能产生有机物分解酶的假单胞杆菌属FK916菌株及用其分解有机垃圾的方法

摘要

本发明涉及能产生有机化合物分解酶的假单胞杆菌属FK 916及用其分解有机垃圾的方法。源于污水的假单胞杆菌属FK 916菌株具有极佳的降解和去除有机物的能力，并能在15－35℃的中等温度下进行分解。因此，不会释放出臭味，并能有效地处理来自于食品垃圾和工厂的有机垃圾。

说明书

技术领域

本发明涉及能产生有机化合物分解酶的假单胞杆菌属(Pseudomonas)FK 916及用其处理有机垃圾的方法。本发明尤其涉及源于污水的假单胞杆菌属FK 916，其具有极佳的分解和去除食品垃圾和有机垃圾中有机物的能力，并能够有效地处理食品垃圾而不会释放出臭味，也涉及一种用其处理有机垃圾的方法。

背景技术

在韩国，每天产生的食品垃圾为11,577吨(1999年基准)，其在城市产生的固体垃圾中约占26.5％。这些固体垃圾中，64％来自家庭，36％来自如餐厅、集体供膳场所等饮食行业。所产生的食品垃圾中58.8％被掩埋、7.3％被焚烧、33.9％被循环再利用。因此目前处理食品垃圾主要依靠掩埋。然而，汉城首都地区将从2005年1月起禁止在城区的掩埋场所直接掩埋食品垃圾。多数地区自治团体面临的严重问题是在食品垃圾处理中因掩埋物中浸出液所造成的环境污染，及居住在掩埋地点周围居民日益增加的普遍不满。同时，与易燃垃圾比较，焚烧处理需要更多的费用，这是因为食品垃圾含水量高，因此不易建造焚烧工厂并且因居民的反对很难保存实施场地。因此急需开发一种经济的食品垃圾处理方法，其能够通过在食品垃圾产生地直接使用微生物来分解、去除或减少食品垃圾的数量，从而增加循环再利用率。

因食品垃圾不一致的特性和形态以及水和盐分含量高，所以食品垃圾较难处理。此外，也应根据不同地区和商业场所采取不同的处理方法。目前研究中的食品垃圾处理和循环再利用方法包括堆肥处理、饲料生产、厌氧降解、污水合并处理等，其中堆肥处理主要分为大范围处理使用的大规模堆肥处理及家庭和小商店使用的小规模堆肥处理。

小规模堆肥处理设备包括发酵槽和干燥器，并放在公寓建筑、公共供膳场所、宾馆、餐厅等建筑中，然而，其中存在许多问题。

常规堆肥设备包括在高温下发酵食品垃圾来产生混合肥料和饲料，其首要问题在于因高温发酵或分降解散发出严重的令人讨厌的臭味，这使其成为不受欢迎的设备。此外，因韩国人食品是含1-5％盐量的高盐食品，所以用其生产混合肥料是不可能的。其次，因常规堆肥设备使用放射菌和嗜热菌，它们需要在高温下活化来增加微生物发酵和分解率，因此设备应保持在50-60℃，从而来维持嗜热菌的适宜生长温度，并减少食物垃圾的发酵物体积和蒸发水分。因此这就需要大量的电力，以致增加了运行成本。

为解决上述问题，本发明人从污水中分离鉴定了新的菌株，其具有极佳的分解和去除食品垃圾和有机垃圾中有机物的能力，并能够在中等温度下进行有氧分解而不会释放难闻臭味，从而利用此菌株对食品垃圾进行分解和降解处理而完成了本发明。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种具有极佳分解和去除食品垃圾和有机垃圾中有机物能力的菌株。

本发明的另一目的是提供一种利用本发明的菌株处理有机垃圾的方法。

根据本发明，上述及其它目的可通过提供假单胞杆菌属FK 916菌株来完成。

源于污水的假单胞杆菌属FK 916在15-35℃、优选25-30℃的中等温度范围内，在足量氧气存在下通过有氧分解可将食物垃圾中诸如碳水化合物、蛋白、脂肪等有机物转变为低分子量的有机物，最终产生稳定物质如CO₂、H₂O等，并产生少许热量。同时微生物属于假单胞杆菌属，可对NO₃、NO₂、NO进行脱氮作用产生N₂，如下面的反应式(I)所示。因此，假单胞杆菌属FK 916及其它微生物也能够通过脱氮作用将产生难闻气味成分之一的NH₃转变为N₂，从而去除难闻和刺激性的氨味。

此外，本发明中的菌株其特征在于不会产生能够释放出难闻气味的诸如吲哚、硫化氢、乙偶姻等物质(表2)。

假单胞杆菌属FK 916菌株于2002年1月7日保藏在作为国际保藏机构之一的韩国种菌协会(KCCM)，保藏编号为KCCM-10350。除保藏的菌株之外，在其它性质方面表现出某些多样性的变异菌株也包括在本发明的范围内，只要它们含有与本发明中的菌株相同的16S RNA序列、脂肪酸组成、形态、培养和生化特征。

此外，本发明的另一方面是提供利用假单胞杆菌属FK 916菌株分解和去除诸如食品垃圾等有机垃圾的方法。

该方法的特征是将假单胞杆菌属FK 916菌株或含此菌株的组合物加入到被处理物中。此菌株或组合物可通过例如将菌株的培养液或菌株培养液与填充物的混合物直接撒入而加入，其中填充物包括天然有机物(如米壳、锯屑、木片)、无机物颗粒(如沸石或陶瓷)及塑料。可选择地，菌株被吸附在诸如天然有机物和无机物颗粒等的填充物上或载体上。填充物或载体可撒在有机垃圾上或根据已知的微生物制备方法操作。

本发明中，术语“被处理物”指工厂和有机垃圾中产生的活性污水淤泥块和污水垃圾。

附图简要说明

从以下结合附图的详细说明，可更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和优点，其中：

图1表明试验结果，其中本发明的假单胞杆菌属FK 916菌株接种到含琼脂培养基的培养板中来进行蛋白酶分析和蛋白酶活性检测；

图2表明试验结果，其中本发明的假单胞杆菌属FK 916菌株接种到含琼脂培养基的培养板中来进行脂肪酶分析和脂肪酶活性检测；

图3是假单胞杆菌属FK 916的照片；及

图4是表明在食品垃圾中加入假单胞杆菌属FK 916的培养液后，食品垃圾重量随分解时间而降低的曲线图。

发明实施的最佳方案

现在将通过以下实施例详细描述本发明。本领域所属技术人员应该理解实施例仅是为了说明本发明，但本发明不限于此。

实施例1：菌株的分离

从韩国全罗北道(Cholabuk-do)周围收集的污水中分离本发明的菌株。污水样品用生理盐水逐渐稀释。一部分涂抹在LB琼脂培养基上(含有细菌用胰蛋白胨10g/L，细菌用酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L，pH 7.0)，并在25℃下培养。分离出现的菌落。

在25℃下，将分离的菌落培养在扩增培养基中(LB液体培养基)。然后在含琼脂培养基的培养板上涂布菌株来进行蛋白酶分析(脱脂乳琼脂培养基：蛋白胨5g/L，细菌用酵母提取物3g/L，脱脂乳1g/L，琼脂15g/L，pH7.0)，在含琼脂培养基的培养板上涂布菌株来进行脂肪酶分析(三丁酸甘油酯琼脂培养基：蛋白胨5g/L，细菌用酵母提取物3g/L，三丁酸甘油酯5ml/L，琼脂15g/L，pH 7.4)，在含琼脂培养基的培养板上涂布菌株来进行淀粉酶分析(淀粉琼脂培养基：蛋白胨5g/L，细菌用酵母提取物3g/L，可溶性淀粉2g/L，琼脂15g/L，pH 7.0)，在含琼脂培养基的培养板上涂布菌株来进行纤维素分析(纤维素1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，FeCl 30.02g/L，刚果红0.075g/L，琼脂15g/L，pH 7.2)。检测每个培养板中由蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活性形成的透明环来鉴定分离阳性菌株。

从图1所示的结果可以看出，作蛋白酶分析(A)的含琼脂培养基的培养板(A)和作脂肪酶分析的含琼脂培养基的培养板(B)在接种FK 916菌株后形成透明环。因此，提示此菌株可产生蛋白酶和脂肪酶。但是，还表明淀粉酶的活性较弱而且未见纤维素酶活性。

实施例2：菌株的鉴定

根据Holt等所描述的方法(Holt等，Bergey鉴定细菌学手册(Bergey，s Manual of Determinative Bacteriology)，第9版(1994))，通过Sherlock系统和clustal W鉴定在实施例1分离的菌株。发现此菌株是属于假单胞杆菌属的菌株，并命名为假单胞杆菌属FK 916。这种新的假单胞杆菌属FK916与含80.2％脂肪酸组成的Pseudomonas chlororaphis(绿菌素假单胞杆菌)类似，并与Pseudomonas gessardii CIP 105469在rRNA方面有99.8％的相似性。

从图3所示的照片可以看出，发现此菌株为具有杆菌状形态特征的革兰氏阴性菌。培养特性如下表1所示，包括适宜生长温度为28-30℃，耐受6％NaCl。因此，提示本发明的菌株适宜处理高盐含量的食品垃圾。

         表1 假单胞杆菌属FK 916的培养和形态学特征

  特征  结果  形态学特征  形状和大小  移动性  革兰氏染色   杆状菌，0.8～0.9×1.7～2.0  +(阳性)  -(阴性)  培养特性  生长pH  生长温度  4℃生长  41℃生长  适宜生长温度  NaCl抗性  Mac ConKey琼脂  色氨酸琼脂  (假单胞杆菌分离的琼脂反应)   4.5～9.0  10～37℃    +  -  28～30℃    6％  +  +

通过API试剂盒分析的生化特性如表2所示，根据MIDI Com.描述的方法，通过气相色谱分析全细胞脂肪酸的结果以及利用Sherlock系统对菌株的鉴定如表3所示。此外，根据Verhille等描述的方法(Verhille等，International J.Systematic Bacteriol.，49，1559，1999)对16s rRNA进行分离测序。结果表明，菌株含有1498个碱基(Seq.ID.No.：1)。利用clustal W，通过与属于假单胞杆菌属的其它菌株进行rRNA碱基序列比较，来分析经基因库筛选的具有高度特异性微生物的相似性。结果如表4所示。根据De Ley方法(De Ley，J.，J.Bacteriol.，101，738，1970)分析的G+C含量为61.5％。

                表2 假单胞杆菌属FK 916的生化特性

  特性  结果  生化特性  硝酸盐还原为亚硝酸盐  吲哚产生  -  -  -  硫化氢产生  乙偶姻产生  还原为N₂气  葡萄糖氧化  葡萄糖氧化发酵  蛋白酶  脂肪酶  淀粉酶  纤维素酶  胶原酶  β-半乳糖甙酶  精氨酸脱氢酶  赖氨酸脱羧酶  鸟氨酸脱羧酶  细胞色素氧化酶  色氨酸脱氨基酶  脲酶  β-葡萄糖甙酶(七叶苷水解)  -  +  -  氧化  +  +  +  -  -  -  +  -  -  +  -  +  -  +  碳源的使用  葡萄糖  阿拉伯糖  甘露糖  甘露醇  N-乙酰葡胺  麦芽糖  葡萄糖酸  癸酸  己二酸  马来酸  柠檬酸  乙酸苯酯   +  -  +  +  +  -  +  +  +  -  +  -

                                                   表3 脂肪酸组成

  脂肪酸  百分比(％)  C10：0  C12：03OH  C12：0  C12：02OH  C12：03OH  C14：0  C15：0  C15：0异2OH  C16：1w7c  C16：1w5c  C16：0  C17：1w8c  0.20  2.00  1.67  4.73  4.27  0.50  0.45  30.01   0.12  33.94  0.27  C17：0环  C17：0  C18：3w6c(6，9，12)  C18：1w7c  C18：0  C19：0环w8c  6.64  0.56  0.63  12.34  1.48  0.15  鉴定菌株(相似性)   绿菌素假单胞杆菌(80.2％)  (生金菌素假单胞杆菌)  腐生质假单胞杆菌生物型B(70.9％)  腐生质假单胞杆菌生物型A(68.7％)  丁香假单胞杆菌(41.5％)

                                                 表4 假单胞杆菌属FK 916与属于假单胞杆菌属的

                                                         菌株间的16S rRNA相似性比较

  菌株  相似性  不同碱基数/比较碱基数  Pseudomonas gessardii CIP 105469  P.libaniensis CIP 105469  P.Synxantha DSM 13080  P.reactans LMG 5329  P.brennerii CFML 97-391-T  P.cedrella CFML 96-198  P.fluorescens ATCC 49642  P.mucidolens IAM 12406  P.azotoformans IAM 1603  P.migulae CIP 105470  P.putida ATCC 17472  P.tolaasii LMG 2342  P.thivervalensis CFBP 1126T  P.fragi ATCC 4973  P.Jessenii CIP 105469  P.pavnaceae IAM 1155  P.plecoglossicida FPC951  P.oryzihabitans IAM 1568  P.mosselii CIP 105259  P.monteilii CIP 104883T  99.80  99.73  99.53  99.53  99.52  99.40  99.33  99.26  98.93  98.93  98.85  98.58  98.11  97.87  97.85  97.80  96.79  96.46  96.44  96.35  3/1491  4/1491  7/1498  7/1478  7/1470  9/1491  10/1498  11/1496  16/1496  16/1491  17/1476  21/1478  27/1431  31/1458  32/1491  33/1497  48/1495  53/1496  53/1490  54/1478

实施例3：食品垃圾的分解和去除：食品垃圾重量随分解时间的降低

为分析食品垃圾重量的降低，将假单胞杆菌属FK 916接种到经灭菌的LB液体培养基中，并在28℃下摇动培养1天1夜。将200ml培养液和100g锯屑(用作通风和水分控制)加入到3L广口烧杯中，充分混匀。将从W大学的食堂收集的1Kg食品垃圾(约含80％水分)加入其中，并充分混匀。称完起始重量后，将混合物放入25℃的培养器中，同时搅拌。每天将混合物称重3-4次，并计算重量降低率。

从图4所示的结果可以看出，在分解的第一天，在垃圾重量降低的同时，食品垃圾固有的难闻气味消失，而且没有出现新的不好气味。在分解后的第18天，垃圾的重量降低到72.3％，说明食品垃圾被分解和去除。重量降低率比仅加入培养物液体的比较例1和加入LB培养基、锯屑的比较例2更迅速。这些结果说明，加入锯屑有助于提供适宜的有氧条件并能控制水分含量，因此促进了有机物的分解和去除。此外，FK 916菌株对有机物的分解和去除作用适宜在25℃下进行。而且还提示出通过搅拌连续提供空气可在食品垃圾零去除器(zero-discharger)中得到理想效果。

比较例1：用假单胞杆菌属FK 916培养液处理的食品垃圾的分解检测

将假单胞杆菌属FK 916接种到经灭菌的LB液体培养基中，并在28℃下摇动培养1天1夜。将200ml培养液和100g锯屑(用作通风和水分控制)加入到3L广口烧杯中，充分混匀。将1Kg食品垃圾(约含80％水分)加入其中，并充分混匀。称完起始重量后，将混合物放入25℃的培养器中，同时搅拌。每天将混合物称重3-4次，并计算重量降低率(图4)。

比较例2：用锯屑处理的食品垃圾的分解检测

将200ml经灭菌的LB液体培养基和100g锯屑(作水分控制)加入到3L广口烧杯中，充分混匀。将1Kg食品垃圾(约含80％水分)加入其中，并充分混匀。称完起始重量后，将混合物放入25℃的培养器中，同时搅拌。每天将混合物称重3-4次，并计算重量降低率(图4)。

实施例4：在零去除器中食品垃圾的分解和去除

80Kg木片(颗粒尺寸：约5-10mm)、5L根据实施例1所述方法培养的FK 916培养体、39Kg从餐厅中收集的食品垃圾加入到由Nambang E & BCo.，Ltd.生产的食品垃圾零去除器(CLEANGATE-50型，容量：50kg)中。在28℃的温度下运行设备，搅拌速度为3.2rpm，通气速度为5.5m³/min。24小时后，称重设备中内容物重量，并计算重量降低率。分解开始1小时后，食品垃圾的难闻气味开始消失。24小时后，内容物的重量降低到76.9％，同时释放出极小的味道。分解的第二天，再加入46Kg的食品垃圾，并在相同条件下运行设备。24小时后，重量降低率达到90.9％。在29天内，每天加入27-60Kg的食品垃圾并在相同条件下运行设备。最终的累计降低率为94.7％。

实验结果证明，本发明的假单胞杆菌属FK 916菌株能够在室温和中等温度条件下通过一次投放长时间地分解和降解食品垃圾，因而是一种分解和去除诸如食品垃圾等有机垃圾的有效菌株。

工业适用性

如实施例所述，因本发明的假单胞杆菌属FK 916菌株在中等温度下具有极佳的分解食品垃圾的能力，而且不会释放出难闻气味，因此它可经济卫生地用于食品垃圾的处理中，并在环境工业中发挥作用。

                               序列表

                          Sequence Listing

<110>CHOI，Dong-Seong

     FUKAI，Kunihirl

<120>Pseudomonas sp.FK916 producing decomposition enzyme of organic compound

     and method for decomposition of organic waste using the same

<130>P03005

<150>KR2002-0007525

<151>2002-02-08

<160>1

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1498

<212>DNA

<213>Pseudomonas sp.FK916

<400>1

agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc    <60>

ggtagagaga agcttgcttc tcttgagagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct    <120>

gcctggtagt gggggataac gttcggaaac ggacgctaat accgcatacg tcctacggga    <180>

gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt    <240>

ggtggggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca    <300>

cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca    <360>

atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag    <420>

cactttaagt tgggaggaag ggttgtagat taatactctg caattttgac gttaccgaca    <480>

gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt gcaagcgtta    <540>

atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttagt taagttggat gtgaaatccc    <600>

cgggctcaac ctgggaactg cattcaaaac tgactgacta gagtatggta gagggtggtg    <660>

gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg    <720>

accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat    <780>

accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt gagctcttag    <840>

tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc gttttagtac ggccgcaagg ttaaaactca    <900>

aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg    <960>

aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttctag agatagattg gtgccttcgg    <1020>

gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa    <1080>

gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgtaatggtg ggcactctaa    <1140>

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt    <1200>

acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt    <1260>

ggagctaatc ccacaaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga    <1320>

agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg    <1380>

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc    <1440>

gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtagcc      <1498>