一种人工构建的生物活性分子及其制备方法

摘要

本发明属于生物工程领域，涉及一种人工构建的生物活性分子及其制备方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种人工构建的生物活性分子及其制备方法。

背景技术

理论上说，抗体可变区结构域可以作为展示外源肽段的一个理想的骨架结构(scaffold)。首先，V_H结构域能够保持一定的刚性，这样与靶蛋白结合形成复合物时熵的损失较小，结合力较强。在抗体可变区(重链：V_H、轻链：V_L)结构中，三个loop由两个反平行的β折叠片层支持，这些β片层在构象上比较稳定，可以支持短肽序列，形成一个确定的三维结构，保持正确的空间折叠。其次，抗体可变区结构在空间上能够将几个展示的短肽集中在一定的区域内，形成一个可与靶蛋白紧密结合的界面。此外，抗体可变区架展示的外源肽段长度可以改变，因为抗体可变区的骨架在展示CDR loop区时，长度可以改变。曾有报道，将重链CDR2延长以增强抗雌激素的抗体的结合能力。也有报道，在框架区FR3的邻近结合部位并靠近CDR的位点插入4个残基，可保持与半抗原的结合能力不改变。因此抗体可变区结构域可以展示在一定长度范围内的外源肽段。同时，利用人抗体可变区骨架作为外源短肽的展示支撑，大大降低了异源化反应。

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要来源于单核细胞和巨噬细胞，T淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞及内皮细胞在一定条件下也能产生(Old L(1985)Science 230：630-632)。成熟TNF-α分子量为17kD，以三聚体形式与细胞表面的TNF-α受体(TNFR)结合，介导多种生物学活性。正常水平的TNF-α可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡，但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤，例如恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合症(MDS)等多种疾病(Moeller A et al.(1990)Cytokine 2：162-169；Moeller等的美国专利5231024号；VasilliP(1992)Annu Rev Immunol 10：411-452；Tracey KJ，Cerami A(1994)Annu Rev Med 45：491-503)。因此，使用TNF-α的拮抗剂降低这些疾病中的TNF-α水平，为这些疾病的治疗提供了一种新途径。

到目前为止，已开发的TNF-α的拮抗剂主要有两大类，一类是TNFR与IgG的Fc段形成的融合蛋白和抗TNF-α的单抗，并进行了比较充分的临床研究。经过近十年的研究，由美国Immunex公司开发出了商品化的TNFR II-Fc融合蛋白，称为Etanercept，商品名为Enbrel，已被FDA批准上市，用于治疗类风湿关节炎、强直性脊椎炎和抑制银屑病病人的骨和关节损伤。另一大类能够有效拮抗TNF-α作用的大分子是抗体，尤其是单克隆抗体，并进行了人源化，美国Centocor公司开发了一种嵌合型抗TNF-α的抗体，命名为Infliximab，商品名为Remicade，FDA已批准用于治疗RA和结肠Crohn病。

应用TNF-α拮抗剂治疗类风湿性关节炎和结肠Crohn病等免疫性疾病已经取得了肯定的结果，这也说明降低TNF-α水平确实是治疗这些疾病的一个有效措施。但是，这两类TNF-α的拮抗剂存在着很多副作用。Etanercept和Infliximab的使用剂量都很大，疗程长，一个疗程需要几百毫克。副作用大，鼠源抗体会产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，人鼠嵌合抗体在长期给药的过程中也可以引发人抗嵌合抗体(HACA)反应(ElliottMJ等(1994)Lancet 344：1125-1127)。

这些TNF-α拮抗剂本身存在的不可克服的缺点将促使人们去开发更加有效的拮抗TNF-α的新型分子。其他与高TNF-α水平密切相关的一些疾病也为TNF-α新型拮抗分子的应用提供了广阔的空间。

本实验室近十年来在TNF-α抗体方面进行了一系列研究，获得了中和TNF-α的单抗(命名为Z12)，通过计算机辅助设计方法构建了Z12与hTNF-α作用的复合物模型，确定了抗体Z12识别TNF-α的表位(141-146位)，根据此模型设计了一些抑制TNF-α的短肽分子(沈倍奋等(2003)中国专利申请号03104870.6)。经生物学实验验证后，发现这些短肽分子具有活性，但是对TNF-α细胞毒性的抑制效果未达到理论预期值，且用量较大，推测原因可能是由于这些短肽分子空间体积较小，与TNF-α分子结合后，尚不足以阻断TNF三聚体与TNF受体这两个大分子之间的作用。

发明内容

基于上述现有技术，本发明提出了构建新的生物活性分子的新方法，即利用人抗体重链可变区(V_H)的框架结构，展示具有特定生物活性的肽段，从而以大分子形式表现出活性肽的生物活性。而且，该生物活性大分子在人体内不会激发排异反应。因此，具有良好的应用前景。

基于本发明的上述方法，本发明利用三个已设计并验证其活性的短肽分子：以选定的人抗体可变区的框架为支撑，将具有拮抗功能的短肽替代人抗体可变区的CDR，构建了对TNF-α具有拮抗作用的的新型分子(抗原拮抗肽抗体)。

本发明涉及一种人工构建的生物活性分子，其中含有人抗体可变区骨架和活性肽，所述人抗体可变区骨架具有稳定的三维结构，并且其天然序列中的一段或几段序列被活性肽取代，从而将活性肽展示于分子表面，表现出活性肽的生物活性。

在人抗体可变区中，被取代的序列优选是CDR区。

各种人抗体可变区均可用于实现本发明，但优选采用人抗体IgG重链或轻链可变区，特别优选的人抗体可变区是IgG V_H5。

活性肽可以是任何具有特定生物活性的肽段，只要该活性肽可以在人抗体可变区骨架中表现出其本身的活性即可。在本发明的具体实施方案中，所述活性肽是对TNF-α具有拮抗活性的短肽，特别是PT2、PT3和PT4。

本发明还涉及本发明的人工构建生物活性分子的制备方法，包括以下步骤：

1)提供一种具有稳定的三维结构的人抗体可变区；

2)提供一种或几种活性肽；

3)以步骤2)的活性肽取代步骤1)中的人抗体可变区中的一段或几段序列，使得活性肽被展示于分子表面，表现出活性肽的生物活性。

在人抗体可变区中，被取代的序列优选是CDR区。

各种人抗体可变区均可用于实现本发明，但优选采用人抗体IgG重链或轻链可变区，特别优选的人抗体可变区是IgG V_H5。

活性肽可以是任何具有特定生物活性的肽段，只要该活性肽可以在人抗体可变区骨架中表现出其本身的活性即可。在本发明的具体实施方案中，所述活性肽是对TNF-α具有拮抗活性的短肽，特别是PT2、PT3和PT4。

附图说明

图1.1.1PTVH1与TNF形成的复合物空间构象模型。其中，绿色线图为TNF三聚体，粉色为VH框架结构，青色球棍结构为PT1，黄色为PT2，红色为PT3，下同。

图1.1.2PTVH2与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.1.3PTVH3与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.1.4PTVH4与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.1.5PTVH5与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.1.6PTVH6与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.1.7PTVH7与TNF形成的复合物空间构象模型。

图1.2.1PTVH5正链的6段序列的二级结构分析。图中，从上至下，从左至右分别为序列1-6的RNA二级结构。

图1.2.2PTVH5负链的6段序列的二级结构分析。图中，从上至下，从左至右分别为序列F1-F6的RNA二级结构。

图1.3.1用PCR方法全合成的PTVH5 DNA，其中1为DNA分子量标记物，2为PTVH5 DNA。

图1.3.2重组质粒PTVH5/pET22的酶切鉴定，图中

1.分子量标记物，2.PTVH5/pET22经Xba I和EcoRI酶切后。

图1.3.3重组质粒PTVH5/pET22的测序结果。

图1.4.1PTVH5/pET223′端修改前后的mRNA二级结构。图中左侧为PTVH5/pET223′端修改前终止密码子附近70bp的RNA二级结构；右侧为修改后的二级结构。

图1.4.2PTVH5/pET223′端突变前后的测序结果。图中左侧为PTVH5/pET223′端突变前的序列；右侧为修改后的序列，红色划线部分为突变部分。

图1.4.3PTVH5/pET223′端突变前后的诱导表达分析。图中，左侧为PTVH5/pET223′端突变前诱导结果，右侧为突变后结果。

1.PTVH5/pET22未诱导；2.0.5mMIPTG诱导后；3.DNA分子量标记物。

图1.5.1PTVH5表达的SDS-PAGE分析。图中：

1.未诱导；2.超声后的沉淀；3.诱导后；4.超声后的上清。

图1.5.2PTVH5/pET22表达的Western印迹鉴定。图中：

1.未诱导；2.PTVH5/pET22诱导后；3.PTVH5/pET22诱导后；4.超声后的沉淀；5.超声后的上清。

图1.5.3PTVH5的Ni²⁺柱亲和层析。

图1.5.4PTVH5经Ni²⁺柱亲和层析富集后的SDS-PAGE分析。

图1.6.1PTVH5对Z12-HRP的竞争抑制试验。图中，三角形曲线代表纯化的PTVH5蛋白，菱形曲线代表pET22/BL21超声后的上清。

图1.6.2PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应。图中，三角形曲线代表纯化的PTVH5蛋白，菱形曲线代表pET22/BL21超声后的上清。

图1.6.3PTVH5对TNF-α细胞毒抑制效应的特异性分析。图中，菱形曲线代表TNF-α+PTVH5(200μg/ml)，方形曲线代表TNF-α+pET22/BL21(200μg/ml)超声后的上清，三角形曲线代表TNF-α。

具体实施方式

以下具体说明以TNF-α拮抗肽(PT2、PT3和PT4)为基础构建新的生物活性分子的过程，同时，通过实验验证了该新生物活性分子的生物活性。必须指出的是，本发明的方法并不局限于TNF-α拮抗肽，其它具有生物活性的肽段都可以按照本发明的方法，制备出新的具有特定生物活性的分子。

PTVH5的设计与功能鉴定

根据TNF-α的晶体结构、TNF-α与鼠源抗体Z12作用的复合物模型，以人抗体IgG可变区为框架，选择三个活性短肽(沈倍奋等(2003)中国专利申请号03104870.6)，替换抗体可变区的CDR区，从而设计出抑制TNF-α的新型分子(抗原拮抗肽抗体)。

利用Octane2图形工作站，借助InsightII(2000)程序包，对7类以人抗体IgG重链(V_H)作为骨架设计的新型分子与TNF-α之间的相互作用模式从理论上进行考察，通过结合自由能、识别功能域(Domain)、参与作用的区域以及形成的分子间氢键等的判别，选择第五类(V_H5)抗体可变区的骨架作为支撑，选择具有拮抗作用的活性肽作为CDR替换物设计成新型分子PTVH5。利用PCR方法全合成编码PTVH5的DNA，并经过原核表达与纯化得到PTVH5蛋白。利用PTVH5与Z12的竞争抑制试验以及对TNF-α细胞毒的抑制实验验证了其生物学活性。

具体而言，上述过程可以分为以下步骤：

(1)计算机辅助分子设计PTVH5

(2)全合成编码PTVH5的DNA序列

(3)PTVH5/pET22重组质粒的构建

(4)修改PTVH5的3′端的结构，提高表达水平

(5)PTVH5的纯化与鉴定

(6)PTVH5对Z12-HRP的竞争抑制试验

(7)PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应

(8)PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应的特异性分析

1.1材料

pET22质粒由本室保存

螯合Ni²⁺的琼脂糖凝胶层析柱购自北京本元正阳基因技术公司

Anti-his抗体购自Invitrogen公司

HRP标记的羊抗鼠IgG由本室制备保存

其余所用材料同1.1材料部分

1.2方法

1.2.1计算机辅助设计新型功能分子PTVH5

根据鼠源抗体Z12与抗原TNF-α相互作用的复合物模型，借助人抗体IgG可变区结构类型，通过计算机合理筛选技术，用具有拮抗作用的功能肽PT2、PT3、PT4(沈倍奋等(2003)中国专利申请号03104870.6)替换人抗体可变区基因的CDR，构建以人抗体IgG可变区骨架为支撑、拮抗肽PT2、PT3、PT4在相应的CDR进行结构展示的抗原拮抗肽抗体。

在图形工作站Octane2上，借助InsightII(2000)程序包的Homology软件对构建的抗原拮抗肽抗体进行空间构象的同源模建。在CVFF、Amber力场下，借助鼠源抗体Z12与TNF-α相互作用模式，通过分子对接方法将构建的抗原拮抗肽抗体与具有晶体结构的TNF-α(PDB号：1tnf)组合获得抗原拮抗肽抗体与TNF-α相互作用的复合物的空间构象。借助分子力学、分子动力学动态模拟确定其最终的稳定构象。

以相互作用模式、识别区域、相互作用自由能、分子间氢键作为判据，利用距离几何学、计算机图形学技术，对已确定的以人IgG抗体重链可变区7类骨架为支撑而获得的抗原拮抗肽抗体的生物学效应进行理论预测，确定最佳设计方案。

1.2.2全合成编码PTVH5的DNA

选择VH5作为展示肽段PT2、PT3和PT4的框架，命名为PTVH5，其氨基酸序列为：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSINYTGEPTYSQSVSNVVWYWIRQP

PGKGLEWIG YTYYPTVNENRSQSVSNVFRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD

TAVYYCAR YINTGYDGLYYNSMD WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)

划线部为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别被PT2、PT3和PT4替换后的序列。

对获得的以人抗体可变区VH5骨架为支撑构建的抗原拮抗肽抗体PTVH5的氨基酸序列进行反向翻译。考虑到基因表达，在翻译过程中对偏性密码子进行修正。

将氨基酸序列反翻译成DNA序列(SEQ ID NO：2)：

1     Q    V    Q    L    Q    E    S    G    P    G    L    V    K    P    S

16    E    T    L    S    L    T    C    T    V    S    I    N    Y    T    G

31    E    P    T    Y    S    Q    S    V    S    N    V    V    W    Y    W

46    I    R    Q    P    P    G    K    G    L    E    W    I    G    Y    T

61    Y    Y    P    T    V    N    E    N    R    S    Q    S    V    S    N

76    V    F    R    V    T    I    S    V    D    T    S    K    N    Q    F

91    S    L    K    L    S    S    V    T    A    A    D    T    A    V    Y

106   Y    C    A    R    Y    I    N    T    G    Y    D    G    L    Y    Y

121   N    S    M    D    W    G    Q    G    T    L    V    T    V    S    S

对于获得的PTVH5基因序列，尝试通过PCR扩增的方法获得。于是，将以上序列分段，用Goldkey软件计算每一段序列的自由能，在保持氨基酸序列不变的前提下调整碱基，以消除发夹(hairpin)结构。这样，获得了如下序列(SEQ ID NO：3)

阴影部分为欲合成的各段序列。

1：5′-GCGACTTCCATATGCAAGTT CAACTTCAGG AATCTGGTCC-3′(40bp)(SEQ ID NO：4)

2：5′-TGAAACCCTG TCTCTGACTT GTACAGTGTC TATCAACTAT ACCGGCGAGC CGACCTAC-3′(58bp)(SEQ IDNO：5)

3：5′-GTAGTTTGGT ACTGGATTCG CCAACCTCCG GGTAAAGGTC TGGAGTGGAT CGGTTACAC-3′(59bp)(SEQ IDNO：6)

4：5′-GAAAACCGTT CTCAATCCGT CTCCAACGTT TTCCGTGTTA CTATCTCTGT TGATACCAG-3′(59bp)(SEQ IDNO：7)

5：5′-TGAAGCTGTC TTCCGTAACA GCAGCTGATA CAGCCGTGTA TTACTGCGC GCGTTAC-3′(56bp)(SEQ IDNO：8)

6：5′-CGGCTTATAT TATAACTCTA TGGATTGGGG TCAAGGCACT TTAGTGACGG TGAGCTCC-3′(58bp)(SEQ IDNO：9)

F1：5′-AAGTCAGAGA CAGGGTTTCA GATGGTTTTA CCAGACCCGG ACCAGATTCC TGAAGTTG-3′(58bp)(SEQ IDNO：10)

F2：5′-GAATCCAGTA CCAAACTACG TTAGACACAG ACTGGGAGTA GGTCGGCTCG CCGGTATAG-3′(59bp)(SEQ IDNO：11)

F3：5′-GGATTGAGAA CGGTTTTCGT TGACGGTCGG ATAATACGTG TAACCGATCC ACTCCAG-3′(57bp)(SEQ IDNO：12)

F4：5′-TTACGGAAGA CAGCTTCAGG GAAAACTGGT TTTTGCTGGT ATCAACAGAG ATAGTAAC-3′(58bp)(SEQ IDNO：13)

F5：5′-CCATAGAGTT ATAATATAAG CCGTCATAGC CCGTGTTAAT GTAACGCGCG CAGTAATAC-3′(59bp)(SEQ IDNO：14)

F6：5′-TGCCGA CTC GAG GGAGCTCACC GTCACTAAAG TGCCTTGAC-3′(41bp)(SEQ ID NO：15)

每段序列长56-59个bp，正链的第一段序列划线部分为NcoI酶切位点，负链的F6序列划线部分为XhoI酶切位点。

用PCR方法扩增得到完整的PTVH5DNA序列：取1个OD单位的序列1-6和F1-F6，分别加入去离子水108、74.4、72、73.6、76.8、73.6、73.6、72.4、74.8、73.2、72.8和105.2μl，使终浓度均为50pmol/μl，稀释5倍，为10pmol/μl，各取2μl到26μl H₂O中，混合，每段序列的浓度为20pmol/50μl，取10μl混合物作模板，加入上游引物(序列1)和下游引物(序列F6)各1μl，dNTP2μl，10×pyrobest buffer 2.5μl，H₂O 8μl，高保真酶pyrobest 0.5μl。

PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，然后降至4℃。扩增产物取3μl用1-5％的琼脂糖电泳检测。

1.2.3 PTVH5/pET22重组表达质粒的构建：

DNA片段和质粒的酶切：pET22质粒或DNA片段5μl，10×buffer II 2μl，BSA(100×)0.2μl，NcoI和XhoI均为0.5μl，加去离子水至总体积为20μl，37℃ 2小时。使用QIAGEN公司的DNA片段快速纯化回收试剂盒，回收目的片段。

按以下条件进行连接反应：NcoI和XhoI酶切的pET22和DNA片段各取7μl，5×连接酶缓冲液4μl，T4 DNA连接酶2μl。室温放置6小时后置4℃过夜。

按1.2所述的方法转化BL21感受态，挑取单克隆，用菌落PCR方法初筛阳性克隆，用酶切方法鉴定。

酶切体系：重组质粒5μl，10×EcoR I buffer 2μl，NcoI和XhoI均为0.5μl，加去离子水至总体积为20μl，37℃ 2小时。用1.5％的琼脂糖电泳检测酶切效果。选择有预期大小片段切下的重组质粒PTVH5/pET22，送博亚生物技术有限公司，以通用引物测序。

1.2.4 PTVH5蛋白的表达与纯化

(1)PTVH5/pET22质粒的诱导表达

将上述鉴定正确的重组质粒，转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，用转化pET22b空载体的BL21(DE3)菌株作对照，在IPTG终浓度为0.1-1mmol/L的诱导下进行小量表达实验，并用12％的SDS-PAGE检测表达情况。

(2)修改PTVH5 DNA的3′端序列，提高表达水平

设计以下引物：

划线部分为突变后的碱基，将编码135位的Ser残基的密码子TCC突变为AGC，使终止密码子附近的二级结构原来过低的自由能增加，有利于翻译和转录，仍然保留XhoI酶切位点(划波浪线的序列)。

以测序正确的PTVH5/pET22质粒为模板，以序列1为上游引物，以Lower3为下游引物，PCR扩增，将扩增产物用NcoI和XhoI酶切后重新连入pET22，经酶切鉴定和测序鉴定正确后诱导，用SDS-PAGE分析表达情况。

诱导剂IPTG的浓度为0.1-1mM时表达产物主要以包涵体形式存在，降低IPTG浓度至0.01mmol/L，则有部分为可溶表达，挑选表达量最高的菌株进行大量表达。

(3)PTVH5的纯化：

复苏PTVH5/pET22/BL21，按1∶500转种至400ml LB培养基中，37℃培养至A600≈0.5时，加入IPTG，使终浓度为0.01mmol/L，于20℃诱导，145rpm，20小时。共诱导4000ml，离心，10mM PBS(pH7.2)洗涤三遍，用400ml 10mM PBS(pH7.2)悬浮，超声破碎后，12000×g离心15分钟，收集上清，调pH至8.0，加入NaCl至500mM，用螯合Ni²⁺的琼脂糖亲和层析柱纯化。用pH8.0的20mM PB加500mMNaCl和20mM咪唑洗涤至基线，用50、100、150和250mM等不同的咪唑浓度洗脱，收集洗脱峰，用12％的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯度。

(4)Western-blot鉴定：

12％SDS-PAGE电泳，40v转印2小时，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。一抗为Anti-His(1∶4000)，37℃1小时，PBST(0.2％Tween20，10mM PBS，pH7.4)洗涤三遍，加入HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗(1∶500)，37℃1小时，PBST洗涤三遍，用ECL显色。

1.2.5PTVH5功能的测定：

(1)PTVH5对Z12-HRP的竞争抑制试验：

以人TNF-α包被酶标板，TNF-α包被浓度为0.2μg/ml，每孔50μl，4℃过夜，PBST洗涤一遍，10％胎牛血清37℃封闭1小时，PBST洗涤三遍，每孔加入Z12-HRP50μl(1∶500)，分别加入不同浓度的PTVH5蛋白(200、100、50、10μg/ml)，每孔50μl，分别以PBS和pET22/BL21超声后的上清作对照，37℃孵育1小时，PBST洗涤三遍，加入OPD底物，每孔50μl，室温显色10分钟，每孔加入50μl 2N H₂SO₄终止反应，492nm波长下测OD值。

(2)PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应

L929细胞悬液调成3.2×10⁵/ml，接种到96孔板，每孔80μl，加入放线菌素D，使终浓度为1μg/ml。加入已除菌的hTNF-α，每孔10μl，加入不同浓度的PTVH5蛋白，每孔10μl，混匀，对照孔加入pET22/BL21超声后的过滤除菌的上清，37℃ 5％CO₂孵箱培养24小时。倾去上清，加入0.5％结晶紫，每孔15μl，室温10分钟，蒸馏水充分洗涤，加入33％的乙酸，每孔100μl，测570nm OD值。按以下公式计算抑制率。

此外，另设一组实验，固定PTVH5和pET22/BL21超声后的上清的浓度，为200μg/ml，加入hTNF-α的量为一组不同的浓度，分别为10、100、500、1000和5000pg/ml，其余方法同上，考察PTVH5对TNF-α细胞毒性抑制作用的特异性。

1.3结果

1.3.1新型分子PTVH5的设计及生物学功能理论预测

按照具有晶体结构的人IgG抗体可变区重链三维构象，依据Kabat分类、骨架及CDR区构象分成7种主要类型。以上述具有晶体结构的V_H1～V_H7七类V_H为模板，将VH的三个CDR区分别用PT2、PT3和PT4(沈倍奋等(2003)中国专利申请号03104870.6)取代，构建新型抗原拮抗肽抗体。以TNF晶体结构为模板，借助鼠源抗体Z12与TNF相互作用模式，构建抗原拮抗肽抗体分子与TNF相互作用的空间三维模型(见图2.1.1-图2.1.7)。通过理论分析，计算新型分子与TNF-α的相互作用自由能、分子间氢键，确定相互识别区域及作用模式。

从计算机模建的结果来看，在这七类VH中，以VH5为模板设计的PTVH5与TNF(3)之间的作用最强。PTVH5与TNF(3)之间的作用的范德华能为-142.95993kJ、静电能为-76.43794kJ，结合自由能(范德华能+静电能)最低，为-219.39787kJ，结合TNF的作用最强(见表1)。

表1  以七类VH为骨架设计的PTVH新分子与TNF(3)的相互作用能

抗体类别          与TNF(3)的相互作用能(kcal)  范德华能  静电能  Total energy  PTVH1  -124.37434  -63.34997  -187.72430  PTVH2  -130.11285  -66.88474  -196.99760  PTVH3  -101.71723  -51.26208  -152.97932  PTVH4  -130.98950  -73.59378  -204.58328  PTVH5  -142.95993  -76.43794  -219.39787  PTVH6  -100.38918  -56.59211  -156.98129  PTVH7  -121.97990  -42.23596  -164.21586

PTVH5与TNF-α的作用区域较广，可以与三聚体中的两个单体作用，其中主要识别位点区域为TNF-α的活性部位141-146位(见表2)，这样得到的PTVH5最终可能会中和TNF-α的毒性作用，而且替代的三个CDR区都参与识别TNF-α(见表3)，可以与TNF(3)形成15对氢键(见表4)，对PTVH5与TNF-α之间的作用起重要作用。

           表2  七类PTVH新分子识别TNF(3)的区域

  新型分子的类别识别的区域(TNF epitiope)  Z12  A141-A146，B141-B146，C141-C146PTVH1  A103(R)，B23-B24(EG)，B65-B72(KGQGCPST)，B103-B110(RETPEGAE)，B114(W)，B138-B142(RPDYL)，B144(F)，C107-C110(EGAE)，C112(K)PTVH2  A92-A95(NLLS)，B20-B24(PQAEG)，B32(R)，B34(N)，B65-B68(KGQG)，B70(P)，B104(E)，B106-B113(PEGAEAKP)，B138-B149(RPDYLLFAESGQ)PTVH3  A20-A24(PQAEG)，A27(Q)，A65(K)，A67-A71(QGCPS)，A107(E)，A110-A111(EA)，A113(P)，A115(Y)，A138-A145(RPDYLLFA)PTVH4  C20-C25(PQAEGQ)，C65(K)，C67-C71(QGCPS)，C73-C74(HV)，C105-C113(TPEGAEAKP)，C137-C142(NRPDYL)，C144(F)PTVH5  B71-B75(STHVL)，C20-C24(PQAEG)，C65-C75(KGOGCPSTHVL)，C105-C115(TPEGAEAKPWY)，C138(R)，C140-C145(DYLLFA)PTVH6  A20-A25(PQAEGQ)，A65-A74(KGQGCPSTHV)，A106-A112(PEGAEAK)，A114(W)，A138-A145(RPDYLLFA)PTVH7  C20-C21(PQ)，C23-C24(EG)，C65-C70(KGQGCP)，C105-C111(TPEGAEA)，C138(R)，C140-C146(DYLLFAE)

表3七类PTVH新分子参与识别TNF(3)的区域

  新型分子类别             识别TNF的作用区域PTVH1  12-14(KKP)，48(Q)，50(P)，55-57(EWM)，106(Y)，108(A)，[PT3]110(Y)，113-123(TGYDGLYYNSM)PTVH2  [PT1]37-44(SVSNVVWY)，[PT2]63(P)，65-71(VNENRSQ)；85(K)，109(R)，[PT3]111-116(INTGYD)，118(L)，120(Y)PTVH3  34-35(YS)，37-41(SVSNV)，62-64(YPT)，85(T)，110-112(YIN)，114-118(GYDGL)，121-123(NSM)PTVH4  38-39(VS)，41-44(VVWY)，58-59(YT)，61(Y)，63-66(PTVN)，68-76(NRSQSVSNV)，85(N)，112-116(NTGYD)PTVH5  11-13(LVK)，34-45(YSQSVSNVVWYW)，64-66(TVN)，86-88(SKN)，109-116(RYINTGYD)  PTVH6  1-2(EV)，5-8(VQSG)，21-23(SCK)，27-36(NYTGEPTYSQ)，38(V)，100(T)，138(Q)  PTVH7  43-44(WY)，54-56(LEW)，61(Y)，63(P)，65(V)，73(V)，110-121(YINTGYDGLYYN)

表4 VH5和(TNF)3之间形成的氢键

           VH5和(TNF)3之间形成的氢键  供体  受体  距离  角度  (TNF)3:B71:HG  VH5:115:O  2.41  129.81  VH5:115:HH  (TNF)3:B74:O  1.86  152.93  (TNF)3:C23:HN  VH5:36:N  2.48  165.94  (TNF)3:C23:HE2  VH5:38:O  1.75  158.12  VH5:39:HG  (TNF)3:C65:O  1.63  165.99  VH5:109:HH11  (TNF)3:C65:NZ  2.38  160.95VH5:38:HN(TNF)3:C67:OE11.86166.84  (TNF)3:C71:HN  VH5:41:O  2.01  173.67  (TNF)3:C110:HE2  VH5:110:OH  1.65  164.08  VH5:113:HG1  (TNF)3:C111:O  1.72  145.83  (TNF)3:C115:HH  VH5:112:OD1  1.65  174.63  (TNF)3:C138:HH11  VH5:86:O  2.14  158.68  (TNF)3:C138:HH21  VH5:86:O  2.27  152.67  (TNF)3:C138:HH22  VH5:40:OD1  2.14  159.26  (TNF)3:C144:HN  VH5:36:OE1  2.05  157.25

1.3.2全合成编码PTVH5的DNA：

选择E.coli偏爱的密码子，将PTVH5的氨基酸序列反翻译成DNA序列，长405bp，CAI＝0.5217(CAI：codon adaptation index，偏性密码子指数)，这也与大多数E.coli胞浆内的高丰度蛋白质所采用的CAI值相似。

将PTVH5的正链和负链DNA各分成6段，正链与负链中的相应两段(如序列1和F1)重迭18-22bp，有利于PCR过程的延伸。分析每段的二级结构，修改碱基，消除过多的发夹结构，便于PCR扩增(见图1.2.1和图1.2.2)。将12段序列混合后作为模板，经过PCR扩增得到了与目的片段大小一致的产物(见图1.3.1)。

1.3.3PTVH5/pET22重组表达质粒的构建：

将PCR扩增得到的全长PTVH5 DNA序列连接到pET22载体后，构建的重组质粒PTVH5/pET22经XbaI和EcoRI酶切鉴定正确(见图1.3.2)，整个序列测定完全正确(见图1.3.3)。

1.3.4PTVH5蛋白表达水平的提高与纯化鉴定

已构建的PTVH5/pET22重组质粒诱导后有表达，但表达水平很低，这会给后续的纯化带来很大困难。重组蛋白的表达水平与mRNA的起始区二级结构、终止密码子附近的二级结构以及全长mRNA的二级结构和半寿期等因素有关。在PTVH5/pET22中，在目的蛋白PTVH5之前有一个pelB信号肽，长21个氨基酸残基(63bp)，因此基本可以排除mRNA的起始区二级结构的影响。对于mRNA整体结构和半寿期，到目前为止还没有很精确的计算和预测方法。终止密码子TAA附近的RNA二级结构对表达水平也有很大影响，结构紧密、自由能相对较低，有利于维持RNA在翻译过程中的稳定性，不易降解，有利于蛋白的高效表达，但是自由能不能太低，自由能过低时RNA往往都是反复折叠的紧密结构，会给转录和翻译造成很大困难。

本发明中尝试了修改3′端的结构，计算终止密码子TAA附近70bp的RNA二级结构的自由能，然后比较了结构变化对表达水平的影响。设计突变引物，将编码135位的Ser残基的密码子TCC突变为AGC，3′端的自由能从-49.348kJ/mol提高至8.782kJ/mol，PTVH5的表达水平增加到12％(见图1.4.1-图1.4.3)。

另一方面，PTVH5中两个半胱氨酸必须形成二硫键才能正确折叠，PTVH5也才有活性。由于pET22的pelB信号肽序列能够携带PTVH5至大肠杆菌的外周腔中(periplasm)，此处氧化还原电位比细胞浆高，有利于二硫键的形成，从而可以促使PTVH5正确折叠。而没有进入外周腔的目的蛋白则在胞浆中以包涵体的形式存在(见图1.5.1，图1.5.2)。超声后，上清中正确折叠的PTVH5蛋白由于带有6×His标签，经螯合Ni²⁺的琼脂糖亲和层析柱可以得到富集。

在利用螯合Ni²⁺的琼脂糖亲和层析柱纯化PTVH5时，在上柱前的上清中加入20mM咪唑和0.2％的Tween 20，可以有效地降低非特异性吸附，有利于PTVH5的富集，洗涤时用50mM的咪唑洗涤5-10个柱体积，可进一步增加目的蛋白的纯度。最终得到的目的蛋白纯度达80％以上(见图1.5.3)。

1.3.5PTVH5功能的测定：

(1)PTVH5对Z12-HRP的竞争抑制试验：

如果PTVH5有活性的话，那么可以与Z12-HRP竞争结合包被在酶标板上的TNF-α，Z12-HRP的显色就会降低。实验结果说明，PTVH5可以竞争抑制Z12-HRP与TNF-α的结合(见图1.6.1)。当Z12-HRP稀释度为1∶500时，200μg/ml的PTVH5的抑制率为52％。

(2)PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应

实验原理与PT4FC对TNF-α细胞毒的抑制效应相类似。在TNF-α作用下，L929细胞会发生凋亡，在加入放线菌素D抑制细胞分裂的同时，L929细胞凋亡的数量就与TNF-α的活性相关，加入PTVH5可部分抑制TNF-α的细胞毒性。在TNF-α浓度为0.2μg/ml时，200μg/ml的PTVH5可以抑制45％的细胞毒性(见图1.6.2)。

当PTVH5的浓度为200μg/ml时，对于不同浓度的TNF-α，所得到的OD570吸光度值与不加PTVH5时明显不同，与加入同样浓度的PTVH5/pET22的上清的对照也明显不同，说明PTVH5对TNF-α细胞毒的抑制效应是特异的(见图1.6.3)。

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                       序列表

<110>秦卫松

     冯健男

     黎燕

     沈备奋

<120>一种人工构建的生物活性分子及其制备方法

<130>CP1040125

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>135

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PTVH5pro

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1               5                   10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Glu Pro

            20                  25                  30

Thr Tyr Ser Gln Ser Val Ser Asn Val Val Trp Tyr Trp Ile Arg Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Thr

    50                  55                  60

Val Asn Glu Asn Arg Ser Gln Ser Val Ser Asn Val Phe Arg Val Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser

                85                  90                  95

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Gly Tyr Asp Gly Leu Tyr Tyr Asn Ser Met Asp Trp Gly Gln Gly

        115                 120                 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    130                 135

<210>2

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PTVH5

<400>2

caggttcaac ttcaggaatc tggtccgggt ctggtaaaac catctgaaac cctgtctctg     60

acttgtacag tgtctatcaa ctataccggc gagccgacct actcccagtc tgtgtctaac    120

gtagtttggt actggattcg ccaacctccg ggtaaaggtc tggagtggat cggttacacg    180

tattatccga ccgtcaacga aaaccgttct caatccgtct ccaacgtttt ccgtgttact    240

atctctgttg ataccagcaa aaaccagttt tccctgaagc tgtcttccgt aacagcagct    300

gatacagccg tgtattactg cgcgcgttac attaacacgg gctatgacgg cttatattat    360

aactctatgg attggggtca aggcacttta gtgacggtga gctcc                    405

<210>3

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5

<400>3

caagttcaac tgcaagaatc tggtccgggt ctggtaaaac catctgaaac cctgtctctg     60

acttgtacag tgtctatcaa ctataccggc gagccgacct actcccagtc tgtgtctaac    120

gtagtctggt actggattcg ccaacctccg ggtaaaggtc tggagtggat cggttacacg    180

tattatccga ccgtcaacga aaaccgttcc cagtctgtct ccaacgtttt ccgtgttact    240

atctctgttg ataccagcaa aaaccagttt tccctgaagc tgagctccgt aacagcagct    300

gatacagccg tgtattactg cgcgcgttac attaacacgg gctatgacgg cttatattat    360

aactccatgg attggggtca gggcacttta gtgacggtga gctcc                    405

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>4

gcgacttcca tatgcaagtt caacttcagg aatctggtcc                           40

<210>5

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>5

tgaaaccctg tctctgactt gtacagtgtc tatcaactat accggcgagc cgacctac       58

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>6

gtagtttggt actggattcg ccaacctccg ggtaaaggtc tggagtggat cggttacac      59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>7

gaaaaccgtt ctcaatccgt ctccaacgtt ttccgtgtta ctatctctgt tgataccag      59

<210>8

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>8

tgaagctgtc ttccgtaaca gcagctgata cagccgtgta ttactgcgcg cgttac         56

<210>9

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>9

cggcttatat tataactcta tggattgggg tcaaggcact ttagtgacgg tgagctcc       58

<210>10

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>10

aagtcagaga cagggtttca gatggtttta ccagacccgg accagattcc tgaagttg       58

<210>11

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>11

gaatccagta ccaaactacg ttagacacag actgggagta ggtcggctcg ccggtatag      59

<210>12

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>12

ggattgagaa cggttttcgt tgacggtcgg ataatacgtg taaccgatcc actccag        57

<210>13

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>13

ttacggaaga cagcttcagg gaaaactggt ttttgctggt atcaacagag atagtaac       58

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>14

ccatagagtt ataatataag ccgtcatagc ccgtgttaat gtaacgcgcg cagtaatac      59

<210>15

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰的PTVH5片段

<400>15

tgccgactcg agggagctca ccgtcactaa agtgccttga c                         41

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

tgccgactcg aggctgctca ccgtcactaa agtg                                  34