用于调变免疫反应的模块化抗原转运蛋白分子(MAT分子)和相关的构建体、方法和用途

摘要

通过添加一种新研发的模块化抗原转运分子(MAT分子)及其他相关的手段，能够以导向性方式有效地调变个体的免疫系统。该MAT分子含有一种转运模块，其将MAT分子转运至细胞内部；一种主动型细胞内导向模块，其引起MAT分子在细胞内转运至细胞内参与抗原加工的细胞器；以及一种抗原模块，其决定由MAT分子所调变的免疫应答的特异性。任选地，该MAT分子可含有其他模块例如标记模块和间隔模块。本发明包含这种新的MAT分子、用该MAT分子产生的抗体和以该MAT分子产生的治疗剂和诊断剂。本发明还包含所述MAT分子、抗体、治疗剂和诊断剂的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及刺激和抑制免疫系统以预防、治疗或诊断与免疫系统激活不足或过度激活相关的疾病，所述疾病包括感染性疾病、肿瘤性疾病、变态反应、自身免疫性疾病、移植物排异反应等等。本发明的核心是一种新的方法，该方法通过一种MAT分子影响免疫系统，所述MAT分子至少由以下三种组分组成：

1.一种转运模块(module)，其作用是使得MAT分子能够自细胞外穿透到细胞内，

2.一种细胞内导向模块，其作用是使得MAT分子在细胞内被加工以便产生改变的免疫应答或改变的抗原呈递，和

3.一种抗原模块，其决定所调变的免疫应答的特异性。

这三种元件的组合产生了一种MAT分子，由此能够以导向性和特异性的方式调变被处理的个体的免疫系统，或能够改变抗原呈递细胞的抗原呈递。

背景技术

抗原呈递细胞对抗原的加工

抗原呈递细胞(APC)通过两者途径对抗原进行加工。存在于细胞内部的抗原通过细胞表面的MHC I(I类主要组织相容性复合物，I类MHC)分子呈递，而细胞外的抗原通过细胞表面的MHC II(II类主要组织相容性复合物，II类MHC)分子呈递。这两种机制引发了宿主对抗原的免疫反应。自抗原被细胞摄取直至以MHC II-抗原复合物的形式呈递在细胞表面的途径通过多种细胞器而进行，其中经由内质网、高尔基体、高尔基体反面的网络结构、溶酶体、内体并经由II类MHC区室(compartment)(MHC)。MHC在MHC II-介导的抗原呈递中具有重要作用。在这些细胞器中，MHC II分子被加载了低分子量抗原或蛋白质的蛋白质水解片段。在这一过程中，最初结合于MHC II分子的恒定链(也称为MHC IIγ链或Ii)发生蛋白质水解降解，而抗原在多种直接或间接结合于MHC II的蛋白质的调控下结合于MHC II分子[1]。这些调节分子包括HLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83等等。这些蛋白质的确切功能尚未完全明了，但其中很多蛋白质具有信号序列，这些信号序列促使这些蛋白质转移至溶酶体、内体、高尔基体反面的网络结构、MHC等等[2-4]。一些蛋白酶参与了这些必需的蛋白质水解反应，由此使得抗原能够在MHC II分子上呈递。MHC中的蛋白酶包括组织蛋白酶家族的多种成员，例如组织蛋白酶S和组织蛋白酶L[1]。

导向作用和导向序列

具有在细胞内或细胞外特异性聚集于特定位点或特定细胞器的特性的氨基酸序列通常被称为导向序列。在这种情况中应该注意到，各种类型的导向作用可以是不同的。具体来说，细胞内和细胞外导向作用是有区别的。对于细胞外导向，可使用例如抗体，其在细胞外结合于细胞表面直接可到达的结构，例如膜蛋白的细胞外部分。结合肿瘤细胞表面蛋白的抗体可偶联例如一种细胞毒素。这样，该抗体将细胞毒素在细胞外导向肿瘤细胞，由此能够将后者定向杀灭。这种类型的导向作用明显不同于细胞内导向。在后者，通常必需克服细胞内的膜，或导向序列结合于细胞内受体且由此穿透进入例如特定的细胞器，或导向序列可穿透由特定蛋白质形成的特定的通道，进入到该导向序列对其具有特异性的细胞器。本申请以下所提及的导向序列或导向模块原则上所指的都是细胞内导向而非细胞外导向。此外，在本申请中，导向作用并非指的是所有类型的细胞内导向，而仅仅是指将分子转运至参与抗原加工、修饰和/或结合于MHC分子的细胞器或细胞内区域的细胞内导向。此类细胞器或细胞内区域的例子是内质网、高尔基体、高尔基体反面的网络结构、内体、溶酶体和MHC。来自各种蛋白质的导向序列可参见文献[1-5]。

转运和转运序列

此外，文献中记载了众多促进蛋白质、肽和其他类型的物质(例如核酸或具有药物活性的物质)转运至细胞内的氨基酸序列，特别是来自病毒的序列，例如HIV tat或来自单纯疱疹病毒的蛋白质VP22。为此，可将这些所谓的转运序列通过共价键或非共价键连接于待转运的分子(也称为货物分子)。这样可将得到的转运序列和货物分子化合物在细胞外添加给细胞。然后转运序列使得货物分子进入细胞内部。这一原理同样已经被许多研究所披露，特别是对于HIV Tat序列而言[6-8]。

尽管已经可以并有意将抗原作为货物分子，但至今仍无法仅仅借助于已知的转运手段在个体中产生在导向作用和剂量方面足以达到特定要求的免疫应答，例如达到对变态反应进行脱敏的要求。因此仍然亟需用于导向免疫调变的进一步的方法。

发明目的

因此，本发明的目的是提供将各种各样的抗原中的任意一种以足够准确的导向方式提供给其加工位点的手段，以使得抗原具有更好的治疗和诊断用途。

发明内容

本发明提供了一种方法，其能够将抗原以极准确的导向方式提供给细胞，以产生有效的特异性免疫反应。所述方法首先能够将抗原有效地自细胞外空间运送至细胞的细胞内空间，且其次能够在抗原进入细胞内部后使其有效达到对其进一步加工以用于抗原呈递的细胞器。这种两阶段的方法可广泛用于对个体的免疫反应进行导向性的有效的调变。

已经产生了作为用于实现这些作用的工具的特殊分子，本申请在下文中将其称为“模块化抗原转运蛋白(Modular antigen transporter)”分子或MAT分子。本申请的权利要求书详细表征了这些MAT分子、相关的核酸、载体、细胞、细胞系、小泡、免疫球蛋白、以及属于本发明并涉及这些组分或通过这些组分而起作用的用途和方法。

为了实现发明目的，本发明提供了一种以往未曾被描述过的至少三种模块的组合，其产生了一类新的分子，称为MAT分子(模块化抗原转运分子)。这三种模块包括至少一种转运模块、至少一种导向模块和至少一种抗原模块。三种不同的模块通过共价键或非共价键彼此偶联。可将如此制备的MAT分子直接施用于个体以影响其对MAT分子中的抗原的免疫反应。或者，可用MAT分子在体外处理细胞，并将如此处理的细胞施用于该个体。在该方法中，转运模块的作用在于使得MAT分子能够穿透进入细胞，导向模块的作用在于使得MAT分子进行细胞内加工以便产生免疫应答，而抗原模块中的抗原本身决定了免疫反应所针对的抗原。这种调变个体的免疫应答的新方法的一个重要的优点在于其通用性，即其能够以各种抗原、各种转运模块和各种导向模块起作用。此外，转运模块的使用使得该方法不再限于特定的组织或细胞，而是广泛适用于对几乎所有类型的细胞进行免疫调变。另一个优点在于MAT分子的模块结构。模块结构使得MAT分子能够快速适应特定的医疗用途。还可以改变MAT分子的三种组分的精确排列及其连接特性，条件是所有三种类型的模块均至少有一种存在于MAT分子中。本发明的方法对抗原没有限制。该方法可用于例如激活个体的免疫系统以抵抗病原体，例如病毒、细菌、寄生虫等等，也就是说可非常广泛地用作疫苗。此外，该方法可用于激活免疫系统以抵抗退化细胞，例如肿瘤细胞等等。不过，在另一方面，其也可用于降低个体的免疫系统对变应原例如花粉、动物毛发、屋尘螨、昆虫毒素等等的敏感性，或用于对免疫系统进行导向性抑制，例如在存在自身免疫反应的情况下，例如关节炎、风湿病、糖尿病、SLE(系统性红斑狼疮)等等，以及用于抑制移植物排异反应。类似地，本发明的MAT分子还可用于治疗其他那些没有明确提及的、与免疫反应过强或过弱有关联的疾病。

至今，现有技术一般认为，如果转运序列不具有特定细胞类型特异性、反而在所有细胞类型中均具有活性，这是非常不利的[9]。不过，在本发明中，转运模块的功能通用性成为一种巨大的优势，这是迄今为止在现有技术中不曾认识到的。现有技术一直在试图保护借助于转运序列进入细胞内的“货物分子”免于在细胞内发生蛋白质水解降解[9]。而在本发明中，这恰恰是特别需要的且对于实施本发明来说是有利的。抗原模块在细胞内发生蛋白质水解降解对于本发明的效果即有效的抗原呈递来说是有利的。因此本发明所采用的导向模块特异性地促进抗原模块转运进入细胞区室内，在那里抗原模块发生蛋白质水解降解。

可用作用于本发明的转运模块的最为熟知的氨基酸序列是HIV Tat和VP22序列。文献记载，这些序列不但转运通过细胞膜，而且转运进入细胞核[7]。对于本发明，转运进入细胞核是不希望的，因为细胞核内不进行抗原加工，且因此不会产生有效的抗原呈递。本发明使用了一种导向模块，该导向模块的作用在于使得MAT分子不会在细胞内被转移至细胞核内，而是特异性地转移至那些进行抗原加工或将抗原加载于MHC分子的细胞器中，由此，本发明解决了这一此前未被解决的问题。因此，本发明的MAT分子的细胞内转运模块消除了现有技术所揭示的Tat抗原融合蛋白的一个重要的不利之处。

由导向序列(如MHC II分子的恒定链)和抗原组成的融合蛋白也是现有技术中已知的。不过，这些融合蛋白不能有效穿透至抗原呈递细胞内部。为此，当用其免疫个体时，需要使用佐剂来促进融合蛋白摄取到细胞内部。不过，这些佐剂，例如矿物油、分枝杆菌提取物或弗氏佐剂，具有以下不良反应，例如局部炎症反应。本发明使用的MAT分子优于常规疫苗之处在于其直接偶联于一种生理学耐受良好的转运模块，所述转运模块可非常有效地促进其被摄取到细胞内。由此可以在一些情况中完全或部分地无需使用佐剂。其结果是使用MAT分子进行免疫将明显减少不良反应。

早已知道由MHC I呈递的细胞外或细胞内抗原可引起细胞毒免疫应答，但不会引起强的保护性体液免疫应答。不过，通过使用MAT分子，可将抗原模块内的抗原在细胞外进行添加，但其却起到细胞内抗原的作用，这是因为转运模块将抗原转运至细胞内空间，而导向模块影响了抗原的细胞内转运，由此引起体液免疫应答。采用这种新的方法，使得通过在细胞外添加抗原(MAT分子)来实现诱导强体液免疫应答这一多年的需求成为可能。

为此，不同于现有技术的是，本发明将两种本身是已知的机制以一种新的方式结合在一起，由此明显增强了抗原的免疫效果。这两种机制均是导向性抗原转运机制，其在总体上引起十分有效的免疫应答。这两种转运机制均是所定义的MAT分子的模块所产生的，其为：

1.将抗原自细胞外空间转运至细胞内空间(转运模块)

结合

2.将抗原在细胞内特异性转运至负责抗原加工的细胞器内部(导向模块)

其结果是：非常有效的免疫，只产生IgG，不产生IgE

两种已知转运机制的这种新的结合使得有可能以例如更低的抗原浓度进行免疫，同时还具有一个非常重要的且出乎预料的优点，即主要引起Th1型免疫应答，即IgG抗体形式的免疫应答，而非引发变态反应的IgE抗体形式的免疫应答。

具体实施方式

转运序列/转运模块

在本申请中，术语转运序列和转运模块可以作为等价物而相提并论，且具有相同的含意。引入转运模块这一术语是为了清楚地表明转运模块仅仅是用于本发明的MAT分子的一部分。此外，转运模块不仅代表天然存在的转运肽序列例如HIV tat，也代表例如能够承担与天然存在的转运肽序列相同的功能的肽模拟物或其他结构。

本发明包括各种转运模块用于制备MAT分子的用途，所述MAT分子由至少一种转运模块、至少一种导向模块和至少一种抗原模块组成。一般而言，所有目前已知的以及将来将要得知的转运序列均适合用于本发明的目的。文献中记载了众多合适的转运序列。这些转运序列包括病毒序列、同源异型蛋白质序列、亮氨酸拉链序列、富含精氨酸和富含赖氨酸序列、以及其他各种尽管缺乏分泌信号序列而仍然能够分泌的蛋白质序列。

适合用作转运模块的病毒肽序列

适合用作本发明的转运模块的肽序列包括病毒蛋白质或病毒蛋白质的部分序列，例如HIV转录激活因子蛋白质(HIV tat)。除了HIV-1病毒的Tat蛋白以外，合适的Tat蛋白还包括其他慢病毒属的Tat蛋白[9]。已经有多种经修饰的Tat蛋白被认为是可引起转运的序列。这些包括仅代表Tat蛋白的部分序列的Tat肽[10]、包含点突变的Tat肽[10]、序列倒转的(反向)Tat肽[10]、或包含少见氨基酸例如氨基酸D异构体的Tat肽[10]，等等。所有这些肽序列的变体因此一般均适合用作转运模块。那些来源于其他病毒例如VP22(单纯疱疹病毒-1VP22间层蛋白质)[9]的肽也适合用作本发明的转运模块。现在已经有了商品化的包含适合用于转运的VP22序列的表达载体。这些表达载体因此可用于制备VP22融合蛋白(Voyager^TM VP22系统，Invitrogen，Breda，theNetherlands)。不过，使用该表达系统的融合蛋白中没有导向模块。其他病毒，如马立克氏病病毒-1，其是一种引起鸡淋巴瘤的病毒，也表达一种与VP22有关联的且同样适合用作转运模块的蛋白质[11]。这些蛋白质和这些蛋白质的部分序列仅仅是作为例子而在此提及，适合用作本发明的转运模块的肽还有其他众多目前已知的以及在将来将要成为已知的肽。

适合用作转运模块的同源异型蛋白质

适合用于本发明的另一组转运模块是来源于果蝇同源异型A蛋白ntennapedia(ANTp)的肽[9]。其中，适合用作转运模块的ANTp肽是那些包含一种ANTp的反向序列的ANTp肽[7]、包含氨基酸D异构体的ANTp肽[7]、或在其序列中包含点突变的ANTp肽[7]。此外还预期可对ANTp序列进行众多其他的修饰且推测也可进行转运[7]。ANTp肽变体也称为转运肽。其他同源异型蛋白质例如Engrailed 1(En1)、Engrailed 2(En2)、Hoxa-5、Hoxc-8、Hoxb-4和KNOTTED-1[7]同样包含可用作用于本发明的转运模块的序列。KNOTTED-1实际上是一种植物蛋白质，但同样适合用作动物细胞的转运模块。所提及的这些肽仅仅是作为例子，且众多其他包含适合用作本发明的转运模块的肽序列的同源异型蛋白质是已知的[12]。其他以往未曾公开的同源异型蛋白质也可包含适合用作转运模块的序列。

适合用作转运模块的亮氨酸拉链蛋白质

另一组适合用作本发明的转运模块的序列是包含亮氨酸拉链结构域的肽。其中的亮氨酸拉链结构域可用作转运序列的蛋白质的例子例如为人cFos-(139-164)、人cJun-(252-279)、或酵母转录因子酵母GCN4-(231-252)[8]。其他已知的亮氨酸拉链蛋白质或在将来将要成为已知的亮氨酸拉链蛋白质也同样适合用作本发明的转运模块。

适合用作转运模块的富含精氨酸肽或富含赖氨酸的肽

富含精氨酸肽，通常来源于RNA-结合蛋白和DNA-结合蛋白，代表了另一种可用作用于本发明的转运模块的肽序列。此类序列的例子为HIV-1rev-(34-50)、禽畜棚病毒(flock house virus)外壳蛋白FHV外壳-(35-49)、BMV Gag-(7-25)、HTLV-II Rex-(4-15)、CCMV Gag-(7-25)、P22N-(14-30)、λN-(1-22)、21N-(12-29)和来自酵母的PRP6-(129-144)[8]。同样可用于本发明的是具有4-6个精氨酸残基[8]或者具有多于16个精氨酸残基的聚精氨酸肽。除了聚精氨酸肽，同样可用作转运模块的肽是那些，除了包含精氨酸以外，还包含其他氨基酸的肽，如W/R肽(RRWRRWWRRWWRRWRR)[9]或R9-Tat肽，其中Tat肽的总共11个氨基酸中的9个中央的氨基酸残基被精氨酸残基(GRRRRRRRRRQ)取代[8]。此外，已经发现例如由9个赖氨酸残基组成的肽也具有作为本发明的转运模块的能力[13]。所提及的这些肽仅仅是作为例子，众多其他的富含精氨酸或富含赖氨酸的肽也适合用作本发明的转运模块[8，13]。其他目前已知的或将来将要已知的富含精氨酸或富含赖氨酸的肽推测起来也适合用作转运模块。包含胍基或脒基的序列也适合用作本发明的转运模块[14]。

适合用作转运模块的无信号序列的蛋白质

其他许多不具有分泌信号序列的蛋白质也具有自内而外穿透细胞膜的功能，即能够被分泌。这些蛋白质通常也能够自细胞外逆向穿透进入细胞内部。这些蛋白质或这些蛋白质的部分序列因此也可用作用于本发明的转运模块。此类蛋白质的一些示范性的例子为成纤维细胞生长因子1(FGF-1)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、小窝蛋白-1(caveolin-1)、乳铁蛋白、硫氧还蛋白、白细胞介素1β和睫状神经营养因子(CNTF)[7]、或白细胞介素1α、输精管蛋白、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PR-ECGF)、胸腺素、旁胸腺素(para-thymosin)、14.5kDa凝集素(L14)、转谷氨酰胺酶、硫氧还蛋白样蛋白(ADF)、坐骨神经生长促进活性、因子XIIIa、乳腺衍生的生长抑制因子、Galectin、硫氰酸酶[15]。所提及的这些肽仅仅是作为例子，其他众多目前已知的或将来将要已知的肽也适合用作本发明的转运模块。

适合用作转运模块的毒素

多种毒素或毒素的部分序列具有作为转运模块的特性，例如以下毒素：完整相思豆毒素、完整篦麻毒素、完整莫迪素(modeccin)、完整假单胞外毒素A、完整白喉毒素、完整百日咳毒素、完整志贺氏菌毒素、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、假单胞外毒素的酶活性结构域、白喉毒素A的A链、百日咳毒素酶活性结构域、志贺氏菌毒素酶活性结构域、Gelonin、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草素、Tritin、大麦毒素和蛇毒肽[16]。所提及的这些毒素仅作为例子，其他众多未提及的毒素或将来将要已知的毒素也适合用作本发明的转运模块。

转运模块效率的调控

可通过例如改变聚精氨酸链的长度或通过例如特异性缺失HIV Tat序列的部分序列来调控转运的效率，由此可根据具体的要求进行相应的MAT分子的非常高效的转运或较低效的转运[8，13]。非常高效的转运的优势在于可提高MAT分子的效率和/或降低所需所MAT分子的剂量，由此降低疫苗的成本。MAT分子剂量的降低的优势的进一步的优势在于可较少出现不良反应。另一方面，转运效率的降低能够使得MAT分子在被处理的个体中分布更广泛，例如在静脉注射后，这是因为其不会立即穿透局部细胞而几乎大量进入邻近的细胞内。

作为转运模块的最小序列的实例

为了作为本发明的MAT分子的有效的转运模块，不必使用所有上述例举的转运序列的完整蛋白质作为MAT分子的成分。相反，对于许多此类蛋白质来说，已知可使用一种最小序列区作为转运序列。这种序列区例如包括，对于HIV Tat来说，例如以下序列：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，对于VP22为以下序列：Asp-Ala-Ala-Thr-Ala-Thr-Arg-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-Ala-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu，对于antennapedia为以下序列：Arg-Gln-Iso-Lys-Iso-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-LysTrp-Lys-Lys[17]。此外，还可使用这些序列的片段形式，只要所得到的序列仍具有转运模块的功能，这些片段可与目前已知的最小功能性序列片段不同。

因此，为了作为本发明的MAT分子的有效的转运模块，作为MAT分子的组分，转运模块不需要是完整的蛋白质或完整的分子。相反，对例如上述蛋白质来说，可用作转运模块的序列区是已知的。此外，还可使用蛋白质序列的片段形式，只要所得到的序列仍具有转运模块的功能，这些片段可与此前公开的功能性序列片段不同。例如可通过采用荧光标记的转运模块或通过采用酶标记的转运模块或通过采用以金属颗粒标记的转运模块来探知转运模块的功能。将以这些方法标记的转运模块施用于实验动物或体外培养的细胞，并采用诸如FACS(荧光激活的细胞分选)、显微镜、共聚焦荧光显微镜、电子显微镜等方法来追踪转运模块的痕迹。文献中记载了这些用于检测转运模块的功能的技术，且其中一些技术已经被用于探知用于转运的序列的功能[8，18]。

导向序列/导向模块

在本申请中，术语导向序列和导向模块可以作为等价物而相提并论，且具有相同的含意。在本申请中，导向作用(Targeting)一般总是指细胞内导向。引入导向模块这一术语是为了清楚地表明导向模块仅仅是用于本发明的MAT分子的一部分。

本发明包括各种作为导向模块的序列用于制备MAT分子的用途，所述MAT分子由至少一种转运模块、至少一种导向模块和至少一种抗原模块组成。一般而言，所有目前已知的以及将来将要得知的且能够介导导向作用的氨基酸序列和分子均适合用作本发明的导向模块。文献中记载了众多合适的序列。属于这些适合用作导向模块的序列的序列是所有那些具有如下作用的序列，即能够使得MAT分子在细胞内转运至细胞内的一些位点或细胞器，而所述位点或细胞器参与了MAT分子内的抗原模块的呈递。这些细胞内的位点和细胞器具体包括MHC II类区室(MHC)、内体、溶酶体、高尔基体、高尔基体反面的网络结构和内质网。这些细胞内细胞器参与了例如以下一些过程：抗原的转运或加工、给MHC II分子制备和加载抗原或经过加工的抗原、以及将加载了抗原的MHC II分子转运至细胞表面等等。

包含适合作为导向模块的序列的MHC分子

许多序列特别适合作为本发明的导向模块。MHC II分子的恒定链(Ii，恒定链，MHC II γ链)是文献中最常提及的能够介导导向作用的序列。人的恒定链的各种不同的变体已经被公开并被称为IiP33、IiP41、IiP35和IiP43[1]且适合用作导向模块。其他适合作为本发明的导向模块的序列是MHC II分子的β链[19]。所述序列的片段也适合用作导向模块。

包含适合作为导向模块的序列的溶酶体膜蛋白

许多存在于溶酶体中且是其中的一种主要蛋白质组分的膜蛋白具有导致溶酶体的序列基序。这组蛋白质包括Lamp 1(溶酶体相关性膜蛋白-1)、LAMP 2、LAMP 3、Limp II(溶酶体整合性膜蛋白II)和LAP(溶酶体酸性磷酸酶)[4]。这些以及其他的目前已知的或将来将要已知的且具有导向序列基序的溶酶体蛋白质均可用作用于本发明的导向模块，也可使用完整的蛋白质序列或其部分序列作为导向模块。

包含适合作为导向模块的序列的Tetraspan蛋白质

具有4个跨膜结构域的蛋白质家族的成员(Tetraspan蛋白)同样适合作为本发明的导向模块，这是因为这些蛋白质可非常有效地进入MIIC。“Tetraspan”蛋白进入MIIC的机制还不清楚，因为其包含未知的具有导向作用的氨基酸序列。尽管如此，存在将这些蛋白质转运至MIIC内部的机制这一事实说明它们可用作用于本发明的导向模块。“Tetraspan”蛋白家族包括CD37、CD53、CD63、CD81、CD82和CD86[20]。已知的CD63和CD82与MHC II、HLA-DO和HLA-DM分子相关[20]。“Tetraspan”蛋白同样存在于外来体的膜中，外来体是MIIC与原生质膜融合后形成的并因此被抗原呈递细胞释放的小泡。外来体包含MHC II分子并能够呈递抗原，且由此刺激T细胞[20]。其他与“Tetraspan”蛋白家族非常相似的且因此同样适合用作本发明的导向模块的蛋白质是曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)膜蛋白SM23和肿瘤相关抗原CO-029[21]。其他未明确提及的或目前尚未知的Tetraspan蛋白或Tetraspan蛋白的部分序列可同样包含适合作为导向模块的序列。

具有适合作为导向模块的序列的其他蛋白质

在各种类型的细胞的内体/溶酶体区室中可发现众多其他的蛋白质，因此这些蛋白质是以目前尚未完全了解的机制达到内体/溶酶体区室的。这些蛋白质或这些蛋白质的部分序列因此也适合用作本发明的导向模块。这些存在于内体/溶酶体区室中的蛋白质包括低密度脂蛋白质(LDL)、胰岛素、表皮生长因子(EGF)、聚合免疫球蛋白、转铁蛋白、阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体、阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体、CD3等等[21]和CD1b[22]，以及许多其他目前已知的或将来将要已知的并可导向进入内体/溶酶体区室的那些蛋白质或蛋白质序列。这些序列可用作本发明的导向模块。也有各种商品化的包含编码适合用于导向作用的序列的核酸序列的表达载体。例如BD Bioscience Clontech(PaloAlto，CA，USA)和Stratagene(La Jolla，CA，USA)均提供具有导向模块的表达载体，所述导向模块可将得到的融合蛋白导引至高尔基体或过氧物酶体。不过，这些表达载体无法产生包含转运模块的融合蛋白，因此不同于本发明的MAT分子。例如，在Clontech的载体中，使用了钙网蛋白的序列(KDEL“挽回序列(retrieval sequence)”)将融合蛋白导向高尔基体。其他未明确提及的或目前尚未知的蛋白质可同样包含适合作为本发明的导向模块的序列。

存在于某些导向序列组中的序列基序

已经被探知某些序列基序对于各种作为导向模块的蛋白质序列的功能是十分重要的。例如对于HLA-DM的β链来说，已经将序列基序酪氨酸-苏氨酸-脯氨酸-亮氨酸鉴定为导向基序，且酪氨酸残基和亮氨酸残基显然具有特别重要的功能[2]。已经鉴定了对于多种溶酶体膜蛋白例如LAP(溶酶体酸性磷酸酶)、LAMP 1(溶酶体相关性膜蛋白1)、LAMP2和Lamp 3[3，4]以及CD1b[22]的细胞内导向具有重要作用的酪氨酸基序。还鉴定出一种亮氨酸基序对于另一种溶酶体蛋白Limp II(溶酶体整合性膜蛋白II)的细胞内导向可能具有重要的作用[4]。还发现对于Ii来说，有两种序列区对于细胞内导向具有相互独立的重要作用(第1至11位氨基酸和第12至29位氨基酸)[23]。这两种导向序列甚至仅依靠自身即可行使功能，且序列1至11在位置7和8包含一个功能上必需的亮氨酸-异亮氨酸基序[23]。MHC II分子的β链同样包含一个序列基序，该序列基序包含一或两个具有重要功能的亮氨酸残基，以及一个位于N-端的刚好位于该亮氨酸基序前方的保守甘氨酸残基[19]。因此，概况来说，亮氨酸和酪氨酸残基在导向序列中具有特别重要的功能，且因此可以设计出特别合适的氨基酸序列作为导向模块。这些均可用作本发明的导向模块。

可用作导向模块的“非氨基酸结构”

不同于一种氨基酸序列或一种氨基酸的分子也可用作本发明的MAT分子的导向模块。一个早已为人所知的适合用于导向溶酶体的结构的例子是甘露糖-6-磷酸[24]。包含甘露糖-6-磷酸残基的蛋白质被不同的甘露糖-6-磷酸受体转运至溶酶体。这一机制可在本发明中用于将MAT分子转运至溶酶体以便实现有效的抗原呈递。为此，可将甘露糖-6-磷酸残基共价地或非共价地、单独地或作为更为复杂的糖结构的组分，偶联于MAT分子。通常可以使用甘露糖-6-磷酸受体的所有配体作为本发明的MAT分子的导向模块。其他的目前已知的或将来将要已知的能够导向MHC、内体、溶酶体、高尔基体、高尔基体反面的网络结构或内质网的结构可用作本发明的导向模块。

作为本发明的MAT分子的有效的导向模块，所有举例提及的导向模块不需要以完整蛋白质或完整分子的形式作为MAT分子的组分。相反，例如对于一些所述的蛋白质来说，可用作导向模块的序列区是已知的。此外，举例提及的蛋白质序列可采用片段的形式，所述片段与以往公开的功能性序列片段不同，条件是所得到的序列仍然具有导向模块的功能。例如可通过采用荧光标记的导向模块或通过采用酶标记的导向模块或通过采用以金属颗粒标记的导向模块来探知导向模块的功能。将以这些方式标记的导向模块施用于实验动物或体外培养的细胞，并通过例如FACS(荧光激活的细胞分选)、显微镜、共聚焦荧光显微镜、电子显微镜等方法来追踪导向模块的痕迹。

抗原模块

一般来说所有类型的能够调变免疫应答的抗原均可用作本发明的抗原模块。目前已知的抗原和将来将要已知的抗原均适合。在一些情况下，抗原也可以是那些以现有技术的常规方法进行免疫接种不能引起免疫应答、但应用于本申请的新的方法中却可在个体中引起免疫应答发抗原。可以用作本发明的抗原的不仅有蛋白质和肽，还有糖结构、脂质如脂多糖、脂磷壁酸质(lipoteichoic acids)和细菌膜的其他组分(例如CD1b结合糖结构和脂质)、核酸如包含CpG基序的DNA、有机物质例如胶乳或具有药物活性的物质。抗原可来自人、动物、植物、真菌、寄生虫、单细胞或多细胞微生物、病毒和其他生命形式。抗原可以是已经自生物材料中分离的、已经作为重组抗原被制备好的或通过合成制备好的，例如通过肽合成。通过合成制备的抗原可以是天然存在的物质或非天然存在的但可化学合成的物质。非天然存在的但在一些情况下适合用作抗原的物质的实例例如为合成制备的药物中的物质、或具有非天然存在的氨基酸序列的肽、或肽模拟物等等。天然存在的或合成的或重组的抗原可通过分子生物学方法、酶方法、化学方法以及其他方法进行修饰，以便使其在具体的应用中具有更加优越的特性。这些优越的特性可以是抗原的活性更高或更低、抗原的作用更广泛或更加特异性、更加易溶于亲水性或疏水性溶剂、抗原模块对细胞膜、细胞器的膜、血脑屏障、血CSF屏障等等具有更好的通透性、在体内或体外具有更长或更短的半衰期、更低或更高的毒性、以MAT分子的形式应用抗原后能够在体内或体外更容易地检测到抗原。此外，本发明还可将多种抗原在一个抗原模块中进行组合[25]。为此，抗原模块中的相同的抗原可以有一个以上的拷贝，或者可以将例如同一种抗原的不同变体组合在一个抗原模块中。也可以进行抗原的组合，例如将抗原1与另一种抗原例如抗原2组合于一个抗原模块中，等等。其他组合，例如将一个以上拷贝的抗原1与单拷贝的抗原2组合于一个抗原模块中，等等。此外MAT分子还可以含有一或多个不同的和/或一或多个相同的抗原模块。一般来说本发明可以进行所有各种可能的来自于一或多种不同抗原的单个或多个存在的相同的或不同的拷贝的组合。

可用作抗原模块的抗原和变应原

文献中已经揭示了众多抗原、特别是变应原。下文中具体已知的变应原可用作本发明的抗原模块。现有技术中已知其他同样可用作本发明的抗原模块的变应原和变应原的变体[26，27]。可将变应原分成不同的组，例如来自植物和草的变应原、来自树木的变应原、来自真菌的变应原、来自昆虫的变应原、来自食物的变应原、以及其他变应原例如胶乳变应原。以下是列举的名单：微生物的学名、变应原的常用缩写、其后是已知的变应原的GeneBank登记号(括号内)。

植物和草变应原：

豚草(Ambrosia artemisiifa)，Amb a 1 and Amb a 2；Mercurialisannua，Mer a 1(Y13271)；墙草(Parietaria judaica)，Par j 1(X77414)，Par j 2(X95865；X95866)；狗牙根(Cynodon dactylon)，Cyn d 1(S83343)；鸭茅(Dactlis glomerata)，Dac g 3(U25343)；Holcus lanatus，Hol I 1(Z27084，Z68893)；黑麦草(Lolium perenne)，Lol p 1(M57474)，Lol p 2(X73363)Lol p 5(M59163)；喜湿虉草(Phalaris aquatica)，Pha a1(S80654)；猫尾草(Phleum pratense)，PhI p 1(X78813)，PhI p 2(X75925)，PhI p 3，PhI p 5(X74735)

树木变应原：

黑赤楊(Alnus glutinosa)，Aln g 1(S50892)；白桦(Betulaverrucosa)，Bet v 1(X15877)，Bet v 2，Bet v 1d；欧洲鹅耳枥(Carpinusbetulus)，Car b 1(X66932，X66918)；欧洲榛(Corylus avellana)，Cor a 1(X70999，X71000，X70997，X70998，Z72439，Z72440，AF136945，AF323973，AF323974，AF323975)；Ligustrum vulgare，Lig v 1(X77787，X77788)；油橄榄(Olea europea)，Ole e 1(S75766)，Ole e 9(AF249675)；丁香(Syringa vulgaris)，Syr v 1(X76541)；日本柳杉(Cryptomeria japonica)，Cry j 1，Cry j 2(D29772，D37765)；Cupressusarizonica，Cup a 1(AJ278498)；柏(Cupressus sempervirens)，Cup s 1(AF257491)；Juniperus ashei，Jun a 2(AJ404653)

螨虫变应原：

Blomia tropicalis，Blo t 5(U59102)；粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)，Der f 1，Der f 2，Der f 11；屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)，Der p 1，Der p 2，Der p 5，Der p 7；Lepidoglyphusdestructor，Lep d 2(X81399)；P.americana，Cra-A；普通谷螨(T.putrescentiae)，Tyr p 2

动物变应原：

家牛(Bos domesticus)，Bos d 2(L42867)；马(Equus caballus)，Equc 1(U70823)；家猫(Felisdomesticus)，Fel d 1(M74952，M74953)

真菌变应原：

烟草赤星病(Alternaria alternata)，Alt a 1(U82633)，Alt a 2(U62442)；黄曲霉(Aspergillus flvus)，Asp fl 1(AFl37272)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，Asp f 1(M83781，S39330)，Asp fl/a，Asp f 2(U56938)，Asp f 3(U20722，U58050)，Asp f 4，Asp f 6，Asp f 8；黑曲霉(Aspergillus niger)，Asp n 18；米曲霉(Aspergillus oryzae)，Asp o 13(X17561)；C.comatus，Cop c 1；黄青霉(Penicillium chrysogenum)，Pench 13(AF193420)，Pen ch 20(S77837)；草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)，Pen o 18(AAG44478)；马拉色菌(Malassezia sympodialis)，Mal s 1(X96486)

昆虫变应原：

意大利蜜蜂(Apis mellifera)，Api m 1(X16709)，Api m 2(L10710)，Api m 4(X02007)；PLA2(X16709)；德国小蠊(Blattella germanica)，Blag 1(AF072219，L47595，AF072221，AF072220)，Bla g 2(U28863)，Bla g4(U40767)，Bla g 5(U92412)；美洲大蠊(Periplaneta americana)，Per a1(AF072222)，Per a 3(L40819)；Dolichovespula maculata，Dol m 1(X66869)，Dol m 2(L34548)，Dol m 5(J03601)；Dolichovespula arenaria，Dol a 5(M98859)，Polistes annularies，Pol a 5(M98857)；Vespula vulgaris，Ves v 1(L43561)，Ves v 2(L43562)，Ves v 5(M98858)；Myrmeciapilosula，Myr p 1(X70256)，Myr p 2(581785)

食物变应原：

鲑鱼(Salmo salar)，Sal s 1(X97824)；家牛(Bos domesticus)，Bos d4(M18780)，Bos d 5(X14712)；家鸡(Galllus domesticus)，Gal d 1(J00902)，Gal d 2(J00992)；对虾(Metapenaeus ensis)，Met s 1(U08008)；大麦(Hordeum vulgare)，Hor v 15(X63517)；水稻(Oryzasativa)，Ory s 1(U31771)；芹菜(Apium graveolens)，Api g 1(Z48967)；胡萝卜(Daucus carota)，Dau c 1(U47087，D88388)；苹果(Malusdomestica)，Mal d 1(X83672)；西洋梨(Pyrus communis)，Pyr c 1(AF057030)；鄂梨(Persea americana)，Pers a 1(Z78202)；杏(Prunusarmeniaca)，Pru ar 1(U93165)；樱桃(Prunus avium)，Pru av 1(U66076)；花生(Arachis hypogaea)，Ara h 1(L34402)，Ara h 2(L77197)；巴西果(Bertholletia excelsa)，Ber e 1(M17146)；核桃(Juglans regia)，Jug r 1(U66866)，Jug r 2(AF066055)；蓖麻(Ricinuscommunis)，Ric c 1(X54158)；芝麻(Sesamum indicum)，Ses i 1(AF240005)

其他变应原(胶乳)：

橡胶(Hevea brasiliensis)，Hev b 1(X56535)，Hev b 2，Hev b 3，Hevb 5(U42640)，Hev b 6(M36986)，Hev b 7，Hev b 8

这些已知的变应原仅是例举，其他同样可用于本发明的抗原模块的变应原是现有技术中已知的。

除了变应原，还有许多病原体目前尚无法获得有效的或持久的免疫。由于本发明的方法所基于的是一种新的免疫策略，因此有可能针对这些至今尚无满意的免疫接种预防性治疗的疾病显示出免疫效果。这些疾病具体包括HIV病毒感染、丙型肝炎病毒感染、结核病原体(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))感染、麻风病(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))、鼠疫(鼠疫杆菌(Yersinia pestis))以及疟疾(疟原虫例如恶性疟原虫)。

MAT分子可具有的其他模块

除了上述三种模块——转运模块、导向模块和抗原模块——MAT分子必须至少具有这些模块，MAT分子也可具有其他任选的模块。这些任选的模块包括例如可用于分离或检测MAT分子的模块。在现有技术中，此类模块通常被称为“标记物”，故在本申请的下文中被称为标记模块。其他任选地存在于MAT分子中的模块可以是间隔模块，即排列在其他模块之间的模块，其作用是使得这些模块彼此偶联。这些模块在本申请的下文中被称为间隔模块。某些模块也可能同时行使两种或两种以上模块的功能。例如许多标记模块可同时用于MAT分子的分离和检测，或者MAT分子中的一种抗原模块可能也可用于MAT分子的检测和/或分离，例如当存在抗该抗原模块的抗体的情况下，等等。

MAT分子可具有的标记模块

在本发明中，可将一或多种不同的标记模块和/或一或多种相同的标记模块作为MAT分子的组成部分。标记模块可以是短肽，通常由不超过20个氨基酸残基组成，但也可相当于完整的蛋白质序列或蛋白质的特定结构域。标记模块也可以是不含有氨基酸的功能性基团，例如生物素或洋地黄毒甙。几乎所有的标记模块均可有两种不同的使用方式，其一为用于分离MAT分子，其二为用于检测MAT分子的存在。一般来说，所有目前已知的标记模块以及所有将来将要已知的标记模块均适合用于本发明。适合用于本发明的合适的标记分子的实例为：4-12或更多的组氨酸序列，优选地为直接连续的组氨酸残基、也称为His标记、His6标记、HIS6标记、Penta His^TM、Tetra His^TM、RGS His^TM等等(Qiagen，Hilden，Germany)，Myc或c-Myc标记、PinPoint^TM标记(一种信号序列，其作用是使得细菌在体内为相应的蛋白质提供生物素基团)、HA标记、6xHN标记(Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA)、Xpress^TM标记、myc标记、V5标记(Invitrogen，Breda，theNetherlands)、S标记、CBD标记、GST标记、HSV标记、T7标记(Novagen Inc.，Madison，WI，USA)、FLAG标记、HA标记、c-myc标记、钙调蛋白结合肽标记(CBP)标记(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、His标记、A蛋白标记、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标记(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)、Strep-tagII(IBA GmbH，Gttingen，Germany)、His标记(Roche Applied Science，Rotkreuz，Switzerland)、FLAG标记、GST标记、A蛋白标记(Sigma，St.Louis，MO，USA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、壳多糖结合标记(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、His标记(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA)。对于这些标记模块中的一些来说，将一种以上的标记模块用于分子的应用已经被公开。例如，可将两种标记模块偶联于一种蛋白质的N端或C端，或将一种标记模块偶联于N端和C端(Qiagen，Hilden，Germany andStratagene，La Jolla，CA，USA)。可将标记模块引入其他蛋白质序列的内部，例如一种蛋白质的两个结构域之间(Strep-tagII，IBA，Gttingen，Germany)。

其他标记模块主要用于检测与之偶联的分子。不过，这些标记分子通常也可用于分离蛋白质，例如通过亲和层析。本发明可使用例如偶联了抗这些标记模块的抗体的层析材料。本发明也可使用的标记模块例如为绿色荧光蛋白(GFP)、增强的绿色荧光蛋白(EGFP)、增强的蓝色荧光蛋白(ECFP)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP)、红色荧光蛋白(DsRed2)(BD Bioscience Clontech，Palo Alto，CA，USA)、Renilla绿色荧光蛋白(hrGFP)(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。这些标记模块可位于例如一种融合蛋白的N端以及C端。除了荧光标记模块，也可使用酶作为标记模块。通常使用的酶的实例为萤光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，等等。可通过这些酶的相应的酶活性对其进行检测，例如基于这些酶对其底物的转化作用。有多种类型的适合用于本发明的底物，例如吸收可见光的底物、荧光底物、其转化后可发光的底物、或可采用各种检测方法通过底物浓度的降低或产物浓度的升高而确定其酶性转化的底物，等等。

另一种可用于本发明的标记模块例如是可作为激酶底物的肽序列。可通过添加放射性磷和添加激酶而对这些肽序列进行放射性标记。可以这种方式用于本发明的标记模块的实例有：激酶底物肽(kemptide)标记(一种可被蛋白激酶A磷酸化的肽)、钙调蛋白结合肽标记(CBP)，其同样可被蛋白激酶A磷酸化(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，等等。

另一种可用于本发明的标记模块例如是可特异性结合其他蛋白质或其他结构的蛋白质、蛋白质结构域或肽序列。文献中记载的此类标记模块的实例有：A蛋白、G蛋白、A蛋白/G、L蛋白，这些蛋白质均结合抗体结构(Pierce，Rockford，IL，USA)，谷胱甘肽-S-转移酶，其结合谷胱甘肽，麦芽糖结合蛋白(MBP)，其结合直链淀粉，链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，两者均结合生物素，钙调蛋白结合肽，其结合钙调蛋白，壳多糖结合标记，其结合壳多糖，等等。一般来说，所有特异性结合其他分子的分子均可作为本发明的标记模块，即受体-配体、抗体-抗原、凝集素-糖结构、蛋白质-脂质、蛋白质-核酸、蛋白质-蛋白质等等，以及文献中提及的其他众多实例[28]。

间隔模块

可用于本发明的间隔模块是所有适合用于将作为MAT分子的成分的其他模块彼此偶联的分子。既可通过共价键也可通过非共价键进行偶联。间隔模块的作用是使得MAT分子的各种模块在空间上彼此分隔，这样使得它们不会对各自的功能相互产生不良影响。本发明的MAT分子的模块可通过间隔模块偶联，这些间隔模块可随后经化学或酶反应而再次裂解，例如通过蛋白酶。这样，在需要的时候可以再次将通过间隔模块连接的MAT分子的模块彼此分开。

一般来说，本发明可以使用所有目前已知的或将来将要已知的蛋白酶[29，30]。目前通常使用的蛋白酶是凝血酶、因子Xa、肠激酶或TAGZyme系统(Qiagen，Hilden，Germany)，等等。本领域人员已知各种适合用于裂解间隔模块的化学反应，或者可以自间隔分子的生产商(例如Pierce)提供的信息中找到这些化学反应。

具体来说，间隔模块可以是肽序列或有机分子。各种可用于本发明的间隔分子是本领域已知的。此外，也可将将来会研发或发现的间隔分子用于本发明。合适的间隔模块包括肽间隔分子、交联剂、天然的或合成的聚合物例如核酸、有或没有取代基的碳氢化合物，等等。此外还可将分子组合用作间隔模块，所述分子能够通过非共价相互作用彼此形成复合体，由此使得两种或两种以上的模块结合在一起形成MAT分子。此类彼此结合的分子组合的一个已知的实例是生物素/链霉抗生物素蛋白。

肽序列作为间隔模块

许多由多个结构域组成的蛋白质在其氨基酸序列中具有短序列区，文献中也将此类短序列区称为间隔。这些间隔的作用是在空间上将蛋白质的各种结构域彼此分隔开，这样使得它们不会对各自的功能相互产生不良影响。为此，应该特别保证间隔序列是柔性的，以便两个结构域在空间上不会影响彼此的功能。

此类肽序列可用作本发明的间隔模块。文献中描述了众多间隔肽序列。这些间隔优选地具有2至60个氨基酸的长度，但也可以具有更长的序列。间隔也可仅由一个氨基酸组成。多种商品化的表达载体已经包含了编码肽间隔的序列区，所述肽间隔例如将标记序列连接于准备引入表达载体中的蛋白质序列。非常短的肽间隔仅由两个氨基酸组成，例如通常使用亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-丙氨酸或丝氨酸-丙氨酸(IBA GmbH，Gttingen，Germany)，或由甘氨酸和/或丙氨酸组成的长度为4-6个氨基酸的短氨基酸序列(Qbiogene Inc.，Carlsbad，CA，USA)。文献中还提及了众多其他的间隔序列，均可用作本发明的间隔模块。一般来说所有目前已知的间隔分子和将来将要已知的间隔分子均可用作本发明的MAT分子的间隔模块。一种用于鉴定适合作为间隔模块的氨基酸序列的方法是使用数据库筛选蛋白质结构域的氨基酸序列。优选地，以这种方式在位于两种蛋白质结构域之间的氨基酸序列中鉴定得到的长度为2至60个氨基酸的短氨基酸序列可用作本发明的间隔模块。目前已有的用于鉴定蛋白质结构域且因此也可用于鉴定适合作为间隔模块的肽序列的数据库是“SBASE蛋白质结构域文库”[31]。

交联剂作为间隔模块

也可将交联剂形式的间隔模块引入本发明的MAT分子。为此，制备好所述MAT分子的各个模块，然后以交联剂通过化学反应将其彼此共价偶联。多种商品化的交联剂可用于此目的。例如Pierce(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)提供了多种不同的交联剂。目前可以例如自Pierce选择与氨基、巯基、糖结构、羧基、羟基反应的交联剂或与那些待组合形成MAT分子的模块非选择性反应的交联剂。目前也可自例如Pierce Biotechnology Inc.得到用于制备MAT分子的、可通过特定化学反应而再次分开的交联剂，例如巯基、碱、高碘酸盐、羟胺、通过光的作用或通过非特异性反应。此外可通过导向选择交联剂来具体确定所述MAT分子的各个模块之间的距离。例如，Pierce目前提供引入的距离为1.4埃(Angstrm)(N-琥珀酰碘代乙酸酯)至34.7埃(双(β-(4-叠氮水杨酰胺)乙基)二硫化物)的交联剂，取决于所使用的交联剂。另一种使用交联剂偶联各种模块以形成本发明的MAT分子的可能的变化是可以使用来自Pierce Biotechnology Inc.的交联剂Sulfo-SBED。Sulfo-SBED在一方面通过共价反应偶联两种模块，并在引入的间隔分子上额外包含一个生物素基团。因此可以通过非共价键将MAT分子的另一个模块连接于该生物素基团。为此，待引入的模块例如可偶联于抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。然后可将以这种方式产生的偶联于链霉抗生物素蛋白的模块通过交联剂中的生物素基团偶联于其他模块。一般来说，所有目前已知的交联剂和将来将要已知的交联剂均可用于将模块连接形成本发明的MAT分子。

其他间隔模块

本发明的间隔模块的组成例如可以是氨基酸的L异构体和D异构体、少见氨基酸、具有翻译后修饰的氨基酸、核酸、PNA(肽核酸)、脂质、糖结构、其他天然的或合成的聚合物例如有取代基的或无取代基的碳氢化合物、聚乙酸、聚乙二醇、环糊精、聚甲基丙烯酸酯、明胶、oligourea等等、或其他物质或上述物质或其他物质的组合。一般来说，所有目前已知的适合用于将模块连接在一起形成MAT分子的物质和将来将要已知的具有相应特性的分子均可用作间隔模块将模块连接形成本发明的MAT分子。

通过非共价相互作用连接在一起的间隔模块

文献中存在大量此类间隔分子的实例。通过非共价相互作用连接在一起的且已经商品化的此类分子组合的实例是：生物素/链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白或Strep-tagII(IBA GmbH，Gttingen，Germany)或PinPoint^TM标记(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽和A蛋白/抗体的不变区(FC部分)(Pharmacia Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden，Sigma，St.Louis，MO，USA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)/直链淀粉(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)，组氨酸标记/Ni螯合物(Qiagen，Hilden，Germany，BD Bioscience Clontech，Palo Alto，Ca，USA，Invitrogen，Breda，the Netherlands，Novagen Inc.，Madison，WI，USA，Roche Applied Science，Rotkreutz，Switzerland)、壳多糖结合标记/壳多糖(Naw England Biolabs，Beverly，MA，USA)、钙调蛋白结合蛋白/钙调蛋白(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。此外还有大量其他的分子组合，例如受体/配体组合、抗体/抗原组合、凝集素/糖结构组合，等等。可在数据库中查到众多目前已知的蛋白质-蛋白质相互作用，且均可用作本发明的间隔模块[28]。一般来说，所有目前已知的或将来将要已知的能够彼此形成非共价键的分子组合，均可用作本发明的间隔模块。将间隔模块引入MAT分子的另一种方法是是使用双特异性分子，其在一个分子中组合了两种不同的结合位点。此类分子的实例可以是生物素标记的凝集素(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)，其能够将例如一种链霉抗生物素蛋白标记的模块与具有结合了凝集素的糖结构的另一种模块连接在一起。另一种可用于这种偶联方式的实例是识别两种不同表位的双特异性抗体，等等。

以下是另一种将间隔模块引入MAT分子的变化：首先，通过非共价连接间隔模块将至少两种模块彼此偶联，然后以化学交联剂处理该复合体，在空间上接近的模块之间引入共价键。这样做的优势在于，在第一个步骤中，特定的模块以导向和限定的方式彼此偶联，然后将非共价偶联转化为更加稳定的共价偶联。如果直接以产生共价键的交联剂处理模块，模块彼此偶联的方式通常是随机的而不是特异性的。

MAT分子的结构

一般来说，可以对所述MAT分子的各个模块进行任何所需的排列。各个模块在MAT分子中可出现一次或多次。最低的条件是需要具有至少一种转运模块、至少一种导向模块和至少一种抗原模块。额外的模块，例如标记模块、间隔模块等等，可任选地存在，但不是必需的。所有模块在MAT分子中均可出现一或多次。如果模块出现一次以上，它们可以相同的拷贝的形式出现，或者在各种情况中，一种模块的不同形式可以以单一拷贝或一个以上拷贝而存在。属于同一类型模块的完全不同的模块，例如His标记模块和生物素标记模块，也可出现于一种MAT分子中。两种模块在MAT分子中在功能上承担相同的任务(标记模块)，但就其分子结构而言不需要有任何共同之处。

MAT分子中的两种或两种以上相同拷贝的抗原模块的作用可以是例如引起针对有关抗原的增强的免疫应答。两种或两种以上不同的抗原模块可例如在一个MAT分子进行组合，以便同时调变针对两种或两种以上不同抗原的免疫反应。两种或两种以上不同的转运模块可用于一个MAT分子中。例如，Tat序列和VP22序列可使得转运更加有效，这是因为MAT分子可在更为广泛的不同细胞类型和组织类型中进行有效的转运。也可以例如在一个MAT分子中使用两种或两种以上标记模块，例如一种His标记和一种FLAG标记，在这种情况下，例如His标记用于分离MAT分子，而例如FLAG标记用于检测MAT分子。在一个MAT分子中可以使用两种或两种以上不同的导向模块，例如一种来自MHC II分子的恒定链的序列以及作为另一种导向模块的一种甘露糖-6-磷酸基团，其中例如恒定链作为进入MIIC的导向模块，而甘露糖-6-磷酸基团用于导向溶酶体，由此可以全面提高抗原呈递的功效或抗原呈递细胞所呈递的抗原的不同表位的数量。

也可根据需要改变MAT分子内各个模块的位置，条件是存在至少一种转运模块、至少一种导向模块和至少一种抗原模块。MAT分子的所有或部分模块还可以例如不以模块的线性顺序排列，而是采用环状或分枝状的模块结构或者是树形(dendrimer)，或者是线性和/或分枝状和/或环状和/或树形分子部分的组合。可通过例如两个半胱氨酸残基彼此发生反应或通过一个半胱氨酸残基与最初为线性结构的模块链内部的硫羟酸酯基发生反应而产生MAT分子的环状模块结构。表达载体的生产商可提供能够通过这些机制制备环状融合蛋白的具体的载体，例如IMPACT^TM-TWIN系统，来自New England Biolabs，Beverly，MA，USA。可例如通过合成一些肽来制备分枝状模块，在所述的肽中，自多聚L-赖氨酸开始，新的赖氨酸残基被连接于每个后来的赖氨酸残基的两个游离氨基上，以这种方式可以产生具有任意分枝程度的肽结构。然后例如可将转运模块和/或导向模块随后合成到分枝状肽的基本结构上[32]。也可通过蛋白质连接将其他模块偶联到线性、环状或分枝状肽基本结构上[33，34]。此外，可在合成肽的过程中将例如生物素基团引入肽基本结构中，然后可将模块通过例如链霉抗生物素蛋白Strep标记系统连接于这些生物素基团或通过PinPoint^TM系统连接于肽基本结构(分别来自IBAGmbH，Gttingen，Germany和Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA)。然后可将以这种方式连接的模块通过非共价键偶联于肽基本结构。

图1以各种模块的组成方式和MAT分子内模块的排列方式举例说明了MAT分子的可能的结构。

MAT分子的模块的结构

肽、蛋白质、氨基酸、少见氨基酸、翻译后修饰等等

在本申请中，术语肽和蛋白质可以作为等价物而相提并论。在本申请中，肽或蛋白质是指通过肽键将至少两个氨基酸进行共价连接。在本申请中，术语“氨基酸”和术语“氨基酸残基”可以作为等价物使用，即这两个术语的含义是相同的。在本申请中，术语氨基酸/氨基酸残基和肽/蛋白质取其最宽的定义。

用于本发明的氨基酸不仅是指由遗传密码确定的20个氨基酸，也指可由终止密码子编码的氨基酸，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸(pyrro-lysine)。所有已知的氨基酸和肽衍生物例如糖基化的、磷酸化的、硫酸化的氨基酸/肽和氨基酸的L异构体和D异构体，以及将来将要已知的氨基酸和肽衍生物也包括在内。可通过翻译后修饰、通过化学修饰、通过酶修饰或基于其他机制产生或特异性制备氨基酸和肽衍生物。得到的肽可包含出现于肽分子内任何区域的修饰。例如，修饰可出现于肽主链、氨基酸侧链、肽的N端或C端。修饰可发生于单个氨基酸、多个氨基酸或所有氨基酸，而且，肽中可以存在无修饰、一种类型的修饰或者多种类型的修饰的任意的组合。肽可以是分枝状的，肽可以是环状的，分枝状和环状肽的任意组合均是可能的。分枝状和/或环状肽可可通过天然的生物过程产生或通过合成而制备。可举例提及的少见氨基酸的实例有：α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、α-氨基己二酸、4-氨基苯酸、氨乙基半胱氨酸、α-氨基青霉烷酸、醛赖氨酸、4-羧基谷氨酸、胱硫醚、羧基谷氨酸、羧基氨基甲基半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸、半胱磺酸、citroline、脱氢丙氨酸、二氨基丁酸、脱氢氨基-2-丁酸、乙硫氨酸、甘氨酸-脯氨酸二肽、4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、同型半胱氨酸、组胺、异缬氨酸、lysinoalanine、羊毛硫氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、2-哌啶羧酸、焦谷氨酸、吡咯赖氨酸、脯氨酸-羟脯氨酸二肽、肌氨酸、4-硒代半胱氨酸、联赖氨酸、硫代脯氨酸，等等。只要其结构允许，所有上述氨基酸均可以是L异构体或D异构体形式的。一般来说，所有目前已知的天然存在的或合成的或通过酶性或化学性或其他方式制备的氨基酸和氨基酸衍生物、以及将来将要已知的氨基酸的修饰，均包括在术语“氨基酸”之内，并且可作为本发明的MAT分子的成分。

在此提及的可出现于本发明的MAT分子的一或多种模块中的翻译后修饰或化学修饰有：用以下结构对氨基酸序列进行修饰：游离半胱氨酸与肽序列中的半胱氨酸结合、两个半胱氨酸残基之间形成二硫键、甲基化、乙酰化、酰化、法尼基化、甲酰化、geranylgeranylation、生物素酰化、硬脂酰化、棕榈酰化、lipoylation、C-甘露糖苷化、肉豆寇酰化、磷酸化、sulfatylation、N-糖基化、O-糖基化、酰胺化、脱酰胺化、去甲基化、半胱氨酰化、羧化、羟化、碘化、氧化、聚乙二醇化、异戊烯化、ADP-核糖基化、5’-腺苷化、4’-phosphopan-theinations、谷胱甘肽化，以下物质的共价结合：黄素、血红素基团(或其他卟啉类)、核酸或核酸衍生物、脂质或脂质衍生物、磷脂酰肌醇、糖基磷脂酰肌醇锚(GPI锚)、磷酸吡哆醛、甘露糖-6-磷酸，将半胱氨酸修饰为羧基氨基甲基半胱氨酸或羧甲基半胱氨酸或吡啶基乙基半胱氨酸、将赖氨酸修饰为硫辛酸、将谷氨酰胺修饰为焦谷氨酸、通过tRNA将氨基酸添加到肽上、用泛素标记肽、肽的分支(如聚L-赖氨酸、肽的环化的形式，如通过在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键)，等等。文献记载了众多存档于数据库中的对蛋白质的进一步修饰[35]。一般来说，所有目前已知的天然存在的或合成的或通过酶性或化学性或其他方式制备的肽的修饰、以及将来将要已知的肽的修饰，均包括在术语“肽”之内，并且可作为本发明的MAT分子的成分。

肽模拟物

在本发明中，还可将模块中的一或多个氨基酸或整个模块或MAT分子中的所有模块以由肽模拟物组成的结构进行取代。在本申请中，术语肽模拟物取其最宽的定义。肽模拟物是这样一种物质，其包含非肽结构元件且能够模拟或拮抗其天然本体分子(natural parent molecule)的生物学效应。本领域有众多研究详细探讨了以肽模拟物作为常规肽结构的替代物的可能性。一般来说，MAT分子的一或多个模块可以全部或部分地由肽模拟物组成[36-38]。这可以由多种优势。由此，转运模块可更有效地穿透到细胞内部，导向模块可将MAT分子更有效地或更低效地和/或更特异性地转运到所需的细胞内细胞器内，抗原模块可引起与常规抗原引起的免疫应答相比更强或更弱的免疫应答，或标记模块可具有更好的物理化学特性，使其更适合用于分离和/或检测MAT分子，等等。此外，在一些情况中，还可通过使用肽模拟物降低或升高MAT分子在体内的稳定性，降低或升高其毒性，提高其在亲水性或疏水性介质中的溶解性，以及延长其在体外的稳定性且相对于合成相应的常规肽来说可降低合成肽模拟物的成本。肽模拟物的一个实例是Spiegelmers^，由NOXXON Pharma AG，Berlin，Germany提供。此类肽模拟物的优势例如在于其不引起免疫应答且因此可能很值得用于例如MAT分子的转运模块、导向模块、标记模块、间隔模块，等等。不过，Spiegelmers^可能不适合用作抗原模块。

MAT分子的制备和分离

本发明的另一个实施方式是使用本领域人员已知的重组表达系统、层析方法、和化学合成方法来分离MAT分子。以这种方式分离的MAT分子可用于制备药物和诊断剂以及用于制备用于实验动物和体外系统中的抗体。

制备MAT分子

本领域人员已知的用于制备MAT分子的方法包括肽的重组表达。为了表达所述的肽，可采用的细胞系统例如为，细菌例如大肠杆菌，酵母细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，昆虫细胞例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)细胞，或哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。这些细胞可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。为进行肽的重组表达，例如可采用分子生物学方法，将编码完整MAT分子或MAT分子的各个分子的核酸序列，与合适的调控核酸序列例如选择标记物、启动子等，引入表达载体中。合适的选择标记物例如是抗生素如氨卡青霉素、卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素的抗性或代谢缺陷的抗性，例如，不能产生丙氨酸、亮氨酸、色氨酸等的酵母细胞，或缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶且因此不能在HAT培养基(次黄嘌呤，Aminopetrin，胸苷培养基)中存活的哺乳动物细胞，等等。合适的启动子例如是巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子)、SP1基本启动子或胸腺嘧啶核苷激酶启动子(TK启动子)。在选择启动子时，需要选择适合于具体细胞系统的启动子。例如，T7或T7/lacO启动子适合于细菌，而例如nmt1启动子适合于酵母细胞。如果MAT分子或MAT分子的模块具有毒性，那么优选地或有必要采用能够在外部对这些分子的表达进行调控的表达载体，例如Tet-On^TM和Tet-Off^TM表达系统(Promega Biosciences，San Louis，CA，USA)。在该系统中，可通过向细胞的生长培养基中添加四环素而调控表达载体的启动子的活性。其他可用来在外部调控MAT分子或MAT分子模块表达的方法的实例是通过IPTG诱导T7聚合酶或使用蜕皮激素诱导型表达系统，例如CompleteControl^诱导型哺乳动物表达系统(Stratagene，La Jolla，MO，USA)。当使用包含内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)序列的载体时，仅使用一种表达载体(如pLP-IRESneo载体，Promega Biosciences，San Louis；CA，USA)即可同时制备多个分子。通过这种方式，例如可使得MAT分子的两种或两种以上倾向于在彼此之间通过非共价键而相互作用的模块，在数量上按照合适的化学计量比彼此平行地表达，且还可能平行地得到纯化。多个公司提供商品化的用于各种细胞系统的表达载体，例如Invitrogen，Qiagen，Stratagene，Clontech，Novagen，NewEngland Biolabs，Pharmingen，Promega，Pharmacia，等等。以这种方式分离的表达载体随后可通过本领域人员已知的方式引入合适的细胞中，例如通过电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体介导的转染，等等。或者，也可使用由分子生物学方法制备的重组病毒，用其转染细胞，并使得被转染的细胞表达MAT分子或MAT分子模块。合适的病毒表达系统为，例如杆状病毒系统如BacculoGold(BD Bioscience Pharmingen，Palo Alto，CA，USA)、腺病毒表达系统如ViraPort^TM(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、逆转录病毒表达系统如AdEasy(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，等等。

作为转染表达载体和病毒表达系统的替代选择，可使用体外翻译系统，其中例如使用兔网状细胞裂解物或E.coli S30提取物或麦芽提取物来合成MAT分子或体外合成MAT分子模块，而无需使用活细胞进行表达。

用于制备MAT分子的细胞系统

细胞裂解物或细胞培养物上清液可用作制备MAT分子或制备MAT分子的各个模块的起始材料。例如，可以自细菌如E.coli、芽孢杆菌、柄杆菌、假单胞菌或链霉菌，或者酵母如糖酵母、毕赤酵母或汉逊酵母，或者昆虫细胞如Sf-9、Sf-21或High Five，或者哺乳动物细胞如CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、BHK细胞、293细胞等获得细胞系统。可通过使用引起蛋白质自细胞内部输出到细胞外空间的信号序列，使得被表达的蛋白质特异性聚集在细胞培养基中或例如细菌的壁膜间隙中。制备MAT分子或MAT分子模块的另一种起始材料的来源可以是转基因动物、转基因植物、转基因真菌或转基因微生物，其中稳定地或瞬时地引入了编码MAT分子或MAT分子模块的核酸。在这种情况中，相应的核酸均可直接整合入特定生物体的基因组中，且可以是以质粒的形式或其他DNA或RNA分子的形式被引入生物体中。然后可分离相应的MAT分子或MAT分子模块，例如分离自转基因动物的乳汁、卵、血清、尿液、组织等等，例如分离自转基因植物的贮藏块茎、种子、叶等等，例如分离自转基因真菌的菌丝体、子实体等等，或者分离自体外培养的细胞或其他生物体，或分离自相应的细胞培养基。一般来说所有生物体均适合用作制备MAT分子或MAT分子模块的表达系统。

分离MAT分子

可采用本领域人员已知的技术分离以这种方式制备的MAT分子或MAT分子模块。为此，可采用多种本领域人员已知的分离蛋白质的方法，例如沉淀法、液相分离法、层析法等等。合适的沉淀法包括免疫沉淀、硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、乙醇沉淀、三氯乙酸沉淀(TCA沉淀)、热沉淀等等。液相分离法包括例如有机溶剂萃取，例如使用醇、丙酮、氯仿、乙腈等等。层析法包括例如阳离子交换层析、阴离子层析、等电聚焦、反相层析、凝胶过滤、固定金属离子亲和层析(IMAC)，其可使用多种金属离子例如镍、锌、钴等等、羟磷灰石层析，多种不同的亲和层析方法，例如免疫亲和层析、使用固定核酸或固定蛋白酶抑制剂的亲和层析，等等。所用的层析介质的结构可基于琼脂糖基质、基于磁性颗粒、膜的形式、中空纤维的形式、基于各种聚合物例如聚苯乙烯，等等。层析法通常可以各种规模进行，自体积为数微升的层析柱直至体积为数百升的大型层析柱不等。此外，层析可在正常大气压、范围为1到50巴(如FPLC系统，Pharmacia Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)的中等压力、范围高达400巴的非常高的压力以及甚至更高的压力(HPLC系统)条件下进行。进行层析的条件对MAT分子来说可以是非变性的和变性的。亲和层析可利用基质材料与待分离的MAT分子或MAT分子的模块之间的各种相互作用。这些包括多种标记分子，所述标记分子在本申请的其他部分已经提及，其可与特定的官能团或配体反应，且因此可用于分离MAT分子或MAT分子模块。不过，一般来说可利用所有类型的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用、核酸-蛋白质相互作用、核酸-核酸相互作用、糖-凝集素相互作用、糖-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、抗体-抗原相互作用(如抗FLAG、抗HA、抗myc tag抗体)、半抗原-抗体相互作用、Spiegelmers相互作用(NOXXON Pharma AG，Berlin，Germany)，等等。

亲和层析

可用于亲和层析的方法具体而言是那些基于标记模块与基质的选择性结合。可用于分离MAT分子的合适的标记模块与有关基质的组合有：组氨酸标记与镍螯合基质(Qiagen，Hilden，Germany)、GST标记与谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、麦芽糖结合蛋白标记与直链淀粉基质(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)、生物素标记与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白基质(IBA GmbH，Gttingen，Germany)、壳多糖结合蛋白标记与壳多糖基质(New EnglandBiolabs，Beverly，MA，USA)、钙调蛋白结合肽标记与钙调蛋白基质(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、A蛋白或G蛋白或A蛋白/G或L蛋白与抗体分子上可被相应的蛋白质识别的特定区域，例如抗体的Fc部分(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、FLAG标记、HA标记、myc标记、组氨酸标记等，以及一种偶联了针对上述特定标记的抗体的基质(很多不同的公司，包括Promega Biosciences Inc.，San Louis Obispo，CA，USA，Invitrogen，Breda，the Netherlands，Qiagen，Hilden，Germany)，等等。

蛋白酶识别序列

以这种方式分离的MAT分子或MAT分子模块可在适当的情况下自其标记模块和/或其他模块分开。为此可以将例如适当位置处的蛋白酶识别序列引入特定的表达载体。本领域人员已知多种合适的蛋白酶识别序列，包括蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、肠激酶或TAGZyme系统(Qiagen，Hilden，Germany)的识别序列。添加的蛋白酶可例如通过固定的蛋白酶抑制剂而去除，例如以EK-AWAY去除肠激酶(Invitrogen，Breda，The Netherlands)，Xa去除树脂(Qiagen Hilden，Germany)，用苯甲脒琼脂糖凝胶去除凝血酶，等等。还可以使用内含肽(inteins)来分离MAT分子或MAT分子模块，即使用的蛋白酶是MAT分子的成分，且在适当的实验条件下可通过蛋白质水解作用将其自身从MAT分子或MAT分子的模块的其余部分去除(Genease^TM，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。一般来说，所有目前已知的蛋白酶识别序列[29，30]以及将来将要已知的蛋白酶识别序列均适合用于本发明中以去除MAT分子的组分。此外，蛋白酶识别序列可以是天然存在的或是特别设计的，且可以完全或部分地由天然氨基酸、少见氨基酸、肽模拟物等组成。

内含体(Inclusion bodies)

本发明的另一个实施方式是制备不正确折叠的蛋白质聚合体(Aggregate)形式的MAT分子或MAT分子的模块，这种不正确折叠的蛋白质聚合体也称为内含体。内含体可制备为包含转运模块的分子，所述转运模块能够实现自细胞外空间经由细胞膜进入细胞内部的转运。这种转运使得最初是不正确折叠的分子成为正确折叠的分子，并能够在细胞内象最初即为正确折叠的MAT分子一样起作用。这一过程的优势在于可在变性条件下分离得到解折叠的(unfolded)蛋白质，这在技术上来说通常更为简单且成本更低。此外，内含体是相对稳定的结构。在一些情况下，这有利于日后用于医疗目的的MAT分子的贮存和稳定性。通过这种方法，也可在本发明中使用解折叠的或不正确折叠的MAT分子或MAT分子模块。某些转运模块引起的转运既可以是自细胞外空间进入细胞内的转运，也可以是反向的转运。尚处于不正确折叠的MAT分子的转换可以在准备以MAT分子进行治疗的个体体内直接进行，或者可在体外在细胞系统中进行MAT分子的折叠。此外，在一些情况下，可由同一种转运模块实现将解折叠的MAT分子转运进入细胞内部，并随后将正确折叠的MAT分子转运到细胞外空间。已经发现一些适合用作本发明的转运模块的序列采用了这种机制，例如VP22序列[39]。

MAT分子的修饰

可通过众多本领域人员已知的方法对MAT分子或MAT分子模块进行酶性、化学性或方法的修饰。例如，可使用激酶为肽提供含磷基团，而含磷基团可使用磷酸酶去除，糖结构可使用糖苷酶而去除，等等。合适的激酶、磷酸酶和糖苷酶等以及合适的方法可自多个生产商获得，例如New England Biolabs，Beverly，MA，USA。还可利用对MAT分子或MAT分子模块的磷酸化，以放射性磷标记MAT分子或MAT分子模块，由此使其在体外和/或体内更易于检测。还可通过化学反应对MAT分子或MAT分子模块进行修饰。例如，可通过还原破坏二硫键，硫酯基团可与半胱氨酸残基共价反应，或者两个半胱氨酸残基可反应形成二硫键，由此能够制备出环状或分枝状的MAT分子或MAT分子模块(如IMPACT^TM-TWIN蛋白质融合及纯化系统，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。还可以通过选择表达系统来对MAT分子或MAT分子模块的修饰施加特异性的影响。例如，细菌内不进行糖基化，昆虫细胞仅合成特定类型的糖基化，而哺乳动物细胞产生全部糖基化。为进行表达，也可使用经过修饰的或经过选择的细胞系，所述修饰或选择的方式使得细胞能够特异性产生特定的翻译后修饰或不能特异性产生翻译后修饰。这些有利的特性可以是，在亲水性溶剂或疏水性溶剂中具有更好的溶解性，MAT分子在例如室温、37℃、4℃、-20℃、-70℃或其他温度具有更高的稳定性，MAT分子在单独存在或与其他固体、液体或气体物质混合(如药物或诊断剂制剂形式)具有更长时间的分子稳定性，MAT分子对细胞膜、细胞器膜、血脑屏障、血-CSF屏障以及其他生物膜和屏障等具有更高的穿透力，更高或更低的体内或体外半衰期，更低或更高的毒性，MAT分子在体内或体外具有更好的可检测性，等等。

蛋白质连接

另外可通过蛋白质连接来制备MAT分子或MAT分子模块。蛋白质连接是指例如一种化学反应，其中通过一或多个化学反应将两个肽端头共价连接在一起。这可以例如是硫羟酸酯与半胱氨酸侧链的反应(如IMPACT^TM-TWIN蛋白质融合和纯化系统，New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。可以这种方式制备例如环状肽。可例如通过化学合成聚赖氨酸肽来制备分枝状MAT分子，在聚赖氨酸肽中，将两个额外的赖氨酸残基(赖氨酸的每个氨基上一个赖氨酸)连接于每个赖氨酸，并由此形成分枝状聚赖氨酸肽。然后，可随后在每个末端赖氨酸上合成一个肽链，或通过肽连接而共价连接一个肽。其他分枝状聚合物也可用作本发明的MAT分子或MAT分子模块的载体结构。其中的一个例子是例如PEG星状分子，其可通过以交联的二乙烯基苯使环氧乙烷发生聚合而制备。

肽模拟物

还可通过化学合成肽或肽模拟物[40]或肽和肽模拟物的组合来制备MAT分子或MAT分子模块。可通过化学合成来制备MAT分子或MAT分子的模块，例如通过Merrifield固相合成方法，采用可自多个生产商获得自动合成仪和合成的化学制品而进行。提供肽模拟物合成法的一个公司例如是Peptide Laboratory^TM，Benicia，CA，USA。用于常规肽和肽模拟物的多种合成子(synthons)可自商业途径得到，例如自Sigma-AldrichCo，St.Louis，MO，USA。

药物和诊断剂组合物

药物和诊断剂中的MAT分子的肽部分、氨基酸部分、氨基酸衍生部分、肽模拟物部分等也可以是盐的形式，条件是所述的盐是药物学可接受的盐。准备用于注射的药物或诊断剂例如可以是无菌的水性或油性溶液，其根据现有技术混合了合适的赋形剂例如分散剂、湿润剂和能够稳定悬液的制剂。可使用药物学可接受的稀释剂或或溶剂例如1，3-丁二醇来制备用于注射的无菌溶液。可使用的可接受的溶剂和缓冲液是水、林格液、等张氯化钠溶液，等等。此外，可使用无菌的油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，可使用脂肪酸例如油酸来制备注射溶液。此外，还可使用二甲基乙酰胺、去垢剂包括离子和非离子去垢剂、聚乙二醇，等等。前述物质的混合物也是可以的。此外可将药物制备为与生物可降解聚合物的混合物，所述生物可降解聚合物可连续地释放药物。该系统的一个实例例如是Atrigel系统(Atrix Labs，Fort Collins，CO，USA)。

可用于直肠施用的制剂那些由以下混合物组成的制剂，所述混合物由MAT分子和，在适当情况下，其他物质组成，所述其他物质具有合适的、非刺激性软膏基质或填充物，例如可可油、合成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、脂肪酸或聚乙二醇。此外还可含有着色剂、防腐剂和添味剂。这些以及其他合适的物质在室温为固体但在体温时融化，从而释放出所含的物质。

口服施用可使用胶囊、片剂、丸剂、粉剂、颗粒等等。在这些剂型中，药物和诊断剂中的活性物质通常与适合特定剂型的佐剂相结合。这些物质可使用乳糖、蔗糖、淀粉、纤维素酯、链烷酸、纤维素烷基酯、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸或亚硫酸的钠盐或钙盐、明胶、阿拉伯树胶、藻酸钠、聚乙烯吡烷酮、聚乙烯醇等加工成例如片剂、胶囊等。此类胶囊、片剂等可额外包含能够进行或促进活性物质控释的物质，例如羟丙基甲基纤维素。此外还可含有缓冲物质，例如柠檬酸钠、碳酸镁或碳酸钙或者碳酸氢镁或碳酸氢钙，等等。其他组分可以是着色剂、香料、调味剂、防腐剂和甜味剂。片剂、丸剂、胶囊等可额外加上涂层，涂层在一方面使其抵抗胃酸，而在另一方面，其可溶解于肠道内的碱性环境中。

口服施用也可使用液体、药物学可接受的乳剂、溶液、糖浆和类似凝胶的制剂。这些制剂可包含医用溶剂，例如水、乙醇，等等。这些制剂还可包含佐剂、湿润剂、乳化剂和混悬剂等，以及甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂和添味剂。

用于注射目的的液体制剂可通过将无菌粉末或颗粒溶解于水性或非水性溶剂而制备。这些溶液所基于的粉末和颗粒可包含一或多种为口服施用药物而提及的物质。合适的溶剂是，水、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、玉米油、棉子油、椰子油、苯甲醇、氯化钠溶液或多种其他缓冲液。其他可能的成分为着色剂、防腐剂，等等。

药物中MAT分子的量以及其他成分的量取决于剂型、剂量频率、所采用的施用途径、患者的年龄、性别、体重和健康状况，等等。需要考虑的一个其他因素是进行的处理是用于诊断、治疗还是用于预防，以及处理的目的是增强免疫反应还是抑制免疫反应。本领域人员已知众多有关药物的配制和剂量的文献[41，42]。

使用MAT分子获得抗体

本发明的另一个实施方式是使用MAT分子获得单克隆、寡克隆或多克隆抗体。可用本领域人员熟知的常规方法获得抗体。使用MAT分子得到的此类抗体能够对MAT分子抗原模块中的抗原进行特异性免疫学检测。抗体精确识别抗原模块中的抗原、和/或与抗原模块中的抗原相似的抗原、和/或抗原模块中的抗原的一或多种表位、和/或抗原模块中的抗原的一或多种新表位、和/或相应的完整抗原，尽管抗原模块中仅具有这些抗原的部分，等等。可通过免疫接种合适的实验动物来产生多克隆抗体，例如、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、猫、狗、猴子、牛、马、驴、鸡或者其他实验动物。可通过例如免疫接种实验动物例如小鼠或大鼠，然后采用本领域人员已知的杂交瘤技术来产生单克隆抗体。单克隆抗体还可通过重组实验方法产生，其中例如自通过以MAT分子免疫接种实验动物而产生的杂交瘤细胞系中分离编码具体的单克隆抗体的核酸。这些核酸可用于重组表达系统或通过使用体外翻译系统来产生相应的抗体。如此产生的抗体可以完整抗体分子、由与其他氨基酸序列融合的完整抗体或部分抗体组成的蛋白质、F(ab)片段、F(ab)2片段、单链可变片段(ScFv)或其他抗体片段的形式产生和使用。

本发明的药物和诊断剂的施用途径

可通过多种途径将本发明的药物和诊断剂施用于患者或待免疫的实验动物。这些方法包括口服和舌下给药，例如使用片剂、带涂层的片剂、胶囊、颗粒、液体溶液、待溶于液体的粉末等形式，在适当的情况下可使用例如带涂层的片剂、片剂、颗粒和胶囊的组合物，如此使得药物不会暴露于胃内的酸性环境而到达肠道，且仅在该处释放出药物的成分。还可以将药物通过局部施用于皮肤或粘膜，例如使用软膏、喷剂、撒粉(dusting powders)、酊剂等形式，或以气溶胶通过例如呼吸道粘膜而吸入。还可以栓剂、灌肠剂等形式施用于直肠。对于药物的经皮施用，还可使用一些辅助剂，例如贴剂或离子透入(iontoporesis)用具(借助于电流的经皮施用)。其他适合用于本发明的药物和诊断剂的施用形式是注射、输注或以医用泵系统进行施用。注射、输注或以泵系统进行施用可以是经静脉、肌肉、皮下、皮内、关节内、胸骨内、鞘内、腹腔内等等。还可以将MAT分子直接注射到淋巴结，例如腹股沟淋巴结。另一种可行的施用MAT分子的方法是体外处理患者的细胞，特别是专门进行抗原呈递的细胞，例如树突细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、其他巨噬细胞样细胞，等等。作为进一步的实例，可使用MAT分子来处理实验动物的细胞或细胞系。然后，将经处理的细胞接下来施用于患者或实验动物。施用于患者或实验动物的细胞可以是活细胞、不能再进行分裂的灭活细胞、或已被杀死的细胞。可例如通过以合适的物质或照射进行处理，如放射性或紫外线处理，得到灭活细胞或死细胞。另一种可用于施用药物、特别是本发明的MAT分子的方法，是以可表达MAT分子的载体稳定或瞬时转染动物细胞、人细胞或植物细胞。适当情况下，可将如此修饰的细胞捕集(entrap)在一种基质中，该基质第一可固定所述细胞，第二可保护细胞抵抗患者或实验动物的免疫系统，但在另一方面，该基质可使得MAT分子自细胞中释放而进入患者或实验动物体内。在一些情况中，还可将转染的细胞直接施用于患者或实验动物，其中细胞被适当地处理以使其不能再分裂，例如通过照射或合适的化学制剂进行处理。此外，可将药物包装在脂质体或其他小泡例如外来体或deoxosomes中而施用，或以药物与生物可降解聚合物的混合物的形式进行施用，所述生物可降解聚合物可连续释放所述药物。此系统的一个实例例如是Atrigel系统(Atrix Labs，Fort Collins，CO，USA)。此外，还可以将其他物质以与本发明的药物或诊断剂给药的相同的施用途径或一或多种不同的施用途径、同时或贯序施用。所述其他物质可通过其免疫刺激特性而增强本发明的药物或诊断剂的作用。此类同时或贯序施用的物质可以是佐剂、矿物油、弗氏佐剂、免疫刺激性蛋白质或介质例如细胞因子、其他疫苗等等。此外，还可适当地同时或贯序施用免疫抑制物质，以便例如降低或抑制不良的局部免疫反应，而同时又保留了系统性免疫反应。不过，也可放疗采用同时或贯序施用免疫抑制物质以预防相同性免疫反应，而同时又保留了局部的免疫反应。

测定MAT分子效率的可能性

可采用多种体外和体内实验来测定MAT分子调变个体的免疫应答的效率。

合适的体外模型为，例如，得自患有变态反应性疾病的患者的外周血单个核细胞(PBMC)。此类细胞的优势在于具体患者的变态反应所针对的确切的抗原通常是已知的。据此有可能在对患者或实验动物进行研究前，例如在体外对患者进行模拟脱敏。为此，例如可用变态反应者所针对的特定抗原或以抗原模块中具有该特定变应的MAT分子处理来自该变态反应者的PBMC。由此可研究患者的原代细胞对该变应原的各种剂型(完整MAT分子、有/没有转运模块的分子、有/没有导向模块的分子，等等)的免疫学反应。合适的测量参数例如为测定细胞培养物上清液中的细胞因子。多种类型的T细胞参与了针对抗原的免疫应答，例如1型(Th1细胞)或2型(Th2细胞)或0型(Th0细胞)T辅助细胞。在各种情况中，参与其中的T细胞的类型极大地影响了所诱导的针对抗原的免疫应答主要是由免疫球蛋白E(IgE)还是免疫球蛋白G(IgG)组成。自文献中可知，具体来说，IgE免疫应答引起变态反应和哮喘，而IgG免疫应答通常与对抗原的耐受相关。例如通过测定细胞表面的表面抗原的表达，或通过测定信使分子(messengers)例如PBMC释放的细胞因子，来确定以抗原处理的PBMC所激活的具体的T细胞类型。可测定的Th1免疫应答的标记物是，例如，细胞培养基中的干扰素γ(INF-g)或白介素-1(IL-1)，而IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13代表Th2免疫应答。可使用本领域人员已知的标准方法来检测这些细胞因子，例如用ELISA测定例如来自细胞培养物的上清液，或用FACS分析存在于PBMC细胞表面或内部的信使分子，或通过细胞培养物上清液或细胞裂解物的Western印迹方法。文献中揭示了多种用于检测这些以及其他信使分子的其他方法[43，44]。除了由PBMC释放的信使分子，还可使用细胞内或膜相关性信使分子或其他蛋白质来对PBMC中的T细胞进行免疫学表征。多种适合用于此类研究的抗体可购自例如Pharmingen，San Diego，CA，USA、Beckmann Coulter Inc.，Fullerton，CA，USA、Santa CruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，USA，等等。相应的研究不仅可使用来自患者的原代细胞，也可使用来自适当处理的实验动物的细胞，例如小鼠、大鼠、豚鼠等等。实验动物研究的优势在于不仅可对这些动物的细胞进行体外研究，而且可在以内对完整生物体的免疫系统进行研究。因此还可研究MAT分子以及相应的对照组在剂量、组成以及施用形式上的效果，所述对照组例如为仅由抗原组成的分子，或仅由转运模块和抗原模块组成的分子，或仅由导向模块和抗原模块组成的分子。还可研究，如果采用常规方式将MAT分子或相应的对照组直接注射至皮下或者例如直接注射至淋巴结，那么免疫应答的性质是否会有不同。还可研究非创伤性施用方式例如口服或舌下施用MAT分子及相应的对照组的效果。可在实验动物中进行的另一个研究是，在施用MAT分子或相应的对照组时，是否同时施用佐剂，例如矿物油、分枝杆菌提取物或弗氏佐剂。还可探知进行免疫接种的最有效的或最佳可耐受的时间表，以及免疫接种的剂量和次数。还可测试不同的抗原模块的效率。以这种方式还可探知将来用于人类患者的最佳免疫接种策略。

除了信使分子、细胞内蛋白和表面蛋白，免疫球蛋白同样特别适合用于表征体外培养的细胞的免疫反应或用于表征实验动物或临床研究中的患者的免疫反应。可例如采用ELISA来研究因施用变应原或抗原所释放的抗体是IgE型的还是IgG型的，并进行定量。这一数据可说明参与其中的免疫反应的类型。

由于由T细胞释放的信使分子还例如可影响例如存在于PBMC制备物中的免疫系统细胞的增殖，因此也可通过测定细胞例如PBMC的增殖情况来表征免疫应答。为此，可进行例如体外研究，例如以氚标记的胸苷进行DNA掺入研究以检测细胞生长。众多本领域人员已知的测定细胞增殖的其他方法同样可用于这些研究中。还可例如以FACS研究来自实验动物或参与研究的人类患者的血样，在体内测定免疫系统的特定细胞的增殖。可选择合适的抗体来定量例如血液中的不同细胞类型的亚群。可以这种方式研究MAT分子或相应的对照组的治疗效果。

实施例

以下例举的实施方式意在举例说明本发明而无意于限制本发明的范围。

实施例1：克隆用于MAT分子的表达载体

以下所述的所有分子生物学方法均按照本领域人员已知的标准方法进行[43]。使用载体pQE-30(Qiagen，Hilden，Germany)来克隆用于表达MAT分子(模块化抗原转运分子)的载体。

第一步，将编码转运模块的核酸序列引入细菌表达载体。以合成的寡核苷酸的形式将编码HIV Tat的氨基酸GYGRKKRRQRRR的DNA序列引入载体pQE-30。除了HIV Tat序列，该寡核苷酸在5’端包含一个限制性内切酶Bgl II的识别序列且在3’端包含BamH I、Spe I、Pst I和Hind III的识别序列。随后以Bgl II和Hind III酶切合成制备的HIV Tat序列，并以限制性核酸内切酶Bam HI和Hind III酶切载体pQE-30。然后使用NucleoSpin提取2合1(Macherey-Nagel，Oensingen，Switzerland)分离Tat序列和载体pQE-30，用连接酶连接在一起，通过电穿孔转化入感受态细菌，并在含有氨苄青霉素的琼脂培养皿中铺板。选择一些所得的菌落，自其分离载体DNA。采用标准方法对如此得到的载体进行测序以确认核酸序列。包含具有正确序列的载体的细菌克隆被用于进一步实验中。第二步，将导向模块引入载体。为此，使用本领域人员已知的标准方法自人外周血单个核细胞(PBMC)分离mRNA，并以逆转录酶PCR转录成互补DNA(cDNA)。通过使用如此得到的cDNA并使用不同的PCR引物得到编码MHC II恒定链1-110位氨基酸的人MHC II分子恒定链的核酸序列，其中所述不同的PCR引物在PCR产物5’端引入Bgl II识别序列并在PCR产物3’端引入Spe I、Bam HI、Pst I和Hind III识别序列。按照第一步，将MHC II的恒定链的序列区引入到已经被引入pQE-30载体的Tat序列的3’端后方。测序以确认所得载体的序列。采用本领域人员已知的定点诱变的标准方法以胸腺嘧啶取代292位的胞嘧啶，并以腺嘌呤取代318位的鸟嘌呤。这两个点突变并不改变相应蛋白质的氨基酸序列，而仅仅是去除了不希望的限制性核酸内切酶的识别序列。第三步，最后，将抗原模块引入载体。通过使用其中已经引入了编码特定抗原的编码序列的pQE-30载体以及使用PCR引物得到了各种抗原的核酸序列，其中所述PCR引物在PCR产物的5’端引入Spe I和/或BamH I识别序列以及在PCR产物的3’端引入终止密码子和Pst I或Hind III识别序列。其中，得到的编码抗原Der p 1(基于成熟Der p 1蛋白质的氨基酸序列)的1-222位氨基酸的核酸序列作为抗原模块。按照前两个步骤，将抗原Der p 1的序列区引入到已经被引入pQE-30载体中的MHC II恒定链序列的3’端后方。测序以便确认所得载体的正确序列。在以后的实验中，使用QIAfilter plasmid midi试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，按照生产商的说明，分离这些表达载体。实施例2：获得抗原Bet v 1、Asp f 1、Asp f 6和Der p 1的编码序列

以各种本领域人员已知的方法分离抗原模块中的各种抗原的编码序列[43]。通过合成的寡核苷酸得到Bet v 1序列，在以前的研究中已经获得了Asp f 1和Asp f 6序列，并自这些研究所用的载体将其分离[45，46]，并随后引入pQE-30载体，通过逆转录酶PCR，使用来自屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的mRNA分离Der p 1序列。

实施例3：在细菌中表达和分离MAT分子

根据生产商的说明进行MAT分子的表达和分离(Qiagen，Hilden，Germany)。具体来说，在20ml培养基(2×YT培养基，100μg/ml氨卡青霉素，25μg/ml卡那霉素)中建立以特定的表达载体(pQE-30-MAT分子)转染的E.coli M15细菌的预培养物，置于细菌摇床上，37℃过夜。然后将预培养物培养于2000ml培养基(2×YT培养基，100μg/ml氨卡青霉素，25μg/ml卡那霉素)中，置于细菌摇床上，在37℃，直至其在600nm波长处的光密度达到0.6。添加IPTG得到终浓度为1mM，然后重新进入4至15h的生长期，离心2000g×20分钟自培养基中分离细菌，将细菌沉淀物置于-20℃储存。通过冻融细菌沉淀物制备细胞裂解物，重悬于8M尿素溶液中(每克细菌沉淀物湿重5ml尿素溶液)，小心搅拌1至2h，随后离心48000g×30分钟。将清澈的上清液用于MAT分子的镍螯合预层析。分离MAT分子使用了49或18ml柱(Bio-RadLaboratories Inc.，Hercules，CA，USA)，柱中注有5至10ml的Ni-NTASuperflow基质(Qiagen)，和来自Bio-Rad(Econo泵和UV监视器)的层析系统。层析柱先以5个柱体积的缓冲液A(100mM NaH₂PO₄，10mMTris/HCl，6M盐酸胍，以HCl将pH调整至8.0)冲洗，然后将细菌裂解物加至柱上，流速为1.4ml/min。然后将5至10个柱体积的每种缓冲液A和缓冲液B(缓冲液B：100mM NaH₂PO₄，10mM Tris/HCl，8M尿素，pH8.0)抽吸到柱上，流速为1.4ml/min，在波长280nm(A280)处观察到流通(flow-through)的吸收。一旦流通在稳定A280处为大约0.01以下，即以5至10个柱体积的缓冲液C(100mM NaH₂PO₄，10mM Tris/HCl，8M尿素，以HCl将pH调整至6.3)进行冲洗直至最终达到稳定A280为大约0.01以下。然后以缓冲液E(100mM NaH₂PO₄，10mM Tris/HCl，8M尿素，以HCl将pH调整至4.5)洗脱MAT分子并收集。

实施例4：以SDS聚丙稀酰胺凝胶、考马斯染色和抗His Western印迹检测MAT分子

SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳：

缓冲液、NuPAGE^凝胶和Xcell SureLock^TM电泳槽来自Invitrogen(Invitrogen Life Technologies，Breda，The Netherlands)，根据生产商的说明进行电泳。每道5或10μg的分离的MAT分子进行电泳分离，凝胶为12％NuPAGE^Novex bis-Tris凝胶(Invitrogen)，恒压200V，使用1×NuPAGE^SDS样品缓冲液在还原条件下电泳35至50分钟。电泳缓冲液为MES或MOPS缓冲液(MES缓冲液：50mM MES(码啉乙磺酸(morpholinoethanesulfonic acid))，50mM Tris/HCl，3.5mM SDS，1mMEDTA，pH 7.3，MOPS缓冲液：50mM MOPS(3-(N-码啉基)-2-羟基丙磺酸(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid))，50mM Tris/HCl，3.5mM SDS，1mM EDTA，pH 7.7)。

考马斯兰染色：

将凝胶置于染色溶液(200ml甲醇，50ml乙酸，250ml水，0.5g考马斯兰R-250)中染色1h，然后数次更换脱色溶液(200ml甲醇，50ml乙酸，250ml水)进行脱色，直至凝胶的背景变得透明。根据生产商的说明，使用Xcell II^TM印迹装置(Invitrogen)将蛋白质自NuPAGE^凝胶电转至印迹膜上。使用含10或20％甲醇的1×NuPAGE^转移缓冲液，根据生产商的说明安装印迹装置。使用PVDF膜作为印迹膜，恒压30V电转1h。

免疫学检测MAT分子：

根据生产商的说明，使用抗His抗体免疫学检测MAT分子(抗RGS(His)4抗体，Qiagen，Hilden，Germany)。所有实验步骤均在室温进行。PVDF膜先进行干燥然后直接与抗His抗体(Qiagen)孵育1小时(无需预先封闭游离蛋白质结合位点)，抗体浓度为1∶1000至1∶2000，溶于含3％BSA(牛血清白蛋白)的TBS(50mM Tris/HCl，150mM NaCl，pH 7.5)。然后将膜以TBS，0.05％Tween 20，0.2％Triton X-100洗涤3次，每次10分钟，然后以不添加其他成分的TBS洗涤1次。第二抗体为抗小鼠Ig-HRP缀合物(Amersham，Buckinghamshire，England)，浓度为1∶10000至1∶20000，溶于含10％奶粉的TBS，孵育1小时。最后，将印迹膜以TBS，0.05％Tween 20，0.2％Triton X-100洗涤4次，每次10分钟。根据生产商的说明，以ECL^TM系统(Amersham)检测缀合物。使用自显影胶片检测根据标准方案产生的化学发光信号。

实施例5：将MAT分子转运至细胞系和原代人类细胞中

采用本领域人员已知的使用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的密度梯度离心的标准方法，自来自志愿者的新鲜的、肝素抗凝血中得到PBMC(外周血单个核细胞)。Jurkat细胞系来自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。将细胞培养于RPMI-1640培养基中，其中添加以下成分：10％胎牛血清，200单位/ml青霉素，200μg/ml链霉素，MEM维生素，MEM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺和0.001％2-巯基乙醇。为测定转运，将细胞重悬于含有添加成分的RPMI培养基中，浓度为1×10⁶/ml。将细胞按照附图中相应的说明与浓度为0.01至5mM的重组分子或MAT分子在4、22或37℃孵育5分钟。离心细胞，然后将细胞沉淀物与40μl裂解缓冲液(8M尿素，100mM磷酸钠，10mM Tris/HCl，100mM氯化铵)在室温孵育5分钟。离心去除不溶的细胞组分(15000g，15分钟)，然后按照实施例4所述以Western印迹对澄清的裂解物进行分析。使用抗His抗体检测蛋白质。

实施例6：刺激来自患有变态反应的患者的外周血单个核细胞(PBMC)

以下用于刺激PBMC以及用于确定经刺激的PBMC的增殖的方法在文献中均有记载[44]。通过使用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的密度梯度离心方法，自来自志愿者的新鲜的、肝素抗凝血中得到PBMC。志愿者是患有变态反应的患者，所述变态反应针对的是病人个体已知的变应原。患者依法对在其血液样品上进行实验这一事实获得知情并同意参与这项实验。获得的PBMC被加入到RPMI培养基中，其中添加了实施例5所述的添加成分，并在各例中添加各特定的患者对其具有变态反应的重组抗原，所述重组抗原的浓度为0.01至100nM。在各例中，研究了未修饰的抗原和偶联了转运模块和导向模块的抗原(MAT分子)。在一些实验中，实验方法中仅偶联了转运模块和抗原模块，而没有偶联导向模块(图7A)。在一些实验中还使用了对照组，对照组仅为转运模块或是无抗原模块而是仅由转运模块和导向模块组成的构建体。孵育5天后，在培养基中加入10μCi/ml氚标记的胸苷。测定PBMC中的胸苷掺入情况，将其作为被处理的细胞的抗原呈递效率及与此相关的增殖情况的指标。为此，在8到10小时后，将具有放射性的细胞培养基去除，洗涤细胞，并通过测量放射性来确定放射性胸苷掺入的量。为此，使用了来自Wallac ADL AG，Hünenberg，Switzerland的1205 Betaplate液体闪烁计数器。作为对照组，未经抗原刺激的细胞同样与氚标记的胸苷进行孵育，然后以同样方法进行分析。得到的结果是放射性胸苷掺入的测定值，作为增殖的指标且因此作为抗原呈递效率的指标。测得的胸苷掺入值越高说明抗原呈递越有效。由于在各个实验中的抗原浓度为0.01nM至100nM，因此还可以确定最大抗原呈递出现的时的抗原浓度。浓度越低说明抗原作为免疫应答的调变剂越为有效。作为进一步的对照组，以均为0.5μg/ml的抗CD3抗体和抗CD28抗体处理细胞，该处理代表一种非常强的增殖刺激。由此可以确定各个实验中因PBMC增殖引起的胸苷掺入的最大可能。

实施例7：MAT分子刺激引起的细胞因子释放

如实施例5所述自变态反应患者的血液分离PBMC并按10⁶/ml以培养基进行稀释。将每份100μl的细胞悬液接种于96孔板中，并以0.01至1000nM的分离的抗原处理5天。这次不更换细胞培养基。将96孔板离心后，取上清液储存于-20℃直至分析其中的细胞因子。以抗原处理各例中的PBMC，所述抗原是自其分离PBMC的患者对其具有变态反应的抗原。研究了如此获得的上清液中的以下细胞因子：干扰素γ(INFg)、白介素-10(IL-10)和白介素-5(IL-5)。图8A和8B给出的结果来自对Bet v 1具有变态反应的患者的PBMC。通过本领域人员已知的方法，使用来自R & D Systems Inc.，Minneapolis，USA.的DuoSet^ELISADevelopment Systems进行INFg、IL-10和IL-5的免疫分析(ELISA＝酶联免疫吸附试验)。

与获得用于细胞因子测定的上清液相平行，以来自相同的供者的PBMC，按照实施例6所述进行刺激实验。细胞增殖分析的结果在图8A和8B中给出。

实施例8：未修饰抗原和MAT分子抗原模块的抗原的体内效果

免疫接种小鼠

为了测试MAT分子的效率，采用本领域人员已知的方式，以重组MAT分子连同作为佐剂的氧化铝免疫CBA/2小鼠3次，每次间隔2周。如实施例3所述产生重组MAT分子。以3种不同的途径进行免疫。对于皮下、腹腔内和淋巴结内注射抗原或对照组等各种情况均进行了一系列的实验。对于淋巴结内注射，以外科手术暴露组织以便进行直接注射。使用的MAT分子是一种蛋白质，其组成为：HIV Tat序列作为转运模块，人恒定链作为导向模块，和PLA2(来自蜂毒的磷脂酶A2)肽作为抗原模块(命名为：trans-target-PLA2)。将PLA2(命名为：PLA2)用作对照，并将0.9％盐溶液(命名为：对照)用作另一种对照。用以下量的MAT分子或相应量的对照蛋白质或对照缓冲液连同作为佐剂的氧化铝进行免疫，淋巴结内免疫使用0.1μg，皮下和腹腔内免疫使用10μg。每个实验组免疫3只动物，故对于每种情况来说，每组实验共使用9只动物。进行了3个系列的实验，且在每个系列的实验中测试了不同的免疫途径(皮下、腹腔内、淋巴结内)。在首次免疫后以及其后2、4和6周自每只实验动物的尾静脉取血。血液在室温凝结，然后离心得到血清，置于-20℃直至进行分析。使用如此制备的血清来测定PLA2特异性IgG和IgE的滴度。

测定小鼠血清中PLA2特异性IgG2a的滴度

为了测定PLA2特异性IgG2a的滴度，将微滴定板(96孔)以100μl/孔的如下溶液在4℃包被过夜，所述溶液为5μg/ml PLA2(Sigma-Aldrich，Buchs DG，Switzerland)溶液，溶于碳酸盐缓冲液。以磷酸缓冲的氯化钠溶液(PBS)，0.05％Tween洗涤2次后，与封闭缓冲液(PBS，2.5％脱脂奶粉)进行孵育以封闭游离蛋白质结合位点，封闭缓冲液为200μl/孔，在室温孵育1至2小时。重复洗涤2次，然后将按照1∶2连续稀释于封闭缓冲液(50μl/孔)中的待测血清样品(1∶2至1∶64稀释)在室温孵育3小时或在4℃孵育过夜。以无血清的孵育或与来自未处理的动物的血清进行孵育作为阴性对照。然后洗涤5次，并与按照1∶500稀释于封闭缓冲液的生物素标记的抗小鼠IgG2a(PharMingen GmbH，Hamburg，Germany)在室温(100μl/孔)孵育2小时，然后再洗涤5次。最后，与100μl/孔的按照1∶1000稀释于封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶在室温孵育1小时，然后洗涤6次。根据生产商的说明，加入100μl/孔的ABTS溶液(2，2’-azinodi-(3-ethylbenzothiazolinesulfonic acid)溶于ABTS缓冲液)和0.1％(v/v)的30％过氧化氢溶液，产生生色反应。大约30分钟后，在405nm波长处(参照滤光片：595nm)测定吸光度。图9给出了这些测试的结果。

测定小鼠血清中的PLA2特异性IgE滴度

按照PLA2IgG2a ELISA的方案进行PLA2IgE ELISA。与上述方案不同之处在于：微滴定板以5μg/ml的抗小鼠IgE抗体包被。在进行血清样品孵育并洗涤滴定板后，与按照1∶333稀释的生物素标记的PLA2(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，USA)进行孵育。与ABTS发生的生色反应进行1小时。图9给出了这些测试的结果。

附图说明

图1

MAT分子的理论结构

图1图解性地举例说明如何构建本发明的MAT分子的各个模块。其中“Trans”代表转运模块，“Target”代表导向模块，“AG”代表抗原模块，“Tag”蛋白质标记模块，而破折号(-)代表连接模块(linkermodule)。连接模块可将其他模块通过共价键和/或非共价键连接在一起。图1A给出了各种模块的线性排列的多种实例。图1B给出了分枝状MAT分子排列的多种实例，其中包括树形结构，而图1C给出了环状MAT分子排列的一些实例，可以将环状排列与线性和/或分枝状排列相结合。一般来说，所有给出的排列均仅是一些实例，旨在举例说明可以存在非常多的排列形式这一事实。这些图解性地给出的MAT分子实例决不能被理解为是对本发明的保护范围的限制。

图2

融合蛋白的表达、纯化和检测

在E.coli中表达多种由标记模块(His6tag)、转运模块(Tat序列)、导向模块(人MHC II的恒定链)和抗原模块(Asp f1＝烟曲霉(Aspergillusfumigatus)抗原1)组成的MAT分子，并在变性条件下采用固定金属离子亲和层析进行分离。根据表达系统的生产商(Qiagen，Hilden，Germany)提供的说明进行这些步骤[47，48]。将10μg或5μg分离蛋白质的样品以SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分离，然后以考马斯兰染色(图2A)或以Western印迹进行分析，使用了识别标记模块的抗体(图2B)。箭头标出的是表达的蛋白质的位置。

图3

蛋白质和MAT分子的温度非依赖性转运

将原代的人外周单个核细胞(PBMC)与浓度为1μM的特定的蛋白质或MAT分子在4、22或37℃孵育5分钟，洗涤，加入含有尿素的样品缓冲液中并裂解。然后将裂解物通过SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分离，并电转至PVDF膜，然后以特异性抗体(抗RGS(His)4抗体)检测蛋白质或MAT分子。箭头显示了蛋白质或MAT分子的位置。在所有的温度下，细胞的裂解物中均可检测到融合蛋白，说明已经成功转运到细胞内部。

图4

将MAT分子转运至细胞系和原代细胞中

图4给出的结果基本上是以与图3的实验相同的方法得到的，但有两个不同之处：图4A显示MAT分子的转运在原代人细胞(PBMC)和人肿瘤细胞系(Jurkat细胞)中均是成功的。箭头显示的是在Western印迹中检测到的蛋白质或MAT分子的位置。此外，图4A和4B显示各种抗原模块(Asp f 1＝烟曲霉变应原，Der p 1＝屋尘螨变应原，Bet v 1＝桦树花粉变应原)可通过转运而进入原代的人PBMC细胞。

图5

MAT分子转运的剂量动力学

图5给出的结果基本上是以与图3的实验相同的方法得到的，但其中使用了3或4种不同浓度的蛋白质或MAT分子(0.01mM，0.1mM，1mM和5mM)。可以看出转运反应具有明显的剂量依赖性。随着添加的MAT分子的浓度的升高，细胞内部检测到了更多的特定的分子。箭头标出的是相应分子的位置。

图6

MAT分子的多种功能性结构

图6给出的结果基本上是以与图3的实验相同的方法得到的，但其中研究了转运模块(Tat序列)和抗原模块(Asp f 1＝烟曲霉变应原)的三种不同排列。图6A的箭头指出的是Western印迹中检测到的融合蛋白的位置。图6B给出了三种不同融合蛋白的结构。研究了具有N端、反向C端和C端转运模块的融合蛋白。所有三种融合蛋白均通过转运而成功地转运至细胞内部。

图7

抗原/MAT分子介导的变态反应患者的PBMC的体外细胞增殖

图7描述了在体外加入了MAT分子的来自变态反应患者的PBMC(外周血单个核细胞)上进行的研究。MAT分子包含作为抗原模块的特定变应原，该变态反应患者对该变应原具有变态反应。添加MAT分子使得变态反应患者的抗原呈递细胞的抗原呈递更加有效，刺激了PBMC的生长。由此引起的细胞增殖可通过放射性标记的DNA构件(胸苷)的掺入而定量(y轴)。x轴指出了用于特定的细胞刺激测试的MAT分子的浓度，或者是抗原分子的浓度，以nM为单位。当使用相对低浓度的MAT分子时，以所有经研究的抗原模块(作为MAT分子的部分)进行研究的所有患者均出现细胞增殖(＝免疫刺激＝胸苷掺入增加＝放射性增加)。作为对照，在每种情况中对相同的PBMC仅以不含MAT分子或抗原的水进行处理(＝在图例中为对照)。此外，测定以强生长刺激(抗CD3和抗CD28抗体，均为0.5μg/ml)处理5天的细胞的胸苷掺入情况，将其作为各个实验的阳性对照。通过这种刺激而得到的生长可用于核对所制备的PBMC就其增殖能力而言的质量。图7A的实验所得到的数值是77864±5347cpm，图7B的实验所得到的数值是100374±11678cpm，而图7C和D的实验所得到的数值是112205±5958cpm。

图7A至7G显示，对于7种测试的抗原，将抗原掺入MAT分子的抗原模块，既便在相对低的浓度，也引起变态反应患者的PBMC出现增殖。测试的抗原为Der p 1(屋尘螨变应原；图7A)，Bet v 2(桦树花粉变应原，图7B)，Asp f 1(烟曲霉变应原1，图7C)，Asp f 6(烟曲霉变应原6，图7D)，Asp f 3(烟曲霉变应原3，图7E)，PLA2(来自蜂毒的磷脂酶A2变应原，图7F)和Fel d 1(家猫(Felis domesticus)，图7G)。图7H显示，除了抗原Bet v 1，当将抗原模块中具有Bet v 1的MAT分子用于对Bet v 1具有变态反应的4个不同患者(I.至IV.)时，在低于以Bet v 1作为抗原的浓度下，在所有4例中，每个患者的PBMC均出现增殖。

图8

抗原/MAT分子介导的来自变态反应患者的PBMC在体外分泌细胞因子

图8A和8B显示了两个无关的对Bet v 1有变态反应的患者的PBMC经体外培养和Bet v 1抗原(Bet v 1单独或作为MAT分子的模块)刺激后，显示出特征性的细胞因子分泌模式。I.显示了各种情况下细胞增殖的结果(如图7相似)，II.显示了细胞培养物上清液中的干扰素γ(INFg)水平，III.显示了细胞培养物上清液中的白介素-10(IL-10)的值，以及IV.显示了细胞培养物上清液中的白介素-5(IL-5)水平。由于PBMC刺激具有脱敏作用，甚至以较低的抗原剂量也可以引起PBMC增殖和INFg释放的增加。此外，IL-5的产生应该降低。这种细胞因子分泌模式代表了变态反应患者免疫细胞的脱敏(Th1免疫应答而不是Th2免疫应答)。IL-10浓度的增加解释了为何当抗原剂量更高时细胞增殖灰降低(图I.)。两例均出现了这种细胞因子分泌模式(图8A和图8B)。

图9

抗原/MAT分子在小鼠中介导的体内免疫应答

分别以分离的PLA2、抗原模块中具有PLA2的MAT分子、或对照缓冲液免疫CBA/2小鼠3次，间隔为2周，然后测定PLA2特异性血清的IgG2a和IgE抗体滴度。如果存在脱敏，则应该仅出现PLA2特异性IgG抗体，而不出现PLA2特异性IgE抗体。IgE抗体负责变态反应。研究了3种不同的抗原免疫途径，皮下、腹腔内和淋巴结内。发现所有3种以PLA2进行免疫的免疫途径均引起明确的IgE免疫应答(变态反应)(图9，左侧)。但是以包含PLA2作为抗原模块的MAT分子进行免疫未出现IgE免疫应答(无变态反应)。相反，以PLA2和以包含具有PLA2的抗原模块的MAT分子进行免疫均引起所需的IgG免疫应答，后者不引起变态反应。

本申请的所有实施例和列举均旨在解释本发明的主题而不是要限制权利要求书。具体来说，转运模块、导向模块、抗原模块、间隔模块以及标记模块的实例应该被理解为仅仅是举例，而非MAT分子的所有组分的穷举。本发明的基本构思并不是一种由具体的转运模块、具体的导向模块和具体的抗原模块组成的具体的组合。相反，本发明的基本构思是采用一种至少三种模块的组合以产生一种用于免疫的MAT分子。因此，各个模块所具体使用的实例对于本发明的构思而言是不重要的，因此也可将其他的实例，包括那些现在还不知道的实例，用作本发明的相应的模块。

如果本申请中的某一术语没有被清楚地定义，或不是具体领域的本领域人员已知的，或某一术语无法在上下文中找到清楚的定义，那么以下标准著作中所提到的对相应的术语的解释可适用于上述情况。如果某一术语在以下列出的一部以上的著作中具有不同的定义，那么下列提及第一部著作的定义可适用于上述情况。为此，引用了以下出版物：

·The Merck Mannual[49]

·Molecular Cloning-A Laboratory Manual[43]

·Current Protocols in Immunology[44]

·Current Protocols in Protein Science[50]

·Current Protocols in Pharmacology[51]

·Current Protocols in Cell Biology[52]

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                       序列表

□

□

<110>拜尔维申股份公司

□

□

<120>用于调变免疫反应的模块化抗原转运蛋白分子(MAT分子)和相关的构建体、方法和用途

□

□

<130>MAT

□

□

<150>EP02022774.0

□

<151>2002-10-11

□

□

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>870

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus + Homo sapiens + Aspergillus fumigatus

<400>1

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc    60

cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg    120

cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac    180

acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc    240

ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg    300

gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc    360

accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc    420

gcgacctgga catgcatcaa ccaacagctg aatcccaaga caaacaaatg ggaagacaag    480

cggcttctat acagtcaagc caaagccgaa agcaactccc accacgcacc tctttccgac    540

ggcaagaccg gtagcagcta cccgcactgg ttcactaacg gctacgacgg gaatggcaag    600

ctcatcaagg gtcgcacgcc catcaaattc ggaaaagccg actgtgaccg tcccccgaag    660

cgcagccaga acggcatggg caaggatgac cactacctgc tggagttccc gacttttcca    720

gatggccacg actataagtt tgactcgaag aaacccaagg aagacccggg cccagcgagg    780

gtcatctata cttatcccaa caaggtgttt tgcggcattg tggcccatca gcgggggaat    840

cagggagact tgagactgtg ttctcattag                                     870

<210>2

<211>289

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus

<400>2

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp

            20                  25                  30

Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly

        35                  40                  45

Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser

    50                  55                  60

Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln

                85                  90                  95

Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys

            10                  105                 110

Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

        115                 120                 125

Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Ala Thr Trp Thr

    130                 135                 140

Cys Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys Trp Glu Asp Lys

145                 150                 155                 160

Arg Leu Leu Tyr Ser Gln Ala Lys Ala Glu Ser Asn Ser His His Ala

                165                  170                  175

Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr

            180                  185                  190

Asn Gly Tyr Asp Gly Asn Gly Lys Leu Ile Lys Gly Arg Thr Pro Ile

        195                 200                 205

Lys Phe Gly Lys Ala Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys Arg Ser Gln Asn

    210                 215                 220

Gly Met Gly Lys Asp Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro

225                 230                 235                 240

Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asp Pro

                245                 250                 255

Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly

            260                 265                 270

Ile Val Ala His Gln Arg Gly Asn Gln Gly Asp Leu Arg Leu Cys Ser

        275                 280                 285

His

<210>3

<211>1044

<212>DNA

<213>Human immunodeiiciency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus

<400>3

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc     60

cagcgtcgcc gcggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg     120

cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac     180

acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc     240

ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg     300

gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc     360

accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatct     420

caatacacgc tcccacccct cccctacccc tacgatgccc tccaacccta catctcccaa     480

cagatcatgg agctgcacca caaaaagcac catcaaacct acgtcaatgg cctgaatgcc     540

gcactcgagg cgcagaagaa agcggcggaa gccaccgacg tccccaagct cgtctccgtg     600

cagcaagcga tcaaattcaa cggcgggggg cacatcaacc attccctctt ctggaagaat     660

ctggccccgg agaaatccgg gggtggcaag atcgatcagg caccggtcct caaagcagcc     720

atcgagcagc gttggggatc cttcgataag ttcaaggatg ctttcaacac gaccctgctg     780

ggcattcagg gcagcggatg gggttggtta gtgaccgacg gacccaaggg aaagctagac     840

attaccacaa cccacgacca ggatccggtg accggggcgg cccccgtctt tggggtggat     900

atgtgggagc atgcttacta ccttcagtac ttgaacgaca aagcctcgta tgccaagggc     960

atctggaacg tgatcaactg ggctgaagcg gagaatcggt acatagcggg tgacaagggt     1020

ggacacccat tcatgaagct gtag                                            1044

<210>4

<211>347

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Aspergillus fumigatus

<400>4

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp

            20                      25                      30

Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly

        35                      40                      45

Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser

    50                  55                   60

Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln

                85                  90                  95

Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys

            100                 105                 110

Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

        115                 120                 125

Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Gln Tyr Thr Leu

    130                 135                 140

Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala Leu Gln Pro Tyr Ile Ser Gln

145                 150                 155                 160

Gln Ile Met Glu Leu His His Lys Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn

                165                 170                 175

Gly Leu Asn Ala Ala Leu Glu Ala Gln Lys Lys Ala Ala Glu Ala Thr

            180                 185                 190

Asp Val Pro Lys Leu Val Ser Val Gln Gln Ala Ile Lys Fhe Asn Gly

        195                 200                 205

Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Glu

    210                 215                 220

Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ile Asp Gln Ala Pro Val Leu Lys Ala Ala

225                 230                 235                 240

Ile Glu Gln Arg Trp Gly Ser Phe Asp Lys Phe Lys Asp Ala Phe Asn

                245                 250                 255

Thr Thr Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Val Thr

            260                 265                 270

Asp Gly Pro Lys Gly Lys Leu Asp Ile Thr Thr Thr His Asp Gln Asp

        275                 280                 285

Pro Val Thr Gly Ala Ala Pro Val Phe Gly Val Asp Met Trp Glu His

    290                 295                 300

Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Asp Lys Ala Ser Tyr Ala Lys Gly

305                 310                 315                 320

Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu Ala Glu Asc Arg Tyr Ile Ala

                325                 330                 335

Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met Lys Leu

            340                 345

<210>5

<211>903

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Betula verrucosa

<400>5

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggbcgtaa aaagcgtcgc    60

cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg    120

cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac    180

acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc    240

ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg    300

gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc    360

accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc    420

atgggtgttt tcaactacga aaccgaaacc acctccgtta tcccggctgc tcgtctgttc    480

aaggccttca tcctggacgg tgacaacctg ttccctaagg ttgctccgca ggctatctcc    540

tccgttgaaa acatcgaagg taacggtggc ccgggtacca tcaagaaaat ctccttcccg    600

gaaggtttcc catttaaata cgtaaaagac cgtgttgacg aagttgacca caccaacttc    660

aaatacaact actccgttat cgaaggtggt ccaattggtg acaccctgga aaaaatctcc    720

aacgaaatca aaatcgtggc aaccccggac ggtggttcca tccttaagat ctccaacaaa    780

taccacacca aaggtgacca cgaagttaaa gctgaacagg ttaaagcttc gaaagaaatg    840

ggtgaaaccc tgctgcgtgc tgttgaatcc tacctgctgg ctcactccga tgcatacaac    900

taa                                                                  903

<210>6

<211>300

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Betula verrucosa

<400>6

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp

            20                  25                  30

Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly

        35                  40                  45

Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser

    50                  55                  60

Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Tnr Ser Gln

                85                  90                  95

Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys

            100                 105                 110

Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

        115                 120                 125

Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Ser Met Gly Val Phe

    130                 135                 140

Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala Arg Leu Phe

145                 150                 155                 160

Lys Ala Phe Tle Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro

                165                 170                 175

Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly

            180                 185                 190

Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe Lys Tyr Val

        195                 200                 205

Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr

    210                 215                 220

Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser

225                 230                 235                 240

Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser Ile Leu Ly5

                245                 250                 255

Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val Lys Ala Glu

            260                 265                 270

Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu Arg Ala Val

        275                 280                 285

Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn

    290                 295                 300

<210>7

<211>1089

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus+Homo sapiens+Dermatophagoidespteronyssinus

<400>7

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc     60

cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg     120

cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac     180

acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc     240

ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg     300

gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcacggcc     360

accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtggatcc     420

actaacgcat gtagtatcaa tggaaatgct ccagctgaaa tcgatttgcg acaaatgcga     480

actgtcactc ccattcgtat gcaaggaggc tgtggttcat gttgggcttt ctctggtggt     540

gccgcaactg aatcagctta tttggctcac cgtaatcaat cattggatct tgctgaacaa     600

gaattagtcg attgtgcttc ccaacacggt tgtcatggtg ataccattcc acgtggtatt     660

gaatacatcc aacataatgg tgtcgtccaa gaaagctact atcgatacgt tgcacgagaa     720

caatcatgcc gacgaccaaa tgcacaacgt ttcggtatct caaactattg ccaaatttac     780

ccaccaaatg caaacaaaat tcgtgaagct ttggctcaaa cccacagcgc tattgccgtc     840

attattggca tcaaagattt agacgcattc cgtcattatg atggccgaac aatcattcaa     900

cgcgataatg gttaccaacc aaactatcac gctgtcaaca ttgttggtta cagtaacgca     960

caaggtgtcg attattggat cgtacgaaac agttgggata ccaattgggg tgataatggt     1020

tacggttatt ttgctgccaa catcgatttg atgatgattg aagaatatcc atatgttgtc     1080

attctctaa                                                             1089

<210>8

<211>362

<212>PRT

<213>Human immunodeficieney virus+Homo sapiens+Dermatophagoidespteronyssinus

<400>8

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp

            20                  25                  30

Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly

        35                  40                  45

Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser

    50                  55                  60

Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln

                85                  90                  95

Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Lys

            100                 105                 110

Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

        115                 120                 125

Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Gly Set Thr Asn Ala Cys

    130                 135                 140

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg

145                 150                 155                 160

Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala

                165                 170                 175

Phe Ser Gly Gly Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala His Arg Asn

            180                 185                 190

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln

        195                 200                 205

His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

    210                 215                 220

His Asr Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu

225                 230                 235                 240

Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr

                245                 250                 255

Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala

            260                 265                 270

Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile Lys Asp Leu Asp

        275                 280                 285

Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly

    290                 295                 300

Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala

 305                310                 315                 320

Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp

                325                 330                 335

Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met

            340                 345                 350

Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu

        355                 360

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>Human immunodeficiency virus

<400>9

ggttacggtc gtaaaaagcg tcgccagcgt cgccgcgga                           39

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>Human immunodeficiency virus

<400>10

Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly

1               5                   10

<210>11

<211>429

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatctggtt acggtcgtaa aaagcgtcgc     60

cagcgtcgcc gtggatctat ggatgaccag cacgacctta tctccaacaa tgagcaactg     120

cccatgctgg gccggcgccc tggggccccg gagagcaagt gcagccgcgg agccctgtac     180

acaggctttt ccatcctggt gactctgctc ctcgctggcc aggccaccac cgcctacttc     240

ctgtaccagc agcagggccg gctggacaaa ctgacagtca cctcccagaa cttgcagctg     300

gagaacctgc gcatgaaact tcccaagcct cccaagcctg tgagcaagat gcgcatggcc     360

accccgctgc tgatgcaggc gctgcccatg ggagccctgc cccaggggac tagtctgcag    420

aagcttaat                                                            429

<210>12

<211>143

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>12

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gly Tyr Gly Arg

1               5                   10                  15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ser Met Asp Asp Gln His Asp

            20                  25                  30

Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met Leu Gly Arg Arg Pro Gly

        35                  40                  45

Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser

    50                  55                  60

Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr Ser Gln

                85                  90                  95

Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Pro Pro Ly5

            100                 105                 110

Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala Leu

        115                 120                 125

Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Thr Ser Leu Gln Lys Leu Asn

    130                 135                 140

<210>13

<211>450

<212>DNA

<213>Aspergillius fumigatus

<400>13

gcgacctgga catgcatcaa ccaacagctg aatcccaaga caaacaaatg ggaagacaag    60

cggcttctat acagtcaagc caaagccgaa agcaactccc accacgcacc tctttccgac    120

ggcaagaccg gtagcagcta cccgcactgg ttcactaacg gctacgacgg gaatggcaag    180

ctcatcaagg gtcgcacgcc catcaaattc ggaaaagccg actgtgaccg tcccccgaag    240

cacagccaga acggcatggg caaggatgac cactacctgc tggagttccc gacttttcca    300

gatggccacg actataagtt tgactcgaag aaacccaagg aagacccggg cccagcgagg    360

gtcatctata cttatcccaa caaggtgttt tgcggcattg tggcccatca gcgggggaat    420

cagggagact tgagactgtg ttctcattag                                     450

<210>14

<211>149

<212>PRT

<213>Aspergillus fumigatus

<400>14

Ala Thr Trp Thr Cys Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys

1               5                   10                  15

Trp Glu Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Ser Gln Ala Lys Ala Glu Ser Asn

            20                  25                  30

Ser His His Ala Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro

        35                  40                  45

His Trp Phe Thr Asn Gly Tyr Asp Gly Asn Gly Lys Leu Ile Lys Gly

    50                  55                  60

Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys Ala Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys

65                  70                  75                  80

His Ser Gln Asn Gly Met Gly Lys Asp Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe

                85                  90                 95

Pro Thr Phe Pro Asp Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro

            100                 105                 110

Lys Glu Asp Pro Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys

        115                 120                 125

Val Phe Cys Gly Ile Val Ala His Gln Arg Gly Asn Gln Gly Asp Leu

    130                 135                 140

Arg Leu Cys Ser His

145

<210>15

<211>633

<212>DNA

<213>Aspergillus fumigatus

<400>15

atgtcacagc aatacacgct cccacccctc ccctacccct acgatgccct ccaaccctac     60

atctcccaac agatcatgga gctgcaccac aaaaagcacc atcaaaccta cgtcaatggc     120

ctgaatgccg cactcgaggc gcagaagaaa gcggcggaag ccaccgacgt ccccaagctc     180

gtctccgtgc agcaagcgat caaattcaac ggcggggggc acatcaacca ttccctcttc     240

tggaagaatc tggccccgga gaaatccggg ggtggcaaga tcgatcaggc accggtcctc     300

aaagcagcca tcgagcagcg ttggggatcc ttcgataagt tcaaggatgc tttcaacacg     360

accctgctgg gcattcaggg cagcggatgg ggttggttag tgaccgacgg acccaaggga     420

aagctagaca ttaccacaac ccacgaccag gatccggtga ccggggcggc ccccgtcttt     480

ggggtggata tgtgggagca tgcttactac cttcagtact tgaacgacaa agcctcgtat     540

gccaagggca tctggaacgt gatcaactgg gctgaagcgg agaatcggta catagcgggt     600

gacaagggtg gacacccatt catgaagctg tag                                  633

<210>16

<211>210

<212>PRT

<213>Aspergillus fumigatus

<400>16

Met Ser Gln Gln Tyr Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala

1               5                   10                  15

Leu Gln Pro Tyr Ile Ser Gln Gln lle Met Glu Leu His His Lys Lys

            20                  25                  30

His His Gln Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn Ala Ala Leu Glu Ala Gln

        35                  40                  45

Lys Lys Ala Ala Glu Ala Thr Asp Val Pro Lys Leu Val Ser Val Gln

    50                  55                  60

Gln Ala Ile Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe

65                  70                  75                  80

Trp Lys Asn Leu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ile Asp Gln

                85                  90                  95

Ala Pro Val Leu Lys Ala Ala Ile Glu Gln Arg Trp Gly Ser Phe Asp

            100                 105                 110

Lys Phe Lys Asp Ala Phe Asn Thr Thr Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser

        115                 120                 125

Gly Trp Gly Trp Leu Val Thr Asp Gly Pro Lys Gly Lys Leu Asp Ile

    130                 135                 140

Thr Thr Thr His Asp Gln Asp Pro Val Thr Gly Ala Ala Pro Val Phe

145                 150                 155                 160

Gly Val Asp Met Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Asp

                155                 170                 175

Lys Ala Ser Tyr Ala Lys Gly Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu

            180                 185                 190

Ala Glu Asn Arg Tyr Ile Ala Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met

        195                 200                 205

Lys Leu

    210

<210>17

<211>519

<212>DNA

<213>Betula verrucosa

<400>17

atgegaggat cgcatcacca tcaccatcac ggatccatgg gtgttttcaa ctacgaaacc    60

gaaaccacct ccgttatccc ggctgctcgt ctgttcaagg ccttcatcct ggacggtgac    120

aacctgttcc ctaaggttgc tccgcaggct atctcctccg ttgaaaacat cgaaggtaac    180

ggtggcccgg gtaccatcaa gaaaatctcc ttcccggaag gtttcccatt taaatacgta    240

aaagaccgtg ttgacgaagt tgaccacacc aacttcaaat acaactactc cgttatcgaa    300

ggtggtccaa ttggtgacac cctggaaaaa atctccaacg aaatcaaaat cgtggcaacc    360

ccggacggtg gttccatcct taagatctcc aacaaatacc acaccaaagg tgaccacgaa    420

gttaaagctg aacaggttaa agcttcgaaa gaaatgggtg aaaccctgct gcgtgctgtt    480

gaatcctacc tgctggctca ctccgatgca tacaactaa                           519

<210>18

<211>172

<212>PRT

<213>Betula verrucosa

<400>18

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Gly Val Phe

1               5                   10                  15

Asn Tyr Glu Thr Glu Thr Thr Ser Val Ile Pro Ala Ala Arg Leu Phe

            20                  25                  30

Lys Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asp Asn Leu Phe Pro Lys Val Ala Pro

        35                  40                  45

Gln Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly

    50                  55                  60

Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Pro Glu Gly Phe Pro Phe Lys Tyr Val

65                  70                  75                  80

Lys Asp Arg Val Asp Glu Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr

                85                  90                  95

Ser Val Ile Glu Gly Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser

            100                 105                 110

Asn Glu Ile Lys Ile Val Ala Thr Pro Asp Gly Gly Ser Ile Leu Lys

        115                 120                 125

Ile Ser Asn Lys Tyr His Thr Lys Gly Asp His Glu Val Lys Ala Glu

    130                  135                  140

Gln Val Lys Ala Ser Lys Glu Met Gly Glu Thr Leu Leu Arg Ala Val

145                 150                 155                 160

Glu Ser Tyr Leu Leu Ala His Ser Asp Ala Tyr Asn

                165                 170

<210>19

<211>1099

<212>DNA

<213>Dermatophagoides pteronyssinus

<400>19

gaattccttt ttttttcttt ctctctctaa aatctaaaat ccatccaaca tgaaaattgt    60

tttggccatc gcctcattgt tggcattgag cgctgtttat gctcgtccat catcgatcaa    120

aacttttgaa gaatacaaaa aagccttcaa caaaagttat gctaccttcg aagatgaaga    180

agctgcccgt aaaaactttt tggaatcagt aaaatatgtt caatcaaatg gaggtgccat    240

caaccatttg tccgatttgt cgttggatga attcaaaaac cgatttttga tgagtgcaga    300

agcttttgaa cacctcaaaa ctcaattcga tttgaatgct gaaactaacg cctgcagtat    360

caatggaaat gctccagctg aaatcgattt gcgacaaatg cgaactgtca ctcccattcg    420

tatgcaagga ggctgtggtt catgttgggc tttctctggt gttgccgcaa ctgaatcagc    480

ttatttggct taccgtaatc aatcattgga tcttgctgaa caagaattag tcgattgtgc    540

ttcccaacac ggttgtcatg gtgataccat tccacgtggt attgaataca tccaacataa    600

tggtgtcgtc caagaaagct actatcgata cgttgcacga gaacaatcat gccgacgacc    660

aaatgcacaa cgtttcggta tctcaaacte ttgccaaatt tacccaccaa atgtaaacaa    720

aattcgtgaa gctttggctc aaacccacag cgctattgcc gtcattattg gcatcaaaga    780

tttagacgca ttccgtcatt atgatggccg aacaatcatt caacgcgata atggttacca    840

accaaactat cacgctgtca acattgttgg ttacagtaac gcacaaggtg tcgattattg    900

gatcgtacga aacagttggg ataccaattg gggtgataat ggttacggtt attttgctgc    960

caacatcgat ttgatgatga ttgaagaata tccatatgtt gtcattctct aaacaaaaag    1020

acaatttctt atatgattgt cactaattta tttaaaatca aaatttttag aaaatgaata    1080

aattcattca caaaaatta                                                 1099

<210>20

<211>320

<212>PRT

<213>Dermatophagoides pteronyssinus

<400>20

Met Lys Ile Val Leu Ala Ile Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ala Val

1               5                    10                 15

Tyr Ala Arg Pro Ser Ser Ile Lys Thr Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Ala

            20                  25                  30

Phe Asn Lys Ser Tyr Ala Thr Phe Glu Asp Glu Glu Ala Ala Arg Lys

        35                  40                  45

Asn Phe Leu Glu Ser Val Lys Tyr Val Gln Ser Asn Gly Gly Ala Ile

    50                  55                  60

Asn His Leu Ser Asp Leu Ser Leu Asp Glu Phe Lys Asn Arg Phe Leu

65                  70                  75                  80

Met Ser Ala Glu Ala Phe Glu His Leu Lys Thr Gln Phe Asp Leu Asn

                85                  90                  95

Ala Glu Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile

            100                 105                 110

Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly

        115                 120                 125

Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala

    130                 135                 140

Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu

145                 150                 155                 160

Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg

                165                 170                 175

Gly Ile Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr

            180                 185                 190

Arg Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg

        195                 200                 205

Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys

    210                 215                 220

Ile Arg Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile

225                 230                 235                 240

Gly Ile Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile

                245                 250                 255

Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile

            260                 265                 270

Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn

        275                 280                 285

Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala

    290                 295                 300

Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu

305                 310                 315                 320