一种基于基质辅助激光解吸电离源质谱靶板的蛋白酶解方法

摘要

本发明属生化分析技术领域，是一种基于基质辅助激光解吸电离源(MALDI)质谱靶板的蛋白质快速酶解方法。现有的传统蛋白酶解存在耗时长和需要大量蛋白变性剂等缺点，不适合用于复杂生物样品中蛋白的大规模分离后所要求的高效酶解及质谱测定。本发明是在MALDI(基质辅助激光解吸电离源)靶板上加入蛋白和蛋白酶并在适当的pH和温度下进行快速有效酶解，随后进行质谱鉴定。本发明可实现复杂生物样品中蛋白分离、酶解及质谱鉴定等操作步骤的连续自动化。该酶解方法具有操作简单、灵敏度高、无需蛋白变性剂及低耗等优点，十分适合应用于复杂生物样品中蛋白的快速分离鉴定，在蛋白质组学研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

说明书

技术领域

本发明属生化分析技术领域，提供了一种基于基质辅助激光解吸电离源质谱靶板的蛋白酶解方法。适用于复杂生物样品中蛋白的快速有效酶解。

背景技术

随着人类基因组计划的顺利完成，生命科学的研究进入了后基因组时代，其中功能基因组学成为研究重点，蛋白质组学则是其中的重要支柱。然而蛋白质组学则是基于质谱技术的新兴研究领域。现代生物质谱技术的发展为蛋白质鉴定提供了强有力的技术支持。由于生物质谱作为检测器，不仅可提供蛋白质分子的精确的分子量信息，同时还可以提供蛋白酶解后肽段的精确相对分子质量信息，从而推断出肽段的部分序列，这些信息的获得对蛋白质的鉴定具有重要意义。

在蛋白质的鉴定分析中，蛋白质的酶解是关键的一步。在各种蛋白酶中，常见的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、金黄色葡萄球菌蛋白酶和V8等。胰蛋白酶的酶切位点少且较为单一，是在肽谱分析中较为常见的蛋白酶。通常溶液中蛋白酶解有三个步骤：第一步是蛋白质变性，由于蛋白质具有一定的空间结构，在水溶液中由于蛋白分子不易深入一些蛋白质的疏水位点，或者由于一些氨基酸序列包埋在蛋白质的内部使得酶分子不能与该肽段结合，常常使得蛋白质酶解不完全。因此，在酶解反应中，常采用一些物理、化学方法使蛋白质变性，破坏蛋白质的空间结构，使之成为舒展开的仅有一级结构的蛋白质。一般的变性方法有：加入高浓度的尿素、蛋白质的高温加热，同时对具有二硫键的蛋白质也采用二硫苏糖醇还原二硫键。实验表明，蛋白质的变性对酶解反应的完全与否具有较为重要的影响；第二步是酶解，由于酶是具有高效催化效率的蛋白质，因此在适宜的酶解条件下，蛋白酶将自身酶解，从而产生一定的背景。在酶解反应中，应当严格控制酶与蛋白质的比例。对胰蛋白酶的酶解反应，一般采用50∶1(蛋白质∶酶)的比例，最少不低于25∶1。同时在酶解反应中，应当严格控制酶解温度，不同的缓冲体系，酶解的适宜温度有所不同。在胰蛋白酶的反应中，0.1mol/L NH₄HCO₃(pH约为8.1)缓冲体系中，适宜的温度一般为37℃，反应时间12小时。第三步为酶解反应的终止，酶解反应的终止可以采用加入强酸、强碱等方法，但由于其他试剂的加入，往往干扰了质谱的测定，带来不必要的背景。因此，在生物质谱的肽谱分析中，采用冰冻或加热的方法终止酶解反应。从上面所述的常规酶解方法可知，该方法烦琐且耗时长，不利于实现蛋白分离、酶解及质谱测定等过程的自动化操作。因此随着目前全球对生物体中蛋白质组学研究的大规模展开，更有效、更简单同时可实现全自动化的蛋白酶解技术被迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于基质辅助激光解吸电离源(MALDI)质谱靶板的蛋白酶解方法。

本发明的另一个目的是提供上述蛋白酶解方法的应用。

本发明提供了一种基于基质辅助激光解吸电离源(MALDI)质谱靶板的蛋白酶解方法，包括以下步骤：

(1)将蛋白样品转移到基质辅助激光解吸电离源(MALDI)质谱靶板上；

(2)若蛋白样品是液态则将靶板温度调节至20-100℃，具体温度视蛋白液滴体积的大小而定，目的在于使液滴体积减小到1微升以内或干掉；若蛋白样品是固态则将靶板温度调节至室温(25℃)。

(3)将靶板置于密闭空间，加入蛋白酶溶液及其缓冲液，所加蛋白酶与样品中蛋白的质量比为2∶1-1∶500；调节温度至蛋白酶的反应温度，一般为25-100℃，最好为所用蛋白酶的最佳反应温度；进行酶解即可。

本发明中，蛋白样品可通过色谱、电泳或者层析分离得到，例如采用安捷伦公司的HP1100微泵系统，戴安公司的LC-packing二维液相分离系统，安捷伦公司的毛细管电泳仪，Beckman公司的毛细管电泳仪，等等。蛋白样品亦可来自未经分离的蛋白混合物或纯蛋白。所述的电泳包括等电聚焦凝胶电泳或者双向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者是液态等电聚焦电泳(如毛细管等电聚焦电泳，制备型液态等电聚焦电泳)等。

本发明中，加入蛋白酶溶液及其缓冲液的体积可以取0.05-20微升。

本发明中，基质辅助激光解吸电离源(MALDI)靶板温度调节范围视具体蛋白混合物成分和酶的种类而定，一般为0-100℃。MALDI靶板一般采用不锈钢板、金属或其他材料制作。例如，Applied Biosystem MALDI板(192-AB stype(192-AB型号)不锈钢)，Bruker MALDI板(涂层镀金不锈钢板)，等等。

本发明中，酶解反应时间为1秒-60分钟或数小时。反应的温度和缓冲溶液根据所使用的蛋白酶来决定，一般控制在30min以内。

本发明中，酶解反应在密闭空间中进行。该密闭空间的作用是保温保湿，因为反应体系暴露在空气中时间一长就干掉了。密闭空间可采用保温箱等。

本发明中，酶解反应后将基质辅助激光解吸电离源(MALDI)靶板温度不变或调节到其它温度下迅速空气吹干以终止酶解反应或自然干燥。最后加入有机基质与蛋白酶解产物形成结晶。亦可采取加入变性剂的方法或者加入强酸改变pH的方法使酶解反应终止。

本发明还提供上述蛋白酶解方法的应用。

本发明中，可将含有蛋白酶解产物的基质辅助激光解吸电离源(MALDI)靶板置于质谱仪中，对MALDI靶板上的样品进行质谱测定。MALDI靶板上的蛋白质在蛋白酶催化下进行的高度专一性的裂解后，酶解产物随即进行质谱分析，从而实现蛋白组分解析的自动化。通常，酶解结束后，MALDI靶板上液滴迅速被吹干(如何吹干)，随即加入有机基质使蛋白酶解产物与有机基质形成结晶，再进行MALDI-MS测定。

本发明中，可将上述系统与液体分离装置连接，即将液体分离得到的蛋白液滴直接转移到(MALDI)辅助激光解吸电离源质谱靶板上。蛋白酶解后随即进行质谱分析，就可以实现蛋白从分离纯化到组分解析的全自动化。

本发明的蛋白酶解方法无需变性剂，灵敏度高，操作简单且易于自动化，省时且低耗，蛋白酶解完全，是一种适合商品化MALDI-MS靶板上操作的酶解新方法。此外，该方法可以作为蛋白混合物的液态分离装置和MALDI-MS之间很好的接口，实现复杂样品中蛋白快速分离鉴定的高通量自动化操作，在蛋白质组学研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

具体实施方式

实例1  液相色谱分离蛋白和胰蛋白酶酶解

蛋白质混合物采用反相高压液相色谱分离，例如采用安捷伦公司的HP1100微泵系统，采用30cm×250μm(长度分离×内径)的C8分离柱，分离时间100min，流速为1μl/min，采用点样机以1次/min的频率将馏分收集到MALDI靶板上，靶板温度为50℃，馏分迅速干掉，所有100份馏分收集结束后，再用点样机以1200次/h的频率将1μl浓度为1ng/μl胰蛋白酶(10mmol/L NH₄HCO₃，pH 8)加到所有100份馏分上，MALDI靶板温度37℃，反应时间10min。酶解结束后，MALDI靶板温度调节为室温(25℃)，再用点样机以1200次/h的频率将0.3μLα-cyano-4-hydroxycinnamic acid(α-氰基-4-羟基肉桂酸)加到所有100份馏分上(蛋白酶解产物与有机基质会形成结晶)，所有样品点干了以后进行MALDI-MS分析。

实例2  毛细管电泳分离蛋白和V8酶解

蛋白质混合物采用毛细管等电聚焦电泳分离，可采用自制的馏份收集系统，采用30cm×100μm(长度分离×内径)的涂层毛细管，分离时间24min，鞘流流速为1μl/min，馏份收集系统以4次/1min的频率将馏分收集到MALDI靶板上，靶板温度为50℃，馏分迅速干掉，所有96份馏分收集结束后，再用点样机以1200次/h的频率将1μl浓度为1ng/μl endoprotease Glu-C(V8)(10mmol/L NH₄HCO₃，pH 8)加到所有96份馏分上，MALDI靶板温度37℃，反应时间10min。酶解结束后，MALDI靶板温度调节为室温(25℃)，再用点样机以1200次/h的频率将0.3μLα-cyano-4-hydroxycinnamic酸(α-氰基-4-羟基肉桂酸)加到所有96份馏分上，所有样品点干了以后进行MALDI-MS分析。