一种C型副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽及其用途

摘要

本发明涉及一种C型副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽及其用途。一种C型副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽，其氨基酸序列为以下通式：YX1PX2QWWX3X4X5X6X7，其中Y代表酪氨酸残基；P代表脯氨酸残基；Q代表谷氨酰胺残基；W代表色氨酸残基；X1～X7代表任意氨基酸。利用本发明的短肽，可以提供一种新型，快速，易于操作的鸡传染性鼻炎的血清型鉴别诊断方法，并为进一步研制安全高效新型疫苗奠定了工作基础，具有良好的经济效益和市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及模拟副鸡嗜血杆菌抗原表位的短肽，具体说涉及一组能模拟C型副鸡嗜血杆菌的血清型抗原表位的短肽，以及该组短肽在制备鸡传染性鼻炎鉴别诊断及疫苗研制中的应用。

技术背景

副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是引起鸡传染性鼻炎的致病菌。它可以分为A、B、C三种血清型，我国现在常见的是A和C型。鸡传染性鼻炎是一种急性呼吸道传染病，它的主要危害是造成蛋鸡产蛋量下降及育成鸡生长不良。有文献报道，由Hpg引起的传染性鼻炎可使产蛋量下降40％，经济损失严重。

对Hpg的鉴别主要有表型鉴定，血清型鉴定及PCR等方法。这些方法在实际推广应用中都受到一定的限制：由于Hpg生长缓慢，培养条件苛刻，普通实验室很难通过表型对其进行分离鉴定；血清型鉴定是常用的方法，它的经典方法是根据Page使用的平板凝集试验将分离到的Hpg分型；也有通过血清型单抗阻断酶联免疫反应进行血清分型的报道。由于迄今尚没有商品供应的血清型特异的单抗，因此无法推广应用。近来有文献报道，通过合成特异的寡核苷酸探针，采用PCR法对Hpg进行快速鉴别。但该法较易出现假阳性，且需要特殊的仪器设备，因而不利于在基层推广使用。

目前对鸡传染性鼻炎的防治主要采用接种油佐剂灭活菌苗的方法。因为缺少方便快捷适于基层推广的血清型鉴别方法，所以通常都是混合接种A和C型灭活菌苗。因此需要大量使用灭活的细菌以及化工材料的佐剂，Hpg是革兰氏阴性菌，含有内毒素，大量接种会影响蛋鸡的产蛋及育成鸡的生长。若能针对疫情分型接种将减少内毒素的影响，减少佐剂残留，从而减少经济损失。因此，建立一种简便有效的Hpg血清型鉴别诊断方法及研制新型多肽疫苗将具有重要意义。

发明内容

为了解决Hpg的鉴别诊断的技术难题，本发明公开了一种能模拟Hpg C的血清型抗原表位的短肽，还公开了该短肽在制备鸡传染性鼻炎鉴别诊断及疫苗中的应用。

一种C型副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽，其氨基酸序列为以下通式：YX₁PX₂QWWX₃X₄X₅X₆X₇，其中Y代表酪氨酸残基；P代表脯氨酸残基；Q代表谷氨酰胺残基；W代表色氨酸残基；X₁～X₇代表任意氨基酸。

上述序列的最优选序列为YSPHQWWLSGAV，其中Y代表酪氨酸残基；S代表丝氨酸残基；P代表脯氨酸残基；H代表组氨酸残基；Q代表谷氨酰胺残基；W代表色氨酸残基；L代表亮氨酸残基；G代表甘氨酸残基；A代表丙氨酸残基；V代表缬氨酸残基。

上述抗原模拟表位肽在制备鸡传染性鼻炎诊断试剂和疫苗中的用途。

所述诊断试剂为C型副鸡嗜血杆菌血清抗原的诊断试剂。

所述疫苗为C型副鸡嗜血杆菌疫苗。

本发明的发明人以C型Hpg的一株血清型单抗为靶蛋白，从噬菌体展示的随机线形十二肽库(New England Biolabs公司)中筛选到与之结合的短肽。所筛选到的短肽具有12个氨基酸残基，其氨基酸序列为YX₁PX₂QWWX₃X₄X₅X₆X₇序列。本发明公开了上述序列之一的最优选序列为YSPHQWWLSGAV。

本发明的短肽可通过本发明技术领域中的常规技术如化学合成等方法制备。

将本发明公开的序列与GeneBank中已公布的Hpg的蛋白序列进行比较，未发现有同源性，这些短肽可抑制天然抗原与单抗的结合，说明它们在结构上能模拟天然抗原表位，为一种新的抗原模拟表位序列。

Hpg的血清型抗原成分迄今尚不清楚。本发明的目的是以这类短肽作为替代血清型抗原，用于对Hpg的鉴别诊断及新型疫苗的研制。将含有上述保守序列短肽的M13噬菌体纯化后作为替代抗原，包被到96孔酶联板，ELISA试验结果表明：该融合短肽可特异地与C型HPG单抗及C型Hpg接种后鸡的多抗血清结合，而不与A型单抗及A型Hpg接种后鸡的多抗血清反应。

本发明的申请人将上述序列展示在大肠杆菌鞭毛硫氧还蛋白的袢环区，该区位于细菌鞭毛上，外源片段不仅具有一定的构象约束性，而且可以实现高拷贝表达。将此重组菌作为免疫原，免疫接种SPF鸡，获得了特异识别插入序列和天然抗原的抗体，说明该表位肽构成免疫原后可以诱导机体免疫系统产生针对C型Hpg的抗体。

利用本发明的短肽，可以提供一种新型，快速，易于操作的鸡的传染性鼻炎的血清型鉴别诊断方法，并为进一步研制安全高效新型疫苗奠定了工作基础，具有良好的经济效益和市场前景。

附图说明

图1：SDS-PAGE检测单抗纯化结果

1，低分子量蛋白Marker.2，3，纯化HPG-C-44单抗IgG

图2：纯化的HPG-C-44单抗对十二肽库进行筛选后富集情况

图3：重组载体构建示意图

图4：pFlitrx空载体酶切；

1，空载体(P0)；2，P0+ApaI酶切；3，P0+XhoI酶切；4，Marker。

图5：重组质粒P44酶切鉴定：

1，P44+Apa I；2，P44+EcoR V；3，P0+EcoR V；4，P0+Apa I；5，MarkerVI；6，P0。

图6：P44多克隆位点定点测序结果

图7：重组菌诱导表达的SDS-PAGE电泳图谱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但所述实施例不以任何形式限制本发明。

实施例1  C型副鸡嗜血杆菌抗原模拟表位的筛选及序列分析

实验材料：

1、噬菌体随机肽库试剂盒

噬菌体表面衣壳蛋白III展示的线形12肽库(Ph.D.-12^TM Phage Peptide Library PeptideLibrary Kit)试剂盒购自美国New England Biolabs公司。肽库的滴度4×10¹²pfu/ml，随机多样性1.9×10⁹；受体菌E.coli ER2537基因型为

F′lac^qΔ(lacZ)M15proA⁺B⁺fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)

5(r_k^-m_k^-McrBC^-)。DNA全自动测序引物(-96gIII sequencing primer)：

5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’

2、1株抗C型副鸡嗜血杆菌单抗HPG-C-44；1株抗A型副鸡嗜血杆菌单抗HPG-A-48；由北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存。

3、0083株A型副鸡嗜血杆菌；668株和Modesto株C型副鸡嗜血杆菌；人工感染SPF鸡制备的0083株HPG-A、668株HPG-C和Modesto株HPG-C多抗鸡血清均由北京市农林科学院畜牧兽医研究所张培君研究员保存。

4、化学试剂

明胶、BSA、Tween-20、PEG 8000为Sigma公司产品；X-gal、IPTG为赛百盛公司产品；酵母提取物和胰蛋白胨Amersham公司产品；抗M13KE多抗：本室免疫兔得到的抗血清；羊抗鼠IgG-HRP、TMB中山生物工程公司产品；其它试剂为国产分析纯。ProteinG-Sepharose4B亲合层析柱购自Pharmacia公司。

5、相关试剂的配制

低盐LB培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和NaCl 5g溶解于蒸馏水并定容至1L，高压灭菌；

顶层琼脂糖：LB培养基+1g/L MgCl₂·6H₂O+7g/L琼脂糖，高压灭菌；

底层LB/IPTG/X-gal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃时，加入IPTG和X-gal(终浓度分别为50μg/ml，40μg/ml)，铺平板；

PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5mol/LNaCl，高压灭菌；

TBS缓冲液：50mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，高压灭菌；

碘化钠缓冲液：10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA，4mol/LNaI；

PB缓冲液：0.02mol/L Na2HPO4，0.02mol/L NaH2PO4；；

6、主要仪器

HimacCR21型高速冷冻离心机(日本日立公司)；Biofuge22R台式高速离心机(德国HERAEUS产品)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；JY92-IIII型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；DF-D型恒流恒压电泳仪(北京东方仪器厂)；蛋白电泳槽(BIO-RAD公司)；UV-120-02型紫外分光光度仪(日本岛津公司)；8823A-UV型紫外检测仪(北京新技术应用研究所)；EL311SX酶联仪(美国BIO-TEK公司)；φ71型pH计(美国贝克曼公司)；EAGLE EYE II型成像仪(美国STRATAGENE公司)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)；PYX-DHS-40×50型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；LRH-250A生化培养箱(广东省医疗器械厂)。

1.1单克隆抗体的亲和纯化

a.平衡：将Protein G亲合层析柱用0.02M pH7.0磷酸缓冲液清洗8～10柱体积，使柱平衡；

b.上样：待纯化的HPG-C-44单抗腹水1.5ml上样，弃掉前两滴，收集流出液，反复上样3-5次，并在柱上保留数分钟；

c.洗脱：先用3～5个柱体积的平衡液洗柱，洗掉非特异结合的部分，然后用0.1M Gly-HClpH2.7的洗脱缓冲液洗脱2～5个体积，在每个收集管中预先加入50μl pH9.0的1MTris-HCl中和液，使收集液近中性；

d.SDS-PAGE电泳鉴定：将收集液超滤浓缩，电泳鉴定纯度。

e.纯化鉴定：SDS-PAGE检测单抗纯化效果(结果见图1)，经分光光度计计算，单抗HPG-C-44浓度是4.0μg/μl，单抗纯度超过95％。

1.2纯化单抗IgG的ELISA效价测定：

用灭活的HPG-C细菌(10¹⁰个/ml)超声裂解后包被酶标板两条(8孔/条)，并设不包被的空白对照一条(8个孔)。4℃过夜，PBST清洗之后用10％脱脂乳300μl/孔、37℃封闭1hr。之后加入44^#单抗1μg/100μl/孔到8个裂解菌液的包被孔和空白对照孔中，另外8个HPG-C包被孔加入无关单抗100μl/孔做对照。37℃作用0.5hr，PBST清洗之后加入稀释好的兔抗鼠酶标二抗IgG-HRP100μl/孔，37℃作用0.5hr，PBST清洗之后，加TMB底物显色20min，2N的50μl/孔H₂SO₄终止反应，50μl/孔，OD₄₅₀读数，结果见表1。

 表1，纯化HPG-C-44单抗IgG的ELISA效价测定

                   C菌包被  空白  McAb  HPG-C-44  无关单抗  HPG-C-44  OD值  0.786  0.082  0.073

1.3纯化的HPG-C单抗对十二肽库进行筛选

a.包被：纯化的HPG-C-44单抗以100μg/ml包被96孔酶联板，100μl/孔，4℃包被过夜；

b.封闭：移去孔中的包被液，然后用0.5％BSA封闭包被孔和空白对照孔300μl/孔，37℃1h；

c.洗涤：移去封闭液，用TBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍；

d.结合：用TBS-T(0.1％Tween-20)稀释噬菌体，每孔加入1μg，室温轻轻摇动孵育60min；

e.清洗：移去未结合的噬菌体，按照上述清洗方法，用TBS-T洗10遍；

f.洗脱：每孔加入100μl 0.2mol/L Gly-HCl(pH2.2)，室温洗脱7-9min

g.中和：吸出洗脱液，加入含有15μl 1M Tris-HCl(pH9.1)中和缓冲液的离心管中，使洗脱液近中性；

h.滴度测定和噬菌体的扩增：取出10μl中和液用LB培养基按10-8-10-10稀释，进行噬菌体滴度的测定，剩余的扩增、纯化后重复步骤a-g进行下一轮筛选。单抗筛选富集情况见图2。

1.4噬菌体的扩增和纯化

a.挑取宿主菌ER2537单菌落，接种于低盐LB培养基中，37℃剧烈振动培养过夜。

b.过夜菌按1∶100接种于20ml低盐LB培养基中，加入待扩增的噬菌体，37℃振摇培养4.5h；

c.将菌液转移至50ml离心管中，4℃、10,000r/m离心10min；上清转移至另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，在4℃沉淀2h。然后4℃、10,000r/m离心5-10min，弃上清；

d.沉淀溶于1ml TBS，然后移至1.5ml离心管中，12,000r/m离心10min；

e.上清移至另一1.5ml离心管中，再加入1/6体积的PEG/NaCI，混匀后于4℃沉淀15min，然后4℃，10,000r/m离心10min；

f.沉淀溶于60ul TBS(含0.02％NaN₃)，4℃贮存备用。

1.5噬菌体滴度的测定

a.挑取宿主菌ER2537单菌落，接种于低盐LB培养基中，37℃剧烈摇至对数生长期(OD600≈0.5)；

b.37℃预温LB/IPTG/X-gal平板。

c.顶层琼脂糖在微波炉中融化后分装到无菌试管，每管3ml，保温于65℃水浴锅中；

d.用低盐LB培养基将洗脱的噬菌体按10倍梯度稀释；

e.取10μl不同梯度的噬菌体稀释液分别加入200μl对数生长期的ER2537菌液中，涡旋混匀，室温孵育5min；

f.将上述混合液加入3ml顶层琼脂糖中迅速涡旋后，立即在37℃预热的LB/IPTG/X-gal平板上铺板，放置冷却后，培养箱中37℃倒置培养过夜；

g.计算噬菌斑数：在平板中选100个噬菌斑左右者进行1/2面积计数，乘以稀释倍数即得每10μl原液所含噬菌体的个数，通常以pfu/μl或pfu/ml表示。

一般情况下，淘洗下来的噬菌体以10¹-10⁴倍稀释，扩增后的噬菌体以10⁸-10¹¹倍稀释。

1.6 HPG-C-44单抗筛选出的噬菌体克隆与该单抗ELISA及与HPG-C竞争ELISA分析

a.包被：A、B、C、D、E五行均用0.5μg/100μl的HPG-C-44抗包被；F行只包被液空白对照。4℃包被过夜。

b.封闭：移去孔中的包被液，然后用5％脱脂奶封闭包被孔和空白对照孔300μl/孔，37℃1hr；

c.洗涤：移去封闭液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗3遍。

d.噬菌体克隆与HPG-C细菌裂解液竞争结合：A、B、C、D、F各行的所有孔中加入与所对应列号的phage克隆，0.5μg/50μl/孔，在B、C、D、E各行依次加入10倍、10²倍、10³倍、10³倍稀释的细菌(原始浓度10¹⁰个/ml)裂解液50μl/孔，37℃1hr。A、F行各孔用PBS补足液量至100μl。

e.洗涤：移去结合液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍。

f.M13酶标抗体结合：在各反应孔中加入1∶5000倍稀释的酶标二抗：兔抗M13IgG-HRP，37℃1hr。

g.洗涤：移去反应液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍。控干。

h.显色：加入TMB底物显色，10分钟后用2N的H₂SO₄终止反应。

i.读数：分光光度计读OD₄₅₀，并记录。试验结果如表2：

表2，HPG-C-44单抗筛选出的噬菌体克隆与该单抗ELISA及与HPG-C竞争ELISA结果

  部分克隆序号  25  26  27  28  29  31  33  B2  36  A  未竞争(HPG^-)  0.698  1.123  1.159  0.726  1.083  1.022  0.619  1.077  1.096  B  10^-1竞争  0.081  0.171  0.218  0.180  0.211  0.248  0.104  0.190  0.205  C  10^-2竞争  0.205  0.320  0.351  0.225  0.331  0.446  0.217  0.263  0.355  D  10^-3竞争  0.417  0.698  0.778  0.447  0.667  0.542  0.449  0.487  0.535  E  空对照(Phage^-)  0.068  0.070  0.070  0.071  0.068  0.064  0.076  0.078  0.099  F  空白  0.060  0.059  0.061  0.062  0.058  0.060  0.066  0.065  0.066

1.7噬菌体单链DNA的制备、序列的测定

a.将1.4中的ER2537过夜菌按1∶100接种于低盐LB培养基中，1ml/管分装于培养试管中，挑取噬菌斑加入其中，37℃振摇培养4.5-5h；

b.将500μl扩增后的噬菌体液体，10,000r/m离心10分钟，取上清重复离心一次。

c.上清移至另一离心管中，加入200μl PEG/NaCl，混匀，室温放置10min

d.10,000r/m离心10min，弃上清，再短暂离心，吸尽上清；

e.用100μl碘化钠缓冲液充分重悬沉淀，加入250μl无水乙醇，室温放置10min；

f.10,000r/m离心10min，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀；

用30μl TE溶解沉淀，送公司进行测序并翻译为氨基酸序列。用M13反向-96位远端引物在CEQ2000XL自动测序仪上完成。

测序结果如下：

44-B2：Y  S  P  H  Q  W  W  L  S  G  A  V

44-34：T  D  K  N  Y  S  P  D  Q  W  W  T

44-27：Q  P  N  V  P  Y  D  P  H  A  W  W

44-28：D  T  T  S  Y  N  P  R  A  W  W  A

44-31：S  L  P  Y  D  P  L  E  W  W  G  I

44-36：Y  L  P  Y  D  P  L  E  W  W  G  I

44-26：G  T  V  Q  Y  S  P  Y  L  W  W  T

44-33：A  L  W  T  P  V  S  P  S  W  W  W

44-25：I  Y  P  P  N  L  W  Q  A  V  S  Q

采用Internet BLAST(网址为：http//：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)软件对Hpg结合肽的共有序列进行比较，得出，上述氨基酸序列有共同的核心序列Y-P-WW。

实施例2  模拟表位融合肽在鉴别诊断中的应用

实验材料

宿主菌：GI826(F^-，lacI^q，ampC∷P_trpcI，ΔfliC，ΔmotB，eda∷Tn10)，Invitrogen公司产品；

质粒：pFliTrx Invitrogen公司产品；

主要试剂

限制性内切酶：ApaI，Xho I TaKaRa公司产品；

T₄DNA连接酶：TaKaRa公司产品；

Taq聚合酶：TaKaRa公司产品。

相关培养基

10×M9盐：Na₂HPO₄ 60g，KH₂PO₄ 30g，NaCl 5g，NH₄Cl 10g溶于900ml去离子水，用10MNaOH调至pH7.4；

IMC培养基：含1×M9盐溶液，0.2％酪蛋白酸性水解物，0.5％葡萄糖，1mmol/L MgCl₂；

RM培养基：1×M9盐，2％酪氨酸，1％甘油，1mMMgCl₂；

SOC培养基：胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，2.5mmol/L KCl，10mmol/LMgCl₂，20mmol/L葡萄糖。

兔抗鸡IgG-HRP：ROCKLAND公司产品，购自上海吉泰科技有限公司

仪器设备

BIO-Rad Gene Pulser II电转仪(美国BIO-RAD公司)；PTC-150minicycler PCR仪(美国MJ RESEARCH产品)；HimacCR21型高速冷冻离心机(日本日立公司)；Biofuge22R台式高速离心机(德国HERAEUS产品)；HZQ-C空气浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；JY92-II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；DF-D型恒流恒压电泳仪(北京东方仪器厂)；蛋白电泳槽(BIO-RAD公司)；UV-120-02型紫外分光光度仪(日本岛津公司)；8823A-UV型紫外检测仪(北京新技术应用研究所)；EL311SX酶联仪(美国BIO-TEK公司)；φ71型pH计(美国贝克曼公司)；EAGLE EYE II型成像仪(美国STRATAGENE公司)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)；PYX-DHS-40×50型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；LRH-250A生化培养箱(广东省医疗器械厂)。

2.1质粒DNA的小量提取

自RMG平板上挑取单克隆菌落，接种于RM(氨苄浓度100μg/μl)培养基，30℃培养至OD值为1.0～2.0，取菌液1ml利用Wizard Plus Minipreps DNA系统提取质粒，具体操作参照说明书。

2.2电转化感受态细胞的制备

g.挑取单克隆GI826宿主菌在50mlLB培养基中37℃培养12～16小时；

h.50ml过夜培养的菌液加入1L LB培养基中，37℃培养至OD₅₅₀为0.6

i.菌液冰浴30min，4℃2000g离心15min，弃上清；

j.预冷的无菌去离子水500ml悬浮沉淀，4℃2000g离心15min；

k.预冷的无菌去离子水250ml悬浮沉淀，4℃2000g离心15min；

l.预冷的10％无菌甘油10ml悬浮沉淀，4℃4000g离心15min；

m.预冷的10％无菌甘油1ml悬浮沉淀，分装于0.5ml离心管中，-70℃保存备用。

2.3模拟表位基因片段的获得

a.基因片段的设计合成：根据线性12肽库对C型单抗的筛选结果，选取模拟表位氨基酸序列YSPHQWWLSGAV，把带有该片段的噬菌体克隆命名为P44。

按照原始测序结果并在5`端加ApaI，3`端加XhoI合成如下碱基序列：

44-1：5`CAGTATTCGCCTCATCAGTGGTGGCTTAGTGGTGCTGTTGC 3`

44-2：5`TCGAGCAACAGCACCACTAAGCCACCACTGATGAGGCGAATACTGGGCC3`

b.合成片段的退火反应：将合成的互补片段分别溶于灭菌去离子水中，使其浓度为1μg/μl，以等摩尔取互补片段各10μl，加入退火缓冲液(10mM Tris，pH7.5～8.0，50mMNaCl，1mM EDTA)3μl，用去离子水补至终体积为50μl，混匀后放入95℃水浴，缓慢降至室温。

2.4外源片段与载体的连接

重组质粒构建示意图：如图3

a.载体的酶切：根据插入片段所加的酶切位点，以相应的酶对载体进行酶切。操作按酶切说明书进行，可适当放大反应体系；

b.连接反应：酶切的载体回收纯化，插入片段与载体片段以5∶1的摩尔比，16℃连接过夜，反应体系10μl。

2.5质粒的电转化

根据所用的菌种，电转仪的参数设置为：25μF，2.5kV，200Ω；采用0.2mm电转杯，将100μl电转感受态细胞与2μl连接产物混匀后加入预冷的电转杯，置入电击槽中，电击4msec，迅速加入900ulSOC(室温)培养液，37℃缓慢振摇45min，将菌液涂布于RMG-Amp培养板中，待菌液干后，于30℃培养箱中倒置培养(不超出12小时)。

2.6重组质粒的鉴定

a.酶切鉴定：按酶切说明书，分别用Apa I，Xho I，EcoR V进行单酶切，电泳观察酶切条带；(如图4，图5)由于外源片段的插入对质粒基因组的大小改变不显著，所以直接用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳不易鉴别；但由于外源片段的插入，改变了原载体多克隆位点的酶切图谱，使一些酶切位点被切除，利用这一改变可对重组质粒作初步鉴定：即用载体中保留的及被切除的酶切位点的内切酶消化原质粒及重组质粒，针对我们所设计的片段，EcoRV位点被切除；Apa I，Xhol I等位点依然保留，这样，能被Xhol I切开而不能被EcoRV切开的可能为重组质粒；能被两种酶切开的则是原质粒。

b.测序鉴定：将经上述方法初步鉴定为阳性的克隆作DNA测序鉴定(结果如图6)。经序列比对，所得序列与目的序列完全一致。

2.7模拟表位融合肽在鉴别诊断中的应用

a.将噬菌体克隆P44作为抗原包被96孔酶联板(浓度1μg/100μl)，每孔100μl，4℃孵育过夜；设M13噬菌体肽库包被对照和不包被空白对照。

b.倒掉包被液，每孔加入250μl 10％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；

c.洗去封闭液，用ELISA方法对A型和C型单抗及多抗鸡血清(均由北京市农林科学院畜牧兽医研究所保存)分别进行检测，并设SPF鸡血清对照，血清稀释度为1∶100，37℃孵育1h；

d.在加入单抗的孔中加入羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗，在加入鸡血清多抗的孔中加入兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗。采用TMB显色系统显色，测定OD₄₅₀。

e.重组噬菌体P44与不同HPG抗体的ELISA结果以及噬菌体肽库与不同HPG抗体的EUSA结果见表3。

                         表3 噬菌体与不同抗体的ELISA反应

  包被  单抗                      羊抗鼠IgG-HRP，重复孔OD₄₅₀  平均  P44  HPG-C-44  1.211  1.043  1.176  0.897  1.129  0.899  1.262  0.997  1.077  HPG-A-86  0.066  0.071  0.056  0.068  0.082  0.049  0.051  0.067  0.064  M13  HPG-C-44  0.101  0.068  0.078  0.094  0.063  0.061  0.083  0.088  0.080  HPG-A-86  0.049  0.048  0.062  0.067  0.064  0.058  0.045  0.049  0.055  空白  HPG-C-44  0.022  0.021  0.034  0.029  0.019  0.025  0.026  0.027  0.025  HPG-A-86  0.018  0.016  0.022  0.019  0.036  0.024  0.033  0.016  0.023  包被  多抗                      兔抗鸡IgG-HRP，重复孔OD₄₅₀  平均  P44  C型多抗  0.579  0.618  0.495  0.613  0.601  0.509  0.608  0.476  0.562  A型多抗  0.089  0.068  0.078  0.084  0.067  0.066  0.088  0.069  0.076  M13  C型多抗  0.101  0.102  0.088  0.094  0.099  0.109  0.078  0.089  0.095  A型多抗  0.057  0.069  0.082  0.068  0.075  0.054  0.066  0.049  0.065  空白  C型多抗  0.032  0.035  0.029  0.041  0.036  0.050  0.028  0.044  0.037  A型多抗  0.029  0.028  0.035  0.037  0.044  0.021  0.033  0.038  0.033

表3的ELISA结果显示带有目的肽段的噬菌体P44能特异结合Hpg-C-44单抗及HPG-C多抗血清，而不与Hpg-A型单抗及HPG-A多抗血清结合，两者有显著性差异(p＜0.01)；不带目的肽段的M13噬菌体与A型和C型单抗或多抗均不反应。

因此该方法能方便快捷地识别HPG致病菌是否为C型，为按血清型进行免疫接种提供鉴别依据。

实施例3：模拟表位融合肽在疫苗中的应用

3.1实验动物及材料

45日龄非免疫鸡56只，购自北京市实验动物研究所；诱导表达后的重组菌F44；诱导后的带有空载体的宿主菌F0；HPG-C活细菌等，本研究室保存；SPF鸡抗HPG-C的抗血清，HPG油乳剂灭活疫苗等，本研究室保存。

3.2展示模拟表位的重组菌的诱导表达

将经测序鉴定正确的重组菌(命名为F44)菌液按1∶100比例接种于RM培养基，(氨苄浓度为100μg/μl)中，30℃振荡培养15h，(约为2.0-3.0)；取过夜菌40μl接种至2mlIMC培养基中，色氨酸(浓度为100μg/ml)诱导，37℃振荡培养6h，收集菌体，检测OD₆₀₀，根据吸收值确定电泳上样体积，检测菌体的诱导表达。(如图7)

3.3表位展示疫苗的安全性试验

45日龄非免疫鸡16只，用诱导表达后的F44活菌分别口服(滴鼻、点眼)、肌注注射各8只，剂量为5亿菌/只，是免疫剂量的5倍。三周内观察实验鸡有无异常反应；安全性检验的试验鸡在试验期间没有出现任何异常现象，说明本表位疫苗在鸡体内不产生任何的不良反应。

3.4表位疫苗的保护性试验

45日龄非免疫鸡40只分A、B、C、D、E五组，8只/组。A、B两组分别用重组菌F44活菌肌注、滴鼻点眼免疫。首免1亿菌/只，三周后进行二次免疫，剂量及途径同首免；C组为常规疫苗免疫对照组，用二价油乳剂灭活菌苗(本所生产)肌注0.5ml/只；D组为空载体宿主菌免疫对照组，用不含有目的肽段的F0活菌肌肉注射，1亿菌/只，免疫方法同F44；E组为不免疫对照组，试验全程不使用任何副鸡嗜血杆菌疫苗免疫，肌注相同剂量的生理盐水。二次免疫三周后，用HPG-C强毒(668株)细菌给所有试验鸡攻毒，眶下窦注射20万菌/只，分别观察各组的保护情况。实验结果见表4。

第一次免疫之前随机采集8只试验鸡的血清；第二次免疫之前以及最后攻毒之前分别采集各组试验鸡血清并编号，以备抗体检测之用。

             表4：重组菌作为表位疫苗的免疫保护试验

组别  免疫后试验鸡发病情况  生理盐水对照组发病情况F44  滴鼻  0/8  7/8  肌注  0/8F0  6/8常规疫苗  0/8

试验结果是：不免疫对照组鸡只7/8发病，而重组菌F44免疫鸡两组共16只全部免疫保护，没有发病；常规疫苗免疫组也全部保护，没有发病；空载体宿主菌免疫的试验鸡6/8发病。说明该重组菌作为副鸡嗜血杆菌疫苗，具有预防HPG-C攻击的能力。

3.5重组菌免疫血清与天然HPG-C抗原的反应

用HPG-C细菌抗原包被ELISA反应板，与重组菌免疫后不同时期采集的鸡血清(见上述步骤3.4)进行反应，并设HPG-C阳性血清对照和SPF鸡血清对照。

a.包被C型副鸡嗜血杆菌(浓度为10¹⁰cell/ml)的超声破碎液，每孔100μl，4℃孵育过夜；

b.每孔加入250μl 10％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；

c.洗去封闭液，每孔相应加入重组菌与宿主菌免疫后的血清，血清稀释度为1∶100，37℃孵育1h；

d.用ELISA方法检测不同细菌免疫鸡血清与副鸡嗜血杆菌的反应性。

e.酶标二抗用兔抗鸡IgG-HRP，采用TMB显色系统显色，测定OD₄₅₀。结果见表5。

                表5.重组菌免疫血清与天然抗原副鸡嗜血杆菌的ELISA反应

  免疫情况                                   血清ELISA OD₄₅₀值  平均  免疫前  0.063  0.078  0.071  0.098  0.085  0.081  0.091  0.079  0.081  滴鼻  点眼  F44一免  0.304  0.308  0.291  0.307  0.440  0.330  0.385  0.366  0.341  F44二免  0.474  0.451  0.464  0.469  0.591  0.529  0.474  0.461  0.489  肌肉  注射  F44一免  0.376  0.460  0.304  0.297  0.324  0.293  0.317  0.336  0.305  F44二免  0.485  0.576  0.499  0.406  0.492  0.490  0.507  0.423  0.511  常规疫苗免疫  1.201  1.103  1.089  1.011  1.065  1.023  1.008  1.087  1.073  F0肌注  0.079  0.083  0.101  0.097  0.087  0.078  0.085  0.095  0.088  生理盐水肌注  0.069  0.077  0.073  0.108  0.095  0.088  0.101  0.109  0.090

附图：一种C型副鸡嗜血杆菌的抗原模拟表位肽的优选序列

SEQ 1：YSPHQWWLSGAV