荧光毛细反应装置及荧光毛细分析法

摘要

本发明公开了一种荧光毛细反应装置及荧光毛细分析法(FCA)。该装置包括固定座、毛细管插入孔、激发光入射窗、荧光发射窗和毛细管；用该装置实施FCA法，将固定座置于荧光仪光路中，再将毛细管吸入被测液后插进固定座顶部的毛细管插入孔内，激发光穿过固定座入射窗照射到毛细管内，被测液受激产生荧光，从固定座发射窗射出，经单色器到达检测器被检出。本发明用荧光毛细反应装置替代常规试液槽，形成FCA法，能显著降低被测液用量，节约贵重试剂，减少排废；毛细管内壁固定不同的化学试剂、酶制剂或DNA探针，能形成专用的毛细生物反应器、荧光毛细测试盒。本发明适用于医药、卫生、工业、食品和环境等样品中各种组分浓度的测定。

说明书

                                技术领域

本发明涉及一种荧光毛细反应装置及荧光毛细分析法(FCA)，属于生化分析和定量技术领域。本发明适用于医学、药物、食品、卫生、工业、农林、环境等微量样品中各种微量组分的荧光分析。

                                背景技术

许多物质当吸收了紫外光和可见光谱区的辐射时，其电子由基态跃迁到激发态，当激发态的电子在返回到基态时，一部分能量以热辐射的形式放出，而另一部分则以光的形式放出，这种光称为荧光。利用荧光对未知样品进行化学分析的方法称为荧光分析法。

荧光分析法选择性好，灵敏度高，比普通的分光光度法高10³倍以上；能够产生荧光的化合物或通过一些化学反应能够间接生成荧光化合物的物质，均可采用荧光分析法进行定性或定量分析。荧光分析法已广泛应用于化学、化工、生物、医药、食品、卫生、农业、轻工、冶金、地质以及环境保护等各个领域。用荧光分析法鉴别和定量有机物、无机物、生物物质、医农药物、污染毒物等的种类和数量与日剧增，是目前一种重要且有效的光谱化学分析手段。

常规的荧光分析法是利用试液槽进行测定。具体测定时，如图1所示，是将被测液(S)移入试液槽(SC)，再将此试液槽(SC)置于荧光仪暗室内(BC)的光路中。由光源(Lamp)发出的光，经激发光单色器(ExMC)后，穿过试液槽(SC)，使被测液(S)的荧光物质受激发产生荧光；与入射光方向垂直的荧光，经过荧光单色器(EmMC)，到达荧光检测器(PMT)被检出；最后，根据荧光强度定量样品浓度。现有技术存在的主要问题是：

a).常规荧光分析法使用的试液槽，每次被测液用量需4mL左右，这样不但浪费大量的贵重试剂，而且实验成本高，废液多，造成排废污染，很难实现微量样品分析。

b).使用试液槽时，激发光通过长吸收液层产生自吸收，常导致长波位移，即在蓝区内所产生的黄色荧光再吸收而引起的荧光作用。

c).由于试液槽的液层厚，发光物质分子间的碰撞机率大，当荧光物质浓度较大时，常产生荧光自猝灭现象。

d).使用试液槽，只能进行液态酶荧光分析，无法实现固定化酶荧光分析。

                            发明内容

本发明的目的是针对常规荧光分析中所存在的缺陷，开发一种荧光毛细反应装置及荧光毛细分析法(FCA)，从而解决了现有技术中所存在的主要问题。

本发明的基本思想是采用荧光毛细反应装置替代常规的试液槽，显著降低了每次被测液用量，能节约大量贵重试剂，实验成本降低；而且废液量排放显著减少；实现微量样品的微量分析；消除了激发光通过常规荧光分析中试液槽的长吸收层所产生的自吸收；毛细管的径向液层很薄，发光物质分子间的碰撞机率降低，即使荧光物质浓度较大时，荧光自猝灭现象也能显著减轻；毛细管垂直于光路中，在激发光斑的几何尺寸范围内，在毛细管纵向上可以尽最大可能增加受光面积，增加被测液的被照射机会，增加荧光产率，增加分析测定的灵敏度；毛细管内壁固定不同用途的各种化学试剂、酶制剂、或DNA探针，能形成各种专用的微型荧光毛细生物反应器、微型荧光生物传感器，或制成各种专用的荧光毛细测试盒。用荧光毛细反应装置替代常规试液槽，形成荧光毛细分析法(FCA)，可用于医药、卫生、工业、食品和环境等样品中的各种组分测定。

本发明的技术方案是由测定原理、荧光毛细反应装置及荧光毛细分析法(FCA)组成。

本发明的测定原理：被测液产生的荧光强度和浓度的关系，可以根据比尔定律推导得出。当一束激发光从一个含有被测液的常规试液槽穿过时，其透射光的强度I可以表达为：

                 I＝I₀e^-εbc                               (1)

式中，ε为摩尔吸光系数；εbc为吸光度；I₀为入射光强度。被吸收的光强度可表示为：

                 I₀-I＝I₀(1-e^-εbc)                        (2)

从理论上讲，被测液发射的荧光强度I_F与吸收掉的激发光强度(I₀-I)、荧光效率、激发光在试液槽光窗上的照射面积p成比例，即

                 I_F＝k(I₀-I)p·＝kpI₀(1-e^-εbc)        (3)

式中k为系数，用于处理不同荧光分析仪器光路的几何形状所产生的系统误差。对公式(3)中的指数项幂级数展开，得下式：

如果样品液浓度很稀，被吸收的总激发光能不超过5％(即εbc≤0.05)时，公式(4)括号内第二项以后可以忽略不计，则公式(4)可简化成：

                   I_F＝kpI₀εbc                           (5)

式中b为液层厚度；c为样品液浓度。在实际测定时，kpI₀εb为一常数，当被测液浓度很稀时，样品液发射的荧光强度I_F和其浓度c成正比。

但是，当样品液浓度c_最大＞0.05/εb时，荧光强度增加不大。从公式(3)中可以看出：当c增大时，e^-εbc变小，荧光强度I_F增大；当样品浓度继续增大，e^-εbc趋近于零，则公式(3)变成了I_F＝kpI₀，说明此时荧光强度与样品液浓度无关。所以样品浓度增大到某一限度后，荧光强度不再增加，甚至降低。这是因为，在较浓溶液中，试液槽前部的溶液强吸收，产生强荧光，后部的溶液不易接受入射光，不产生荧光，综合因素导致荧光强度降低；另外，当样品浓度较大时，试液槽前部的溶液所产生的荧光通过后部溶液时，短波长的荧光被自吸收，也导致荧光强度降低。

根据公式(3)可知，如果样品浓度一定，使用常规的试液槽，其液层厚度b对荧光强度影响很大。当b增大时，e^-εbc变小，当b继续增大，e^-εbc趋近于零，则式3变成I_F＝kpI₀，此时荧光强度与b无关。

从公式(5)可以看出：如果I_F、kpI₀ε一定，b减少可以使样品浓度c相应增大；因此，本发明采用毛细管作为反应容器，毛细管的径向液层厚度b降到试液槽的1/10以下，所以，实现了在灵敏度不变的情况下使测定的线性范围增大的目的。

另外，从公式(5)可以看出：如果kpI₀εbc一定，荧光强度I_F将和激发光照射在试液槽光窗上的面积p成正比，即，p越大，样品产生的荧光强度I_F越大。本发明将毛细管反应器垂直置入光路中，增加受光面积，减少透光距离就是基于此考虑。这样，激发光照射毛细管内物质所产生的荧光可以均匀分布于溶液中，把自吸收、自熄灭因素降到最低。

本发明荧光毛细反应装置：如图2所示，它包括固定座、固定座上的激发光入射窗、荧光发射窗、固定座顶部的毛细管插入孔和毛细管。使用时，用它替代常规荧光分析中的试液槽，将荧光毛细反应装置置于荧光仪光路中。

本发明荧光毛细分析法(FCA)：如图3所示，先将荧光毛细反应装置的固定座置于荧光分析仪的光路中。测定前，先设定好所需的单色激发光和荧光发射光波长之后，利用毛细现象将被测液即被测样品、或被测样品和试剂的混合液吸入到毛细管内，再将含有被测液的毛细管插入固定座的插入孔内。测定时，单色激发光从毛细管固定座的激发光入射窗进入，照射到固定座中的毛细管内；毛细管内的被测液或反应产物被激发光照射后产生特征荧光；此荧光从荧光发射窗射出，经过荧光单色器到达荧光检测器，荧光信号被检出；最后根据荧光强度可定量毛细管内被测样品浓度。

本发明荧光毛细反应装置中各组成部分结构特征如下：

本发明的关键部分是由固定座和毛细管组成的荧光毛细反应装置，两者是缺一不可。固定座是外形高28～40mm、边长12～14mm的立方体，它也可以做成圆柱体、或三角形柱体。固定座所用的材质为金属、或非金属；固定座的激发光入射窗和荧光发射窗分别设置在其相邻的两个侧面；激发光入射窗和荧光发射窗的开口长为15～20mm、宽0.50～1.0mm；两个光窗可以避免杂散光、折射光进入测定光路中。

毛细管插入孔设置在固定座顶部的中心位置，它可以为圆孔、或矩形孔，其尺寸以毛细管能插入并与毛细管尺寸相吻合，毛细管垂直置于毛细管插入孔，使毛细管与光路保持垂直。

毛细管的作用，既是被测液容器，又是微型反应容器；毛细管所用材质为石英玻璃、光学玻璃、或透明塑料。毛细管的长度为30～50mm，内径为0.14～0.90mm，外径为0.55～1.20mm，壁厚为0.10～0.25mm；毛细管可以是圆孔、或矩形孔；毛细管是矩形孔时，其边长为0.25～0.45mm，壁厚为0.10～0.25mm。

毛细管内壁固定不同用途的各种化学试剂、酶制剂、或DNA探针，可以形成各种专用的微型荧光毛细生物反应器、微型荧光生物传感器，以及制成各种专用的荧光毛细测试盒。

荧光毛细反应装置作为一个附件可直接用于目前已商品化的各种荧光分析仪，实施FCA法和相关的测定及研究。

本发明荧光毛细分析法(FCA)的特征如下：

本发明采用荧光毛细反应装置替代常规荧光分析中的试液槽，将荧光毛细反应装置置于荧光分析仪暗室内的光路中，设定好所需的单色激发光和荧光发射光波长，利用毛细现象将被测样品、或被测样品与试剂的混合液吸入毛细管内，再将此毛细管垂直插入固定座顶部的插入孔内，来源于光源的单色激发光进入固定座侧面的入射窗，照射到固定座中的毛细管内，毛细管内的被测样品或反应产物被激发光照射后产生特征荧光；该特征荧光从固定座另一侧面的发射窗射出，经过荧光单色器到达荧光分析仪的检测器，荧光信号被检出；最后，根据检测出的荧光强度即可定量被测样品浓度。

常规荧光法的各种方法，如直接测定法、化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法、时间分辨荧光分析法等，能形成直接测定FCA法、化学转化FCA法、荧光猝灭FCA法、敏化发光FCA法、时间分辨荧光FCA法等。

基于FCA法，可派生出传统荧光法中所没有的新方法，如固定化酶FCA法(IEFCA)等。

本发明的优点和积极效果是：用荧光毛细反应装置替代常规的荧光试液槽，形成了一种新的、具有很大潜力的化学分析领域。它可以完全继承常规荧光法中的各种测定方法，如直接测定法、化学转化法、荧光猝灭法、敏化发光法、时间分辨荧光分析法等；还能派生出传统荧光法中所没有的固定化酶FCA法(IEFCA)等。

a)使用本发明荧光毛细反应装置，每次分析的被测液用量是常规荧光分析法的1/400，这样不但节约了大量的贵重试剂，降低实验成本，真正实现了微量样品的微量分析，而且大大减少了排废污染，在环保方面有着非常重要的意义。

b)本发明采用毛细管，可以消除常规荧光分析中激发光通过试液槽的长吸收液层时所产生的自吸收现象。

c)本发明毛细管内的径向液层厚度b很薄，使发光物质分子间的碰撞机率降到使用试液槽时的1/10；所以，使用本发明毛细管时即使荧光物质浓度较大，荧光自猝灭现象也能得到消除。

d)本发明采用毛细反应装置替代常规荧光分析法的试液槽后，可以用于不透明试样、浑浊溶液、浓溶液的测定。

e)本发明荧光毛细反应装置可作为一个附件，直接用于目前已商品化的各种荧光光度分析仪。

f)本发明毛细管的内壁还可以固定不同用途的各种化学试剂或酶制剂，形成各种专用的微型荧光毛细反应器、或微型生物传感器，在此基础上制成各种用途的专用荧光毛细测试盒，使荧光分析法真正进入实用化、普及化阶段。

g)本发明派生的固定化酶FCA法，特别适用于试剂昂贵、样品量少、浓度低的样品测定；固定有酶或试剂的毛细管，即毛细生物反应器可以重复使用，用于批量样品的测定；这样不但使测定成本显著降低，而且便于携带、保存，利于普及推广，使酶荧光分析法真正进入实用化阶段。

本发明可用于医学、药物、生物、食品、卫生、工业、农林、环境等样品中各种组分含量的测定，产生巨大的经济效益和社会效益。

                           附图说明

图1常规荧光分析法系统示意图

图中S被测液、Lamp光源、ExMC激发光单色器、SC被测液槽、EmMC荧光单色器、PMT荧光检测器、BC暗室。

图2本发明荧光毛细反应装置结构示意图

图中S被测液、1激发光、2入射窗、3荧光、4发射窗、5固定座、6插入孔、7毛细管。

图3本发明荧光毛细分析法(FCA)系统示意图

图中S被测液、1激发光、2入射窗、3荧光、4发射窗、5固定座、6插入孔、7毛细管、Lamp光源、ExMC激发光单色器、SC被测液槽、EmMC荧光单色器、PMT荧光检测器、BC暗室。

图4实施例1用FCA法测定核黄素浓度得到的标准曲线图

图5实施例2用FCA法测定NADH浓度得到的标准曲线图

图6实施例3用FCA法测定乙醇浓度得到的标准曲线图

图7实施例4用FCA法测定EB浓度得到的标准曲线图

                            实施例

结合附图并用实施例对本发明作进一步描述：

实施例1

利用本发明对核黄素(VB₂)标准溶液(S)浓度进行了测定。测定条件：激发光波长500nm，发射光波长550nm，室温20℃，样品用量10μL。测定时，将荧光毛细反应装置的固定座(5)置于荧光分析仪的光路中；用毛细管(7)分别吸入浓度为0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50μg/L的VB₂标准溶液之后，将毛细管(7)分别插入固定座(5)顶部的插入孔(6)内，测定其荧光强度，结果如图4所示。VB₂浓度与荧光强度在0.10-2.50μg/L的浓度范围内有良好的线性相关性。

实施例2

本实施例是用本发明测定了还原型辅酶I(NADH)浓度。测定条件：激发光波长352nm，发射光波长456nm，室温20℃，样品用量为10μL。测定时，将荧光毛细反应装置的固定座(5)置于荧光分析仪的光路中；用毛细管(7)分别吸入浓度为50、100、150、200、250、350μmol/L的NADH标准溶液之后，将毛细管(7)分别插入固定座(5)顶部的插入孔(6)内，测定其荧光强度，结果如图5所示。NADH浓度与荧光强度在50-350μmol/L的浓度范围内有良好的线性相关性。用氧化型辅酶I、辅酶II(NAD⁺或NADP⁺)作为辅酶的脱氢酶反应，其最终生成物都是还原型辅酶I、辅酶II(NADH或NADPH)。因此，本发明根据NADH或NADPH的生成量或减少量，可以定量所有以NAD(H)⁺或NADP(H)⁺为辅酶的脱氢酶反应底物以及这些脱氢酶的活性。

实施例3

本实施例是基于固定化酶FCA法测定乙醇浓度。测定条件：激发光波长352nm，发射光波长456nm，室温20℃，被测液用量10μL。测定前，将酶固定在毛细管(7)的内壁，制成乙醇毛细生物反应器。测定时，将荧光毛细反应装置的固定座(5)置于荧光分析仪的光路中；用乙醇毛细生物反应器分别吸入浓度为2、4、8、10、15g/L的乙醇标准液和反应试剂的混合液之后，将其分别插入固定座(5)的插入孔(6)内，测定其荧光强度，结果如图6所示。乙醇浓度和荧光强度在2.0-15.0g/L的浓度范围内有良好的线性相关性。由此证明，本发明可派生出传统荧光法中所没有的固定化酶荧光光度分析法。

在本实施例中，同一毛细生物反应器能达到重复使用的目的，显著地降低了测定成本。

实施例4

本实施例是用本发明测定溴化乙啶(EB)浓度。测定条件：激发光波长526.4nm，发射光波长584nm，室温20℃；测定前，将荧光毛细反应装置的固定座(5)置于荧光分析仪的光路中；用毛细管(7)分别吸入浓度为60、200、300、400、500μg/L的EB标准溶液之后，将其分别插入固定座(5)的插入孔(6)内，测定其荧光强度，结果如图7所示。结果表明，EB浓度和荧光强度在60-500μg/L的浓度范围内有良好的线性相关性。EB对双链DNA的选择性远大于单链DNA，常作为双链DNA的嵌入型荧光染料，因此，本发明也可用于被EB标记物(DNA及细胞)的定量、定性测定。