高比活植酸酶基因及其高效表达

摘要

本发明提供了一种高比活植酸酶及其编码基因，筛选到的植酸酶基因(定名为PHYQ)编码的植酸酶，其比活性高达4.1×106IU/mg蛋白，与目前报道的比活性最高的植酸酶APPA(来源于大肠杆菌)相比，比活性高37％。该基因phyQ长该基因全长1299bp，编码432个氨基酸，与报道的植酸酶相比，同源性最高的是来源于大肠杆菌的植酸酶APPA，本发明还提供了含有本发明的植酸酶基因的重组酵母细胞。本发明的重组酵母中植酸酶的表达量可达到5.5×106U/mL发酵液。本发明中的植酸酶可应用于饲料工业中作为饲料添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高比活植酸酶及其编码基因。本发明还涉及含有该植酸酶基因的、能高效表达植酸酶的重组酵母细胞。

背景技术

植物中50～70％磷以植酸磷(肌醇六磷酸)的形式存在(Lolas M.Etal.Food Sci.42：1094-1097，1977；Nelson T.S.Poultry Sci.47：862-871，1967)，不能直接被单胃动物和人所利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.Alltech TechnicalPublication，Nicholasville，KY，133-145)，造成磷源浪费、饲料成本增加，同时，植酸磷不能被动物利用而直接排出体外，还会造成土壤及水域的磷污染。另外，植酸还能与动物所必须的微量元素及蛋白质螯合，使这些营养元素不能有效利用，导致了植物性饲料(或食品)营养价值的降低(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17：201-204，1978)。广泛存在于微生物中的植酸酶(Phytase，肌醇六磷酸酶)将植酸水解为肌醇和磷酸。植酸酶喂饲效果已有确证，可使饲料中磷的利用率提高60％，粪便磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此饲料中加入植酸酶，可减少无机磷酸盐加入量，对提高畜牧业生产效益和降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

虽然植酸酶具有良好的饲喂效果(Ware J.H.et al.，US PatentNo.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 101：1289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.47：1842-1848，1968)，但到目前为止它还没有在饲料工业上得到广泛应用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表达量太低，从而难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求(Han Y.W.，Animal Feed Sci.Technol.，24：345-350，1989).随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的(Conneely O.M.，Biotechnologyin the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，Alltech Technical Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992)。

几种微生物来源的植酸酶基因已得到了分离，如酵母Saccaromyces cerevisiae(Bajwa W.，Nucleic Acids Res.12：7721-7739，1984)、Aspergillus niger(MacRae W.D.，Gene，71：339-348，1988；姚斌，农业生物技术学报，Vol.6，No.1，1-6，1998)、A.terreus和Myceliophthorathermophila(van Loon，Patent NO.EP 0684313A2，1995)、A.niger(ficuum)(van Hartimgsveldt et al.，Gene，127：87-94，1993；Ehrlich K.C.，Biocem.Biophys.Res.Comm.195：53-57，1993)、A.niger var.awamori(Piddington C.S.Gene，133：55-62，1993)等。

通过基因工程手段使植酸酶基因在重组菌株中高效表达是植酸酶得以大规模廉价生产和实际应用的有效途径。1995年Van Gorcomd等(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)将酸性植酸酶基因phyA重组到黑曲霉中，使植酸酶在重组菌株中的表达量达到了2.8×10⁵U/mL，与天然植酸酶产生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生产成本。1997年姚斌等构建的基因工程酵母在小试水平上其酸性植酸酶的表达量达到5×10⁵U/mL(相当于每毫升发酵液中表达5mg植酸酶蛋白)(姚斌等，中国发明专利97121731.9，2000)，中试水平上将表达量提高到1×10⁶U/mL发酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger 963中的植酸酶表达量高3000倍，比国外正在用于商品化生产酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent 5436156,1995)高一倍以上。最近姚斌等采用来源于大肠杆菌的高比活植酸酶基因构建了重组酵母，将植酸酶的表达水平提高到6×10⁶以上(姚斌，生物工程学报，20(1)：78～84，2004)。

目前分离到的比活性最高的植酸酶为来源于大肠杆菌的植酸酶APPA(Golovan S.Can J Microbiol，46：59～71,2000)。其比活性可达3,000,000IU/mg左右。

发明内容

本发明的目的是通过构建猪肠道微生物总DNA基因组文库的方法，直接筛选到高比活植酸酶基因，进一步，利用生物反应器毕赤酵母(Pichia pastoris)高效表达此基因，使植酸酶得以廉价生产。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的植酸酶的DNA分子。所述的DNA分子具有图2(SEQ ID NO.1)的核苷酸序列。

本发明的再一目的是提供本发明的植酸酶基因在表达系统中高效表达的方法。

本发明人从猪肠道微生物总DNA中筛选到高比活植酸酶基因。筛选到的植酸酶基因(定名为PHYQ)编码的植酸酶，其比活性高达4.1×10⁶IU/mg蛋白，与目前报道的比活性最高的植酸酶APPA(来源于大肠杆菌)相比，比活性高37％。该基因phyQ长该基因全长1299bp，编码432个氨基酸，与报道的植酸酶相比，同源性最高的是来源于大肠杆菌的植酸酶APPA，但核苷酸序列同源性仅为67.7％，氨基酸序列同源性仅为50.3％，是一种新的植酸酶基因，具有如图2(SEQ ID NO.2)所述的核苷酸序列。

本发明还提供了具有如图3(SEQ ID NO.2)所示的氨基酸序列的植酸酶具有。

本发明提供了phyQ基因在表达系统中高效表达的方法。包括整套重组表达载体的构建、受体菌的遗传转化、重组子的筛选与分子鉴定方法以及重组子中植酸酶表达，其中本发明采用毕赤酵母(P.pastoris)作为phyQ基因的表达受体，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产植酸酶奠定了基础。

上述phyQ基因在表达系统高效表达的方法中，其它可以使用的真核表达系统为昆虫表达系统如家蚕-杆状病毒表达系统、霉菌表达系统如黑曲霉表达和植物表达系统如玉米、大豆等。

上述phyQ基因在表达系统高效表达的方法中，可以使用大肠杆菌作为克隆和表达该植酸酶基因的载体。

本发明还提供了含有所述phyQ基因的表达载体。

本发明提供了phyQ的表达载体pPIC9-phyQ。

本发明提供的具体技术方案如下：

1.猪肠道中微生物总DNA的提取和纯化  参照从土壤中提取、纯化总DNA的方法(张福瑞等，微生物学报，2003，2：276-282；Ogram A等，J Microb.Methods，1987，7：57-66)。

2.基因克隆按常规方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New York：Cold Spring harbor laboratory，1982)。将提取的总DNA酶切后克隆到大肠杆菌载体pET-22b(+)上，同样的方法也可克隆到大肠杆菌克隆载体或表达载体上，如pPUC18、pPGEM等，转化大肠杆菌，获得重组子。

3.植酸酶的筛选  对重组大肠杆菌表达的植酸酶进行性质测定，筛选出比活性高的植酸酶的编码基因，并进行序列测定。

4.重组高效表达体系的构建选择高效表达系统-P.pastoris作为表达植酸酶基因的生物反应器。通过体内重组使植酸酶基因整合到酵母的基因组上，筛选出阳性重组子。别的真核表达系统如杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统等也适应于此基因的高效表达。

本发明提供了具有高比活性的植酸酶及其编码基因。通过基因工程手段使植酸酶基因在重组菌株中高效的表达，使得植酸酶可以大规模的廉价生产，并在实际中得到广泛的应用。带来巨大的经济效益。

附图说明

图1大肠杆菌重组载体pWY的物理图谱

图2phyQ基因DNA序列

图3推导出的phyQ编码的氨基酸序列

图4重组酵母表达载体pPIC9-phyQ的物理图谱

图5在5L发酵罐中表达植酸酶的发酵曲线；具体实施方式

具体实施方式

                      实验条件

1.菌株与载体  大肠杆菌菌株E.coli DH5a、质粒pET-22b(+)等购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His-Mut+)、质粒pPIC9由加拿大Alberta大学D.Luo博士惠赠(Invitrogen公司产品)。

2.酶与试剂盒  限制性内切酶、连接酶为Boehringer公司产品。

3.生化试剂  IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

4.培养基  大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。

                      实验一

本实验说明猪肠道微生物总DNA的提取和纯化程序。

取猪肠液0.5mL，加入1mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸钠，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，pH9.0)，混匀，加入100mL蛋白酶K(10mg/mL)，37℃摇动1hr，加入1.5mL 20％的SDS，65℃水浴2hr，6000rpm离心10min，收集上清液。沉淀部分再加入450mL提取液和50mL的20％SDS，65℃水浴2hr，6000rpm离心10min，收集上清液并与上次上清液合并。上清液中加入等体积的氯仿抽提，上清液用0.6倍体积沉淀。沉淀溶于50mL水中备用。

DNA纯化采用电泳纯化的方法。将提取的总DNA在0.5％的琼脂糖凝胶电泳，切取DNA条带，用QXII DNA纯化试剂盒回收，回收方法见试剂盒使用说明。

实验二

本实验说明DNA分子的克隆程序。

实验一中获得的DNA分子，用Sau3A部分酶切，使酶切片断集中在2.0～8.0kb，电泳回收，与经BamHI酶切的载体pET-22b(+)于15℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coli DH5a，LB培养基上涂板后挑选阳性重组子，提取质粒进行酶切鉴定，得到重组子。每个重组子中含有一段DNA分子。

实验三

本实验说明进行突变植酸酶的筛选程序。

实验二中得到的5000个重组子，分别接种到5mL LB培养液中，37℃培养至OD值0.6，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续培养2小时，诱导表达植酸酶。离心收集菌体，菌体重悬于5mL 0.25mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)中，超声波破碎菌体，15000rpm离心15分钟去细胞碎片，上清液用于进行植酸酶酶活性测定。测定方法为：0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mL 10％TCA使酶灭活，再加入同体积的底物保温。一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1nmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。筛选到8个重组子可产生植酸酶活性，进一步通过实验确定植酸酶的比活性。8个重组子培养后，收集菌体细胞，进行超声波破碎，含植酸酶的细胞破碎液用85％硫酸胺沉淀浓缩，纯化用KTA FPLC快速液相色谱仪(Pharmacia公司)纯化。含酶的浓缩液首先用HiPrep_26/10_Desalting柱脱盐，缓冲液为20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速为5mL/min，收集洗脱峰，接着用离子交换柱Hitrip_SP_Sepharose_XL(5mL)分离，A泵为15mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，B泵为1mol/L NaCl、15mmol/LHAc-NaAc(pH5.0)高盐缓冲液，流速为1.5mL/min，高盐缓冲液从0～100％梯度洗脱10个柱床，分部收集洗脱峰，通过酶活性测定后的洗脱峰进一步用凝胶柱Superdex 75HR 10/30纯化，缓冲液同样为15mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速为0.8mL/min，收集洗脱峰得到纯蛋白。对纯化的植酸酶进行酶活性的测定，计算酶活性和酶蛋白的比值，得到酶的比活性。8个重组子中，产生的植酸酶比活性最高的达到4.1×10⁶IU/mg蛋白，高于目前报道的所用植酸酶，比目前发现的比活性最高的植酸酶APPA还高37％。该重组质粒定名为pWY，该植酸酶定名为PHYQ。

实验四

本实验说明植酸酶PHYQ的序列。

对重组质粒pWY上的植酸酶基因进行序列测定，图3为其核苷酸序列，图4为其氨基酸序列。结果表明，该基因phyQ长该基因全长1299bp，编码432个氨基酸，与报道的植酸酶相比，同源性最高的是来源于大肠杆菌的植酸酶APPA，但核苷酸序列同源性仅为67.7％，氨基酸序列同源性仅为50.3％，是一种新的植酸酶基因。

实验五

本实验说明phyQ在酵母表达载体上的构建程序。

用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将植酸酶基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：根据植酸酶基因phyQ的5’端和3’端设计一对引物，在引物上加上EcoRI位点(p1：5’TTGAATTCATGATACCCACCGGAAACCC；p2：5’GCGAATTCTTACAGATCCCACGCCAAAAT)，以重组质粒pWY为模板，PCR扩增出1.3Kb的植酸酶基因，用EcoRI酶切后，电泳回收约，再将它们插入到载体pPIC9上的EcoRI位点，通过序列测定判断phyQ的插入方向，得到了插入方向正确的用于酵母转化的重组表达载体-pPIC9-phyQ(图4)。这样就将带有α-因子分泌信号的植酸酶基因克隆到了AOX1启动子下游。

                      实验六

本实验是说明酵母转化及筛选重组酵母株系的程序。

质粒pPIC9-phyQ的DNA经BglII酶切后电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因将整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的植酸酶氨基酸序列按设计应与天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。

首先用2～3倍过量的内切酶BglII消化质粒pPIC9-phyQ的DNA，使之线性化，电泳检测酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，取5μgDNA转化毕赤酵母细胞，在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下将培养皿倒置培养至转化子出现。

转化子可在基本培养基RDB(不含His)上生长，而非转化子不能生长，这是因为受体菌GS115为组氨酸缺陷型，而载体上虽然带有his4基因，但没有酵母复制子，所以载体上的his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于重组的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(mut-)。

用无菌牙签从转化平板RDB上挑取his+重组子，首先接种到MM固体培养基上，再接种到MD固体培养基上，如此挑取his+重组子，30℃培养2天。筛选在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子(his+mut-)即为阳性克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中植酸酶的表达情况。将his+mut-转化子首先在BMGY培养基中培养，待其生长至饱和状态，离心弃BMGY，换入诱导培养基BMMY，在诱导培养36h后取上清液进行植酸酶酶活性分析。通过表达植酸酶的酶活性测定，从350株重组酵母中初步筛选到42株表达植酸酶的重组子，其中表达量最高的1株重组子，定名为P.pastoris phyQ-66。

                     实验九

本实施例是说明重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产植酸酶的程序。

发酵过程分为三个阶段。具体如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基10×Basal Salts接种前先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18～24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重达到90～110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为28mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此步结束时菌体湿重达到180～220g/L。3)诱导表达阶段。加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的植酸酶的积累量。

结果表明，表达的植酸酶随诱导时间的增加而积累，在诱导120小时时达到高峰，酶活性达到5.5×10⁶U/mL发酵液(图5)。结果证明植酸酶基因不仅得到了表达、有效分泌，且表达的植酸酶具有正常的生物学活性。

Application Project

<110>Applicant：刘大庆

<120>Title：高比活植酸酶基因及其高效表达

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