一种治疗癌性疼痛中药组合物的质量控制方法及应用

摘要

本发明公开一种治疗癌性疼痛的中药组合物的质量控制方法及其在制备治疗癌性疼痛的药物中应用。该药物组合物由青风藤、白屈菜和汉桃叶三味药按重量份数比4－200∶5－230∶10－250制成，其注射剂的质量控制方法包括指纹图谱的测定方法、鉴别方法或含量测定方法。指纹图谱的测定方法是应用照高效液相色谱法记录色谱图，计算共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积比值。鉴别方法包括青风藤或汉桃叶的鉴别。含量测定有青藤碱含量测定或白屈菜碱含量测定。本发明还公开该药物组合物在制备治疗癌性疼痛的药物中的应用，尤其是在制备治疗肺癌疼痛或肝癌疼痛的药物中的应用。

说明书

发明领域

本发明涉及一种中药组合物的质量控制方法及其应用，特别涉及一种用于治疗癌性疼痛的中药组合物的质量控制方法及其应用。

背景技术

疼痛是癌症患者最常见、最难忍受的症状之一，它常比癌症引起死亡更令人畏惧。根据统计资料，我国目前有癌症病人超过700万，其中51-62％的病人伴随不同程度的疼痛，其中40％为轻度疼痛，30％为中度疼痛，30％为重度疼痛。国内最新资料指出：我国肿瘤疼痛的病人中仅有41％得到有效缓解，而晚期癌痛仅有25％得到有效缓解。癌痛不同于一般的炎性疼痛，通常由以下原因引起：肿瘤直接压迫、刺激神经；肿瘤骨骼转移；肿瘤对痛觉敏感组织(血管、淋巴管等)的刺激；肿瘤分泌因子致痛、伴随炎症因素致痛；手术后、放射治疗后、化疗后和其他治疗后疼痛；目前临床治疗癌症疼痛的方法主要包括采用WHO三阶梯癌痛治疗方案等的化学药物治疗以及中医中药、理疗、心理疗法和外科治疗等。经过数年临床实践，WHO三阶梯癌痛治疗方案已经成为一个被国际上广泛接受的止痛方法，能使90％患者的癌症疼痛得到有效缓解。第一阶梯采用非阿片类药物如阿司匹林、芬必得等，第二阶梯采用弱阿片类如可待因、强痛定、盐酸曲马多，第三阶梯采用强阿片类如盐酸哌替啶(杜冷丁)、吗啡等。由于阿片类药物均会引起恶心、呕吐等不良反应，甚或有戒断症状和成瘾性，我国对于阿片类药物的控制非常严格，加之医生和患者对癌症疼痛的专业教育不足，以致WHO三阶梯癌痛治疗方案在国内的推行工作并不理想，较多癌症患者的疼痛不能得到缓解，严重影响了他们的生活质量。在这种情况下，由于中药公认的低成瘾性、低耐受性、低毒副作用，从中寻找有效的癌症疼痛治疗药物已逐渐成为一个重要的新药研发方向。但是，到目前为止，此类研究较多的停留在中医理论或临床处方上，尚未出现能达到与阿片类药物同等止痛效果的中药品种。

发明内容

本发明的一个目的在于公开一种治疗癌性疼痛的中药组合物的质量控制方法。

本发明所涉及的药物组合物的原料药组成及配比如下：

青风藤4-200重量份           白屈菜5-230重量份

汉桃叶10-250重量份

上述原料药的优选配比如下：

青风藤750-850重量份         白屈菜650-750重量份

汉桃叶950-1050重量份

上述原料优选配比还可以为：

青风藤800重量份        白屈菜700重量份       汉桃叶1000重量份

按药剂学方法，可以将上述原料药制备成各种临床可接受的剂型，包括但不限于如下剂型当中的一种：如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、软胶囊剂及栓剂等固体制剂，混悬剂、口服液、灌肠剂、注射剂或冻干粉针等制剂。

本药物组合物注射液的制备方法：白屈菜、青风藤加调pH至1.5-2.5，冷藏，滤过，滤液用15-25％氢氧化钠溶液调pH至6.5～7.0，再加乙醇使含醇量达80-90％，滤过，滤液减压浓缩至相对密度60℃时为1.35～1.40，真空干燥，得汉桃叶干膏。7-9倍量70-90％乙醇浸泡20-40分钟，加热回流1-3次，每次1.5-2.5小时，合并醇提液，减压回收乙醇并浓缩至1∶1.5，用0.5-1.5mol/L磷酸调pH2～3，静置10-15小时，滤过，滤液用30-50％氢氧化钠溶液调pH10～11，用等量氯仿提取4-6次，合并氯仿液，回收氯仿，残留物真空干燥，得总生物碱。汉桃叶加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎煮液，滤过，滤液减压浓缩，用乙醇沉淀处理2次，第一次溶液含醇量达50-70％，第二次达80-90％，每次均滤过，回收乙醇，然后加水稀释，用5-7mol/L盐酸取上述总生物碱，汉桃叶干膏，加900-1000体积份加注射用水，用0.5-1.5mol/L磷酸调pH至4～5，搅拌使溶解，冷藏，滤过，加8-12体积份吐温-80、加8-12体积份苯甲醇、混匀，用0.45/μm微孔薄膜滤过，灌封于安瓿中，于100℃流通蒸汽灭菌20-40分钟，即得。

上述方案中重量份/体积份与g/ml相对应。

本组合物制成药剂的质量控制方法包括指纹图谱检测、鉴别或含量测定。

指纹图谱检测方法如下：

供试品溶液的制备：取注射液1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，微孔滤膜0.45μm滤过，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

色谱条件和系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02M磷酸二氢钾线性梯度洗脱为流动相；检测波长为230nm；理论板数按青藤碱峰计算应不低于3000。其中乙腈-0.02M磷酸二氢钾线性梯度洗脱作为流动相的配比变化关系为：

            线性梯度洗脱流动相配比变化程序

  时间(min)  流速(ml/min)  乙腈(％)  0.02M磷酸二氢钾(％)  0  10  50  1  1  1  10  20  30  90  80  70

测定方法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50分钟的色谱图。

指纹图谱：在供试品的50分钟色谱图中，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰，即S峰为1计算相对保留时间，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰，即S峰的峰面积为1计算峰面积的比值；应有8个共有指纹峰在相同的相对保留时间处出现。

共有指纹峰的标定

共有峰的相对保留时间(峰号)应为：0.69±20％(1)；1.00(S)；1.25±20％(2)；1.65±20％(3)；2.10±20％(4)；2.32±20％(5)；2.49±20％(6)；2.58±20％(7)。

共有指纹峰面积的比值：峰面积过5％共有指纹峰的峰面积比值(峰号)应为：1.00(S)：0.08±30％(3)。供试品色谱图中，非共有峰面积总和不得大于总峰面积的5.0％。

其中供试品溶液的指纹图谱见附图1。

鉴别方法包括如下方法中的一种或几种：

A.物组合物注射剂8-12ml，用8-12％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿提取1-3次，每次8-12ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取青风藤对照药材1.5-2.5g，白屈菜对照药材4-6g，分别加0.5-1.5％盐酸溶液25-35ml与45-55ml，超声处理30-50分钟，滤过，滤液加8-12％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿同法制成对照药材溶液；再取青藤碱与白屈菜碱对照品，分别加甲醇制成每1ml含1.5-2.5mg与0.5-1.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述五种溶液各5-7μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯——乙腈——三乙胺6-8∶1.5-2.5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，在254nm紫外光灯下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；喷以稀碘化铋钾试液后，置碘蒸汽中熏后，日光下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

B.药物组合物注射剂4-6ml，加稀盐酸溶液调节pH值至1～2，加醋酸乙酯提取1-3次，每次8-12ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇0.5-1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取汉桃叶对照药材4-6g，加水45-55ml，加热回流0.5-1.5小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；再取富马酸对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-1.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5-7μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，60～90℃下以石汕醚—醅酸乙酯—冰醋酸7-9∶1-2∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；

含量测定方法包括如下方法中的一种或几种：

A.青藤碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以1-2∶8-9的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相：检测波长260-270nm；理论板数按青藤碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.4-0.6mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各8-12μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

B.白屈菜碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以2-3∶7-8的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相；检测波长为285-295nm；理论板数按白屈菜碱峰计算不得低于2000；

对照品溶液制备：精密称取白屈菜碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.04-0.06mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各8-12μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

其中在上述含量测定方法中，注射剂中青藤碱的含量测定每1ml含青风藤以青藤碱C₁₉H₂₃NO₄计，不得少于4.4mg；

其中在上述含量测定方法中，注射剂中白屈菜的含量测定每1ml含白屈菜以白屈菜碱C₂₀H₁₉NO₅计，不得少于0.30mg；

在青藤碱含量测定试验中：检测波长的选定选定265nm为青藤喊的检测波长；从空白试验及色谱图可知青藤碱的阴性对照无干扰；标准曲线的绘制，青藤碱对照品在进样量2.57μg～15.42μg范围内呈良好的线性关系；精密度试验，测定供试品中青藤碱的峰面积值，结果表明精密度良好；稳定性试验表明痛安注射液供试品溶液在制备后22小时内稳定；重现性试验测定痛安注射液中青藤碱的重现性良好；回收率测定其青藤碱的含量，结果表明回收率良好；样品中青藤碱的含量测定，根据样品含量测定结果，每1ml含青风藤以青藤碱(C₁₉H₂₃NO₄)计，不得少于4.4mg。

在白屈菜碱含量测定试验中：检测波长的选定290nm为白屈菜碱的检测波长；从空白试验及色谱图可知白屈菜碱的阴性对照无干扰；标准曲线的绘制，测定结果表明，白屈菜碱对照品在进样量0.261μ～1.566μg范围内呈良好的线性关系；精密度试验，测定供试品中白屈菜碱的峰面积值，结果表明精密度良好；稳定性试验，表明痛安注射液供试品溶液在制备后22小时内稳定；重现性试验，测定痛安注射液中白屈菜碱的重现性良好；按样品含量测定方法测定其白屈菜碱的含量，计算白屈菜碱的回收率，表明回收率良好；根据十批样品含量测定结果，每1ml含白屈菜以白屈菜碱(C₂₀H₁₉NO₅)计，不得少于0.30mg。

本发明的药物组合物治疗癌症疼痛具有低成瘾性、低耐受性、低毒副作用，有深厚的中医理论基础，在临床应用上具有突出的疗效，不仅能预防疼痛发作，止痛效果明显，而且具有协同止痛作用。

实验例1：青风藤白屈菜的鉴别试验

取十批痛安注射液(三味药物组合物的注射剂)样品进行试验观察。取10ml，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取青风藤对照药材2g，白屈菜对照药材5g，分别加1％盐酸溶液30ml与50ml，超声处理40分钟，滤过，滤液加10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿同法制成对照药材溶液。再取青藤碱与白屈菜碱对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg与1mg的溶液，作为对照品溶液。另分别取缺白屈菜或缺青风藤的阴性模拟制剂10ml，同法制成缺白屈菜或缺青风藤的阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述七种溶液各6μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯——乙腈——三乙胺(7∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(254nm)下检识。供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。喷以稀碘化铋钾试液后，置碘蒸汽中熏后，日光下检识。供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰，故用同一色谱条件可以将白屈菜与青风藤同时进行TLC鉴别。

实验例2：汉桃叶的鉴别试验

取痛安注射液5ml，加稀盐酸，溶液调节pH值至1～2，加醋酸乙酯提取2次，每次10ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取汉桃叶对照药材5g，加水50ml，加热回流1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。再取富马酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。再取汉桃叶阴性模拟制剂5ml，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各6μl分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(60-90℃)——醋酸乙酯——冰醋酸(8∶1.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点。阴性对照未见干扰。本研究增加了以富马酸为对照的TLC鉴别，由于富马酸为汉桃叶药材中的指标成份之一，标准中增加了以富马酸为对照，目的是进一步增加质量标准的可控性。

实验例3：青藤碱含量测定试验

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品12.35mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml相当于0.514mg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取痛安注射液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，滤液作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：精密量取缺青风藤的阴性模拟制剂1ml，置10ml量瓶中，同法制备阴性对照溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各8-12μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

注射剂中青藤碱的含量测定每1ml含青风藤以青藤碱C₁₉H₂₃NO₄计，不得少于4.4mg；

4：白屈菜碱含量测定试验

对照品溶液的制备：精密称取白屈菜碱对照品13.05mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml相当于0.0522mg的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取痛安注射液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，滤液作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备精密量取缺白屈菜的阴性模拟制剂1ml，置10ml量瓶中，同法制备阴性对照品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各8-12μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

其中在上述含量测定方法中，注射剂中白屈菜的含量测定每1ml含白屈菜以白屈菜碱C₂₀H₁₉NO₅计，不得少于0.30mg；

实验例5：痛安注射液的临床试验研究

采用随机双盲对照试验方法进行临床试验，以观察痛安注射液(2ml)治疗血瘀证肺癌、肝癌疼痛的临床疗效与安全性，对照药为盐酸曲马多注射液(2ml)。合格病例共40例，治疗组(痛安注射液2ml)20例(其中肺癌8例，肝癌12例)对照组(盐酸曲马多2ml)

两组治疗前可比性分析表明，两组年龄、性别、病种、病程、中医证候总分等影响疗效的主要因素均衡，中医证候中性情急躁、面色、舌质、脉象、胸胁胀闷、脘腹胀满、痞块两组治疗前基线亦均衡，仅治疗组疼痛强度症状略重于对照组，差异有统计学意义。

临床疗效结果分析显示，治疗组镇痛的临床控制率为20％，显效率45％，有效率30％，总有效率为95％，对照组临床控制率为15％，显效率40％，有效率25％，总有效率为80％。两组治疗后总的镇痛效果比较，差异无统计学意义。

                 两组治疗后总镇痛疗效比较

  临床控制  显效  有效  无效  合计  治疗组    对照组  4  20％  3  15％  9  45％  8  40％  6  30％  5  25％  1  5％  4  20％  20  100.0％  20  100.0％

秩和检验，Z＝0.915，P＝0.360

治疗组肺癌疼痛的临床控制率为12.5％，显效率25.0％，有效率62.5％，总有效率为100％，对照组肺癌疼痛的临床控制率为0％，显效率45.5％，有效率27.3％，总有效率为72.7％。两组对肺癌疼痛的镇痛效果比较，差异无统计学意义。

                                肺癌疼痛疗效比较

  临床控制  显效  有效  无效  合计  治疗组    对照组  1  12.5％  0  0％  2  25.0％  5  45.5％  5  62.5％  3  27.3％  0  0％  3  27.3％  8  100.0％  11  100.0％

秩和检验，Z＝0.574，P＝0.566

治疗组肝癌疼痛的临床控制率为25.0％，显效率58.3％，有效率8.3％，总有效率为91.7％，对照组肝癌疼痛的临床控制率为33.3％，显效率33.3％，有效率22.2％，总有效率为88.9％。两组对肝癌疼痛的镇痛效果比较，差异无统计学意义。

                            肝癌疼痛疗效比较

  临床控制  显效  有效  无效  合计  治疗组  3  7  1  1  12  25.0％  58.3％  8.3％  8.3％  100.0％  对照组  3  33.3％  3  33.3％  2  22.2％  1  11.1％  9  100.0％

秩和检验，Z＝0.190，P＝0.849

两组治疗后起效时间与镇痛维持时间比较，差异均无统计学意义。

对中医证候的疗效分析表明：治疗组中医证候疗效临床控制与显效率均为0％，有效85％，总有效率为85％：对照组中医证候疗效临床控制与显效率均为0％，有效65％，总有效率为65％：两组中医证候的疗效，差异无统计学意义。

痛安注射液治疗组治疗血瘀证疼痛(刺痛不移)、胸胁胀闷、脘腹胀满、性情急躁、面色、舌质、脉象、痞块疗效与对照组相当，差异无统计学意义。

经采用卡方检验对两组实验室检查指标治疗前后正常和异常情况(例数)进行统计学处理，各指标均无显著性差异。其中治疗组和对照组均无血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、尿常规、大便常规、谷丙转氨酶治疗前正常而治疗后异常的病例。治疗组和对照组亦无上述七个指标治疗前异常而治疗后异常有加重的病例。治疗组和对照组均血清谷草转氨酶治疗后异常有加重的病例。

说明书附图：

附图1：供试品溶液的指纹图谱

具体实施方式如下：

实施例1：组合物注射液的制备

取青风藤800g、白屈菜700g和汉桃叶1000g三味，白屈菜、青风藤加8倍量80％乙醇浸泡30分钟，加热回流二次，每次2小时，合并醇提液，减压回收乙醇并浓缩至1∶1，用1mol/L磷酸调pH2～3，静置12小时，滤过，滤液用40％氢氧化钠溶液调pH10～11，用等量氯仿提取5次，合并氯仿液，回收氯仿，残留物真空干燥，得总生物碱。汉桃叶加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液减压浓缩，用乙醇沉淀处理二次，第一次溶液含醇量达60％，第二次达85％，每次均滤过，回收乙醇，然后加水稀释，用6mol/L盐酸调pH至2.0，冷藏，滤过，滤液用20％氢氧化钠溶液调pH至6.5～7.0，再加乙醇使含醇量达85％，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.35～1.40(60℃)，真空干燥，得汉桃叶干膏。取上述总生物碱，汉桃叶干膏，加950ml注射用水，用1mol/L磷酸调pH至4～5，搅拌使溶解，冷藏，滤过，加10ml吐温-80、10ml苯甲醇、混匀，用0.45/μm微孔薄膜滤过，灌封于2ml安瓿中，于100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得。

实施例2：注射剂的鉴别

A.取本药物组合物注射剂10ml，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取青风藤对照药材2g，白屈菜对照药材5g，分别加1％盐酸溶液30ml与50ml，超声处理40分钟，滤过，滤液加10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿同法制成对照药材溶液；再取青藤碱与白屈菜碱对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg与1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各6μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯——乙腈——三乙胺7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，在254nm紫外光灯下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；喷以稀碘化铋钾试液后，置碘蒸汽中熏后，日光下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

B.取本药物组合物注射剂5ml，加稀盐酸溶液调节pH值至1～2，加醋酸乙酯提取2次，每次10ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取汉桃叶对照药材5g，加水50ml，加热回流1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；再取富马酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各6μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，60～90℃下以石油醚—醅酸乙酯—冰醋酸8∶1.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；

实施例3：注射剂的含量测定

A.青藤碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以15∶85的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相：检测波长265nm；理论板数按青藤碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

本药物组合物注射剂每1ml含青风藤以青藤碱C₁₉H₂₃NO₄计，不得少于4.4mg；

B.白屈菜碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以25∶75的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相；检测波长为290nm；理论板数按白屈菜碱峰计算不得低于2000；

对照品溶液制备：精密称取白屈菜碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

本药物组合物注射剂每1ml含白屈菜以白屈菜碱C₂₀H₁₉NO₅计，不得少于0.30mg；

实施例4：注射剂的指纹图谱检测

供试品溶液的制备：取本品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

测定方法：照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录(VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02M磷酸二氢钾线性梯度洗脱为流动相；检测波长为230nm。理论板数按青藤碱峰计算应不低于3000。

            线性梯度洗脱流动相配比变化程序

 时间(min)  流速(ml/min)  乙腈(％)  0.02M磷酸二氢钾(％)  0  10  50  1  1  1  10  20  30  90  80  70

测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50分钟的色谱图，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)为1计算相对保留时间，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)的峰面积为1计算峰面积的比值。

指纹图谱：在供试品的50分钟色谱图中，应有8个共有指纹峰在相同的相对保留时间处出现。

共有峰的相对保留时间(峰号)应为：0.69±20％(1)；1.00(S)；1.25±20％(2)；1.65±20％(3)；2.10±20％(4)；2.32±20％(5)；2.49±20％(6)；2.58±20％(7)。

共有指纹峰面积的比值

峰面积过5％共有指纹峰的峰面积比值(峰号)为：1.00(S)：0.08±30％(3)。

(4)非共有峰面积

供试品色谱图中，非共有峰面积总和不得大于总峰面积的5.0％。

实施例5：注射液的质量控制

供试品溶液的制备：取本品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

测定方法：照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录(VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02M磷酸二氢钾线性梯度洗脱为流动相；检测波长为230nm。理论板数按青藤碱峰计算应不低于3000。

              线性梯度洗脱流动相配比变化程序

  时间(min)  流速(ml/min)  乙腈(％)  0.02M磷酸二氢钾(％)  0  10  50  1  1  1  10  20  30  90  80  70

测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入液相色谱仪，测定，记录50分钟的色谱图，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)为1计算相对保留时间，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)的峰面积为1计算峰面积的比值。

指纹图谱：在供试品的50分钟色谱图中，应有8个共有指纹峰在相同的相对保留时间处出现。

共有峰的相对保留时间(峰号)应为：0.69±20％(1)；1.00(S)；1.25±20％(2)；1.65±20％(3)；2.10±20％(4)；2.32±20％(5)；2.49±20％(6)；2.58±20％(7)。

共有指纹峰面积的比值

峰面积过5％共有指纹峰的峰面积比值(峰号)为：1.00(S)：0.08±30％(3)。

(4)非共有峰面积

供试品色谱图中，非共有峰面积总和不得大于总峰面积的5.0％。

A.青藤碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以15∶85的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相：检测波长265nm；理论板数按青藤碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

本药物组合物注射剂每1ml含青风藤以青藤碱C₁₉H₂₃NO₄计，不得少于4.4mg；

B.白屈菜碱含量测定

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以25∶75的乙腈--0.02M磷酸二氢钾为流动相；检测波长为290nm；理论板数按白屈菜碱峰计算不得低于2000；

对照品溶液制备：精密称取白屈菜碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的制备：精密量取本药物组合物注射剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液；

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得；

本药物组合物注射剂每1ml含白屈菜以白屈菜碱C₂₀H₁₉NO₅计，不得少于0.30mg；

实施例6：注射液的质量控制

供试品溶液的制备：取本品1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：精密称取青藤碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

测定方法：照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录(VID)测定。

色谱条件和系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02M磷酸二氢钾线性梯度洗脱为流动相；检测波长为230nm。理论板数按青藤碱峰计算应不低于3000。

           线性梯度洗脱流动相配比变化程序

  时间(min)  流速(ml/min)  乙腈(％)  0.02M磷酸二氢钾(％)  0  10  50  1  1  1  10  20  30  90  80  70

测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录50分钟的色谱图，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)为1计算相对保留时间，以供试品溶液中青藤碱的色谱峰(S峰)的峰面积为1计算峰面积的比值。

指纹图谱：在供试品的50分钟色谱图中，应有8个共有指纹峰在相同的相对保留时间处出现。

共有峰的相对保留时间(峰号)应为：0.69±20％(1)；1.00(S)；1.25±20％(2)；1.65±20％(3)；2.10±20％(4)；2.32±20％(5)；2.49±20％(6)；2.58±20％(7)。

共有指纹峰面积的比值

峰面积过5％共有指纹峰的峰面积比值(峰号)为：1.00(S)：0.08±30％(3)。

(4)非共有峰面积

供试品色谱图中，非共有峰面积总和不得大于总峰面积的5.0％。

A.取本药物组合物注射剂10ml，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿提取2次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取青风藤对照药材2g，白屈菜对照药材5g，分别加1％盐酸溶液30ml与50ml，超声处理40分钟，滤过，滤液加10％氢氧化钠溶液调节pH值至9～10，加氯仿同法制成对照药材溶液；再取青藤碱与白屈菜碱对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg与1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述四种溶液各6μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以甲苯——乙腈——三乙胺7∶2∶1为展开剂，展开，取出，晾干，在254nm紫外光灯下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；喷以稀碘化铋钾试液后，置碘蒸汽中熏后，日光下检识；供试品色谱中，分别在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

B.取本药物组合物注射剂5ml，加稀盐酸溶液调节pH值至1～2，加醋酸乙酯提取2次，每次10ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取汉桃叶对照药材5g，加水50ml，加热回流1小时，滤过，滤液同法制成对照药材溶液；再取富马酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各6μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，60～90℃下以石油醚—醅酸乙酯—冰醋酸8∶1.5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗斑点；

实施例7：注射液的应用

青风藤750g、白屈菜750g、汉桃叶950g，制成注射液1000ml，肝癌疼痛患者，肌注，一次2ml，一日1～2次。

实施例8：注射液的应用

青风藤850g、白屈菜650g、汉桃叶1050g，制成注射液1000ml，肺癌疼痛患者，肌注，一次2ml，一日1～2次。

实施例9：注射液的应用

青风藤800g、白屈菜700g、汉桃叶1000g，制成注射液1000ml，癌性疼痛患者，肌注，一次2ml，一日1～2次。

实施例10：片剂的应用

青风藤800g、白屈菜700g、汉桃叶1000g，制成1000片，肝癌疼痛患者服用，每次2片，一日1～2次。

实施例11：胶囊剂的应用

青风藤800g、白屈菜700g、汉桃叶1000g，制成1000粒，肺癌疼痛患者服用，每次2粒，一日1～2次。

实施例12：冻干粉针剂的应用

青风藤1600g  白屈菜1400g汉桃叶2000g，制成1000瓶，肺癌疼痛患者服用，每次一瓶，一日1～2次。