横向电场提高离子交换吸附剂动态吸附容量的方法

摘要

本发明公开了一种利用交变电场作用提高蛋白质等生物大分子在离子交换吸附剂上的动态吸附容量的方法，所述的制备型电色谱分离设备包括凝胶室和两侧的电极室构成；采用该设备分离生物大分子的方法，其特征在于，配制乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液为流动相；流动相流速为10－200cm/h，温度为2－25℃；在凝胶室两侧施加电极电压为1－600伏、电流交变周期为2－200秒的等周期交变电场，电极液流速为20－400cm/h，温度为4－25℃；样品溶液用迎头方式进样；穿透达到进样浓度2－80％后停止进样；蛋白质用2－20个柱体积洗脱液洗脱。本发明的方法具有操作方便、设备结构简单、适用范围广等优点，在蛋白质、核酸等生物大分子的分离与纯化中具有广阔的应用前景。

说明书

                                   技术领域

本发明涉及一种利用交变电场作用提高蛋白质等生物大分子在离子交换吸附剂上的动态吸附容量的方法，属于生物产品加工与分离技术领域。

                                   背景技术

目前，在生物下游产品加工过程中，层析分离具有其它分离手段无法替代的地位。但大多数层析介质的孔径均在纳米数量级，蛋白质在上述介质中的传质系数比小分子物质低2-3个数量级，严重影响了生物大分子在层析介质内的传质。因此，强化介质的内部传质、提高其处理生物大分子的分离效率是层析分离技术急待解决的问题之一。

目前，解决上述问题的思路主要有两种：

第一，减小介质的粒径。它主要着眼于减小层析介质粒径、缩短传质路径来提高传质效率。由于采用了小粒径的介质，因此操作过程中层析柱的背压增大，对介质的机械强度提出了更高的要求。该方法目前主要用于分析规模的色谱实验。

第二，开发大孔介质。在层析介质制备过程中加入某种致孔剂，在生成纳米级扩散孔的同时，形成一定量微米级的流通孔。溶液在流通孔中以对流形式流动而在扩散孔中则以扩散方式传递。孔内对流流动仍需要很大的外压，且大孔介质对于传质过程的强化必将牺牲一定的吸附容量。

最近，随着毛细管电色谱理论和应用的深入发展，人们的注意力也开始转入利用电渗等电动现象来加快传质过程及提高分离效率上。因此，在常规色谱中引入外电场，利用电动现象(电渗、电泳)强化介质颗粒间/颗粒孔内传质逐渐成为第三种思路。电渗现象源于固体和液体接界电位差，是电场中液体相对于带电表面移动的现象。在外电场作用下，含有电解质的溶液相对于带电静止相的运动称为电渗流(EOF)，采用电渗流推动溶液移动的毛细管电色谱是目前分析色谱研究中的一大热点。电渗流的产生和双电层有关，对于1∶1型电解质水溶液，当其浓度分别为1、100mmol/L时，双电层的厚度分别为10、1nm。因此在普通液相色谱研究条件下，除介质颗粒间产生电渗流外，介质的孔内也可能产生电渗流。利用电渗流作为推动力，当孔道半径远大于双电层厚度时(一般情况下大于20即可)，EOF速率和孔道尺寸无关，也不存在反压力。已有的理论研究也表明，在压力驱动色谱中，随色谱介质孔径的减小，孔内对流传质的贡献迅速下降，而对于电渗流，只要孔径远大于双电层厚度，则电渗流与孔径无关。因此，采用电动传递强化传质将是发展大规模高效液相色谱的一条很有希望的途径。

已有制备型电色谱技术中有一种多通道流动电泳设备，该设备由清华大学的刘铮等提出(交变电场下离子交换色谱分离过程，化工学报，2001，52：311-315)。其核心设备是一种五腔室的电泳槽，中间腔室装阴离子交换剂DEAE-Sepharose FF，其两侧分别是进样腔室与出样腔室，中间腔室与进样和出样腔室之间由尼龙滤网隔开。最两端的是正、负电极腔室，它们与进样、出样腔室之间用凝胶膜隔开，交变电场施加在电极腔室中的铂金电极上。实验时，将牛血清白蛋白(BSA)样品液泵入进样室，将不含BSA的缓冲溶液泵入电极室，从电极室流出的电极液回电极液储瓶，经脱气后供循环使用。BSA样品液全部穿过介质层进入出样室，由出样室的出口流出并进入部分自动收集器。吸附结束后，依次通入清洗液和洗脱液进行淋洗和洗脱，洗脱过程结束后，通入再生液对床层进行再生。由此可见，这也是一种轴向电场电色谱，流动相和电场均同向穿过中间的填料室。作者利用该设备考察了交变电场对牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上的动态吸附行为。研究结果表明，外加电场在颗粒间和介质孔内所产生的电渗流可加速蛋白质和色谱填料间的传递过程，显著提高色谱填充床的动态吸附容量。但该设备结构较复杂，腔室较多。中间装填料的腔室很薄，如果增大该腔室将导致两电极间距离的增大。

                                   发明内容

本发明的目的是提供一种利用交变电场作用提高蛋白质等生物大分子在离子交换吸附剂上的动态吸附容量的方法，它是将横向电场与色谱分离相结合，利用电动现象(电渗、电泳)来强化介质颗粒间/孔内传质而达到上述目的。

本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种利用交变电场作用提高蛋白质等生物大分子在离子交换吸附中吸附容量的方法，所述的制备型横向电场电色谱分离设备，其中横向电场是指电场方向与液体流动方向垂直，电色谱包括凝胶室和两侧的电极室构成，凝胶室是两侧有对称的槽沟、槽沟内平台上有密封凹槽和中间为长方形中空的有机玻璃体；槽沟内设置具有截留分子量大于1000道尔顿的、可自由通过导电离子的膜板；在凝胶室外两侧各有一个电极室；电极室内壁固定惰性铂电极；电极室与凝胶室中充有包括乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；采用该设备分离生物大分子的方法，其特征在于，包括以下过程：配制含有0-100mmol/L氯化钠的1.0-20mmol/L乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为流动相和电极液，流动相使用前经0.45μm超滤膜和超声处理；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0.1-100mg/ml的溶液；凝胶室和两侧的电极室用流动相平衡后，将带有季胺盐、磺酸基、二乙基乙二胺基修饰基团的离子交换吸附剂按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室；流动相流速为10-200cm/h，温度为2-25℃；在凝胶室两侧施加电极电压为1-600伏、电流交变周期为2-200秒的等周期交变电场，电极液流速为20-400cm/h，温度为4-25℃；待系统稳定后，待分离样品以迎头方式进样，色谱柱流出液经检测器检测；当出口处样品穿透达到进样浓度2-80％后；改用流动相缓冲液冲洗色谱柱以除去未吸附的蛋白质；切断电源，改用线性梯度洗脱法洗脱色谱柱，洗脱体积为2-20个柱体积；上述吸附和洗脱可交替连续进行。

上述的优化条件：配制含有5-50mmol/L氯化钠的2.0-15mmol/L乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液为流动相和电极液；生物大分子溶于流动相中制备成浓度为0-5-50mg/ml的溶液；凝胶室和两侧的电极室用流动相平衡后，将离子交换吸附剂按重力填充的方法填充到电色谱柱的凝胶室；流动相流速为20-70cm/h，温度为4-15℃；在凝胶室两侧施加电极电压为5-300伏、电流交变周期为4-120秒的等周期交变电场，电极液流速为40-300cm/h，温度为5-15℃；当出口处样品穿透达到进样浓度5-40％后停止进样；洗脱色谱柱所用洗脱体积为5-15个柱体积。

下面对本发明进行详细说明：

本发明的关键技术有八点：一是色谱中横向交变电场的引入，采用了一种三腔室的矩形色谱柱，中间装填料的填料室和两侧的电极室，填料室和电极室之间由平面膜板来隔离，电极室内设置电极，电极和外电源相连，填料室内便产生了横向电场。关键技术之二是膜板为具有一定分子截留能力的亲水性膜板，其主要作用是阻止生物大分子进入两侧的电极室而导电离子可自由通过，膜板的厚度和其内部的焦耳热有关，膜板越薄焦耳热越小，但膜板也需要有一定厚度(或需一定厚度的支撑板)来满足流动相的液压和本身机械强度的要求。关键技术之三是等周期交变电场的应用，用等周期来解决生物大分子在隔离膜板处的堆积，同时也解决了轴向电场电色谱中由于电场的持续应用而引起的诸多问题；周期的大小又是影响蛋白质的横向电动迁移和传质速率的重要因素。关键技术之四是缓冲液为常规的色谱缓冲液，缓冲液的离子强度为0.5-100mmol/L，过大的离子强度将压缩双电层厚度而导致电动传递的锐减。关键技术之五是为了保证操作过程中色谱柱内缓冲液的电导率和pH的稳定，电极液与缓冲液组成相同。关键技术之六是缓冲液和电极液的温度必须具有一定减缓填料室及电极室内焦耳热效应的能力。关键技术之七是缓冲液和电极液流速的选择除应满足分离效率和填料承载能力的要求外，还要满足消除填料室及电极室内焦耳热的要求。关键技术之八是电压的选择，电压的大小直接影响蛋白质的横向电动传递、传质速率和填料室及电极室内焦耳热效应。

由于在电极上施加一与填料室中液流方向相垂直的电场，所以在这种形式电色谱中，在色谱柱的轴向，液相由压力驱动；在横向上，溶质受横向电动传递的影响。图1给出了交变电场的应用方位及荷电溶质迁移示意图。在电色谱柱的横向，在外电场作用下有三个主要的传质过程：电渗流、蛋白质电泳和蛋白质的分子扩散。由于电渗流和电泳速度都随电场强度的增大而增大，因此吸附介质的局部质量通量也将随电场强度的增大而增大，所以通过调节电场强度的大小可以有效提高传质过程。另外，在介质孔内和介质表面产生的电渗流也可以通过减少滞流区和增大有效接触表面积而增大蛋白质的吸附容量。

本发明所采用的横向电场来增大吸附容量的方法具有的优点是：填料为常规的色谱填料，价格便宜；由于主要采用电动传递来提高吸附容量，色谱的操作压力没有要求，对设备的承压能力要求较低；该方法由于采用了这种三腔室的矩形色谱柱结构，并且填料室和两侧的电极室由亲水性薄膜来隔离，故电极室内产生的电解气可稳定地被循环的电极液带走，填料室内产生的焦耳热又可被轴向压力驱动的、冷却的流动相带走，从而很好地解决了电色谱中的焦耳热和电解气问题；电动传递过程依赖于电场强度，可以通过调节电场强度来达到提高传质过程。在色谱操作条件下，表面带电荷的吸附剂都可以采用这种方法，如离子交换介质、亲和吸附介质等。相对不加电场情况，在较低的电场强度下(＜20V/cm)吸附容量即可提高2～5倍，能满足多种吸附分离要求，在蛋白质等生物大分子的分离、纯化等方面具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1给出了本发明工作流程示意图。。

图2给出了牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上有、无电场时的归一化动态吸附曲线。其中电色谱柱尺寸为1.5×0.5×1.2cm，上样缓冲液为3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸(pH8.2)含5.0mmol/L氯化钠，流速80cm/h，填料层电场强度如图上所示，电流循环周期为20秒，牛血清白蛋白料液浓度为2mg/mL。

                                   具体实施方式

下面的实例将对本发明予以进一步的说明。

实施例1

不同电场强度下牛血清白蛋白在DEAE-Sepharose FF上的动态吸附曲线电色谱填料室的尺寸为(长×宽×深)1.5×0.5×1.2cm，平衡缓冲液是含5.0mmol/L氯化钠的3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸缓冲液(pH8.2)。洗脱液和再生液分别为含0.5和1.0mol/L氯化钠的3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸缓冲液(pH8.2)。BSA样品溶液的浓度为2.0mg/mL。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。

采用重力沉降法将预平衡的DEAE-Sepharose FF装入填料室。在上样之前，填料室先用平衡缓冲液平衡直到UV(280nm)吸收值稳定在基线附近。然后，在凝胶柱两侧加上交变电场，并以恒定流速加入预冷却的BSA样品液。出口处蛋白质的浓度由在线UV检测，当出口UV吸收值达到进样蛋白质UV的70％，停止上样。改用平衡缓冲液冲洗色谱柱以除去未吸附的BSA，出口UV吸收值会逐渐下降并接近基线，这时停止电源供应。然后，改用线性梯度洗脱法洗脱色谱柱，洗脱体积为15个柱体积。最后，用再生液再生填料，再生后用平衡缓冲液平衡系统，准备下一次穿透实验。其他实验条件如附图2说明中所述，结果如图2所示，电场下的动态吸附容量显著提高(3～5倍)。

实施例2

利用DEAE-Sepharose FF分离牛血清白蛋白和免疫球蛋白G混合物电色谱填料室的尺寸为(长×宽×深)3.0×0.5×1.2cm，平衡缓冲液是含5.0mmol/L氯化钠的3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸缓冲液(pH8.2)；洗脱液和再生液分别为含0.5和1.0mol/L氯化钠的3.9mmol/L三羟甲基氨基甲烷-47mmol/L甘氨酸缓冲液(pH8.2)。总浓度为2.0mg/mL的蛋白质混合物是由等体积、浓度均为2.0mg/L的牛血清白蛋白和免疫球蛋白G样品液混合而成。实验过程中，电极液由冷却器冷却在6℃，流动相则由冰水混合物冷却。

采用重力沉降法将预平衡的填料(DEAE-Sepharose FF)装入中心室。电极电压为75伏，电流变化周期20秒。色谱柱由平衡缓冲液平衡后，打开电源在色谱柱的横向施加交变电场。然后，以流速160cm/h的速度加入预冷却的蛋白质混合物32mL，改用平衡缓冲液冲洗色谱柱以除去未吸附的蛋白质。出口UV吸收值会逐渐下降并接近基线，这时停止电源供应。然后切换到洗脱液，以线性梯度洗脱，洗脱体积为13.3个柱体积。收集到的馏分由SDS-PAGE来分析。实验结果：在超载情况下，得到电泳纯的牛血清白蛋白和免疫球蛋白G产品。