次，再用升汞浸泡4分钟，无菌水冲洗3次；表面消毒后的果肉组织直接种植于PDA培养基平皿上，置26℃恒温箱内培养，从中选出表面无任何菌种生长的果实组织；

将经无菌检测的果肉在超净工作台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片，然后将小片种植于PDA平板上，置26℃恒温箱培养；当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经纯化后转接到PDA斜面培养基，备用。

将上述分离得的银杏内生真菌各菌株进行液体发酵培养：液体发酵培养基其各组分与每升所含的质量为：玉米粉8g、葡萄糖1g、可溶性淀粉10g、黄豆饼粉9g、CaCO₃2.5g、NH₄NO₃0.1g、MgSO₄0.9g、KH₂PO₄0.9g；

将500mL培养基分装在300mL的三角瓶中，每瓶装液量为50mL；用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于26℃摇床，200r/min，振荡培养5天；发酵液5000r/min离心10min，取上清液，弃菌丝体；

发酵液抑菌活性测定：取上述菌株发酵液1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养基平面放1个供试菌葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的菌饼(直径为4mm)，菌饼接于培养皿中央(培养皿直径为9cm)，置28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率，计算方法同实施例1；

结果表明：编号为78、207、305、391、634、1002菌株的代谢产物对葡萄炭疽病菌的抑制率分别为25.3％、61％、64.6％、43.4％、50.9％、61.3％。

实施例4-6为本发明所述菌株的代谢产物进行杀菌剂产品的研制和在防治农作物病害上应用效果的说明；

其中920菌株代谢产物为按实施例1的工艺和配方发酵4天所得上清液；

604菌株代谢产物为按实施例2的工艺和配方发酵5天所得上清液；305菌株代谢产物为按实施例3的工艺和配方发酵5天所得上清液；

实施例4：产品含2％的920菌种代谢产物，加入3％的白炭黑作为吸附剂，并加入1％的农乳0203-B和3％的木质素磺酸钠辅料，最后用轻质碳酸钙补足到100％，混匀后，经气流粉碎后制成可湿性粉剂(以下内容中称“产品A”)。

实施例5：产品含1.5％的604菌种代谢产物，用5％的甲醇溶解，并加入2％农乳601和0.5％十二烷基磺酸钠作为分散助剂，加入1％尿素作为防冻剂，最后用水补足到100％，35℃下混匀，经高剪切乳化器乳化分散后制成微乳剂(以下内容中称“产品B”)。

实施例6：产品含3％的305菌种的代谢产物，用5％的乙醇溶解，加入6％农乳0204-C作为乳化剂，最后用二甲苯补足到100％，搅拌混匀制成乳油(以下内容中称“产品C”)。

试验例：

将实施例4-6试制的农用杀菌剂对黄瓜立枯病、蕃茄早疫病和葡萄炭疽病等作物病害进行防治试验，以常规化学农药、清水为对照，如表1所示，试制的农用杀菌剂与常规化学农药的防治效果相仿或略优。

表1  产品A、B、C对几种作物病害防效统计表

(药效试验均于2004年5月-8月在杭州市郊试验农田进行)

  产品与对照药  稀释倍数  使用方法                校正防效(％)  黄瓜立枯病  蕃茄早疫病  葡萄炭疽病  产品A  1000  喷雾  92.3  -  -  1500  喷雾  88.5  -  -  2000  喷雾  80.4  -  -  70％甲基托布  津可湿粉  1000  喷雾  89.7  -  -  产品B  800  喷雾  -  93.2  -  1200  喷雾  -  86.5  -  1600  喷雾  -  81.7  -  50％多菌灵可  湿粉  500  喷雾  -  84.5  -  产品C  1000  喷雾  -  -  94.8  1500  喷雾  -  -  90.5  2000  喷雾  -  -  83.8  70％代森锰锌  可湿粉  800  喷雾  -  -  91.5  清水  -  喷雾  4.3  -10.2  2.8

“-”为未试验。