一种提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性的方法

摘要

本发明涉及一种提高金龟子绿僵菌孢子储藏稳定性的方法。它首先是构建金龟子绿僵菌中性海藻糖酶RNA干扰载体，然后再建立分生孢子转化体系。所得转化子利用DNA印迹鉴定，RNA印迹检测转化子中性海藻糖酶基因的表达量，比较转化子和出发菌株孢子内海藻糖含量、耐贮性、耐热性，可以得知转化子与出发菌株孢子的海藻糖含量、耐贮性和耐热性都有很大的差异。通过这种方法可使金龟子绿僵菌孢子的耐贮性、耐热性得到很大的提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高真菌孢子储藏稳定性的方法，特别是一种提高金龟子绿僵菌孢子储藏稳定性的方法。

背景技术

海藻糖(α-D-葡萄糖苷(1，1)-α-D-葡萄糖苷)是非还原性二糖，广泛存在于微生物、植物及一些低等动物中。在生物体内，它不仅作为结构成分和能量物质存在，而且在热击和脱水等协迫条件下，对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用，是一种抗逆境剂。海藻糖酶(EC 3.2.1.28)是海藻糖水解酶，它将海藻糖水解成两分子葡萄糖。真菌海藻糖酶根据其最适pH和调节特性分为酸性和中性海藻糖酶。在完整细胞内，海藻糖是由中性海藻糖酶分解而非酸性海藻糖酶。

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一种重要的虫生真菌，广泛运用于农业害虫如多种蝗虫的生物防治，与其它真菌制剂一样，其孢子制成的产品常常不稳定。阻碍绿僵菌等杀虫真菌制剂大规模应用的主要原因之一就是孢子的储藏稳定性。欲提高金龟子绿僵菌孢子的耐贮性和抗逆境能力，可通过抑制金龟子绿僵菌孢子体内中性海藻糖酶基因的表达，提高海藻糖含量来增强孢子储藏能力和抗逆能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性的方法，以便于金龟子绿僵菌孢子的储藏。

本发明是这样实现的：一种提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性的方法，其特征在于：首先构建金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸干扰载体，然后建立分生孢子转化体系。

它是通过核糖核酸干扰技术构建中性海藻糖酶核糖核酸干扰载体，利用基因枪转化法转化金龟子绿僵菌孢子，并筛选出稳定的转化子加以利用。

提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性的具体方法是：采用金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因中部一段编码序列构建发卡—环状的核糖核酸(RNA)干扰载体，可有效起着降低中性海藻糖酶基因信使RNA(mRNA)含量的作用；利用基因枪法转化金龟子绿僵菌分生孢子的体系，该体系可有效地将质粒pBTM-RNAi整合到金龟子绿僵菌基因组中，经过抗性筛选和聚合酶链式反应法筛选稳定的转化子。

上述所得转化子利用DNA印迹鉴定，RNA印迹检测转化子中性海藻糖酶基因的表达量，比较转化子和出发菌株孢子内海藻糖含量、耐贮性、耐热性，可以得知转化子与出发菌株孢子的海藻糖含量、耐贮性和耐热性都有很大的差异。这样的金龟子绿僵菌孢子的耐贮性、耐热性都得到了很大的提高。

附图说明

图1：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰载体结构示意图；

图2：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰转化子的Southern杂交验证；

图3：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰转化子的Northern杂交分析；

图4：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰转化子Ma688和金龟子绿僵菌菌株CQMa102不同成熟度分生孢子内海藻糖含量比较；

图5：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰转化子Ma688和金龟子绿僵菌菌株CQMa102分生孢子耐贮性比较；

图6：金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(RNA)干扰转化子Ma688和金龟子绿僵菌菌株CQMa102分生孢子耐热性比较。

在图2中：1、RNA干扰载体；2、金龟子绿僵菌CQMa102基因组DNA；3-5、3个RNA干扰转化子基因组DNA。

在图3中：1、金龟子绿僵菌CQMa102；2、RNA干扰转化子Ma217；3、RNA干扰转化子Ma688；4、RNA干扰转化子Ma573。

具体实施方式

实施例：一种提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性的方法

1、构建金龟子绿僵菌中性海藻糖酶核糖核酸(以下简称为RNA)干扰载体：

参见图1，根据金龟子绿僵菌菌株CQMa102中性海藻糖酶基因反转录DNA(cDNA)序列(GenBank登录号：AY557612)设计引物，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出一段正向编码序列(366→1508(从起始密码子ATG中A开始记数)和一段反向互补编码序列(891→366)，将这两段序列相连接，并在5’端加一来自于构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子，在3’端加一来自于构巢曲霉色氨酸(trpC)基因的终止子，然后将此片段通过限制性内切酶Spe I和Not I双酶切、连接到质粒pBTM上，形成RNA干扰载体pBTM-RNAi，将此载体转入金龟子绿僵菌菌株CQMa102，整合到基因组DNA后，可以转录出中性海藻糖酶基因366→891正向编码序列和891→366反向互补编码序列，这两段序列可以互补连接形成发卡结构，中间891→1508(图1中的spacer)可形成一个环状结构，这种发卡—环结构比较稳定，经过核酸内切酶III加工成21-25个碱基的小干扰RNA，此小干扰RNA就可进一步引起中性海藻糖酶基因的沉默。

2、建立分生孢子转化体系

将金龟子绿僵菌CQMa102成熟分生孢子10⁷个/ml涂布于1/4 SDA(strengthSabouraud’s dextrose agar)培养基上，26℃-28℃，培养10天，收集分生孢子，无菌水悬浮，4000r/m离心5min沉淀孢子，无菌水重悬再洗2次，最后无菌水重悬使其孢子浓度达10⁹个/ml，取50μl分生孢子悬液(约5×10⁷个孢子)于灭菌60mm平皿中央，使其直径达1cm，然后放于70％乙醇灭菌的基因枪室内用于转化。

按照Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System(Bio-Rad)系统提供的方法进行金粉的处理和质粒pBTM-RNAi的包埋，并利用该系统，以1350psi气压，27.5英寸汞(Hg)真空度进行微粒子轰击。轰击后取出样品，在超净台上取出孢子液，用5ml1/4SDA液培重悬，26℃-28℃，50r/m，预培18h，离心收集孢子，无菌水冲洗，重悬于5ml 1/4SDA液培，取100μl涂布于含5μg/ml苯莱特的1/4SDA平板上，26℃-28℃，培养7天。

7天后挑取正常生长并产孢的菌落，接种于不含抗生素的1/4SDA培养基上，26℃-28℃培养7天，再从该平板中挑取单菌落接种于不含抗生素的1/4SDA培养基上，如此重复接种5次后，从中挑取单菌落接种于含5μg/ml苯莱特的1/4SDA培养基上，如果该单菌落仍然能够正常生长，可以认为是较稳定的转化子。

为了验证本发明提供的方法可以提高金龟子绿僵菌孢子耐贮性和耐热性，发明人作了如下实验：

1、利用DNA印迹鉴定转化子，RNA印迹检测转化子中性海藻糖酶基因的表达量

培养稳定转化子的菌丝并提取DNA，进一步做PCR筛选，然后利用DNA印迹鉴定转化子，DNA印迹杂交结果如图2所示，采用的探针为RNA干扰载体的部分gpdA启动子序列，从图2中可以看出：只有RNA干扰载体转入金龟子绿僵菌CQMa102基因组中才能显示出与RNA干扰载体相同大小的杂交带，出发菌株无与此探针同源的序列，则无杂交带可见。

利用RNA印迹分析RNA干扰转化子中性海藻糖酶基因的表达量，Northern杂交结果如图3所示。3个RNA干扰转化子中性海藻糖酶基因的表达量与出发菌株相比，都有所下降，其中RNA干扰转化菌株Ma688的表达量最低，经定量软件分析约为出发菌株的42％。

2、分生孢子内海藻糖含量检测：

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102成熟孢子划线接种1/4SDA培养基，26℃-28℃条件下培养，分别收集培养4天、6天、8天和10天的分生孢子，用0.05％吐温80窝旋悬浮分生孢子，静置2min，小心吸取上清孢子悬液，弃下层菌丝残片。重复此操作几次可得到较纯的分生孢子悬液。然后利用血球计数板计数分生孢子悬液的孢子浓度，计算孢子数量。无菌水冲洗2次，0.5ml无菌水重悬孢子，100℃煮沸20min，冰上冷却5min，加入适量0.5mm直径的玻璃珠窝旋20min，15000r/m离心10min，取上清，记录液体总体积，取上清50μl加入50μl柠檬酸钠缓冲液中(pH5.6)，然后加入10μl酸性海藻糖酶，混匀，30℃保温过夜，同时做一用灭菌水代替酸性海藻糖酶的对照，分别做3个重复。反应液于100℃煮沸10min终止反应，冰上冷却5min，10000r/m离心10min，取40μl上清液加入160μl葡萄糖测定试剂(北京中生北控生物科技股份有限公司)，37℃反应15min，使用Model 550酶标仪，于505nm处测定溶液的0D值。

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102分生孢子海藻糖含量如图4所示。这两种菌株分生孢子在生长4天时，海藻糖含量就有显著性差异，Ma688的海藻糖增加28％；在生长6天、8天和10天时，Ma688的海藻糖含量迅速增加，与出发菌株的差异达到极显著。

3、孢子耐贮性检测：

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102成熟孢子划线接种1/4SDA培养基，26℃-28℃条件下培养10天，收集分生孢子，用PBS/0.1％吐温80(150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液pH7.2，0.1％吐温80)悬浮，使其浓度达到10⁹个孢子/ml，然后于20℃储藏，取储藏0天、10天、20天、30天、35天的适量孢子悬液用PBS/0.1％吐温80稀释到10⁷，然后取2μl涂布于置于1/4SDA平板上直径约0.5mm的玻璃纸上，27℃培养20h，取出玻璃纸用棉兰乳酚油(20ml苯酚，20ml乳酸，40ml甘油，0.05-0.1％棉兰，定容到100ml)染色，显微镜观察计数萌发孢子。

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102分生孢子的耐贮性如图5所示。Ma688孢子在各个储藏时间点的萌发率都比出发菌株高，随着储藏时间的延长，与出发菌株的差异越大。

4、孢子耐热性检测：

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102成熟孢子划线接种1/4SDA培养基，26℃-28℃条件下培养10天，收集分生孢子，用PBS/0.1％吐温80悬浮分生孢子，并梯度稀释到10⁴，取50μl孢子悬液分装于0.2ml扩增管，分别经45℃热处理0h、2h、4h、6h、8h，然后从中取20μl(约200个分生孢子)涂布到加入0.1％ Triton X-100的1/4SDA平板上(0.1％Triton X-100可限制菌落的扩散生长，便于计数)，26℃-28℃培养4天，观察计数生长菌落数。

RNA干扰转化菌株Ma688和出发菌株CQMa102分生孢子的耐热性如图6所示，Ma688孢子在各个热处理时间点的存活率与出发菌株比较都达到极显著差异。

可见，RNA干扰转化子与出发菌株孢子的海藻糖含量、耐贮性和耐热性都有很大的差异，这样的金龟子绿僵菌孢子的耐贮性、耐热性都得到了很大的提高。