多核苷酸微阵列和使用该微阵列检测靶多核苷酸的方法

摘要

本发明涉及一种多核苷酸微阵列，包括两组或多组可将探针多核苷酸固定在其上的点，其中所述每组探针多核苷酸具有落在探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm的预定范围内的解链温度(Tm)。本发明还提供了使用多核苷酸微阵列检测靶多核苷酸的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多核苷酸微阵列(polynucleotide microarray)和使用该微阵列检测靶多核苷酸的方法，所述微阵列包括根据解链温度(Tm)而被固定的多核苷酸。

背景技术

微阵列是为相关技术领域人员所熟悉的。微阵列的实例在美国专利5,744,934和5,744,305中描述。利用光蚀刻技术(photolithography)制作(fabricate)微阵列的方法是已知的。根据一种利用光蚀刻技术制作多核苷酸微阵列的方法，用具有可去除的保护基的单体包被基质(substrate)的预定区域，并将所述区域暴露于能量源以去除所述保护基。然后，去保护的单体和具有可去除的保护基的单体偶联。重复上述过程可产生多核苷酸微阵列。在这样的情形下，将要被固定在多核苷酸微阵列上的多核苷酸可通过持续延伸多核苷酸单体来制备。可选地，可以将事先合成的多核苷酸固定于多核苷酸微阵列的预定区(也称为“定点技术(spottingtechnique)”)。这种制作多核苷酸微阵列的方法也在美国专利5,744,305，5,143,854和5,424,186中举例说明。上述有关多核苷酸微阵列及其制作方法的专利文件的全文内容包含在本文中作为参考。

然而，探针多核苷酸随机固定在这些传统的多核苷酸微阵列上。此外，单个微阵列使用覆盖层(cover)覆盖，该覆盖层具有单一杂交溶液的入口和出口，并由此进行单一杂交反应。因此，传统的微阵列技术不能指示探针多核苷酸可根据Tm进行固定，也不能指示包含多个区(aplurality of blocks)的多核苷酸微阵列。

已知多种检测靶多核苷酸的方法。通常根据这些方法，靶多核苷酸用可检测的标记物标记，然后和探针多核苷酸在多核苷酸微阵列上杂交。杂交完成后，分析杂交结果。例如美国专利5,871,928公开了检测靶多核苷酸和探针多核苷酸的杂交的方法，包括：(a)将标记物连接到靶多核苷酸；(b)在杂交条件下使标记的靶多核苷酸和固定在基质的已知区上的探针多核苷酸集合(collection)接触；和(c)测定与靶多核苷酸杂交的探针多核苷酸的序列，所述集合包括至少100探针/cm²。

根据上述方法，使用固定在微阵列上的探针多核苷酸集合。然而，它们没有涉及使用固定的探针多核苷酸区的方法，所述区是根据探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm分组的。

发明内容

本发明提供了多核苷酸微阵列，它包括固定在基质上的探针多核苷酸，其中所述探针多核苷酸根据这些探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的解链温度(Tm)分组。

本发明还提供了使用所述多核苷酸阵列检测靶多核苷酸的方法，其中杂交是根据探针多核苷酸的区使用不同的杂交溶液进行的。

本发明一方面提供了一种多核苷酸微阵列，它包括两组或多组点(spot)，这些点上固定了探针多核苷酸，其中每组的探针多核苷酸具有落在探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm的预定范围内的Tm。

本发明另一方面提供了检测靶多核苷酸的方法，包括将含有靶多核苷酸的样品点样(spotting)到探针多核苷酸上，所述探针多核苷酸固定在多核苷酸微阵列的各组点(the groups of the spots)上，然后进行杂交，其中至少一组点经杂交溶液处理(所述杂交溶液包括变性剂，稳定剂或其混合物)，使得固定于各组点上的探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm偏差在预定的范围内。

附图说明

本发明的上述和其它特征和优点通过示例性实施例的详细描述并参考附图会更明显，：

图1显示了根据本发明包含两个区(block)的一种多核苷酸微阵列的实例。

发明详述

本发明提供了一种多核苷酸微阵列，它包括两组或多组点(下文也称“区”)，其上固定了探针多核苷酸，其中每组探针多核苷酸具有落在探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm的预定范围内的解链温度(Tm)。

本文术语“多核苷酸微阵列”指一种分析系统，其中多核苷酸组以高密度固定于基质上。本文术语“点(spot)”指微阵列上的区域，在这样的区域中相同的多核苷酸被固定于基质上。

在本发明的多核苷酸微阵列中例如首先选出靶多核苷酸。计算靶多核苷酸和用于探测它们的探针多核苷酸之间的Tm。根据由此获得的Tm，对探针多核苷酸进行分组。例如，当特定靶多核苷酸和探针多核苷酸之间的Tm在30-60℃的范围，所述探针多核苷酸可根据Tm分成三组，即30-40℃，40-50，和50-60℃。根据上述在固体基质上合成多核苷酸的传统方法，将每组的探针多核苷酸固定在相同的区域。固定在相同区域的各组探针多核苷酸可用覆盖物(cover)覆盖，所述覆盖物具有相应杂交溶液的入口和出口，以便将各组探针多核苷酸单独暴露于相应的杂交溶液。结果固定每组探针多核苷酸的区域形成了独立暴露于相应杂交溶液的隔室(compartment)。本发明中固定于相同区的各组探针多核苷酸之间Tm的差异没有具体的限制，但优选为10℃或更低，且更优选5℃或更低。

本文术语“解链温度(Tm)”指50％的双链多核苷酸在变性条件下分解成单链或50％的单链多核苷酸在杂交条件下杂交的温度。所述Tm随使用的溶液，碱基组成，和多核苷酸序列的长度，以及变性剂和稳定剂的浓度而不同。Tm可通过实验确定，或使用相关公式根据影响Tm的参数计算。例如，Tm可通过以下公式算出：

Tm＝81.5+16.6×log₁₀M+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/长度(bp)

其中M是Na⁺的摩尔浓度(mM)，％甲酰胺是甲酰胺的％(v/v)(见Meinkoth，J.和Wahl，G；(1984)Anal.Biochem.138，269)。

计算Tm的公式，例如上述公式，可以根据反应溶液中含有的变性剂或稳定剂来选用。本领域熟练技术人员可轻易获得计算Tm的这些公式。

当由此制作的多核苷酸微阵列用于检测靶多核苷酸的方法中时，可以提高该方法的敏感性和迅速性(rapidity)。例如在检测靶多核苷酸时，当固定在本发明的多核苷酸微阵列上的各组探针多核苷酸采用的杂交溶液中含有不同浓度的变性剂时，可以调整具有高Tm的探针多核苷酸组的Tm，使之接近具有最低Tm的探针多核苷酸组的Tm。因此，更多能在同一温度下杂交的探针多核苷酸可固定在单一的微阵列上。结果，可在单一微阵列上检测更多的靶多核苷酸。此外，使用单一微阵列可提高检测速率。

本发明还提供了检测靶多核苷酸的方法，它包括将含有靶多核苷酸的样品点到固定在本发明多核苷酸微阵列各组点上的探针多核苷酸上，然后进行杂交，其中至少一组点经杂交溶液处理(所述杂交溶液包括变性剂，稳定剂或其混合物)，使得固定于各组点上的探针多核苷酸和靶多核苷酸之间的Tm的偏差在预定的范围内。优选，所述偏差在0-5℃的范围内，更优选在0-3℃的范围内。

本发明的方法还还包括使用荧光来检测杂交结果。在这种情形下，靶多核苷酸可由多种可检测标记物标记。例如，标记物可以是放射活性物质，荧光物质，酶，或配体。优选，靶多核苷酸用荧光物质标记。

本文所用变性剂是一种使得双链多核苷酸不稳定的物质，但没有具体限制。优选，所述变性剂是具有自由电子(free electron)的化合物，它能灭活多核苷酸碱基之间的氢键。例如，所述变性剂选自甲酰胺，尿素，氯化胍(guanidine chloride)，二甲基甲酰胺(DMF)，及其混合物。本文的稳定剂是稳定双链多核苷酸的化合物，且没有具体限制。由于多核苷酸通常是带负电的，已知带正电的化合物可稳定双链多核苷酸。优选，所述稳定剂是含有阳离子如Na⁺，K⁺，Ca²⁺和Mg²⁺的金属盐。

本发明中变性剂和稳定剂的浓度可通过实验按经验确定，或可选地通过上述Tm公式来计算。

本发明中杂交的温度可根据所需的特异性和敏感性变化。可在比Tm低20-25℃的温度进行杂交，但不限于此。

以下将更具体的通过实施例描述本发明。然而，以下实施例只作为举例而不是限制。

实施例

实施例1：制作具有根据Tm分组的点的多核苷酸微阵列

在本实施例中，靶多核苷酸采用启动子和野生型HNF-1α(肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1-α))基因的外显子1-10，所述基因与年轻人的成人发病型糖尿病(MODY3)相关。10种靶多核苷酸的多重PCR(multiple PCR)使用10对引物(SEQ ID NOS：1-20)(每种引物10pmol)和来自人血液的gDNA(0.2μg)作为模板(见表1)进行。在以下条件中进行多重PCR：95℃起始变性5分钟；然后以95℃变性30秒，64℃退火10秒，和72℃延伸30秒的条件共进行30个循环；并且在72℃最后延伸3分钟。在PCR中，加入Cy3-dUTP(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)来制备使用荧光染料标记的靶多核苷酸。

                            表1：源自HNF-1α基因的靶多核苷酸的扩增中使用的引物

  引物 SEQ ID NO  引物 SEQ ID NO  启动子-正向 1  外显子5-正向 11  启动子-反向 2  外显子5-反向 12  外显子1-正向 3  外显子6-正向 13  外显子1-反向 4  外显子6-反向 14  外显子2-正向 5  外显子7-正向 15  外显子2-反向 6  外显子7-反向 16  外显子3-正向 7  外显子8，9-正向 17  外显子3-反向 8  外显子8，9-反向 18  外显子4-正向 9  外显子10-正向 19  外显子4-反向 10  外显子10-反向 20

设计了与这些靶核苷酸完全相配或错配的探针多核苷酸。这些探针多核苷酸的特性总结在下表2中。如表2中所述，这些探针多核苷酸被分成两组，即Tm为52.8-56.9℃的一组探针多核苷酸和Tm为69.4-77.8℃的一组探针多核苷酸，且这两组分别固定在区1(block1)和2(block2)(见图1)。

                 表2探针多核苷酸的序列和特性

  区  靶位点  完全配对的探针(WP)  错配的探针(MP)  Tm(℃)  1  外显子1  SEQ ID NO：21  SEQ ID NO：22  55.51  1  外显子2  SEQ ID NO：23  SEQ ID NO：24  54.3  1  外显子7  SEQ ID NO：25  SEQ ID NO：26  52.8  1  外显子9  SEQ ID NO：27  SEQ ID NO：28  56.9  1  外显子10  SEQ ID NO：29  SEQ ID NO：30  53.4  2  外显子1  SEQ ID NO：31  SEQ ID NO：32  77.8  2  外显子2  SEQ ID NO：33  SEQ ID NO：34  71.2  2  外显子4  SEQ ID NO：35  SEQ ID NO：36  71.0  2  外显子4  SEQ ID NO：37  SEQ ID NO：38  69.4  2  外显子9  SEQ ID NO：39  SEQ ID NO：40  75.7

表2所示的Tm值是通过使用PERL语言和Santa Lucia 98参数执行的一种程序(Samsung，Korea)来计算的。本领域普通技术人员可轻易获得这些参数。

通过定点技术(spotting technique)使用放射状聚乙二醇衍生物(radialpolyethyleneglycol derivative)(水凝胶(hydrogel))制作根据本发明的多核苷酸微阵列。所述举例性多核苷酸微阵列制作法如下。

1合成具有环氧基(epoxy group)的放射状聚乙二醇衍生物

3-氯-1，2-环氧丙烷(Epichlorohydrin)(7.5mL)和溴化四丁基铵(tetrabutylammonium bromide)(0.32g)加入NaOH水溶液(50wt％，2mL)中并搅匀。然后，将乙氧基季戊四醇(pentaerythritol ethoxylate)(1g)逐渐加入上述溶液中，并在室温搅拌18小时。通过薄层色谱(TLC)确定反应终点。当反应不彻底时，进一步在60℃搅拌反应溶液1小时。所得溶液用水(30mL)稀释，并使用二氯甲烷(40mL)萃取3次以获得有机层。使用饱和NaHCO₃(40mL)将有机层洗三次，并加入无水MgSO₄，然后进行干燥并在低压除去溶剂。随后，真空干燥两天，以去除3-氯-1，2-环氧丙烷残余物。结果获得含有环氧基的放射状聚乙二醇衍生物，用H-NMR鉴定，然后使用0.1N HBr/乙酸(冰(glacial))滴定环氧基。

2.合成二胺交联剂

戊(1，2-亚乙基二醇)二-甲苯磺酸酯(penta(ethyleneglycol)di-tosylate)(5g，9.2mmol)溶于二甲基甲酰胺(DMF)(40mL)。将NaN₃(4.2g，64.1mmol)和吡啶(0.5mL)序贯加入上述溶液中，140℃搅拌18小时。低压去除反应液中的溶剂，加入水(200mL)并同时搅拌。反应溶液使用二氯甲烷(40mL)萃取3次以便获得有机层。有机层用盐水(brine)(100ml)洗三次，并加入无水MgSO₄，然后进行干燥并在低压中除去溶剂，然后经(flash)柱层析(EA∶nHex＝1∶2)，得到二叠氮中间体(diazide intermediate)。将该二叠氮中间体溶于甲醇(30mL)，加入10％Pd-C(0.1当量)，并在氢气环境中还原18小时。使用硅藻土片(Celite pad)从所得溶液中除去催化剂，并使用乙醇清洗该硅藻土片。将所得的滤出液(filtrate)和乙醇洗液混合，然后低压除去溶剂，得到二胺交联剂(diamine crosslinking agent)。

3.使用交联剂制备凝胶基质溶液(gel matrix solution)

将分子量为1,500道尔顿的聚乙二醇(PEG)加入2N NaOH水溶液中，并在冰浴中搅拌，以便制备PEG交联剂溶液。

然后，将第一节中合成的具有环氧基的放射状聚乙二醇衍生物溶于碳酸盐缓冲液(0.1M，pH9.1)。将预先制备好的PEG交联剂溶液逐渐加入上述溶液中，并在室温搅拌3小时。当鉴定出反应终止时，所得溶液使用二氯甲烷萃取，低压除去溶剂后保存在4℃。

4.通过在芯片上点样(spotting)凝胶基质-DNA偶联物溶液来制作多核苷酸微阵列

将预先制备的探针多核苷酸加入第3节中制备的凝胶基质溶液中，使具有环氧基的放射状聚乙二醇，二胺交联剂，和探针多核苷酸的当量比为4∶1∶4，并在37℃温育14小时同时进行搅拌，从而获得基质-DNA偶联物溶液。用所述基质-DNA偶联物溶液作为点样溶液。

玻璃表面经处理具有胺基，将点样溶液点样在该玻璃上，并在37℃的潮湿小室内温育14小时。然后为进行背景对照，即为防止靶多核苷酸附着于玻璃表面，处理该玻璃表面使得玻璃表面未点样处的胺基基团带负电，然后在干燥器中温育。

同时，制作对照多核苷酸微阵列。在对照多核苷酸微阵列中，固定在基质上的探针多核苷酸没有根据Tm分组，使得杂交在相同的杂交条件下进行。

实施例2：靶多核苷酸的杂交和检测

用实施例1中野生型HNF-1α基因的10种区序列的混合物作为靶多核苷酸。

在实施例1所制作的含有两个区的多核苷酸微阵列中，区1(block 1)使用不含甲酰胺的杂交溶液。而区2(block 2)使用含有7.5％甲酰胺的杂交溶液。

经1.8％琼脂糖凝胶电泳后，通过与分子量标记物进行对比来鉴定实施例1获得的多重PCR产物。所述多重PCR产物揭示了所有10个靶基因位点(579，459，365，308，332，241，286，230，414，和171bp)的扩增。使用PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。纯化的DNA与0.5U DNase I(Boehringer Mannheim，Germany)37℃温育10分钟，然后加入终止混合物(stop mix)终止反应。将切割的DNA产物的浓度调节到150-187.5nM，94℃变性5分钟，并在冰上保温2分钟。将冷却的(cooled)DNA溶液和相同量的杂交缓冲液(6×SSPE-0.1％Triton X-100)混合，然后加入到多核苷酸微阵列的杂交室(hybridization chamber)内。32℃温育所述微阵列16小时，并使用洗涤缓冲液I(6×SSPE-Triton X-1000.05％)室温洗5分钟，接着用洗涤缓冲液II(3×SSPE-Triton X-1000.005％)室温洗5分钟。所述微阵列室温干燥15分钟，并进行扫描(试验组)。在扫描中，使用GenePix 4000B型扫描仪(Axon Instruments，American)生成图像，并使用GenePix Pro软件(Axon Instruments，American)进行图像分析。测定532nm的荧光。

在对照实验中，如上所述，所用多核苷酸微阵列中具有固定的探针多核苷酸，并使得杂交在相同的条件中进行，即所用的多核苷酸微阵列未根据Tm分区。使用不含甲酰胺的杂交溶液在32℃(对照1)和40℃(对照2)进行杂交。对照1和2的其他条件相同。

结果显示在下表3中。关于表3中区的描述仅限于试验组。

                                                表3：杂交结果

  区  靶位点              试验组               对照1             对照2  Wp  Mp  比例  Wp  Mp  比例  Wp  Mp  比例  1  1  1  1  1  2  2  2  2  2  外显子1  外显子2  外显子7  外显子9  外显子10  外显子1  外显子2  外显子4  外显子4  外显子9  6712  4934  20021  7178.4  14366  2016.4  3221.8  14269.6  14637  4009  10  11  3524  32  10  1  1  309.4  262.8  1  6.51  6.11  1.74  5.41  7.27  7.61  8.08  3.83  4.02  8.30  5924  3850  18005  6596  14706  2833.2  5087.2  17842.4  14031.8  3321.4  10  10  3348.6  24.8  10  56  365.8  1671.8  874.4  179.8  6.38  5.96  1.68  5.58  7.29  3.92  2.63  2.37  2.78  2.92  2962  1925  9002.5  3298  7353  1416.6  2543.6  8921.2  7015.9  1660.7  4.5  5.9  1512  14  4.8  1  1  281  210  1  6.49  5.79  1.78  5.46  7.33  7.26  7.84  3.46  3.51  7.41

Wp：与靶多核苷酸完全相配的探针多核苷酸

MP：与靶多核苷酸错配的探针多核苷酸

比例：In(Wp/Mp)值

试验组：区1；0％甲酰胺，32℃；区2，7.5％甲酰胺，32℃

对照1：0％甲酰胺，32℃

对照2：0％甲酰胺，40℃

如表3所示，固定在试验微阵列的区1上的探针多核苷酸具有与对照微阵列1相同的条件。因此，荧光强度和In(Wp/Mp)几乎没有差异。与对照微阵列1相比，固定在试验微阵列的区2上的探针多核苷酸的荧光强度略低，但In(Wp/Mp)值显著增加。与对照微阵列2相比，固定在试验微阵列的区2上的探针多核苷酸的荧光强度和In(Wp/Mp)值均增强。即，相同温度条件下，使用具有两个固定在基质上的多核苷酸区的微阵列进行的杂交可获得与使用两个微阵列相同的结果。

在单一温度中进行具有较宽范围的Tm分布的探针多核苷酸的杂交时，必须用的杂交温度是：具有低Tm的探针组和具有高Tm的探针组中的之一或两组的最佳杂交温度。如本实施例所述，根据本发明，将变性剂或稳定剂加入杂交溶液，能使得在单一微阵列和单一温度中进行杂交。

从上述内容明显可见，本发明的多核苷酸微阵列包括固定的探针多核苷酸，其中根据Tm将所述多核苷酸分区。因此，使用单一微阵列可检测的靶多核苷酸数量以及检测的速率可提高，由此降低检测成本。

此外，本发明的多核苷酸微阵列还提高检测靶多核苷酸的敏感性和迅速性。

根据本发明检测靶多核苷酸的方法，可在高敏感度下迅速检测所述靶多核苷酸。

尽管本发明具体显示并根据示例性实施方式描述，本领域熟练技术人员应理解可进行各种形式和细节变化，而不偏离以下权利要求所定义的本发明的精神和范畴。

                              <序列表>

<110>三星电子株式会社(Samsung Electronis Co.Ltd.)

<120>多核苷酸微阵列和使用该微阵列检测靶多核苷酸的方法

<130>PN051215

<160>40

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>引物

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taatacgact cactataggg tggccgtgag catcctctgc c                         41

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<220>

<223>引物

<400>17

taatacgact cactataggg ggcccagtac acccacacgg g                          41

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

gtaaccctca ctaaagggag ggcagggaca gtaagggagg                            40

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

taatacgact cactataggg gccttgtttg cctctgcagt g                          41

<210>20

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>20

gtaaccctca ctaaagggag gccatctggg tggagatgaa g                          41

<210>21

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>21

gggagtcctg c                                                           11

<210>22

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>22

ggaagtcctg c                                                           11

<210>23

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>23

ccaacacctc aa                                                          12

<210>24

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>24

ccaacgcctc aa                                                          12

<210>25

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>25

acccagaacc cc                                                          12

<210>26

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>26

acccagagcc cc                                                          12

<210>27

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>27

ctgccggcat cc                                                          12

<210>28

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>28

ctgccagcat cc                                                          12

<210>29

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>29

gagatgaagg tctc                                                        14

<210>30

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>30

gagatgaaga tctc                                                        14

<210>31

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>31

tggtgggccg cctc                                                        14

<210>32

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>32

tggtggagcg cctc                                                        14

<210>33

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>33

cgggccgccc tg                                                          12

<210>34

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>34

cgggccaccc tg                                                          12

<210>35

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>35

caaccggcgc aaagaa                                                      16

<210>36

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>36

accggcacaa aga                                                         13

<210>37

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>37

cccccagtaa ggtcc                                                       15

<210>38

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>38

cccccagtaa aggtc                                                       15

<210>39

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>39

ccggcccacc ggc                                                         13

<210>40

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针多核苷酸

<400>40

ccggcccacg ggc                                                         13