一种松树萎蔫病病原线虫的快速的检测方法

摘要

本发明属于森林病害检测技术领域，涉及一种松材线虫和拟松材线虫的检测方法。本发明的技术方案包括四个步骤：①设计用于松材线虫和拟松材线虫PCR检测的特异引物各一对；②用机械破碎和滤纸吸附的方法获得单条线虫DNA作为模板；③进行松材线虫和拟松材线虫的特异PCR扩增；④PCR产物检测。本发明可快速、准确、灵敏地从线虫分离液中鉴定出松材线虫或拟松材线虫，为危险性的松树线虫萎蔫病的诊断及检疫提供了一种快速、准确且便于操作的方法，本发明可用于松材线虫及拟松材的成虫和幼虫。

说明书

技术领域：

本发明属于森林病害检测技术领域，具体地说是一种能对的松材线虫和拟松材线虫进行检测的方法。

背景技术：

由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松树萎蔫病是一种毁灭性的森林病害，具有危害极其严重、蔓延速度快、防治困难等特点，一旦发生将给国民经济和生态环境造成极大的损失，现已成为我国林业生产上的头号生物灾难，其病原松材线虫为我国对内对外的重要检疫对象。由于缺乏较好的松树萎蔫病发生后的应对措施，目前对于松树萎蔫病的治理主要是通过清除传染源和切断传染途径来控制其传播蔓延的速度，具体做法是在松树萎蔫病发生区伐除病树并销毁防止扩散，在松树萎蔫病未发生区则做好对内对外的检疫工作防止传入。上述两项工作涉及的技术关键是林间病树的诊断和松木制品中病原线虫的检测。

对于松树萎蔫病的诊断和检疫最直接、最有效的方法是快速准确的鉴定出病木或松木制品中的病原线虫种类，长期以来松材线虫的鉴定主要依靠形态学，尤其是对雌、雄成虫某些特征的观察。这种方法的优点是简便、直观，存在的弊端是：1.在松木材质中有众多的线虫，有些种类的线虫形态特征与松材线虫相似，特别松材线虫的致病力较弱的近缘种拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)，其形态与松材线虫很容易混淆，使得鉴定的准确性完全依靠操作者的经验；2.松材线虫在形态上有变异的情况存在，在实际操作时至少需要对雌、雄成虫各10条以上进行观察才能确诊，费工、费时；3.形态学鉴定只适用于成虫，不适宜幼虫，而病木中的松材线虫在很多情况下是以幼虫的形式存在，使的该方法在实际应用中受到限制.。

近年来随着分子生物学技术的发展，采用PCR技术对松材线虫进行快速、准确鉴定已成为趋势。松材线虫PCR鉴定包含两项关键技术，即PCR扩增技术和线虫DNA制备技术。早期的PCR鉴定包括采用随机引物扩增的RAPD-PCR技术和采用线虫通用引物扩增后再对扩增产物进行限制性酶切的PCR-RFLP技术，线虫DNA的制备多采用酚仿抽提法，它们的共同缺点是由于使用非松材线虫专用的特异引物而造成鉴定的稳定性和准确性不高，而且需要大量线虫制备DNA，制备时间长。林茂松等发明的《松材线虫检测试剂盒及其检测方法》(专利号：ZL2003l0106109.5)提供一种松树萎蔫病诊断的新方法，该方法采用三条特异引物对分离自松树病木的单条线虫进行PCR检测，鉴定准确率高，自获得线虫分离液后8小时内可完成鉴定，大大提高了松树萎蔫病的诊断效率。但由于采用了蛋白酶消化法提取单条线虫的DNA，使得提取时间延长，同时在线虫样品在转移过程中易丢失，增加了操作的难度。采用PCR反应中加入荧光探针的实时荧光PCR可以在每一轮循环时检测荧光信号的强度，而不必等到PCR反应全部结束后才能检测扩增结果，因此能大大缩短PCR扩增的时间。Cao等(Phytopathology 200595：566-571)建立的松材线虫实时荧光PCR检测技术可以将获得线虫DNA样品后的检测时间缩短至1小时内。但该方法的完成必须依赖价格昂贵荧光实时PCR仪、检测设备和试剂，因而使其应用受到限制。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种快速、准确，且经济实用的松树萎蔫病病原线虫的PCR检测方法。

本发明包括以下步骤：

(1)根据松材线虫和拟松材线虫的rDNA序列设计用于松材线虫PCR检测的一对引物BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX2：5’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，用于拟松材线虫PCR检测的一对引物BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM2：5’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’。

(2)用于PCR检测的单条线虫DNA模板制备：在一块经高压灭菌并剪成2～4mm的方形定量滤纸上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、BM1和BM2及的线虫检测液，晾干待用；在解剖镜下从线虫分离液中挑取一条线虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥时，用镊子取一块已干燥的含线虫检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液。

(3)PCR扩增：在步骤(2)得到的单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含1.5～2.0mM MgCl₂的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增，经优化的扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，54～55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。

(4)PCR产物检测：取5～10μl步骤(3)得到的PCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶在电泳结束经溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，如检测到一条分子量为501bp的电泳谱带表明受检线虫为松材线虫，如检测到一条分子量为160bp的电泳谱带表明受检线虫为拟松材线虫。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

1.本发明采用了机械破碎和滤纸直接吸附的方法制备用于PCR扩增的单条线虫DNA模板，无需蛋白酶消化和酚仿抽提，线虫DNA的制备时间缩短到了15min之内，从而使从获得线虫分离液开始的整个鉴定过程在4小时内完成，同时在解剖镜下将线虫DNA吸附于滤纸上后便于观察，不易发生线虫DNA在转移中丢失的情况，使得操作更为方便。

2.本发明用于PCR检测的引物为根据松材线虫和拟松材线虫rDNA区的特异序列设计的专用引物，鉴定的稳定性好、准确性高。

3.本发明采用普通PCR仪和常规试剂，检测成本，利于推广应用。

4.检测的灵敏度高，单条线虫制备的DNA足以完成检测，可以对成虫和幼虫进行检测。

附图说明

图1松材线虫种群成虫和幼虫的扩增结果

图2拟松材线虫种群成虫和幼虫的扩增结果.

图3对不同来源的松材线虫和拟松材线虫种群的扩增结果

具体实施方式

实施例一

1.用于松材线虫和拟松材线虫检测的特异引物的设计：采用线虫ITS通用引物扩增不同来源的2个松材线虫和5个拟松材线虫种群，获得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2区的扩增片段；双脱氧终止法测定各扩增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0软件分析，找出松材线虫和拟松材线虫种群间的差异序列，根据差异序列利用primer Premier 5.0软件设计松材线虫的特异引物BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，拟松材线虫的特异引物BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1区，BX2位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为160bp；DNA合成仪合成上述4条寡聚核苷酸引物。

2.用于单条线虫PCR鉴定的DNA模板制备：在一块经高压灭菌并剪成4mm的方形定量滤纸上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、M1和BM2的线虫检测液，晾干待用；在解剖镜下从来源于广东的松材线虫分离液中挑取一条典型的成虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥；用镊子取已干燥的含线虫检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液。

3.病原线虫的PCR特异扩增：在单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含1.5mM MgCl₂的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增，扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。

4.PCR产物检测；取5μl的PCR扩增产物加入2μl 6×电泳上样缓冲液，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，检测到一条分子量为501bp的电泳谱带，表明受检线虫为松材线虫(图1、图3)。

实施例二

1.用于松材线虫和拟松材线虫检测的特异引物的设计：采用线虫ITS通用引物扩增不同来源的2个松材线虫和5个拟松材线虫种群，获得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2区的扩增片段；双脱氧终止法测定各扩增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0软件分析，找出松材线虫和拟松材线虫种群间的差异序列，根据差异序列利用primer Premier 5.0软件设计松材线虫的特异引物BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，拟松材线虫的特异引物BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1区，BX2位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为160bp；DNA合成仪合成上述4条寡聚核苷酸引物。

2.用于单条线虫PCR鉴定的DNA模板制备：在一块经高压灭菌并剪成2mm的方形定量滤纸上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、M1和BM2的线虫检测液，晾干待用；在解剖镜下从来源于江苏的松材线虫分离液中挑取一条典型的幼虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥；用镊子取已干燥的含线虫检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液。

3.病原线虫的PCR特异扩增：在单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含2.0mM MgCl₂的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增，扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。

4.PCR产物检测：取10μl的PCR扩增产物加入2μl 6×电泳上样缓冲液，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，检测到一条分子量为501bp的电泳谱带，表明受检线虫为松材线虫(图1、图3)。

实施例三

1.用于松材线虫和拟松材线虫检测的特异引物的设计：采用线虫ITS通用引物扩增不同来源的2个松材线虫和5个拟松材线虫种群，获得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2区的扩增片段；双脱氧终止法测定各扩增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0软件分析，找出松材线虫和拟松材线虫种群间的差异序列，根据差异序列利用primer Premier 5.0软件设计松材线虫的特异引物BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，拟松材线虫的特异引物BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM2：5’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1区，BX2位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为160bp；DNA合成仪合成上述4条寡聚核苷酸引物。

2.用于单条线虫PCR鉴定的DNA模板制备：在一块经高压灭菌并剪成4mm的方形定量滤纸上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、M1和BM2的线虫检测液，晾干待用；在解剖镜下从来源于云南的拟松材线虫分离液中挑取一条典型的成虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥；用镊子取已干燥的含线虫检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液。

3.病原线虫的PCR特异扩增：在单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含1.5mM MgCl₂的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增，扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，54℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。

4.PCR产物检测：取5μl的PCR扩增产物加入2μl 6×电泳上样缓冲液，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，检测到一条分子量为160bp的电泳谱带，表明受检线虫为拟松材线虫(图2、图3)。

实施例四

1.用于松材线虫和拟松材线虫检测的特异引物的设计：采用线虫ITS通用引物扩增不同来源的2个松材线虫和5个拟松材线虫种群，获得包含rDNA的ITS1、5.8S、ITS2区的扩增片段；双脱氧终止法测定各扩增片段的DNA序列；所得的序列信息用DNASTAR 5.0软件分析，找出松材线虫和拟松材线虫种群间的差异序列，根据差异序列利用primer Premier 5.0软件设计松材线虫的特异引物BX1：5’-CGATGATGCGATTGGTGACTT-3’和BX25’-ATGCGAGACGACTGTCACAACG-3’，拟松材线虫的特异引物BM1：5’-TTCTCAAGTTTCTGCATTTGTAAG-3’和BM25’-GGCGCGGTCGCACAATCGAG-3’，其中BX1定位于rDNA的ITS1区，BX2位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为501bp；BM1和BM2定位于rDNA的ITS2区，预期扩增片段为160bp；DNA合成仪合成上述4条寡聚核苷酸引物。

2.用于单条线虫PCR鉴定的DNA模板制备：在一块经高压灭菌并剪成2mm的方形定量滤纸上滴加2μl含有1.25mM dNTP和各15μM的特异引物BX1、BX2、M1和BM2的线虫检测液，晾干待用；在解剖镜下从来源于湖南的拟松材线虫分离液中挑取一条典型的幼虫入预先滴在载玻片的双蒸水滴中清洗后，移至水滴外，待线虫虫体周围的水接近完全干燥；用镊子取已干燥的含线虫检测试剂的滤纸片覆盖于线虫虫体上，镊子轻按滤纸片将线虫压破，将滤纸片移入装有15μl双蒸水的0.2ml薄壁管中95℃加热10min，冷却至室温，8000rpm离心30s得到单条线虫DNA模板制备液。

3.病原线虫的PCR特异扩增：在单条线虫DNA模板制备液中加入2.5μl含2.0mM MgCl₂的10×PCR buffer，1U Taq酶，补双蒸水至25μl；置于PCR仪内进行扩增，扩增条件为：预变性94℃2min；30个循环，每个循环包括：94℃45s，55℃60s，72℃60s；最后再72℃延伸10min。

4.PCR产物检测：取10μl的PCR扩增产物加入2μl 6×电泳上样缓冲液，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳；电泳结束后凝胶块用溴化乙锭染色后在紫外透射仪下观察，检测到一条分子量为160bp的电泳谱带，表明受检线虫为拟松材线虫(图2、图3)。