体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法

摘要

本发明公开一种体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法，包括如下步骤：用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；对淋巴细胞单层进行传代培养；当淋巴传代细胞长成单层后，用刀豆蛋白A诱导培养即可生产出抗菌肽及转移因子。无需提纯，只需超声波及冻融简单处理，可直接将产品(抗菌肽与转移因子混合体)用在动物身上，起到抗菌、抗病毒的作用，同时还可提高受体的免疫功能；生产工艺简单，原料用量少，无需宰杀大量的生猪，通过传代培养可生产出大量的产品(抗菌肽与转移因子)，产出率高且成本低，可节省大量的人力、物力；可避免产品携带外源病毒及其他病原微生物。

说明书

技术领域：

本发明涉及抗菌肽及转移因子的生产方法，尤其是一种生产工艺简单、产出率高的体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法。

背景技术：

抗菌肽(Anti-bacterial peptides，简称ABP)是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。目前的制备方法是以新鲜猪小肠为原料，去脂、浆膜和内容物，称重后冷冻剪碎，捣碎成浆。匀浆后隔水煮沸15分钟，按照1∶1的比例加入5％乙酸，并在4℃温度条件下搅拌过夜，次日将混合物在4℃温度条件下以8000转/分钟离心30分钟，取上清，保存在4℃温度环境中。将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再置于4℃搅拌浸提过夜，重复上述离心过程，取上清，合并两次上清液，调整pH值，再次离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥品即为抗菌肽。

转移因子(Transfer factor，TF)是具有免疫活性淋巴细胞释放的一种低分子量多核苷酸肽，它能将供体的某种特定的细胞免疫功能特异地传递给受体。目前的制备方法是：将新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25℃左右去脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净；将洗净的组织切成小块，加入适量水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置-20℃反复冻融5～8次，融化温度不得超过37℃；将冻融的匀浆离心(离心温度4℃)，去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，透析24-48小时；半成品过滤除菌；成品的配置与检验。

现有制备抗菌肽及转移因子的方法存在着如下缺点：

1.生产工艺复杂、产出率低，所提取的抗菌肽需要进一步纯化才能获得纯度较高的产品，产品成本高；

2.必需以新鲜猪小肠、脾脏及淋巴结为原料，若要获得大量的抗菌肽、转移因子，只能宰杀大量的生猪；

3.产品中有潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的产品生产工艺复杂、产出率低、成本高以及生产原料来源较少、产品中有潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险等技术问题，提供一种生产工艺简单、产出率高、成本低，原料用量少、可避免产品携带外源病毒及其他病原微生物的体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法，并可多次传代培养生产。

本发明的技术解决方案是：一种体外培养诱导淋巴细胞制备抗菌肽及转移因子的方法，其特征在于包括如下步骤：

a.用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；

b.对淋巴细胞单层进行传代培养；

c.当淋巴传代细胞长成单层后，用刀豆蛋白A诱导培养。

本发明以较少的脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养、诱导淋巴细胞单层即可生产出大量抗菌肽与转移因子的混合体。具有如下优点：

1.无需进一步提纯，可经超声波及冻融简单处理后直接将混合体用在动物身上，即可起到抗菌、抗病毒的作用，同时还可提高受体的免疫功能；

2.生产工艺简单，原料用量少，无需宰杀大量的生猪，即可生产出大量的产品(抗菌肽与转移因子)，产出率高且成本低，可节省大量的人力、物力；

3.可避免产品携带外源病毒及其他病原微生物。

4.能多次传代培养生产抗菌肽及转移因子。

具体实施方式：

实施例1：

1.以新鲜猪脾脏为原料，按常规方法制备淋巴细胞单层。

具体操作方法可以按以下步骤进行：

a.处理新鲜猪脾脏

取新鲜猪脾脏，立即放入无菌烧杯中，加入平衡盐液浸泡半小时或浸于1％新洁尔灭溶液中，取出以碘酒酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用平衡盐液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成1mm³小块，再用平衡盐液洗涤2～3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；

b.消化及分散组织块

将上步清洗过的平衡盐液吸掉、将剪碎的组织块移入三角烧角烧瓶中，按组织块体积的5倍量加入0.25％胰蛋白酶液(PH7.6～7.8)，置37℃水浴中消化20～40分钟左右。每隔10分钟摇动一次三角烧瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出三角烧瓶吸去胰蛋白酶液，再用平衡盐液洗涤2～3次，用0.5％水解乳蛋白—Hanks液洗一次。加入少许0.5％水解乳蛋—Hanks液，用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过、计数。

c.细胞计数：采用标有0.1mm字样的血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相同。

d.细胞悬液的分装和培养

按细胞计数结果，将细胞悬液用营养液调整至50万/毫升细胞悬液。将细胞悬液分装入细胞培养瓶(100ml)和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/10，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养。

e.观察

置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

(1)培养物是否污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶已污染。

(2)细胞形态特征及生长阶段的观察：

待细胞培养24小时后，即可进行观察。若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段(游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期)，直至形成淋巴细胞单层。

2.对淋巴细胞单层进行传代培养；

在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。

3.当淋巴传代细胞长成单层后，用刀豆蛋白A诱导培养。

当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入刀豆蛋白A诱导培养。

诱导培养24小时后对产品进行检验：

将细胞培养物经超声破碎后取样检测转移因子和抗菌肽的浓度。

转移因子浓度的测定：对转移因子的定量多以多肽含量定量：用Folin—酚法或分光光度法测定多肽含量，以多肽含量1mg为一个转移因子单位。此工艺生产的转移因子含量是常规生产方法的4～5倍。

抗菌肽浓度测定：采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白为标准溶液，所生产的抗菌肽的浓度是常规提取量的10倍。

抗菌肽抑菌实验：

大量的抑菌实验显示，所生产的抗菌肽微克分子浓度能杀死85％以上的革兰氏阳性、阴性细菌和真菌。它的抗菌谱广，能抑制大肠杆菌、葡萄球菌、产气单胞菌、链球菌、巴氏杆菌、放线菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、分枝杆菌等十余种近500株分离株，且实验中抑菌圈直径在15mm以上的细菌在85％以上。

半成品和成品的检验：

半成品检定：半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测。

成品检定：成品分别作转移因子和抗菌肽的鉴别试验、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒性等项检验。

实施例2：

1.以动物外周血为原料，按常规方法制备淋巴细胞单层。

具体方法是：无菌静脉采取动物全血20毫升，加1％肝素溶液0.2ml抗凝，静置60分钟左右，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用平衡盐液反复洗涤2～3次，离心速度800～1200转/分，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养方瓶或砖瓶中，塞紧瓶塞，置37℃恒温箱中或砖瓶机中培养，经2～3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。

2.对淋巴细胞单层进行传代培养；

在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定细胞已长成单层，即可进行细胞的传代培养。

3.当淋巴传代细胞长成单层后，用刀豆蛋白A诱导培养。

当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入刀豆蛋白A诱导培养。

转移因子浓度的测定、抗菌肽抑菌实验及结果、半成品和成品的检验项目均同实施例1。