微生物转化吡虫啉合成烯式吡虫啉的方法

摘要

本发明涉及一种微生物转化吡虫啉合成烯式吡虫啉的方法，所述的方法是：将具有吡虫啉转化酶活力的微生物菌种接种到含有吡虫啉的培养液中，进行转化发酵培养；或将微生物菌种接种到不含吡虫啉的培养液中，进行发酵培养；转化发酵或发酵培养结束后，将转化发酵液或发酵培养液进行菌液分离，若是转化发酶液，保留待与后面的转化液一并处理，所得菌体作为静息细胞，加入到含有吡虫啉的转化液中，使吡虫啉转化为烯式吡虫啉；转化结束后，去除菌体细胞，上述转化发酵液与转化液用有机溶剂萃取浓缩后，得到含烯式吡虫啉的晶体；或将萃取浓缩液用柱层析方法分离纯化，再将含烯式吡虫啉的洗脱液经浓缩结晶，得到烯式吡虫啉晶体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物转化吡虫啉合成烯式吡虫啉的方法。

背景技术

吡虫啉(Imidacloprid，IMI)是一种新型高效烟碱类杀虫剂，其作用于昆虫烟碱乙酰胆碱受体，具有触杀、胃毒和内吸活性。吡虫啉已广泛用于刺吸式口器害虫如蚜虫和叶蝉及鞘翅目害虫防治，种子和土壤处理，另外还用于建筑防治白蚁和防治猫和狗等宠物身上的跳蚤等。目前，吡虫啉已在全球120多个国家登记，在140多种作物上使用。

国内外对于吡虫啉的研究主要集中在三个方面，一是吡虫啉的作有机制和特点，包括药效、抗性和受体研究；二是吡虫啉的合成方法研究；三是吡虫啉的环境行为研究，包括土壤的吸附性、移动性、挥发性和环境降解性(光解、水解和土壤降解)研究，在作物中吡虫啉的代谢及活性研究。国内外对于吡虫啉的研究均是在动植物和土壤方面的，没有微生物转化吡虫啉合成有关代谢物的相关文献报道。

Krohn等人(2002)报道，IMI在土壤中的主要代谢途径之一是：IMI被羟基化后生成羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI)，5-hydroxy IMI进一步脱水生成烯式吡虫啉(olefin IMI)。

Sarkar MA等人(2001)在研究印度西孟加拉邦地区不同土壤对IMI的降解时发现，在30天后土壤可将IMI代谢为olefin IMI。Nauen等(1998，2001)报道olefin IMI对桃蚜与棉蚜的生物活性是IMI的16倍，对白飞虱的生物活性是IMI的10倍。据此Nauen认为与叶面喷洒相比，IMI用于土壤浸透的杀虫效果好、持续时间长的原因是IMI在土壤中产生了一些具有生物活性的代谢物，这些代谢物单独或与IMI共同作用，从而提高了IMI的药效和持续时间。而叶面喷洒或浸透不产生IMI具有生物活性的代谢物。

土壤中微生物活性是农药代谢和转化的主要影响因素之一，土壤可将IMI代谢为olefin IMI，因而可以从土壤中筛选出可转化IMI为olefin IMI的菌株。

发明内容

本发明目的在于提供一种微生物转化吡虫啉合成烯式吡虫啉的方法：筛选获得可直接催化IMI为olefin IMI的微生物菌株，以便采用微生物转化的方法，获得具有更高杀虫活性的olefin IMI产品或含有olefin IMI与IMI的混合物用于提高杀虫效果。

本发明采用具有吡虫啉转化酶活力的微生物菌种，接种到含有吡虫啉的培养液中进行转化发酵培养，使吡虫啉转化为烯式吡虫啉；或接种到不含吡虫啉的培养液中进行发酵培养。转化发酵或发酵培养结束后，将转化发酵液或发酵液与菌体分离，若是转化发酵液保留待与后面的转化液一并处理，所获菌体作为静息细胞，加入到含有吡虫啉的转化液中，使吡虫啉直接转化为烯式吡虫啉。转化结束后，去除菌体细胞，上述转化发酵液与转化液用有机溶剂萃取浓缩后，得到含烯式吡虫啉的晶体；或将萃取浓缩液用柱层析方法分离纯化，再将含烯式吡虫啉的洗脱液经浓缩结晶，得到烯式吡虫啉晶体。

上述具有吡虫啉转化酶活力的微生物菌种，可以是Aspergillus niger CGMCC3.769；Bacillus cereus CGMCC 1.1689；Bacillus megaterium CGMCC 1.1741；Bacillus thuringiensis CGMCC 1.792；Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853；Pseudomonas putida CGMCC 1.1819；Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788中的一种或几种，或者是其他任何可转化吡虫啉的微生物或混合微生物。上述菌种均可在美国菌种保藏中心(ATCC)或中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买到。

上述用于发酵培养的培养液的营养物质没有特别的限制，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质。

上述吡虫啉转化微生物发酵培养条件是：10-40℃，10-300r/min摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，发酵10-96小时。

上述的发酵液与菌体分离，可采用＞1000r/min的离心分离方法、或过滤分离方法获得菌体沉淀。

上述若是吡虫啉的转化发酵液，与菌体分离后，含有烯式吡虫啉的转化发酵液可保留与后面的转化液一并处理。

上述转化吡虫啉的静息细胞转化反应条件为，底物吡虫啉的浓度介于0.01-1g/L，在任意一种ph 5-9缓冲溶液中转化，转化温度范围在10-40℃，10-300r/min摇瓶振荡通气、或搅拌通气或管道通气供氧，反应时间1-192小时，转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开，可获得含有烯式吡虫啉的转化液。

上述含有烯式吡虫啉的溶液可用乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，有机相溶液经减压蒸馏浓缩后可得到含有烯式吡虫啉的晶体；或采用硅胶柱层析进行进一步分离纯化，收集含有烯式吡虫啉的洗脱液，洗脱液经减压蒸馏浓缩后可得到白色针状的烯式吡虫啉晶体，其纯度大于95％。上述白色针状晶体经质谱和核磁共振分析，确认为烯式吡虫啉，质谱和核磁共振分析数据如下，质谱数据：m/z of 253 for themolecular ion.¹H NMR数据(DMSO，400MHz)：δ12.79(s，1H)，8.41(s，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)，7.53(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38(s，1H)，7.07(s，1H)，5.13(s，2H).13CNMR数据(DMSO，100MHz)：δ150.3，149.8，146.2，139.8，131.8，124.9，117.3，114.3，45.1。

具体实施方式

实施例1：将100ml LB培养基放入500ml三角瓶，115℃高压蒸汽灭菌20min后，接入Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788菌种，30℃，200r/min振荡发酵培养20小时后，停止发酵，离心使菌体和发酵液分离，取62.5ml菌液的菌体加入到含有1g/L IMI，50g/L蔗糖的25ml磷酸盐缓冲液(pH 7.0)的250ml三角瓶中，30℃，200r/min振荡通气进行静息细胞转化反应，96小时后，停止转化反应，离心去除菌体，上清液中含有0.4g/L olefin IMI。按上述方法制备2000ml转化液，用等体积的二氯甲烷萃取两次后，将含olefin IMI和未转化的IMI二氯甲烷溶液于50℃减压蒸馏浓缩至50ml，浓缩液进行硅胶柱层析。上样后，用10％甲醇和90％乙腈(体积比)以1ml/min流速进行洗脱，含有olefin IMI的洗脱液继续蒸馏浓缩，可得0.5g olefin IMI晶体。

实施例2：将200ml含0.05％吡虫啉的LB培养基放入500ml三角瓶，115℃高压蒸汽灭菌20min，接入Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853菌种，30℃，200r/min振荡发酵培养，48小时后，停止发酵，离心使菌体和发酵液分离，菌体加入到含有0.5g/L吡虫啉的10ml磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，30℃，220r/min振荡通气进行转化96小时后，停止转化，8000r/min离心去除菌体，上清液中含有0.2g/L olefin IMI。按上述方法制备2000ml转化液，用等体积的二氯甲烷萃取两次后，将含olefin IMI和未转化的IMI二氯甲烷溶液于50℃减压蒸馏浓缩，所得的晶体中0.32g olefin IMI和0.50g IMI。

实施例3：将300ml含马铃薯培养基(PDA)放入1000ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min后，接入Aspergillus niger CGMCC 3.769的孢子，25℃，150r/min振荡发酵培养48小时后，停止发酵，采用砂布过滤使菌丝球和发酵液分离，菌丝球用pH 7.5的磷酸盐缓冲液洗涤后，加入到含有1g/L吡虫啉，1％葡萄糖的25ml磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中，25℃，220r/min振荡通气转化120小时后，停止转化反应，过滤去除菌体，上清液中含有0.34g/L olefin IMI。按上述方法制备1000ml转化液，用等体积的二氯甲烷萃取两次后，将含olefin IMI和未转化的IMI二氯甲烷溶液于50℃减压蒸馏浓缩至50ml，浓缩液进行硅胶柱层析。上样后，用10％甲醇和90％乙腈(体积比)进行洗脱，含有olefin IMI的洗脱液继续蒸馏浓缩，可得0.22g含量为97％的olefin IMI晶体。

实施例4：与实施例1基本相同，但菌种采用Pseudomonas putida CGMCC1.1819，发酵培养条件是：10℃，300r/min振荡发酵96小时。

实施例5：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus megaterium CGMCC1.1741，发酵培养条件是：40℃，10r/min振荡发酵10小时。

实施例6：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus thuringiensis CGMCC1.792，转化反应条件为：底物吡虫啉的质量比浓度为0.01g/L，缓冲溶液pH 5，转化温度10℃，300r/min摇瓶振荡通气，反应10小时。

实施例7：与实施例1基本相同，但菌种采用Bacillus cereus CGMCC 1.1689，转化反应条件为：缓冲溶液pH 9，转化温度40℃，10r/min摇瓶振荡通气，反应192小时。

实施例8：与实施例2基本相同，但菌种采用Bacillus cereus CGMCC 1.1689和Bacillus megaterium CGMCC 1.1741的混合菌种，接入到含0.01％吡虫啉的肉汤培养基中，有机溶剂采用乙酸乙酯。

实施例9：与实施例2基本相同，但菌种采用Psedudomonas putida CGMCC1.1819和Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788的混合菌种，接入到含1％吡虫啉的LB培养基中。