公开/公告号CN1774449A
专利类型发明专利
公开/公告日2006-05-17
原文格式PDF
申请/专利权人 俄克拉荷马医学研究基金会;伊利诺伊大学董事会;
申请/专利号CN01822927.1
申请日2001-12-28
分类号C07K14/81(20060101);A61P25/28(20060101);A61K38/55(20060101);C07K5/03(20060101);C12Q1/37(20060101);
代理机构72002 永新专利商标代理有限公司;
代理人过晓东
地址 美国俄克拉荷马州
入库时间 2023-12-17 17:16:35
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-02-27
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K14/81 授权公告日:20100217 终止日期:20111228 申请日:20011228
专利权的终止
2010-02-17
授权
授权
2006-07-12
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-05-17
公开
公开
相关申请
本发明要求于2001年3月14日和2000年12月28日提交的美国专利申请No.60/275,756和No.60/258,705的权益，这两份申请的全部内容都通过在此引述而合并于本文。
发明背景
本发明涉及设计与合成天冬氨酸蛋白酶Memapsin2(beta-secretase或β-分泌酶)的特效抑制剂，该抑制剂用于治疗和/或预防阿耳茨海默氏病。
阿耳茨海默氏病(AD)是一种退化的脑紊乱，于1907年由Alios Alzheimer检查一位病人后首次文字纪录，该病人的认知能力急剧下降，诊断为痴呆(The early story of Alzheimer’s Disease，edited by Bick et al(Raven Press，New York 1987))。AD是老年痴呆的主要原因。其患者记忆力不断丧失，智力不断下降，最终丧失正常人的功能。随着智力的丧失，病人表现出个性变化、不适当的社会行为和精神分裂症(A Guide to the Understanding ofAlzheimer’s Disease and Related Disorders，edited by Jorm(NewYork University Press，New York 1987))。由于针对此类必然性神经退化没有有效的缓解或预防方法，AD给病人及其家庭带来毁灭性的后果。
AD与皮层、海马状突起、脑下脚、海马回、扁桃体中直径200微米的神经炎蚀斑有关。刚果红染色的淀粉朊是神经炎蚀斑最重要的成分之一(Fisher(1983)；Kelly Microbiol.Sci.1(9)：214-219(1984))。明视场中刚果红染色的淀粉蚀斑位于细胞外，呈粉红色或铁绣色，且在偏振光中呈现重折射。蚀斑是由多肽纤丝组成，通常出现在血管周围，从而导致对各种脑神经元供血的减少。
人们已经提出了可能作为AD神经病机理的各种致病因素，诸如遗传素因、传染物、毒素、金属和头部外伤。现有证据有力地表明AD存在遗传素因的特殊类型。首先，分子分析提供了证据，某些患AD的家族中淀粉前体蛋白(APP)基因中出现突变(Goate et al.Nature 349：704-706(1991)；Murrell et al.Science254：97-99(1991)；Chartier-Harlin et al.Nature 353：844-846(1991)；Mullan et al.，Nature Genet.1：345-347(1992))。对应AD早期发作主要形态的其它基因位于染色体14和染色体1(Rogaev et al.，Nature376：775-778(1995)；Levy-Lahad et al.，Science 269：973-977(1995)；Sherrington et al.，Nature 375：754-760(1995))。与AD相关的另一基因位置在染色体19上，其编码阿朴脂蛋白E的变异体(Corder，Science 261：921-923(1993))。
AD患者和寿命超过40岁的唐氏综合症患者出现大量的淀粉蚀斑。超量表达APP被认为是年龄超过30岁唐氏综合症患者发展成AD的潜在原因(Rumble et al.，New England J.Med.320：1446-1452(1989)；Mann et al.，Neurobiol.Aging 10：397-399(1989))。蚀斑也出现在正常老化的脑中，只是数量很少。蚀斑主要由淀粉β肽组成(Aβ；文献有时也称为β淀粉肽、或β肽)(Glenner and Wong，Biochem.Biophys.Res.Comm.120：885-890(1984))，该淀粉β肽也是脑血管淀粉沉淀的主要蛋白成分。淀粉朊是以β折叠片状排列的丝状物质。Aβ是由43个氨基酸组成的疏水肽。
为了确定其氨基酸序列，克隆APP cDNA(Kang et al，Nature325：733-735(1987)；Goldgaber et al，Science 235：877-880(1987)；Robakis et al，Proc Natl Acad Sci 84：4190-4194(1987)；Tanzi et al，Nature 331：528-530(1988))和染色体组的APP DNA(Lemaire et al，Nucl Acids Res 17：517-522(1989；Yoshikai et al，Gene87，257-263(1990)))。已鉴别出APP cDNA的许多类型，包括3个丰度最高的类型，APP695、APP751和APP770。这些形态是由单前体RNA交替剪切产生的。此基因跨度超过了175Kb，带有18个外显子(Yoshikai et al(1990))。APP含有一个胞外区、一个跨膜区和一个胞质区。Aβ是由恰处于疏水跨膜区外部的28个氨基酸和跨膜区的15个残基组成。Aβ正常情况下出现在脑和其它组织中，诸如心脏、肾、脾。然而，Aβ仅在脑中出现大量沉淀。
Van Broeckhaven等人(Sciene 248：1120-1122(1990))已经证明在两个荷兰家族中，APP基因紧紧关联于淀粉样变性的遗传性脑溢血(HCHWA-D)。在两位荷兰患者APP编码区中发现的点突变进一步证实此观点(Levy et al，Science248：1124-1128(1990))。Aβ位置22的突变是以谷氨酰胺替换了谷氨酸(APP695的位置618，或APP770的位置693)。此外，由于全长蛋白位置717的突变造成了氨基酸的替换(Goate etal(1991)；Murrell et al(1991)；Chartier-Harlin et al(1991))，某些家族遗传性地容易患有阿耳茨海默氏病，此病症被称为家族式阿耳茨海默氏病(FAD)。这些突变在各家族之间共同异化了疾病，并且不在AD晚期发作的家族中出现。氨基酸717突变增加了从APP生成Aβ的Aβ1-42类型的含量(Suzuki et al，Science264：1336-1340(1994))。另一突变类型含有全长蛋白位置670和671的氨基酸变化(Mullan et al(1992))。氨基酸670和671的突变增加了从APP生成Aβ的总量(Citron et al，Nature360：622-674(1992))。
APP被加工在体内的3个位点上。证据表明，由膜金属蛋白酶造成的β-分泌酶位点断裂是生理作用的结果。此位点位于距质膜内腔壁的第12个APP残基。距质膜内腔壁表面β-分泌酶位点第28个残基的断裂和β-分泌酶位点跨膜区域生成了40/42个残基的β淀粉肽(Aβ)，其于脑中的生成与积累在阿耳茨海默氏病发病机理中起重要作用(for review，see Selkoe，DJ Nature399：23-31(1999))。衰老蛋白素(Presenilin)1是人脑中发现的另一种膜蛋白，其控制着APPγβ-分泌酶位点的水解，已被确认为是起重要作用的蛋白酶(Wolfe，MS et al，Nature398：513-517(1999))。衰老蛋白素1是以单链分子表达，需要由一种称为衰老蛋白酶(presenilinase)的蛋白酶对其加工，防止其自身的迅速降解(Thinakaran，G et al，Neuron 17：181-190(1996)andPodlisny，MB，et al，Neurobiol Dis 3：325-37(1997))。衰老蛋白素的特性尚不得而知。据认为，体内对β-分泌酶位点的加工是Aβ生成的限速步骤(Sinha，S&Lieberburg，I，Proc Natl Acad Sci，USA，96：11049-11053(1999))，因此是有效的治疗靶。
有效减少淀粉蚀斑生成的抑制剂设计依赖于关键酶的鉴别，该关键酶能使APP断裂生成Aβ的Aβ1-42型，一种42个氨基酸的多肽。尽管已经鉴定出许多酶，但是尚不能制备活性酶。在无活性酶的情况下，人们既不能进一步确认底物的特异性，并确定亚位点的特异性，也不能确定相关的动力学或关键活性位点的残基，对于设计抑制剂这些都是至关重要的。
据已证明，Memapsin2是β-分泌酶，涉及从β-淀粉前体蛋白生成人脑β-淀粉肽的关键蛋白酶(参见Selkoe，DJ Nature399：23-31(1999))。当前人们普遍接受，人脑中β-淀粉肽积累是造成阿耳茨海默氏病的主要原因。特别为人类memapsin2设计的抑制剂应该减少β-淀粉肽的生成，抑制阿耳茨海默氏病的发展。
Memapsin2是天冬氨蛋白酶族的一员。其氨基酸序列相似于其它真核天冬氨蛋白酶，并含有此族特有的基序。此结构相似性预示memapsin2和其它真核天冬氨蛋白酶享有相同的催化机理(Davies，DR，Annu Rev Biophys Chem 19，189(1990))。对于天冬氨蛋白酶效果最好的抑制剂是这些酶过渡态的模拟物。这些抑制剂具有与底物类似的结构，由两个四面体原子(诸如羟基乙烯基[-CH(OH)-CH2])替换羰基碳原子和酰胺氮原子之间断裂的平面肽键，其首先从抑胃肽结构中发现的(Marciniszyn et al，1976)。
依旧需要开发新型改进的蛋白酶抑制剂，诸如有效治疗阿耳茨海默氏病患者的memapsin2抑制剂，该蛋白酶涉及从β-淀粉前体蛋白生成β-淀粉蛋白。
发明概述
本发明涉及memapsin2活性的抑制剂和使用memapsin2抑制剂治疗阿耳茨海默氏病患者的方法。
在一实施方案中，本发明提供了催化活性memapsin2的抑制剂，其结合于由2个催化的天冬氨残基和底物结合裂隙限定的memapsin2活性位点，抑制剂的Ki值小于或等于10-7M。
在另一实施方案中，本发明包括如下化合物，MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070和MMI-071。
在另一实施方案中，本发明还包括如下化合物，MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070和MMI-071。
另一实施例提供治疗患者降低其阿耳茨海默氏病恶化可能性的方法，其中包括将有效用量的memapsin2抑制剂给药于病体，抑制剂选自MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-070和MMI-071。
在另一实施方案中，本发明提供对应底物侧链、确定memapsin2亚位点优先的方法，其步骤有，先将memapsin2底物混合物与memapsin2反应，再通过测定memapsin2底物混合物的相对初始水解速率，测定memapsin2亚位点优先。
在另一实施方案中，本发明包括对应底物侧链、确定memapsin2亚位点优先的方法。先制备memapsin2抑制剂的组合文库，其中抑制剂含有取自OM99-2的基本序列。然后，以memapsin2探测抑制剂文库，memapsin2会结合一个或多个抑制剂生成一个或多个结合的memapsin2，再用memapsin2的抗体和结合第二抗体的碱性磷酸酶检测出结合的memapsin2。
在另一实施方案中，本发明包括治疗阿耳茨海默氏病患者的方法，其中包括以催化活性memapsin2的抑制剂给药于病体，该抑制剂结合于由2个催化的天冬氨残基和底物结合裂隙限定的memapsin2活性位点，抑制剂的Ki值小于或等于10-7M。
在另一实施方案中，本发明涉及治疗阿耳茨海默氏病患者的方法，其中包括以催化活性memapsin2的抑制剂给药于病体，该抑制剂结合于由2个催化的天冬氨残基和底物结合裂隙限定的memapsin2活性位点，抑制剂的Ki值小于或等于10-7M，其中对应序列2氨基酸28-441，抑制剂具有均方根差小于或等于0.5埃的侧链和主链原子。
在另一实施方案中，本发明提供治疗阿耳茨海默氏病患者的方法，其中包括以一种化合物给药于病体，该化合物选自MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-070和MMI-071。
在另一实施方案中，本发明涉及催化活性memapsin2抑制剂的应用，该抑制剂结合于由2个催化的天冬氨残基和底物结合裂隙限定的memapsin2活性位点，抑制剂的Ki值小于或等于10-7M，用于制备治疗阿耳茨海默氏病患者的药剂。
在附加实施方案中，本发明涉及催化活性memapsin2抑制剂的应用，该抑制剂结合于由2个催化的天冬氨残基和底物结合裂隙限定的memapsin2活性位点，抑制剂的Ki值小于或等于10-7M，其中对应memapsin2氨基酸18-379，抑制剂具有均方根差小于或等于0.5埃的侧链和主链原子，用于制备治疗阿耳茨海默氏病患者的药剂。
在另一实施方案中，本发明涉及化合物的应用，用于制备治疗阿耳茨海默氏病患者的药剂，该化合物选自MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-065、MMI-066、MMI-070和MMI-071。
催化活性memapsin2重组体的底物和亚位点特异性用于设计天然memapsin2底物类似物，该天然memapsin2底物能够抑制memapsin2的功能。首先，用memapsin2与底物类似物OM99-2结合的晶体X光照片，测定memapsin2的三维结构、以及不同结合残基的重要性。然后，再基于肽序列设计底物类似物，该肽序列表现出与memapsin2天然肽底物和晶体结构有关。该底物类似物含有至少一个不能被memapsin2断裂的酰胺(肽)键类似体。
通过质谱分析测定底物初始水解速率的方法，进一步确定催化活性memapsin2的底物和亚位点特异性，例如MALDI-TOF/MS(matrix assisted laser desorption/ionization-timeof flight/mass spectroscopy)。此外，以memapsin2探测抑制剂文库，再用memapsin2抗体和结合第二抗体的碱性磷酸酶检测出结合的memapsin2，进一步确定了memapsin亚位点的特异性。底物和亚位点特异性信息用于设计其它能够抑制memapsin2功能的其天然底物类似物。
已经开发出，在关键氨基酸残基位点含有电子等排体的底物类似物的合成方法。并已合成出OM99-1、OM99-2和另外70多种底物类似物。OM99-2是以八肽做为基础，谷-缬-天酰-亮-丙-丙-谷-苯(序列：28)，再用过渡态电子等排体羟乙烯基团替换亮-丙肽键。对于pro-memapsin2重组体OM99-2抑制常数是1.6×10-9M。对于pro-memapsin2重组体MMI-005、MMI-012、MMI-017、MMI-018、MMI-025、MMI-026、MMI-037、MMI-039、MMI-040、MMI-066、MMI-070和MMI-071的抑制常数范围是1.4-61.4×10-9M。
抑制memapsin2天冬氨蛋白酶活性的组分是小分子，其能够迅速穿过血脑屏障，并以口服用药，且不被肠酶钝化。而且，人们期望，该组分生产成本相对低廉，且优先抑制memapsin2造成的β-淀粉前体蛋白断裂。
业内技术人员利用这些信息，可以设计其它新型抑制剂，运用商品软件程序和有机化学和酶学中与其相似的技术，设计出新型的抑制剂。例如，可以改进抑制剂的侧链，产生更强的相互作用(通过氢键、疏水性相互作用、电荷作用、和/或范德华力)，以增强其抑制力。基于此类信息，从新型抑制剂的设计中可以去除相互作用最小的残基，以减少抑制剂分子量。将无结构障碍(对应酶)的侧链交联在一起，以禁闭其有效的抑制构象。基于此结构也能够设计出有效填充memapsin2结合位点而产生更好药用特性的肽替代物。本发明提供了抑制剂化合物的合理设计、筛选、和其特性。有效抑制memasin2的组合物包括小分子抑制剂和能够穿过血脑屏障的抑制剂。该抑制剂能够与memapsin2、或其底物相互作用，抑制memapsin2造成的断裂。
本发明提供了抑制memapsin2活性的化合物，特别是抑制memapsin2的天冬氨蛋白酶活性的化合物，其将β-淀粉前体蛋白转换为β-淀粉蛋白。本发明的化合物可用于治疗阿耳茨海默氏病患者。
附图简述
图1是memapsin2抑制剂的图示。“A”和“B”表示在位置P1和P3支链之间任何数量碳原子的脂族连结(饱和或部分不饱和)，例如，各自位置上的氨基酸侧链P1亮和P3缬。为了清楚，省去了抑制剂的其它结构元素。
图2是measpin2抑制剂的图示。“A”表示位置P2和P4支链之间任何数量碳原子的脂族连结(饱和或部分不饱和)，例如，各自位置上的氨基酸侧链P2天酰和P4谷。为了清楚，省去了抑制剂的其它结构元素。
图3是基于现有的晶体结构，为新型memapsin2抑制剂P1’亚位点设计的侧链图解。箭头表示memapsin2和抑制剂之间可能的相互作用。为了清楚，省去了抑制剂的其它结构元素。
图4是memapsin2抑制剂的图示。“A”和“B”表示位置P1的支链和P3主链原子之间的脂族连结(饱和或部分不饱和)，例如，此位置上的氨基酸侧链P1亮。为了清楚，省去抑制剂的其它结构元素。
图5说明了对于位置P1’-P4’的氨基酸残基、memapsin2相对特异性。条形图上的字母表明在该位置的原生氨基酸。在每个位置上相对于原生氨基酸，表示了催化效力。
图6描绘了人类memapsin2的核苷酸序列(序列：1)。
图7A和图7B描绘了除信号肽(序列：2)外人类memapsin2的部分蛋白序列。氨基酸28-48是公认残留的前肽残基。氨基酸58-61、78、80、82-83、116、118-121、156、166、174、246、274、276、278-281、283和376-377是与OM99-2抑制剂接触的残基。氨基酸54-57、61-68、73-80、86-89、109-111、113-118、123-134、143-154、165-168、198-202和220-224是氮-裂片β链。氨基酸184-191和210-217是氮-裂片螺旋。氨基酸237-240、247-249、251-256、259-260、273-275、282-285、316-318、331-336、342-348、354-357、366-370、372-375、380-383、390-395、400-405和418-420是碳-裂片β链。氨基酸286-299、307-310、350-353、384-387和427-431是碳-裂片螺旋。
图8A和8B描绘了人类promemapsin2的蛋白序列(序列：3)。氨基酸1-15是载体衍生残基。氨基酸16-63是公认的pro肽。氨基酸1-13来源于T7启动子。氨基酸16-456是pro-memapsin2-T1。氨基酸16-421是promemapsin2-T2。
图9描绘了人pre-promemapsin2的氨基酸序列(序列：4)。氨基酸1-13是信号肽。氨基酸41-454与图7A和7B的氨基酸28-441、和图8A和8B的氨基酸43-456对应。活性位点的天冬氨酸位于氨基酸位置93和289。
通过下文更具体地描述优先实施方案，本发明前述和其它目的、特征和优点将清楚明了。
发明详述
本发明的特征和其它细节既作为本发明步骤，又作为本发明部分的组合，下文将对其给予更详细的描述，并在权利要求中指出。可以理解，以图解方式展示的本发明具体实施方案并不作为对本发明的限制。在不超出发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于不同的实施方案。
I.设计并合成抑制剂
设计memspsin2的底物类似物
5种人类天冬氨蛋白酶具有相同的氨基酸序列和相似的三维结构。在活性位点中存在2个天冬氨残基，每个残基出现在天冬氨蛋白酶的特征基序中，天冬-苏/丝-甘-。天冬氨蛋白酶含有2个类同区域，基于三维结构，底物结合位点位于这2个区域之间。天冬氨蛋白酶的底物结合位点识别八个氨基酸的残基。由天冬氨蛋白酶断裂的酰胺键两侧各有4个残基。
每个氨基酸的侧链都涉及底物与天冬氨蛋白酶相互作用的特异性。统称为亚位点的酶区域识别每个底物残基的侧链。对于蛋白酶亚位点和其对应的底物残基，其为人们广泛接受的命名如下所示，其中双斜线代表键断裂的位置。
蛋白酶的亚位点 S4 S3 S2 S1 S1’ S2’ S3’ S4’
底物残基 P4 P3 P2 P1 //P1’ P2’ P3’ P4’
尽管为了识别底物，天冬氨蛋白酶具有普遍的基序，但是每种蛋白酶都具有差别很大的底物特异性和特异性宽度。一旦掌握了天冬氨蛋白酶的特异性，就能够基于此特异性设计以阻止天然底物有效断裂的方式与天冬氨蛋白酶相互作用的抑制剂。为了有效的水解，有些天冬氨蛋白酶的亚位点具有容纳不同残基的特异性。胃蛋白酶和组织蛋白酶D有此特异性，一般认为其具有“宽度”的底物特异性。当天冬氨蛋白酶亚位点仅识别很少的残基时，诸如在肾素中，一般认为其具有严格的或窄度的特异性。
天冬氨蛋白酶的特异性信息可用于设计特效抑制剂，其优选的残基位于特异性的亚位点上，断裂的肽键可以被替换成过渡态类似物。此类似物被称为过渡态的电子等排体。天冬氨蛋白酶按照水解机理，断裂酰胺键。此反应机理涉及羟基离子攻击氨基酸的β碳。通过将要断裂的键与β碳相连的另一个原子一定发生质子化作用。如果β碳的亲电子能力不足，或与将要断裂的键相连的原子亲质子性不强，该键就不能按照水解机理断裂。类似物不以模仿过渡态的形式存在，但不能被水解；而过渡态的电子等排体特别模仿过渡状态，并且也不能被水解。
过渡态理论表明，由于酶具有最强的亲和力，因此酶催化反应中一定存在过渡态的中间体。对于特定酶，具有最强亲和力的底物一定是过渡态结构，而不是基态结构。对于酰胺键的水解，过渡态是四面体结构，而基态是平面结构。天冬氨蛋白酶的典型过渡态电子等排体是CH(OH)-CH2-，由Marciniszyn等人于1976年首次在抑胃肽中发现。过渡态类似物原理已经成功地运用于人免疫缺陷病毒蛋白酶(一种天冬氨蛋白酶)的抑制剂中。它们中的许多抑制剂正在临床广泛使用。有关抑制剂结构、特异性和类型的信息可以查阅文献，Tang，Acid Protease，Structure，Functionand Biology，Adv in Exptl Med Biol vol 95(Plenum Press NY1977)；Kostka，Aspartic Proteinases and their Inhibitor(Walter deGruyter，Berlin 1985)；Dunn，Structure and Functions of theAspartic Proteinases，Adv in Exptl Med Biol 306(Plenum Press，NY1991)；Takahashi，Aspartic Proteases，Structure，Function，Biology，Biomedical Implications，Adv in Exptl Med Biol 362(Plenum Press，NY 1995)；and James，Aspartic Proteinases，Retroviral and CellularEnzymes，Adv in Exptl Med Biol 436(Plenum Press，NY 1998)，所有内容都通过在此引述合并于本文。
底物类似物组成的通式是X-L4-P4-L3-P3-L2-P2-L1-P1-L0-P1’-L1’-P2’-L2’-P3’-L3’-P4’-L4’-Y。底物类似物组成是小肽分子的类似物。其基本结构来源于结构与功能研究确定的肽序列。可以理解，相对于由-L0-代表的断裂位点，Px代表了底物的特异性位置。组成的Lx位置代表了每个底物的特异性位置Px之间的连结区。
Memapsin2的天然底物中，Px-Lx配对代表了断裂肽的单个氨基酸。此通式中，每个Px部分指的是α碳，Px的侧链官能团是氨基酸。因此，就丙氨酸来讲，Px-Lx配对的Px部分代表HC-CH3。代表组成Px部分的通式是-R1CR3-。
通常，R1既可以是CH3(丙氨酸侧链)，CH(CH3)2(缬氨酸侧链)，CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)，(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)，CH2(吲哚)(色氨酸侧链)，CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)，CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)，H(甘氨酸侧链)，CH2OH(丝氨酸侧链)，CHOHCH3(苏氨酸侧链)，CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)，CH2SH(半胱氨酸侧链)，CH2CH2CONH2(谷氨酰胺侧链)，CH2CONH2(天冬酰胺侧链)，CH2CH2CH2CH2NH2(赖氨酸侧链)，CH2CH2CH2NHC(NH)(NH2)(精氨酸侧链)，CH2(咪唑)(组氨酸侧链)，CH2COOH(天冬氨酸侧链)，CH2CH2COOH(谷氨酸侧链)，也可以是其天然和非天然的官能性衍生物或合成的替代物。
R3最可取的是单个H。通常，R3可以是能与memapsin2结合的烯基、炔基、烯氧基、炔氧基。可取的是烯基、炔基、烯氧基、炔氧基，其含有2-40个碳，更可取的是2-20个碳，2-10个碳，或2-3个碳，和其天然和非天然的官能性衍生物或合成替代物。
Px-Lx配对的Lx部分代表与Px区连接在一起的原子。天然底物的Lx代表了β碳和链中下一个氨基酸的氨基部分。因此，Lx是以-CO-NH-为代表。Lx通式以R2表示。通常，R2可以是CO-HN(酰胺)，CH(OH)(CH2)(羟乙烯基)，CH(OH)CH(OH)(二羟乙烯基)，CH(OH)CH2NH(羟乙胺)，PO(OH)CH2(亚膦酸盐)，CH2NH(还原的酰胺)。可以理解，只要底物类似物起到了抑制天冬氨蛋白酶功能的作用，也许就不只有一个L-成为电子等排体。
不是电子等排体的Ls既可能是酰胺键，也可能是酰胺键的模拟，并都不能水解。
X和Y代表不被天冬氨蛋白酶识别位点识别的分子，而且不干扰此类识别。可取的是，此类分子具有防止底物类似物降解的能力。可取的实例有通过不可水解的键与底物类似物连接的氨基酸。其它可取的化合物有盖帽剂。还有提纯底物类似物的化合物，诸如生物素。
如文中所用，烷基指的是取代或非取代的直链、支链或环烷基；烷氧基指的是取代或非取代的直链、支链或环烷氧基；可取的是，烷基和烷氧基含有1-40个碳，更可取的是1-20个碳，1-10个碳，或1-3个碳。
如文中所用，烯基指的是取代或非取代的直链或支链的烯基；炔基指的是取代或非取代的直链或支链的炔基；烯氧基指的是取代或非取代的直链、或支链烯氧基；炔氧基指的是取代或非取代的直链、或支链炔氧基；可取的是，烯基、炔基、烯氧基和炔氧基含有2-40个碳，更可取的是2-20个碳，2-10个碳，或2-3个碳。
如文中所用，烷芳基指的是带有取代芳基的烷基；芳烷基指的是带有取代烷基的芳基；杂环-烷基指的是带有取代烷基的杂环基；烷基-杂环指的是带有杂环取代基的烷基。
用于烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基的取代基可以是卤素、氰、氨基、硫代基、羧基、酯基、醚基、硫醚基、氨甲酰基、羟基、或巯基。此外，基团可以任选含有一个或多个杂原子(诸如O、NH或S)取代的亚甲基。
检测并分析了多种底物，并确定了对应Memapsin2的断裂原则。对底物的分析结果列于表1，从结果中确定的原则总结如下：
(1)对于memapsin2底物，主要特异性位点是亚位点S1’。这说明，对于memapsin2的底物特异性，最重要的决定因素是氨基酸P1’。P1’也许是使memapsin2识别底物的小侧链。在可取实施方案中，底物类似物P1’位置的R1可以是H(甘氨酸侧链)、CH3(丙氨酸侧链)、CH2OH(丝氨酸侧链)、或CH2COOH(天冬氨酸侧链)。使用结构上简于CH3(丙氨酸侧链)或CH2OH(丝氨酸侧链)的R1实施方案也是可取的。由于其氨基酸成分，表1没有列出memapsin2底物特异性的全部代表。因此，P1’不限于上述小残基，并包括下列残基：
CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)，
(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)，
CH2(吲哚)(色氨酸侧链)，
CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)，
CH(CH3)2(缬氨酸侧链)，
CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)，
CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)，
CH(CH3OH)(苏氨酸侧链)，
CH2CONH2(天冬酰胺侧链)，
CH2CH2CONH2(谷氨酰胺侧链)，
CH2CH2COOH(谷氨酸侧链)，
CH2CH2CH2CH2NH3(赖氨酸侧链)，
CH2CH2CH2NC(NH2)2(精氨酸侧链)，
CH2(咪唑)(组氨酸侧链)。
(2)位置P4、P3、P2、P1、P2’、P3’、P4’不要求特异性序列。只要满足规则(3)，每个位点可以容纳其它任何氨基酸残基。
(3)剩余的7个位置P4、P3、P2、P1、P2’、P3’、P4’中至少有2个必须含有由疏水残基组成的R1。可取的是，剩余的7个位置P4、P3、P2、P1、P2’、P3’、P4’中至少有3个疏水残基。对于含有疏水基团的位置，可取的R1是CH3(丙氨酸侧链)，CH(CH3)2(缬氨酸侧链)，CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)，(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)，CH2(吲哚)(色氨酸侧链)，CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)，CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)，CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。更可取的疏水基团是大疏水基团。含有大疏水基团的R1S可取的是CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、(CH3)CH(CH2CH3)(异亮氨酸侧链)、CH2(吲哚)(色氨酸侧链)，CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)，CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)，CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。疏水性位置R1最可取的是CH(CH3)2(缬氨酸侧链)、CH2CH(CH3)2(亮氨酸侧链)、CH2(苯)(苯丙氨酸侧链)、CH2CH2SCH3(甲硫氨酸侧链)、或CH2(苯酚)(酪氨酸侧链)。
(4)P4、P3、P2、P1、P1’、P2’、P3’、P4’，8个位置在其R1处都不能含有脯氨酸的侧链。
(5)在类似物中不是所有的亚位点都必须以P表示。例如，底物类似物可以具有X-P2-L1-P1-L0-P1’-L1’-P2’-L2’-P3’-L3’-Y，或X-L1-P1-L0-P1’-L1’-P2’-L2’-P3’-L3’-P4’-L4’-Y的结构。
可取的是含有表1公开序列且P1和P1’之间不能水解的底物类似物。
制备抑制剂的组合化学
组合化学包括、且不限于离析分子的所有方法，该分子既能够结合小分子，也能够结合其它大分子。大分子的实例有蛋白、寡核苷酸和多糖。例如，能够从随机的寡核苷酸复杂混合物中分离带有特定功能(催化或与配基结合)的寡核苷酸分子，称之为“体外遗传学”(Szostak，TIBS 19：89，1992，其所有内容都通过在此引述而合并于本文)。先合成含有随机和确定序列的分子与目标分子复杂混合的大文库，例如1015个100微克、100个核苷酸的RNA单个序列，再进行分选和浓缩加工。通过重复循环的亲和色谱分离与PCR扩增与色谱柱配基结合的分子，Ellington和Szostak估计(1990)，以与染料小分子结合的方式捕获RNA分子的比率是1∶1010。也可以离析能与该配基结合的DNA分子(Ellington and Szostak，1992；Bock et al，1992，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。
目标相似的技术适用于有机小分子、蛋白、多肽和业内公知的其它分子。不管是否基于合成小分子、寡核苷酸、蛋白或多肽的文库，对所需活性分子的筛选都统称为组合化学。
存在多种方法，用于离析脱氮活性蛋白或改性蛋白。例如，噬菌体显示文库已经应用了许多年。离析特定功能蛋白的优先方法如Roberts和Szostak所述(Roberts RW and Szostak JW ProcNatlAcad Sci USA,94(23)12997-302(1997)，其内容通过在此引述而合并于本文)。设计离析肽的另一优先的组合化学法如Cohen等人所述(Cohen BA et al Proc Natl Acad Sci USA 95(24)：14272-7(1998)，其所有内容通过在此引述而合并于本文)。该方法使用改进的双杂交技术。酵母双杂交系统可用于检测和分析蛋白：蛋白的相互作用。首先记载为酿酒酵母的双杂交系统是一种强有力的分子基因技术，用于鉴别新型调节分子，特别是关键蛋白(Fields andSong，Nature 340：245-6(1989)，其所有内容通过在此引述而合并于本文)。Cohen等人改进了此技术，以鉴别出合成或设计的肽序列与所选分子之间的新型相互作用。该类技术的优点是在细胞内环境完成选择。该方法使用了附着酸性活化区的肽分子文库。选择肽，例如memapsin2的胞外部分附着在转录活化蛋白(诸如Gal4)的DNA结合区。通过在此系统中使用双杂交技术，可以鉴别出结合memapsin2胞外部分的分子。
小分子文库的筛选
除了这些更专业的技术外，与不同小分子或组合文库结合、业内公知的操作法也可用于离析和特征化与期望目标结合或相互作用的分子，期望目标既可以是memapsin2，也可以是其底物。比较这些化合物的相对结合亲和力，研究业内公知的竞争性或非竞争性结合，鉴别最佳抑制剂。可取的竞争性抑制剂是不可水解的memapsin2类似物。可取的另一种抑制剂会造成抑止memapsin2功能及其正确折叠的变构重排。
计算机辅助的药物合理设计
抑制剂的另一种离析方法是通过合理设计。离析的实现是利用结构信息和计算机模拟。计算机模拟技术能够将所选分子的原子三维结构成像，合理设计与此分子相互作用的新型化合物。三维构造通常依赖于所选分子晶体X光分析或核磁共振成像的数据。分子动力学还需要力场的数据。计算机图形系统能够预测新型化合物将如何与目标分子结合，并实验性地控制化合物与目标分子的结构，以完善结合特异性。例如，应用核磁共振谱，Inouye及其同事获得N-末端截断跨膜传感组氨酸激酶(TSHK，transmembrane sensor histidine Kinases)片段的结构信息，该片段保留了TSHK催化位点的单亚区结构。基于核磁共振的研究，他们鉴别出有效的TSHK抑制剂(US Patent No 6,077,682 to Inouye，其所有内容通过在此引述而合并于本文)。另一个出色的实例是基于用晶体X光高清晰成像确定的钙调磷酸酶/FKBP12/FK506复合物的三维结构，从而获得钙调磷酸酶(calcineurin)活性位点结合袋与FKBP 12/FK506辅助结合袋的形状和结构(US PatentNo5,978,740 to Armistead，其所有内容通过在此引述而合并于本文)。根据掌握的信息，研究者很好地理解了天然配基或底物与其对应受体或酶结合袋的缔合，因此设计和制备出有效的抑制剂。
当分子与化合物任一或两者发生微小变化时，对两者之间相互作用的预测，需要分子力学软件和运算能力强的计算机，通常还要外加分子设计程序与用户之间友善的菜单驱动界面。分子模拟系统的实例有Polygen公司的CHARMm和QUANTA程序(Waltham，MA)。CHARMm程序执行了能量最小化和分子动力学的功能。QUANTA程序执行了构造与图像模拟以及分子结构分析。QUANTA程序提供了交互的构造、改进、成像、及分子间的性能分析。
许多文章评价了药物与特异性蛋白交互作用的计算机模拟，诸如Rotivinen et al，1998，Acta Pharmaceutica Fennica 97，159-166；Ripka，New Scientist 54-57(June 16，1988)；McKinaly andRossmann，1989 Annu Rev Pharmacol Toxicol 29，111-122；Perry andDavies，QSAR：Quantitative Structure-Activity Relationships in DrugDesign pp 189-193(Alan R Liss，Inc 1989；Lewis and Dean，1989Proc R Soc Lond 236，125-140 and 141-162；and，with respect to amodel enzyme for nucleic acid components，Askew et al，1989 J.AmChem Soc 111，1082-1090，其内容都通过在此引述而合并于本文)。拍摄和图像描绘化学品的其它计算机程序可从多家公司购得，诸如BioDesign Inc，Pasadena，CA；Allelix，Inc，Mississauge；Ontario，Canada；Hypercube，Inc，Cambridge，Ontario。
尽管上文描述了有关改变结合的化合物设计与制备，为了获得改变底物结合或酶活性的化合物，人们同样能够筛选公知的化合物文库，包括天然产物或合成化合物、和生物活性物质，其中包括蛋白。
文库的筛选
底物类似物的设计与合理药物设计都是基于对活性位点和靶的认知，创建酶和其底物详细结构的计算机软件程序的应用，以及它们单独或有抑制剂存在下相互作用的方式。现有的晶体X光相片数据显著增强了此项技术。通过筛选现存的化合物文库，也可以获得抑制催化活性酶的抑制剂。与文献中有关memapsin2的报道相反，本文所述的酶具有与天然生成酶相似的活性，提供了抑制内生活性的化合物鉴别方法。潜在的抑制剂的鉴别通常是通过高处理量的分析，其中将酶、底物(可取的是生色底物)和潜在的抑制剂(通常在一定浓度范围内筛选)混合，再测定底物的断裂程度。有效的抑制剂是那些减少断裂数量的抑制剂。
II.催化活性重组memapsin2的制备
Memapsin2的克隆和表达
如实施例1所述，先克隆memapsin2，再测定核苷酸序列(序列：1)和预测的氨基酸序列(序列：2)。从片段装配cDNA。核苷酸序列和推断的蛋白序列分别展示于序列：1与序列：2。此蛋白与天冬氨蛋白酶2(ASP2)相似，如文献所述，EP0855444A bySmithKline Beecham Pharmaceuticals，(published July 29，1998)，USPatent No 6,319,689，Sinha，et al，Nature 402，537-540(December1999)and Vassar，et al Science 286，735-741(22October 1999)，所有内容都通过在此引述而合并于本文。
Pro-memapsin2类同于其它天冬氨蛋白酶，与鼠ASP1同源(US Patent No 6,291,223，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。基于此排列，Pro-memapsin2含有一个pro区、一个天冬氨蛋白酶区、和一个靠近碳末端的跨膜区。碳-末端区含有80多个残基。活性酶是memapsin2，其pro-酶是pro-memapsin2。
重折叠催化活性酶
为了测定底物特异性并设计抑制剂，需要表达催化活性的重组酶。由于其活性位点不属于跨膜区，且活性不需要膜锚定作用，memapsin2在大肠杆菌中能够以两种不同长度表达，且都不含跨膜区，接着，如实施例3的描述将其提纯。基本上如Lin等人(1994)所述(其全部内容合并于此)，培养转染的细菌，导入合成的重组蛋白，回收和清洗含有重组蛋白的包含体。为了重折叠，蛋白溶解在强变性/还原溶液中，诸如8M尿素/100mMβ-巯基乙醇。在哪种溶液中蛋白重折叠的速率对于其活性至关重要。一种方法是，将蛋白溶解到8M尿素/100mMβ-巯基乙醇溶液中，接着迅速稀释到20倍体积的PH9.0、20mMTris溶液中，再用1M HCL溶液将其缓慢调至PH8。接着，将重折叠溶液在4℃下保存24小时到48小时，再提纯处理。第二种方法是，将等体积的20mMTris、0.5mM氧化的/1.25mM还原的谷胱甘肽、PH9.0溶液加入快速搅拌的pro-memapsin2的8M尿素/10mMβ巯基乙醇溶液中。此过程在一小时内至少重复3遍。再将所得溶液相对于足体积的20mM Tris碱性溶液进行渗析处理，最终使尿素浓度达到0.4M。最后，再用1M HCL缓慢调节溶液至pH8.0。
基于分子量排阻和/或盐梯度洗脱，应用色谱柱进一步提纯重折叠蛋白，在还原或非还原条件下用SDS-PAGE分析。
III.Memapsin2的底物特异性和酶动力学
通过抑制memapsin2对其底物的结合与断裂来筛选抑制剂。
底物的特异性
在脑中存在memapsin2(M2)，说明它可能水解了β-淀粉前体蛋白(APP)。如下所述，对酶和细胞的详细研究证明，M2符合β-分泌酶的所有标准。M2的三维结构模仿了膜内在蛋白I。此模型暗示，其球状蛋白酶单元能够在离膜表面20-30个残基范围内水解膜锚定的多肽。作为脑跨膜蛋白，APP是潜在的底物，其β-分泌酶位点位于离质膜表面大约28个残基，并处于M2蛋白水解范围之内。
来源于该位点的合成肽(SEVKM/DAEFR)(序列：5)被M2pd(含有从Ala-8P到Ala326氨基酸的改进M2)在β-secretase位点(以“/”标记)水解。第二肽(SEVNL/DAEFR)(序列：6)来源于APPβ-分泌酶位点，含有“瑞典突变”(Mullan，M et al NatureGenet 2：340-342(1992)，所有内容都通过在此引述而合并于本文)，并公知地提高了细胞中Aβ的含量(Citron，M et al，Nature260：672-674(1992)，)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)，且被高催化能力的M2pd水解。在PH4.0时两种底物发生最佳断裂。来源于衰老蛋白素1加工位点的肽(SVNM/AEGD)(序列：7)也可以被有效动力学参数较小的M2pd断裂。来源于APPγ-分泌酶位点的肽(KGGVVLATVIVK)(序列：8)不能被M2pd断裂。抑胃肽A抑制M2pd的效果很差(IC50大约是0.3mM)。动力学参数证明衰老蛋白素1(Kcat0.67s-1；Km，15.2mM；Kcat/Km，43.8s-1 M-1)和原生APP肽(Kcat/Km，39.9s-1 M-1)作为底物都不如瑞典APP肽(Kcat2.45s-1；Km，1mM；Kcat/Km，2450s-1 M-1)的效果好。
为了确定M2在哺乳动物细胞中是否拥有APPβ-分泌酶功能，在海拉细胞中瞬时表达以35S-蛋氨酸作为代谢脉冲标记的memapsin2(Lin，X，et al FASEBJ 7：1070-1080(1993)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)，然后，再用APP抗体使其免疫沉淀，在SDS-聚丙烯酰胺电泳后成像，获得APP生成的片段显影。从脉冲追踪实验特定介质(2h)中得到免疫沉淀的APP Nβ片段(97KD条带)，其SDS-PAGE带型表明APP是被M2断裂的。用APP单独转染，并用APP和M2外加Bafilomycin A1共同转染，进行对照。从特定介质中免疫沉淀出APPβC-片段的SDS-PAGE带型(12KD)与上述实验相同。用APP单独转染，用APP和M2共同转染，APP和M2外加Bafilomycin A1共同转染，用瑞典APP转染，以及用瑞典APP和M2共同转染，再进行对照。分别对免疫沉淀的M2(70KD)、M2转染的细胞、经长时间胶片曝光后未被转染的海拉细胞、HEK293细胞内生的M2进行SDS-PAGE凝胶分析。使用特异于APP不同区域的抗体免疫沉淀后，从特定介质中获得的APP片段(100KDβN-片段和95KDβN-片段)的SDS-PAGE带型表明，memapsin2断裂了APP。
表达APP和M2的细胞在特定介质中生成了97KD APPβN-片段(来自β-分泌酶位点的N-末端)，在细胞溶解产物中产生12KDβC-片段(来自β-secretase位点的C-末端)。由APP单独转染的对照产生少量的βN-片段，且不产生βC-片段。BafilomycinA1公知地增加了溶酶体和核内体泡囊内的PH，已经证明其抑制APP的β-分泌酶断裂(Knops，J etal，J Biol Chem270：2419-2422(1995)，其所有内容都通过在此引述而合并于本文)，并消除了在共同转染的细胞中APPβN-和βC-片段的生成。由Swedish APP单独转染的细胞并不在细胞溶解物中产生βC-片段条带，但是由瑞典APP和M2共同转染的细胞产生此条带。该瑞典βC-片段条带的强度高于野生型APP的条带。在特定介质中也能发现一条97KD βN-条带，但是其与野生型APP转染的强度大体相同。
这些结论表明，在酸性的区室内(诸如核内体)M2加工了APP的β-分泌酶位点。为了证实表达了转染的M2基因，将脉冲标记的细胞溶解，再用M2抗体免疫沉淀。由M2基因转染的细胞中发现一条70KD M2条带，其具有与HEK293细胞主要条带相同的迁移率，HEK293表达β-分泌酶是公知的(Citron M etalNature 260：672-674(1992)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。在未被转染的海拉细胞中，经过长时间的胶片曝光后，还发现了一条很暗淡M2条带，表明内生M2含量非常低，无M2转染的情况下其不足以生成βN-片段或βC-片段。特异性识别Aβ肽1-17残基的Aβ1-17抗体用于进一步证实正确的β-分泌酶位点断裂。使用识别APP两种片段N-末端区域的抗体，在APP和M2转染的细胞中，βN-和βN-片段都是可见的。未经转染的细胞中Aβ1-17抗体能够识别内生β-分泌酶产生的βN-片段。然而，在APP和M2共同转染的细胞中该抗体不能识别公认存在的βN-片段。这些观测结果进一步证实，βN-片段是M2切割β-分泌酶位点的产物，并且M2消除了Aβ1-17的识别表位。
在特异性研究中，人们发现在活化后(表1)16小时培养过程中M2pd断裂了其pro肽(2个位点)和蛋白酶部分(2个位点)。除了上述三个肽之外，M2pd还断裂了氧化的牛胰岛素B链和合成的肽Nch。内生蛋白不能被M2pd断裂。
这样相同的方法可以与公开的抑制剂结合使用，用于筛选抑制memapsin的最佳效果。
IV诊断和治疗的方法
抑制剂可以用于诊断和治疗、和/或抑制阿耳茨海默氏病及其相关症状，诸如42个氨基酸肽断裂产物含量的增加，和淀粉蚀斑中该肽的积累。
诊断应用
底物类似物可以用作特效结合memapsin2或memapsin2的类似物的试剂，辅助memapsin2的离析、提纯和特征化，如实施例所述。抑制剂和提纯的重组酶可用于筛选有发展成AD严重遗传倾向的个体。
治疗应用
重组的人类memapsin2断裂了带有序列LVNM/AEGD(序列：9)的底物。该序列是人类衰老蛋白素的体内加工位点序列。衰老蛋白素1和衰老蛋白素2都是膜内在蛋白。以蛋白酶断裂的方式对它们进行加工，此断裂去除了未加工形态的N末端序列。只要经过加工，衰老蛋白素就形成了双链杂二聚体(Capell et al，JBiol Chem 273，3205(1998)；Thinakaran et al，Neurobiol Dis4,438(1998)；Yu et al，Neurosci Lett 2：254(3)：125-8(1998)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)，与未被加工的衰老蛋白素相比，该双链杂二聚体是稳定的。未被加工的衰老蛋白素会被快速地降解(Thinakaran et al，J.Biol.Chem.272，28415(1997)；Steiner et al，J.Biol.Chem.273，32322(1998)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。众所周知，衰老蛋白素控制了β-分泌酶的体内活性，而β-分泌酶又断裂了淀粉前体蛋白(APP)，导致了Aβ42的生成。众所周知，脑细胞中Aβ42的积累是造成AD的主要原因(参见Selkoe，1998，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。因此，衰老蛋白素的活性促进了阿耳茨海默氏病的发展。该观点获得了观察结果的支持，在缺少衰老蛋白素基因的情况下产生的Aβ42A肽含量降低(De Strooper et al，Nature 391，387(1998)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。由于未被加工的衰老蛋白素降解很快，因此加工过的杂二聚体衰老蛋白素一定是造成Aβ42积累并导致阿耳茨海默氏病的主要原因。Memapsin2对衰老蛋白素的加工会促进Aβ42的生成，从而促进了AD的发展。因此，透过血脑屏障的memapsin2抑制剂可以减少其发生的可能性，或减缓以Aβ42沉淀为介质AD的发展。既然memapsin2在β断裂位点断裂APP，阻止APP在β断裂位点的断裂，就会阻止Aβ42的增长。
药用载体
抑制剂通常是口服用药或注射。可取的是口服用药。此外，其它配方可以用于肺、粘膜、或皮肤线路用药。抑制剂通常是与药用载体结合用药。对于业内技术人员，药用载体是公知的。适合的载体通常基于用药方式进行选择。药用组合物也包括一种或多种活性成分，诸如杀菌剂、抗炎剂、和镇痛剂。
肠外用药或注射用药的制剂包括无菌的水状或非水状溶液、悬液和乳液。非水状溶剂的实例有丙二醇，聚丙二醇，蔬菜油、诸如橄榄油，和可注射的有机酯、诸如油酸乙酯。水状载体包括水，醇和水状溶液，乳液或悬液、包括盐水和缓冲介质。可取的肠外赋形剂有氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳化的林格氏溶液、或不挥发油。静脉赋形剂有流体和营养补充剂，和电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的试剂)。
局部(包括应用于粘膜表面，其中包括口腔、肺、鼻腔、阴道或直肠)用药的配方包括软膏、洗剂、乳油、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。这些应用的配方是公知的。例如，已经开发了许多肺部配方，通常以喷雾干燥配制1-3微米粒径的气动粉末，其含有药物或将药物与聚合物、和/或表面活性剂结合使用。
口服用药的组合物包括粉末或颗粒、水或非水状介质的悬液或溶液、胶囊、药囊、或片剂。也许还需要稠化剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂、或粘合剂。
如文中所述，肽还能以酸性或碱性的药用盐用药，肽与酸反应生成酸性药用盐，无机酸诸如盐酸、溴氢酸、过氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸，有机酸诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、和延胡索酸，肽与碱反应生成碱性药用盐，无机碱诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，有机碱诸如单、双、三烷基和芳基的胺、和经取代的乙醇胺。
用药剂量
药剂量是由所要治疗病情的严重性和应激性决定的，但是通常每天用药一次或多次，治疗周期持续数天到数月，或直至主治医生确认不会取得更好的效果为止。一般技术人员能够确定最佳剂量、用药方法和重复率。
采取足够宽的剂量范围以产生期望的效果，缓解memapsin2为介质的功能失调症状(通常以淀粉蚀斑尺寸和/或数量的减少或不增加为特征)，或减少了断裂产生的Aβ42肽。药剂量可以由医生根据反馈迹象进行调整。
以下实施例进一步对本发明加以说明，并不对其加以限制。
实施例
实施例1 蛋白水解的活性和重组memapsin2的断裂位点优先
为了证实memapsin2的特异性，测定APP蛋白水解断裂位点周围的氨基酸序列。室温下将重组的pro-memapsin2-T1培养在PH4.0、0.1M醋酸钠溶液中16小时，以产生自催化断裂。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析产物。发现了许多分子量小于pro-memapsin2的泳带。将泳带转印迹到PVDF膜上。选出4条泳带，在蛋白序列仪中测定其N-末端的序列。这些泳带的N-末端序列确定了pro-memapsin2蛋白水解断裂位点的位置。
此外，将牛胰岛素氧化的β链和2种不同的合成肽用做memapsin2的底物，以测定其它水解位点的范围。将promemapsin2置于PH4.0、0.1M乙酸钠溶液中，使其发生自活化反应，再与上述肽共同培养。在反相的C-18色谱柱中以高压液相色谱法分析水解产物，再以电喷射质谱法分析洗脱峰，以确定片段的分子量。在氧化的胰岛素β链上检测出2个水解位点(表1)。在肽NCH-γ检测出3个水解位点。在合成肽PS1-γ发现唯一的水解位点，其序列(LVNMAEGD)(序列：10)来源于人类衰老蛋白素1β-加工位点(表1)。
表1memapsin2的底物特异性
位置Pn和Pn’(其中“n”是1，2，3，4，等)指的是相对于断裂位点肽中氨基酸的位置，该断裂位点以双竖线标记。位置号从易断裂键向远侧增加。
*合成肽是基于缺刻蛋白的氨基酸序列(登记号AAG33848)。Memapsin2在三个位点上断裂缺刻蛋白。
**合成肽是基于衰老蛋白素-1的加工位点(登记号P49768，Sherrington et al，Nature 375(6534)：754-760(1995)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。
实施例2 pro-memapsin2的活化和酶动力学
22℃下将pro-M2pd在PH4.0的0.1M乙酸钠溶液中培养16小时，使其经自催化转变成M2pd。为了测定初始水解速率，将两个合成肽分别与pro-M2pd培养在PH4.0的0.1M乙酸钠溶液中，并保持2-18小时不等。使用液相色谱(LC)和质谱仪(MC)分析培养的样品，以鉴别水解产物。为了动力学研究，将鉴别的HPLC(Beckman System Gold)产物峰值整合到一起，进行定量分析。利用静态动力学测定衰老蛋白素1和瑞典APP肽(表1)的Km和Kcat值。由于不能以标准方法精确测定APP肽的Km和Kcat单值，所以利用混合底物与衰老蛋白素1肽的竞争性水解测定其Kcat/Km值(Fersht A“Emzyme Structure and Mechanism”，2nd ED，WH Freeman and company，New York(1985)，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。
SDS-聚丙烯酰胺电泳法展示了在PH4.0条件下pro-M2pd转换为更小的片段。Pro-M2pd与转换酶之间的迁移差别在两者混合物中清晰地表现出来。
实施例3 Memapsin2抑制剂OM99-1和OM99-2的设计与合成
基于memapsin2特异性的研究结果，人们预测适合P1与P1’位置的残基应该是亮氨酸和丙氨酸。接着，由特异性数据确定，P1’优选的是小残基，诸如丙氨酸和丝氨酸。然而，晶体结构(下文确定)表明该位点也能够容纳多种大残基。据证实，memapsin2的P1’是特异性要求最严格的位置，其可取的是小侧链残基，诸如丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸。P1’选取丙氨酸，主要因为其疏水性优于丝氨酸、天冬氨酸，有利于穿透血脑屏障，满足治疗AD的memapsin2抑制剂的设计要求。因此，将抑制剂设计成在亮氨酸和丙氨酸之间放置过渡态类似物电子等排体(以亮*丙表示，其中“*”表示过渡态电子等排体，-CH(OH)-CH2-)，用来自β-淀粉蛋白瑞典突变体的β-分泌酶位点序列装填亚位点P4、P3、P2、P2’、P3’和P4’。
OM99-1 缬-天酰-亮*丙-丙-谷-苯(序列20)
OM99-2 谷-缬-天酰-亮*丙-丙-谷-苯(序列21)
亮*丙二肽电子等排体的合成如下所述：
从L-亮氨酸开始制备M2-抑制剂的亮-丙二肽电子等排体。下述的粗体数字，例如2、3、4等，指的是合成方案1、2和3中各自编号的化合物。文中，编号数字也指的是“化合物”，例如合成方案的化合物2。
方案1
如方案1所示，在含有10％NaOH的二乙醚中用BOC2O处理L-亮氨酸12小时，保护其生成叔丁氧羰基衍生物2。接着，用氯甲酸异丁酯和N-甲基哌啶处理，再用N、O-二甲基羟胺处理所得的混和酸酐，生成Weinreb酰胺3(Nahm and Weinreb，TetrahedronLetters 1981，32：3815，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。在二乙醚中用氢化铝锂还原3，生成了醛4。使用丙炔酸锂与醛4反应，获得42％得率的非对映体不可分离混合物的炔醇5(5.8∶1)，该丙炔酸锂是由丙炔酸乙酯与二异丙胺锂反应生成(Fray，Kayeand Kleinman，J.Org.Chem.1986，51：4828-33，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。以Pd/BaSO4使5发生催化加氢反应，随后在回流的甲苯中加入足量乙酸，使所得的γ-羟基酯发生酸性催化的内酯化反应，生成73％得率的γ-内酯6和7。
使用含有40％乙酸乙酯的己烷作为洗脱剂，以硅凝胶色谱法分离异构体。使用甲基碘立体选择地烷基化7，将甲基导入C-2位置(方案2)。这样，在-78℃四氢呋喃中，使用六甲基乙硅烷锂(30分钟)，使内酯7生成二价阴离子，并在-78℃用甲基碘(1.1当量)烷基化30分钟，随后用丙酸(5当量)骤停，产生所需的烷基化内酯8(76％得率)以及少量(少于5％)的对应异构体(Ghosh and Fidanze，1998 J.Org.Chem.1998，63，6146-54，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。再使用乙酸乙酯和己烷混合物(3∶1)作为溶剂系统，使用硅凝胶色谱柱，去除了异构的顺式-内酯。基于广谱1H-NMR核极化效应实验进行烷基化内酯8的立体化学测定。随后，将内酯8置于氢氧化锂溶液促使其水解，在含有咪唑和二甲基氨基吡啶的二甲基甲酰胺中，使用氯化叔丁基二甲基甲硅烷保护其γ-羟基基团，经标准整理(work-up)和色谱分离后获得90％得率的酸9。在0℃二氯甲烷中使用三氟乙酸处理1小时，选择性地去除叔丁氧羰基。然后，在含有二氧己环的NaHCO3水溶液中，用商品Fmoc-丁二酰亚胺衍生物与所得胺盐反应，经色谱分离后获得65％得率的Fmoc-保护的亮*丙电子等排体10。受保护的电子等排体10可用于制备随机序列的抑制剂文库。
方案1
实验过程
N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(化合物2)
向悬浮10g(76.2mmol)L-亮氨酸的140ml二乙醚中加入80ml的10％ NaOH。在所有固体溶解后，向反应混合物加入20ml(87.1mmol)BOC2O。在23℃下搅拌所得反应混合物12小时。然后，分离各层，向水层小心加入0℃的1N HCL溶液，酸化至PH1.O。再用乙酸乙酯(3×100ml)抽提所得混合物。合并有机层后，用盐水清洗，再用无水Na2SO4干燥。在减压条件下去除溶剂，得到标题化合物，其不需进一步提纯(产量97％)可直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.89(broadd，1H，J＝8.3Hz)，4.31(m，1H)，1.74-1.49
(m，3H)，1.44(s，9H)，0.95(d，6H，J＝6.5Hz))。
N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸-N’-甲氧基-N’-甲基-酰胺(化合物3)
在0℃氮气环境下，向经搅拌的含有盐酸化N，O-二甲基羟胺(5.52g，56.6mmol)的无水二氯甲烷(25ml)逐滴加入甲基哌啶。在0℃下搅拌所得混合物30分钟。氮环境下于另一烧瓶中，将N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨酸(2)(11.9克，51.4mmol)溶解在THF(45mL)和二氯甲烷(180mL)的混合物中。所得溶液冷却到-20℃。向此溶液加入1-甲基哌啶(6.9mL，56.6mmol)后，接着加入氯甲酸异丁酯(7.3mL，56.6mmol)。在-20℃下搅拌所得混合物5分钟后，加入上述的N，O-二甲基羟胺溶液。将反应混合物放置在-20℃环境下30分钟，再升温至23℃。用水骤停反应并分层。再用二氯甲烷(3×100mL)抽提水层。接着，分别用10％柠檬酸、碳酸氢钠饱和溶液和盐水清洗合并的有机层。再用无水Na2SO4干燥有机层，使其在减压条件下浓缩。利用快速硅凝胶色谱法(25％乙酸乙酯/己烷)提纯剩余物，产生淡黄色油状的标题化合物3(13.8克，97％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.06(broadd，1H，J＝9.1Hz)，4.70(m，1H)，3.82(s，3H)，3.13(s，3H)，1.70(m，1H)，1.46-1.36(m，2H)1.41(s，9H)，0.93(dd，6H，J＝6.5，14.2Hz)。
N-(叔丁氧羰基)-L-亮氨醛(化合物4)
在-40℃氮气环境下，向经搅拌的含有悬浮的氢化铝锂(770mg，20.3mmol)的无水二乙醇溶液(60ml)，加入含有N-叔丁氧羰基-L-亮氨酸-N’-甲氧基-N’-甲胺(5.05g，18.4mmol)的二乙醚(20ml)。搅拌所得反应混合物30分钟。然后，用10％NaHSO4溶液(30ml)骤停反应。再升温所得反应混合物至23℃，在此温度下搅拌30分钟。过滤所得溶液，再用两份二乙醇清洗滤饼。先后用碳酸氢钠饱和溶液、盐水清洗合并的有机层，再用无水MgSO4干燥。减压蒸干溶剂，得到淡黄色油状的标题醛4(3.41g)。所得醛不需进一步提纯可以直接使用。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.5(S，1H)，4.9(s，lH)，4.2(broad m，1H)，1.8-1.6(m，2H)，1.44(s，9H)，1.49-1.39(m，1H)，96(dd，6H，J＝2.7，6.5Hz)。
乙基(4S，5S)-和(4R，5S)-5-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-羟基-7-methyloct-2-ynoate(化合物5)
在0℃氮气环境下，向经搅拌的加有二异丙基胺(1.1ml，7.9mmol)的无水THF溶液(60mL)，逐滴加入n-BuLi(1.6M/己烷，4.95ml，7.9mmol)。在0℃下搅拌所得溶液5分钟，再升温至23℃搅拌15分钟。将混合物冷却至-78℃，在5分钟内逐滴加入含有丙炔酸乙酯(801μL)的THF(2ml)。搅拌混合物30分钟后，然后加入含有N-叔丁氧羰基-L-亮氨醛4(1.55g，7.2mmol)的8ml无水THF。在-78℃下搅拌所得混合物1小时。然后，使用含有乙酸(5ml)的THF(20ml)骤停反应。再将反应混合物升温至23℃，加入盐溶液。分层后，用碳酸氢钠饱和溶液清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，其经快速硅凝胶色谱提纯，获得炔醇5(0.96g，42％)的混合物(3∶1)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ4.64(d，1H，J＝9.0Hz)，4.44(broad s，1H)，4.18(m，2H)，3.76(m，1H)，1.63(m，1H)，1.43-1.31(m，2H)，1.39(s，9H)，1.29-1.18(m，3H)，0.89(m，6H)。
(5S，1’S)-5’[1’-[(叔丁氧羰基)氨基]-3‘-甲丁基]-二氢呋喃-2(3H)-酮(化合物7)
向经搅拌的含有上述炔醇混合物(1.73g，5.5mmol)的乙酸乙酯溶液(20ml)，加入5％Pd/BaSO4(1g)。50psi下将所得混合物氢化1.5小时。然后，用硅藻土滤掉催化剂，并在减压条件下浓缩滤液。将剩余物溶解在甲苯(20mL)和乙酸(100μl)溶液中。回流处理反应混合物6小时。然后，冷却反应物至23℃，蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经快速硅凝胶色谱(40％二乙醚/己烷)提纯，生成(5S，1S’)-γ-内酯7(0.94g，62.8％)和(5R，1S’)-γ-内酯6(0.16g，10.7％)。内酯7：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.50-4.44(m，2H)，3.84-3.82(m，1H)，2.50(t，2H，J＝7.8Hz)，2.22-2.10(m，2H)，1.64-1.31(m，3H)，1.41(s，9H)，0.91(dd，6H，J＝2.2，6.7Hz)；13CNMR(75MHz，CDCl3)，δ177.2，156.0，82.5，79.8，51.0，42.2，28.6，28.2，24.7，24.2，23.0，21.9。
(3R，5S，1’S)-5-[1’-[(叔丁氧羰基)氨基]-3’-甲丁基]-3-甲基二氢呋喃-2(3H)-酮(化合物8)
在-78℃氮气环境下，3分钟内向经搅拌的含有内酯7(451.8mg，1.67mmol)的无水THF(8ml)溶液，加入六甲基二硅氮烷锂(3.67ml，1.0M in THF)。在-78℃搅拌所得混合物30分钟，生成烯醇锂。然后，逐滴加入MeI(228μl)，在-78℃下搅拌所得混合物20分钟。再用NH4CL饱和水溶液骤停反应，使其自行升温至23℃。减压下浓缩反应混合物，再用乙酸乙酯(3×100mL)抽提剩余物。用盐水清洗合并的有机层，再用无水Na2SO4干燥。蒸干溶剂获得剩余物，该剩余物经硅凝胶色谱(15％乙酸乙酯/己烷)提纯，获得非晶态固体的烷基化内酯8(0.36g，76％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ4.43(broad t，1H，J＝6.3Hz)，4.33(d，1H，J＝9.6Hz)，3.78(m，1H)，2.62(m，1H)，2.35(m，1H)，1.86(m，1H)，0.91(dd，6H，J＝2.2，6.7Hz)；13CNMR(75MHz，CDCl3)，1.63-1.24(m，3H)，1.37(s，9H)，1.21(d，3H，J＝7.5Hz)，0.87(dd，6H，J＝2.6，6.7Hz)；13CNMR(75MHz，CDCl3)180.4，156.0，80.3，79.8，51.6，41.9，34.3，32.5，28.3，24.7，23.0，21.8，16.6。
(2R，4S，5S)-5-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基]-2，7-二甲基辛酸(化合物9)
向经搅拌的含有内酯8(0.33g，1.17mmol)的THF(2ml)，加入1N水状LiOH溶液(5.8ml)。在23℃搅拌所得混合物10小时。然后，减压浓缩反应混合物，将剩余水状剩余物冷却至0℃，再用25％柠檬酸溶液酸化至PH4.0。用乙酸乙酯(3×50ml)抽提所得的酸性溶液。将合并的有机层用盐水清洗，并用Na2SO4干燥，再经浓缩生成相应的白色泡沫状羟酸(30mg)。该羟酸不需进一步提纯直接用于后续反应。
向含有上述羟酸(330mg，1.1mmol)的无水二甲基甲酰胺(DMF)，加入咪唑(1.59g，23.34mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.76g，11.67mmol)。在23℃搅拌所得混合物24小时。然后，加入MeOH(4ml)后，搅拌混合物1小时。用25％柠檬酸(20ml)稀释混合物，再用乙酸乙酯(3×20mL)抽提。先后用水和盐水清洗合并的抽提物，再用无水Na2SO4干燥。蒸干溶剂获得粘稠状油，该油再经快速硅凝胶色谱(35％乙酸乙酯/己烷)提纯，获得由甲硅烷基保护的酸9(0.44g，90％)。IR(neat)3300-3000(broad)，2955，2932，2859，1711cm-1；1H NMR(400MHz，DMSO-d6，343K)delta 6.20(broad s，1H)，3.68(m，1H)，3.51(broad s，1H)，2.49-2.42(m，1H)，1.83(t，1H，J＝10.1Hz)，1.56(m，1H)，1.37(s，9H)，1.28-1.12(m，3H)，1.08(d，3H，J＝7.1Hz)，0.87(d，3H，J＝6.1Hz)0.86(s，9H)，0.82(d，3H，J＝6.5Hz)，0.084(s，3H)，0.052(s，3H)。
(2R，4S，5S)-5-[(芴基甲氧羰基)氨基]-4-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基]-2，7-二甲基辛酸(化合物10)
在0℃下向经搅拌的含有酸9(0.17g，0.41mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)，加入三氟乙酸(500μl)。在0℃搅拌所得混合物1小时，再将另一部分的三氟乙酸(500μl)加入反应混合物。搅拌混合物30分钟后，用TLC监控反应进程。然后，减压条件下小心去除溶剂，且浴温不超过5℃。将剩余物溶解到二氧己环(3ml)和5ml NaHCO3(300mg)的溶液中。再向此溶液加入含有Fmoc-丁二酰亚胺(166.5mg，0.49mmol)的5ml二氧己环。在23℃搅拌所得混合物8小时。接着，用5ml水稀释混合物，再用25％柠檬酸溶液酸化至PH4.0。用乙酸乙酯(3×50ml)抽提所得的酸性溶液。用盐水清洗合并的抽提物后，用Na2SO4干燥，再经减压浓缩，生成粘稠油状剩余物。用快速硅凝胶色谱提纯剩余物，得到白色泡沫状Fmoc-保护的酸10(137mg，61％)。′H NMR(400MHz，DMSO-d6，343K)δ7.84(d，2H，J＝7.4Hz)，7.66(d，2H，＝8Hz)，7.39(t，2H，J＝7.4Hz)，7.29(m，2H)，6.8(s，1H)，4.29-4.19(m，3H)，3.74-3.59(m，2H)，2.49(m，1H)，1.88(m，1H)，1.58(m，1H)，1.31-1.17(m，3H)，1.10(d，3H，J＝7.1Hz)，0.88(s，9H)，0.82(d，6H，J＝6.2Hz)，0.089(s，3H)，0.057(s，3H)。
按照固体肽合成步骤，合成OM99-1和OM99-2，其中亮*丙在第四步中插入。合成的抑制剂经反相HPLC提纯，其结构由质谱分析进一步确定。
实施例4 其它抑制剂的设计、合成与分析
可以类似地设计并合成不同于OM99-1和OM99-2的各种底物类似物。例如，设计出另外66种抑制剂类似物，MMI-1到MMI-62、MMI-065、MMI-66、MMI-70、MMI-071，并都模仿了memapsin2活性位点的电子等排体。其它底物类似物的合成效仿了OM99-1和OM99-2的合成。其它底物类似物的化学结构列于表3。在方案3中概括了各种抑制剂的普遍合成过程。
方案3
如方案3所示，按照标准肽结合步骤，在含有N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)carbodiimide的盐酸化物、三乙基胺和1-羟基苯并三唑水合物的DMF和CH2Cl2混合物中，将缬氨酸衍生物11与二肽电子等排体9反应，生成酰胺衍生物12。在THF中用氟化四丁基铵与之反应，除去起保护作用的甲硅烷基基团，得到抑制剂13(MMI-001)。在CH2Cl2中将13暴露于三氟乙酸，得以去除BOC(叔丁氧羰基)基团。用BOC-天冬酰胺结合所得的胺，得到抑制剂14(MMI-011)。用三氟乙酸处理14后，标准条件下用BOC-缬氨酸结合所得的胺，产生抑制剂16(MMI-012)。为了合成抑制剂MMI-15，将化合物13与三氟乙酸反应，所得的胺与BOC-蛋氨酸结合，生成抑制剂15(MMI-015)。去除16的BOC基团，将所得的胺与BOC-缬氨酸结合，生成抑制剂17(MMI-017)。
制备抑制剂MMI-001、MMI-011、MMI-012、MMI-015和MMI-017：
制备缬氨酸衍生物(化合物11)：将N-BOC缬氨酸(500mg，2.30mmol)和苯胺(0.5ml，4.60mmol)溶解在CH2Cl2(20ml)和DMF(2ml)的溶液中。在0℃下向此溶液相继加入HOBt(373mg，2.76mmol)、EDC(529mg，2.76mmol)和二异丙乙胺(2.4mL，13.80mmol)。然后，让反应物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用30％乙酸乙酯/己烷抽提所得的混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经快速色谱柱提纯(30％乙酸乙酯/己烷)，得到442mg(63％)结合产物。将所得的胺溶解到CH2Cl2溶液中(20ml)。接着，在室温下加入TFA(4ml)。搅拌反应混合物0.5小时。再将其减压浓缩。获得定量的胺11。
1H NMR(500MHz，CDCl3)0.87(3H，d，J＝6.9Hz)，1.02(3H，d，J＝6.9Hz)，2.00(2H，br s)，2.37(1H，m)，3.36(1H，br s)，4.43-4.52(2H，m)，7.27-7.37(5H，m)，7.70(1H，br s)。
制备酰胺衍生物(化合物12)：将二肽电子等排体9(41mg，0.10mmol)和酰胺11(41mg，0.20mmol)溶解到DMF(2.0ml)中。在0℃下向此溶液相继加入HOBt(20mg，0.15mmol)、EDC(29mg，0.15mmol)和二异丙乙胺(0.2mL)。然后，让反应混合物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用30％乙酸乙酯/己烷抽提混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经色谱柱提纯(20％乙酸乙酯/己烷)，得到55mg(95％)酰胺12。1H NMR(500MHz，CDCl3)0.09(3H，s)，0.10(3H，s)，0.91(9H，s)，0.92-0.98(12H，m)，1.10(3H，d，J＝6.7Hz)，1.25(1H，m)，1.44(1H，m)，1.46(9H，s)，1.63(1H，m)，1.74(1H，br s)，1.80(1H，m)，2.18(1H，m)，2.56(1H，m)，3.62-3.78(2H，m)，4.13(1H，m)，4.48-4.56(3H，m)，6.35(1H，br d，J＝8.5Hz)，6.41(1H，br s)，7.26-7.40(5H，m)。
制备抑制剂MMI-001(化合物13)：在23℃下向含有酰胺12(61mg，0.1mmol)的THF(1.0ml)加入TBAF(1.0M in THF：0.3ml，0.3mmol)，再搅拌过夜。减压浓缩反应混合物。再用色谱柱提纯剩余物(40％乙酸乙酯/己烷)，得到MMI-001(13.41mg，83％)。1HNMR(300MHz，CDCI3)0.88-0.98(12H，m)，1.15(3H，d，J＝6.9Hz)，1.40-1.80(5H，m)，1.43(9H，s)，2.10(1H，m)，2.60(1H，m)，3.40-3.60(2H，m)，4.00(1H，m)，4.20-4.45(3H，m)，4.70(1H，m)，708-718(5H，m)。
制备抑制剂MMI-011(化合物14)：在23℃下向含有13(44mg，0.089mmol)的CH2Cl2(1ml)，加入TFA(0.2ml)。静置0.5小时后，减压浓缩反应混合物。将剩余物溶解到DMF(4ml)中。在0℃下向此溶液相继加入N-Boc-天冬酰胺(41mg，0.18mmol)、HOBt(24mg，0.18mmol)、EDC(34mg，0.18mmol)、二异丙乙胺(0.2ml)。然后，让反应混合物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用乙酸乙酯抽提混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经色谱柱提纯(4％MeOH/乙酸乙酯)，得到12.5mg(23％)MMI-011(14)。1H NMR(500MHz，CD3OD)0.85-1.00(12H，m)，1.10(3H，d，J＝6.7Hz)，1.20-1.50(5H，m)，1.45(9H，s)，1.60(1H，m)，1.75(1H，m)，2.05(1H，m)，2.50-2.70(3H，m)，3.45(1H，m)，3.75(1H，m)，4.10(1H，m)，4.30-4.40(3H，m)，7.20-7.30(5H，m)。
制备抑制剂MMI-015(化合物15)：在23℃下向含有化合物13(64mg，0.13mmol)的CH2Cl2(4ml)，加入TFA溶液(1ml)。静置0.5小时后，减压浓缩反应混合物。将剩余物溶解到DMF(4ml)中。在0℃下向此溶液相继加入N-Boc-蛋氨酸(65mg，0.26mmol)、HOBt(35mg，0.26mmol)、EDC(50mg，0.26mmol)、二异丙乙胺(0.4ml)。然后，让反应混合物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用乙酸乙酯抽提混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经色谱柱提纯(80％乙酸乙酯/己烷)，得到37.2mg(46％)MMI-015(15)。1HNMR(300MHz，CD3OD)0.80-1.00(12H，m)，1.50(3H，d，J＝6.7Hz)，1.20-2.10(10H，m)，1.45(9H，s)，2.10(3H，s)，2.45-2.60(2H，m)，2.70(1H，m)，3.50(1H，m)，3.90(1H，m)，4.10-4.15(2H，m)，4.30-4.42(2H，m)，7.20-7.35(5H，m)。
制备抑制剂MMI-012(化合物16)：在23℃下向含有化合物13(8.4mg，0.014mmol)的CH2Cl2(1ml)，加入TFA(0.2ml)。静置0.5小时后，减压浓缩反应混合物。将剩余物溶解到DMF(1ml)中。在0℃下向此溶液相继加入N-Boc-缬氨酸(6mg，0.028mmol)、HOBt(3.8mg，0.028mmol)、EDC(5.3mg，0.028mmol)、二异丙乙胺(0.2ml)。然后，让反应混合物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用乙酸乙酯抽提混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经色谱柱提纯(4％MeOH/乙酸乙酯)，得到2.1mg(21％)抑制剂MMI-012(16)。1H NMR(400MHz，CD3OD)0.80-1.00(18H，m)，1.05(3H，d，J＝6.7Hz)，1.10-1.50(6H，m)，1.40(9H，s)，1.55(1H，m)，1.70(1H，m)，2.00(1H，m)，2.45-2.70(3H，m)，3.45(1H，m)，3.80-4.45(6H，m)，7.15-7.30(5H，m)。
制备抑制剂MMI-107(化合物17)：在23℃下向含有15(14.5mg，0.023mmol)的CH2Cl2(2ml)，加入TFA(0.5ml)。静置0.5小时后，减压浓缩反应混合物。将剩余物溶解到DMF(2ml)中。在0℃下向此溶液相继加入N-Boc-缬氨酸(10mg，0.046mmol)、HOBt(6.2mg，0.046mmol)、EDC(8.8mg，0.046mmol)、二异丙乙胺(0.4ml)。然后，让反应混合物自然升温至23℃，再搅拌过夜。将混合物倒入NaHCO3饱和溶液。再用乙酸乙酯抽提混合物。用盐水清洗有机层，再用Na2SO4干燥。减压蒸干溶剂得到剩余物，该剩余物经色谱柱提纯(乙酸乙酯)，得到5.5mg(33％)抑制剂MMI-017(17)。Rf＝(10％乙酸乙酯/己烷)；1H NMR(300MHz，CD3OD)0.80-1.00(18H，m)，1.10(3H，d，J＝6.7Hz)，1.20-2.10(11H，m)，1.43(9H，s)，2.10(3H，s)，2.40-2.60(2H，m)，2.70(1H，m)，3.50(1H，m)，3.80-3.95(2H，m)，4.18(1H，m)，4.30-4.50(3H，m)，7.20-7.30(5H，m)。
这些电子等排体酶活性的度量如上文所述，但除上述内容外还要另外加入OM99-1、OM99-2，和MMI-001-MMI0062、MMI-065、MMI-066、MMI-070、MMI-071中的一种抑制剂。OM99-1抑制了重组的memapsin，其ki计算值为3×10-8。所用底物是合成的荧光肽底物。使用相同的荧光底物，度量OM99-2对重组memapsin2的抑制作用。测定的Ki值是9.58×10-9M。
因为M2抑制剂必须穿过血脑屏障(BBB)，P1和P1’的残基非常重要。P1’选择丙氨酸，利于其穿过血脑屏障。丙氨酸侧链的类似物同样起作用。例如，除了丙氨酸的甲基侧链外，经取代的甲基、与甲基或乙基尺寸相同的基团也能够替代丙氨酸侧链。在P1位点的亮氨酸也能够被尺寸相似的基团所替代，或在其侧链发生取代。为了穿过血脑屏障，人们希望将抑制剂做得更小。因此，人们把OM99-1作为制备的起点，去除其外侧亚位点P4、P3、P3’、和P4’。然后，将保留结构“天酰-亮*丙-丙”进一步演变成带有取代基，从而获得既能够穿过血脑屏障又紧密结合的M2抑制剂。
还测定了其它底物类似物的酶抑制性，MMI-001到MMI-071。例如，MMI-017、MMI-070、MMI-071的Ki值与OM99-2的值具有可比性，表明它们也是优秀的memapsin抑制剂。MMI-012、MMI-018、MMI-026或MMI-066的Ki值大约比OM99-2的值高一倍，表明它们是抑制memapsin的合格候选物。每种其它底物类似物的Ki和其相应的化学结构都列于表3。
表3其它底物类似物的化学结构和Ki值
(续前页表3)
(续前页表3)
(续前页表3)
实施例5 memapsin2的亚位点(β-secretase)特异性
从OM99-2获得的结论证明，通过制定OM99-2的8个亚位点，其可以获得高抑制效力(Ki＝1.6nM)。然而，为了穿过血脑屏障到达脑部，药用memapsin2抑制剂必须要小(例如，通常小于500-700道尔顿)。关于Memapsin2亚位点特异性的详细信息会为设计紧密结合的小抑制剂提供更好的认知。基于底物动力学和探测随机序列抑制剂文库的结果，已经确定了memapsin2的所有亚位点优先。
实验过程
设计确定的底物混合物
为了探测模板序列EVNLAAEF(序列：22)8个位点中的每个位点，合成了肽混合物，该模板序列来源于上述memapsin2抑制剂OM99-2和APP的β-secretase断裂。为了特征化每个位置，在固相合成的适当循环中加入7种氨基酸衍生物的等摩尔混合物(Research Genetics，Invitrogen，Huntsville，Alabama)，生成了在单一位置有7种不同氨基酸的7肽混合物。为了利于将底物和水解产物迅速定量，使用高处理量的MALDI-TOF MS。由于一些氨基酸具有妨碍识别的相同质量，所以不可能在单一混合物中替换全部共有的氨基酸侧链(总共19种，半胱氨酸除外)。从而，将不同氨基酸的替换分为三组(表4和5)，使其质量差异最大化，并将位于单一亚位点的全套19种氨基酸(较少的半胱氨酸)包含于底物的3种混合物中，该混合物中肽被合成为在单一位置插入每一种氨基酸。每组也含有标准肽，目的是关联混合物之间的定量信息，从而计算相对的Kcat/Km。公知Kcat/Km值的底物作为规范化其它底物的相对初始率与计算Kcat/Km值的内部标准。对于P1’、P2’、P3’、P4’位置，在模板序列的碳端扩展了4个残基(模板EVNLAAEFWHDR，序列：23，表4)以利于其在MALDI-TOF MS中的测定。同样，在模板的氮端也另加长4个残基，以特征化P1、P2、P3和P4位置的特异性(模板RWHHEVNLAAEF，序列：24，表5)。
表4.对P1’位置测定memapsin2特异性的肽底物混合物
表5.对P1位置测定memapsin2特异性的肽底物混合物
用MALDI-TOF MS测定初始率
在10％冰醋酸溶液中溶解底物混合物(2mg/ml)，再将其搀入适当浓度的NaOH溶液中，得到底物混合物(μM数量级)的PH4.1乙酸钠溶液。在25℃等分试样，再加入memapsin2的等分试样，引发反应。在一定时间间隔内移出等分样品(10μl)，与MALDI-TOF基物(α羟基肉桂酸的丙酮溶液，20mg/ml)混合后，立即一分两份放置在不锈钢MALDI样品盘的指定位置。以150毫微秒延迟、20,000伏加速电压的正极模式应用MALDI-TOF质谱分析仪，同时使用校内分子生物资源中心的PE生物系统Voyager DE仪器，分析样品。在400-2000原子质量单位(amu)范围内检测到带有质量与电荷比(m/z)的离子。再使用Voyager数据探测模块，得到重要物种的离子强度数据。
随机序列抑制剂文库
随机序列抑制剂文库是基于在P2、P3、P2’、和P3’四个亚位点含有任一氨基酸(较少的半胱氨酸)的OM99-2序列。联电子等排体“亮*丙”(“*”代表羟乙烯过渡态电子等排体)用于合成以嵌入位置P1和P1’。以合成固形肽的方法合成肽，并附着在树脂珠的左侧。利用“分割-合成”的过程(Lam等人1991)，每个树脂珠只含一种序列，同时每个珠的序列都不相同。全文库序列如下，
甘-Xx1-Xx2-亮*丙-Xx3-Xx4-苯丙-精-蛋-甘-甘-[树脂球]
P4 P3 P2 P1 P1’P2’P3’P4’(序列：67)
其中对于Xxn残基(其中“n”代表1、2、3、或4)的每个位置，随机从19种氨基酸中选取。在橡胶珠上也出现了以P2’为起点的短型肽(序列：Xx3-Xx4-苯丙-精-蛋-甘-甘-[树脂球]序列：68)，其与长序列的比率大约是7∶3。由于不含电子等排体，短序列不能以强作用力与memapsin2相结合，但是其出现便于以自动的埃德曼降解法鉴别残基。从随机位置鉴别的残基如下：
埃德曼循环# 1 2 3 4
序列1，从长序列 甘 Xx1 Xx2 亮
序列2，从短序列 Xx3 Xx4 苯丙 精
对Xx3和Xx2的测定具有确定性，因为它们是循环1和3中各自唯一未知的残基。氨基酸Xx1和Xx4的分配是根据其相对含量。蛋氨酸的存在允许经MS/MS鉴别的肽发生CNBr断裂。
随机序列文库的探测
代表了文库的一个拷贝的大约130,000个单珠，据估计可包含于1.1ml结合牢固的珠中，在缓冲液A(50mM乙酸钠，0.1％Triton X-100，0.4M尿素，0.02％叠氮化钠，1mg/ml BSA，PH3.5；经5微米滤料过滤)中水合。将珠浸泡在含有3％BSA的缓冲液A中1小时，以阻止非特异性结合，再用相同的缓冲液清洗2次。将重组的memapsin2在缓冲液A稀释至4nM，再与此文库一起培养1小时。进行一次严格的清洗，其中包括含有6.7μM过渡态电子等排抑制剂OM99-2的缓冲液B(50mM乙酸钠，0.1％TritonX-100，0.02％叠氮化钠，1mg/ml BSA，PH5.5；经5微米滤料过滤)，随后再用不含OM99-2的缓冲液B清洗二次。将亲和提纯的重组memapsin2特异IgG在缓冲液B中稀释100倍，再与文库一起培养30分钟。接着，用缓冲液B清洗三次，再将亲和提纯的抗-羊-碱性磷酸酶偶联体搀入缓冲液B(1∶200)，培养30分钟，随后清洗三次。将单片碱性磷酸酶底物(BCIP/NBT)溶解到10ml水中，并将1ml所得液与珠混合培养1小时。将珠再次悬浮于0.02％叠氮化钠水溶液中，并在解剖显微镜中观察。目测区分暗黑色斑珠，逐个分离，在8M尿素中脱除24小时，然后在DMF中脱色。在校内分子生物资源中心使用生物系统蛋白测序仪，进行珠序列的测定，并以反相HPLC量化PTH-氨基酸。
确定动力学参数
利用单肽底物和单体抑制剂的Ki，对动力学参数Km和Kcat的测定如上所述。
构建OM00-3结合memapsin2的模型
将OM99-2结合memapsin2的晶体结构用作初始模型。用OM00-3的残基替换其对应的亚位点残基。从rotomer文库目测选择最适合以非结合方式相互作用、结合袋的侧链构象。再运行CNS程序，使用Engh和Huber能量参数进行能量最小化(Engh，RA and Huber“Accurate bond and angle parameters for X-raystructure refinement”in：Acta Cryst.A47，392-400(1991))。在最小化过程中，Cα原子和与抑制剂距离超过5埃的原子受到了调和抑制。
结论
对应底物侧链、memapsin2亚位点优先的测定
对于如晶体结构所示的侧链，memapsin2底物的裂隙容纳了8种亚位点。针对memapsin2的所有亚位点，以传统酶动力学分析全套的侧链优先，需要测定160对单个Kcat和Km值，如此繁重的工作以致对于具有宽度特异性的任何天冬氨蛋白酶都是不可能的。然而，亚位点优先是以带有不同侧链底物相对催化能力、Kcat/Km值定义的，其可由确定的底物混合物相对初始水解率确定。(Fersht，A，Enzyme Structure and Mechanism，2nd Ed.Freeman，New York(1985)，其所有内容合并于此)。此方法成功地应用于分析其它天冬氨蛋白酶的特异性(Kassel et al，1995；Koelsch etal，2000，其所有内容都通过在此引述而合并于本文)。使用MALDI-TOF/MS离子强度量化产物和底物的相对含量，进一步简化了水解率的测定。MALDI-TOF/MS离子强度应用于准确地量化来自血浆和细胞培养的化合物(Sugiyama et al，“Aquantitative analysis of serum sulfatide by matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry with delayedion extraction”in：Anal Biochem 274：90-97(1999)；Wu et al，“Anautomated MALDI mass spectrometry approach for optimizingcyclosporin extraction and quantitation”in：Anal Chem69：3767-71(1997)，所有内容都通过在此引述而合并于本文)，以测定Aβ40和来自细胞培养的Aβ42的相对含量(Davies et al，“The structure and function of the aspartic proteinases”in：AnnuRev Biophys Chem 19：189-215(1990)，所有内容都通过在此引述而合并于本文)。对于本方法MALDI-TOF/MS的优点包括灵敏性与快速获取数据。产物与底物混合物的离子强度数据产生了极匹配的线性相关，与混合物中每种底物都一致，并不需要校正因子。因此，应用此方法，可以测定每种混合物中每种肽的水解初始速率。初始速率的比率与其相对催化效力Kcat/Km成比例(Fersht，1985)。
对应底物，Memapsin2的8个亚位点的相对催化效力展示在图5中。其结果进一步证实了以前的观察，memapsin2的8个亚位点并非决对严格。在P侧与P’侧上，中心亚位点(P1和P1’)比外侧亚位点(P4和P4’)更严格。当将非优先残基(背景)的水解效力与优先残基相比较时，这种情况明显地表现出来。P’侧的四个亚位点更加明显地缺少严格性，尤其是当背景含量相对较高时的P3’和P4’。两个亚位点较差的严格性与观察结果是一致的，晶体结构中OM99-2的P3’和P4’侧链并未与酶发生显著的相互作用。
亚位点P4优选谷氨酰胺，而不是谷氨酸，且谷氨酰胺优于天冬氨酸。OM99-2的P4-谷氨酸对于具有多种相互作用的S4袋非常合适。由谷氨酰胺替代P4-谷氨酸，催化效力降低，也许是由于丧失了带有Arg235和Arg307P4侧链的电荷相互作用。由天冬氨酸替代P4-谷氨酸，催化能力的进一步降低，可能是因为缺少了P2-天冬酰胺之间的氢键。对于OM99-2，亚位点P3更优选异亮氨酸，而不是缬氨酸。因为异亮氨酸更适合S3疏水袋。
以组合文库确定抑制剂的侧链优先
人们也已经研究了对于抑制剂结合的亚位点优先。合成了固定在珠上、大约1.3×105个不同抑制剂的组合文库，再以memapsin2探测。文库的基本序列取自OM99-2，EVNL*AAEF(序列：69)(“*”标明电子等排体羟乙烯基)，其中亚位点P3、P2、P2’和P3’(黑体字)随机选取除了半胱氨酸的所有氨基酸。由于文库合成中使用“亮*丙”，所以P1和P1’保持不变。不任选P4和P4’，为的是保持文库大小的可控性。况且，对于设计更小的抑制剂，关于外侧亚位点的信息并不重要。用尿素溶液清洗以增强memapsin2的结合选择性后，用memapsin2抗体和结合第二抗体的碱性磷酸酶探测珠上的结合memapsin2。在光学显微镜下从大约130,000颗珠中观察到大约65颗重染色珠。对10颗着色最重的珠，使用自动的Edman测序仪，确定了抑制剂序列。在4个随机位置上观察到明显的一致性，ELDLAVEF(序列：70)。阳极珠上明显的一致性和阴极珠上一致性的缺乏(表2)支持了memapsin2结合文库优选序列的观点。而且，抑制剂序列的一致性非常符合底物研究的结论。利用上述方法合成具有一致序列ELDL*AVEF(序列：71)的抑制剂，OM00-3。经证明，其Ki值是0.31nM，几乎比OM99-2的Ki值低5倍。
表2从组合文库选出OM99-2的有效竞争者
文库模板：Gly-P3-P2-Leu*Ala-P2’-P3’-Phe-Arg-Met-Gly-Gly-Resin：树脂(序列72-83)
在memapsin2的活性位点结合OM00-3
将OM99-2的晶体结构和OM2000-1分子模型之间进行比较，显示出基于与memapsin2结合的OM99-2的改进抑制剂。与OM99-2相比，通过改进的范德华力，酶的亚位点更好地容纳了OM00-3亚位点P3和P2’上更大的疏水侧链。它们之中有6种显著的新型相互作用：抑制剂的P3-Lew与酶的亮氨酸和甘氨酸，P2’-缬氨酸与酶的缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和酪氨酸。此外，模型显示，在P2位置以天冬氨酸替换天冬酰胺，为P2-天冬氨酸侧链原子CD1和CD2与精氨酸-235侧链原子NE和NH1之间导入了三条新盐桥。这些盐桥的原子间距分别是3.6、3.4和3.5埃。这些电荷的相互作用应该提供了高于OM99-2中P2-天冬酰胺的结合自由能。观察到的两种抑制剂结合之间的结构差异与Ki值从OM99-2到OM00-3下降4.5倍是一致的。
为了药用治疗AD，memapsin2抑制剂必须穿透血脑屏障，因此，抑制剂尺寸必须要小(小于700道尔顿)。一种八残基抑制剂是917道尔顿，诸如OM00-3。更小的抑制剂可以设计为使用更少的亚位点，也许仅跨4或5个亚位点。文中所述的关于亚位点优先与三维结构的信息相结合，用于设计此抑制剂。
实施例6：应用晶体结构设计抑制剂
药用抑制剂通常小于800道尔顿。关于memapsin2抑制剂，由于存在药物穿过血-脑的需要，要求甚至会更严格。在当前的模型中，良好确定的P4-P2’亚位点结构为该药物的合理设计提供了充足的模板区域。如晶体结构所示，抑制剂每个侧链与酶相应亚位点的空间关系允许在每个位置上设计新型抑制剂结构。也可将亚位点P2’、P3’、P4’的独特构象体现在memapsin2抑制剂的选择性中。基于现晶体结构下文给出了抑制剂的设计实例。
实例A：因为P3缬氨酸与P1亮氨酸的侧链相互包裹，且两者之间不存在酶结构，所以这些侧链的交联会增加抑制剂对memapsin2的结合力。这是因为当与酶结合时，与未交联的抑制剂相比，交联的抑制剂在自由态与结合态之间具有较小的熵差(Khan，A R et al，Biochemistry，37：16839(1998)，其全部内容都通过在此引述而合并于本文)。可能的侧链交联结构包括图1所示的结构。
实例B：相同的情况也出现在P4谷氨酸与P2天冬酰胺之间。现晶体结构显示这些侧链已经以氢键相互结合，因此它们之间的交联也带来如A所述的结合益处。该交联结构包括图2所示的结构。
实例C：基于当前的晶体结构，P1’丙氨酸侧链能够以新型疏水的相互作用、范德华力、氢键得到扩展。此类设计的实例如图3所示。
实例D：基于当前的晶体结构，P1、P2、P3区域中的多肽主链和P1-亮氨酸的侧链、加上两个原子(图4的A和B)能够成环。而且，甲基基团能够加到P1-亮氨酸的β-碳上(图4)。
文中所述的方法和材料的改进与变化对于本技术领域的技术人员是显而易见的，并属于权利要求范围之内。
当优先实施方案特别说明并描述了本发明时，业内技术人员可以理解，在不超出权利要求范围的情况下可以做出形式与细节上的各种变化。
序列表
<110>俄克拉荷马医学研究基金会
伊利诺伊大学董事会
<120>MEMAPSIN2的抑制剂及其用法
<130>2932.1006009
<140>PCT/US01/50826
<141>2001-12-28
<150>US 60/275,756
<151>2001-03-14
<150>US 60/258,705
<151>2000-12-28
<160>83
<170>FastSEQ用于视窗4.0版
<210>1
<211>3252
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
gcgggagtgc tgcctgccca cggcacccag cacggcatcc ggctgcccct gcgcagcggc 60
ctggggggcg cccccctggg gctgcggctg ccccgggaga ccgacgaaga gcccgaggag 120
cccggccgga ggggcagctt tgtggagatg gtggacaacc tgaggggcaa gtcggggcag 180
ggctactacg tggagatgac cgtgggcagc cccccgcaga cgctcaacat cctggtggat 240
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cagctttgtg gtgctggctt ccccctcaac cagtctgaag tgctggcctc tgtcggaggg 660
agcatgatca ttggaggtat cgaccactcg ctgtacacag gcagtctctg gtatacaccc 720
atccggcggg agtggtatta tgaggtgatc attgtgcggg tggagatcaa tggacaggat 780
ctgaaaatgg actgcaagga gtacaactat gacaagagca ttgtggacag tggcaccacc 840
aaccttcgtt tgcccaagaa agtgtttgaa gctgcagtca aatccatcaa ggcagcctcc 900
tccacggaga agttccctga tggtttctgg ctaggagagc agctggtgtg ctggcaagca 960
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aaccagtcct tccgcatcac catccttccg cagcaatacc tgcggccagt ggaagatgtg 1080
gccacgtccc aagacgactg ttacaagttt gccatctcac agtcatccac gggcactgtt 1140
atgggagctg ttatcatgga gggcttctac gttgtctttg atcgggcccg aaaacgaatt 1200
ggctttgctg tcagcgcttg ccatgtgcac gatgagttca ggacggcagc ggtggaaggc 1260
ccttttgtca ccttggacat ggaagactgt ggctacaaca ttccacagac agatgagtca 1320
accctcatga ccatagccta tgtcatggct gccatctgcg ccctcttcat gctgccactc 1380
tgcctcatgg tgtgtcagtg gcgctgcctc cgctgcctgc gccagcagca tgatgacttt 1440
gctgatgaca tctccctgct gaagtgagga ggcccatggg cagaagatag agattcccct 1500
ggaccacacc tccgtggttc actttggtca caagtaggag acacagatgg cacctgtggc 1560
cagagcacct caggaccctc cccacccacc aaatgcctct gccttgatgg agaaggaaaa 1620
ggctggcaag gtgggttcca gggactgtac ctgtaggaaa cagaaaagag aagaaagaag 1680
cactctgctg gcgggaatac tcttggtcac ctcaaattta agtcgggaaa ttctgctgct 1740
tgaaacttca gccctgaacc tttgtccacc attcctttaa attctccaac ccaaagtatt 1800
cttcttttct tagtttcaga agtactggca tcacacgcag gttaccttgg cgtgtgtccc 1860
tgtggtaccc tggcagagaa gagaccaagc ttgtttccct gctggccaaa gtcagtagga 1920
gaggatgcac agtttgctat ttgctttaga gacagggact gtataaacaa gcctaacatt 1980
ggtgcaaaga ttgcctcttg aattaaaaaa aaactagatt gactatttat acaaatgggg 2040
gcggctggaa agaggagaag gagagggagt acaaagacag ggaatagtgg gatcaaagct 2100
aggaaaggca gaaacacaac cactcaccag tcctagtttt agacctcatc tccaagatag 2160
catcccatct cagaagatgg gtgttgtttt caatgttttc ttttctgtgg ttgcagcctg 2220
accaaaagtg agatgggaag ggcttatcta gccaaagagc tcttttttag ctctcttaaa 2280
tgaagtgccc actaagaagt tccacttaac acatgaattt ctgccatatt aatttcattg 2340
tctctatctg aaccaccctt tattctacat atgataggca gcactgaaat atcctaaccc 2400
cctaagctcc aggtgccctg tgggagagca actggactat agcagggctg ggctctgtct 2460
tcctggtcat aggctcactc tttcccccaa atcttcctct ggagctttgc agccaaggtg 2520
ctaaaaggaa taggtaggag acctcttcta tctaatcctt aaaagcataa tgttgaacat 2580
tcattcaaca gctgatgccc tataacccct gcctggattt cttcctatta ggctataaga 2640
agtagcaaga tctttacata attcagagtg gtttcattgc cttcctaccc tctctaatgg 2700
cccctccatt tatttgacta aagcatcrca cagtggcact agcattatac caagagtatg 2760
agaaatacag tgctttatgg ctctaacatt actgccttca gtatcaaggc tgcctggaga 2820
aaggatggca gcctcagggc ttccttatgt cctccaccac aagagctcct tgatgaaggt 2880
catctttttc ccctatcctg ttcttcccct ccccgctcct aatggtacgt gggtacccag 2940
gctggttctt gggctaggta gtggggacca agttcattac ctccctatca gttctagcat 3000
agtaaactac ggtaccagtg ttagtgggaa gagctgggtt ttcctagtat acccactgca 3060
tcctactcct acctggtcaa cccgctgctt ccaggtatgg gacctgctaa gtgtggaatt 3120
acctgataag ggagagggaa atacaaggag ggcctctggt gttcctggcc tcagccagct 3180
gcccmcaagc cataaaccaa taaamcaaga atactgagtc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240
aaaaaaaaaa aa 3252
<210>2
<211>488
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Ala Gly Val Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro
1 5 10 15
Leu Arg Ser Gly Leu Gly GlyAla Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg
20 25 30
Glu Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val
35 40 45
Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val
50 55 60
Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp
65 70 75 80
Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu
85 90 95
His Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg
100 105 110
Lys Gly Val Tyr Val Pro TYr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu
115 120 125
Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg
130 135 140
Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly
145 150 155 160
Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg
165 170 175
Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr
180 185 190
His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro
195 200 205
Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile
210 215 220
Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro
225 230 235 240
Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile
245 250 255
Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys
260 265 270
Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val
275 280 285
Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lyr Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys
290 295 300
Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala
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Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met
325 330 335
Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln
340 345 350
Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr
355 360 365
Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val
370 375 380
Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile
385 390 395 400
Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala
405 410 415
Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr
420 425 430
Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val
435 440 445
Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val
450 455 460
Cys Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe
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Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
485
<210>3
<211>503
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Ala
1 5 10 15
Gly Val Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu
20 25 30
Arg Ser Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu
35 40 45
Thr Asp Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu
50 55 60
Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu
65 70 75 80
Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn IIe Leu Val Asp Thr
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Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His
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Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys
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Gly Val Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly
130 135 140
Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala
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Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser
165 170 175
Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro
180 185 190
Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His
195 200 205
Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu
210 215 220
Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly
225 230 235 240
Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile
245 250 255
Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn
260 265 270
Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser
275 280 285
Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe
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Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe
305 310 315 320
Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly
325 330 335
Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly
340 345 350
Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr
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Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys
370 375 380
Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile
385 390 395 400
Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly
405 410 415
Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala
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Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn
435 440 445
Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met
450 455 460
Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys
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Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala
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Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys
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<210>4
<211>501
<212>PRT
<213>Homo sapien
<400>4
Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser
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Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val
50 55 60
Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr
65 70 75 80
Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser
85 90 95
Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr
100 105 110
Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val
115 120 125
Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp
165 170 175
Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp
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Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro
195 200 205
Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln
210 215 220
Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile
225 230 235 240
Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg
245 250 255
Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln
260 265 270
Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val
275 280 285
Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Val Phe Glu Ala
290 295 300
Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp
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Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val
340 345 350
Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg
355 360 365
Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala
370 375 380
Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu
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Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala
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Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu
420 425 430
Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro
435 440 445
Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala
450 455 460
Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp
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Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp
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Ile Ser Leu Leu Lys
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Glu Val Asn Leu Ala Ala Glu Phe
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>9
Ser Val Asn Met Ala Glu Gly Asp
1 5
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Lys Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Lys
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>11
Leu Val Asn Met Ala Glu Gly Asp
1 5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>12
Arg Gly Ser Met Ala Gly Val Leu
1 5
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu
1 5
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala
1 5
<210>15
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala
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<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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His Leu Cys Gly Ser His Leu Val
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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Val Gly Ser Gly Val
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<223>Synthetic peptide
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Val Gly Ser Gly Val Leu Leu
1 5
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys
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<213>Artificial Sequence
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<223>Synthetic peptide
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Val Gly Ser Gly Val Leu Leu Ser Lys
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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<223>Xaa＝Transition-state isostere hydroxyethylene
<400>23
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<211>5
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
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<223>Xaa＝Trasition-state isostere hydroxyethylene
<400>24
Asn Leu Xaa Ala Ala
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
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Glu Val Asn Leu Ala Ala Glu Phe Trp His Asp Arg
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<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<213>Artificial Sequence
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<213>Artificial Sequence
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<213>Artificial Sequence
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<213>Artificial Sequence
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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<212>PRT
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<220>
<223>Synthetic peptide
<400>53
Arg Trp His His Glu Val Asn Phe Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>54
Arg Trp His His Glu Val Asn Ala Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>55
Arg Trp His His Glu Val Asn Val Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>56
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>56
Arg Trp His His Glu Val Asn Leu Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>57
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>57
Arg Trp His His Glu Val Asn Gln Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>58
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>58
Arg Trp His His Glu Val Asn Met Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>59
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>59
Arg Trp His His Glu Val Asn Tyr Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>60
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>60
Arg Trp His His Glu Val Asn Phe Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>61
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>61
Arg Trp His His Glu Val Asn Pro Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>62
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>62
Arg Trp His His Glu Val Asn Asn Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>63
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>63
Arg Trp His His Glu Val Asn Lts Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>64
Arg Trp His His Glu Val Asn Arg Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>65
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>65
Arg Trp His His Glu Val Asn His Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>66
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>66
Arg Trp His His Glu Val Asn Trp Ala Ala Glu Phe
1 5 10
<210>67
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>2，3，7，8
<223>Xaa＝Any amino acid
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝HY droxyethylene transition-state isostere
<400>67
Gly Xaa Xaa Leu Xaa Ala Xaa Xaa Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>68
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>1，2
<223>Xaa＝Any amino acid
<400>68
Xaa Xaa Phe Arg Met Gly Gly
1 5
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>69
Glu Val Asn Leu Xaa Ala Ala Glu Phe
1 5
<210>70
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<400>70
Glu Leu Asp Leu Ala Val Glu Phe
1 5
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>71
Glu Leu Asp Leu Xaa Ala Val Glu Phe
1 5
<210>72
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>72
Gly Leu Asp Leu Xaa Ala Val Glu Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>73
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>73
Gly Leu Glu Leu Xaa Ala Val Glu Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>74
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>74
Gly Leu Asp Leu Xaa Ala Val Glu Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>75
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>75
Gly Leu Asp Leu Xaa Ala Val Glu Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>76
Gly Leu Asp Leu Xaa Ala Val Gln Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>77
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>77
Gly Ile Asp Leu Xaa Ala Ala Gln Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>78
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>78
Gly Ile Asp Leu Xaa Ala Val Tyr Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>79
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>79
Gly Leu Glu Leu Xaa Ala Val Gln Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>80
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>80
Gly Leu Phe Leu Xaa Ala Val Glu Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>81
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>2，8
<223>Xaa＝Phe or Ile
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>81
Gly Xaa Ser Leu Xaa Ala Val Xaa Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>82
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<400>82
Gly Phe Met Leu Xaa Ala Asn Arg Phe Arg Met Gly Gly
1 5 10
<210>83
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Synthetic peptide
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝Hydroxyethylene transition-state isostere
<221>VARIANT
<222>7
<223>Xaa＝Any amino acid
<400>83
Gly Asp Phe Leu Xaa Ala Xaa Ser Phe Arg Met Gly Gly
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机译： 用法呢基转移酶抑制剂治疗癌症的方法
机译： 用法呢基转移酶抑制剂治疗癌症的方法
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