高纯度蛇床子素及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物

摘要

本发明公开了高纯度蛇床子素的光谱分析结构确证、制备工艺方法、稳定性研究、急性毒性研究、含蛇床子素的药物组合物，以及该天然产物新的药物用途。将中药蛇床子经过乙醇提取，大孔吸附树脂脱色富集，以及树脂分离纯化等工艺步骤处理，得到纯度在98％以上的蛇床子素。本发明蛇床子素药理活性的研究表明，其具有明显的抗肝癌、抗自发淋巴瘤、肿瘤辐射增敏以及对白细胞减少症有升白作用等药理活性。蛇床子素有望研制成为低毒高效且具有多种药理功效的天然中药成分的肿瘤防治新药及肿瘤辅助治疗用药。

说明书

技术领域：

本发明高纯度蛇床手素的提取分离技术属于医药领域中天然药物单体成分的制备技术。特别是涉及高纯度蛇床子素的提取分离，以及蛇床子素在制备防治肿瘤、肿瘤辐射增敏、升高白细胞等药物中的应用。

背景技术：

大孔吸附树脂法是二十世纪七十年代发展起来的一项新工艺技术，由于其具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等优点，近年来在中药有效成分的提取分离，中药制剂的质量控制与分析方面广泛应用。大孔树脂吸附技术能缩短生产周期，而且所需设备简单，免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序；药物精制后体积缩小，成本降低，同时为中药进入国际市场创造了条件；大孔树脂吸附技术，操作工艺简便，且容易再生，可多次使用，溶剂可以回收重复利用。

众所周知，中药提取和精制工艺的滞后，导致中药粗(杂质多)、大(服用量大)、黑(颜色深)，是制约中药产业化发展和拓展国际市场的主要因素之一。因此用大孔吸附树脂探索快速分离蛇床子素，适合产业化生产。本发明所研制的高纯度蛇床子素提取分离工艺解决了这一技术难题，可以方便快速地得到纯度大于98％的蛇床子素，而且该工艺可以实现产业化，为该天然药物成分的开发应用建立了新的制备工艺方法。

蛇床子素(Osthol)又名甲氧基欧芹酚，其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是首先从伞形科植物中提取分离得到的一种香豆素化合物。其结构式为：

其在伞形科植物蛇床的干燥成熟果实蛇床子(Fructus Cnidii)中含量较高，平均含量约为2％。蛇床子素是中药蛇床子中所含的主要活性成分，具有广泛的药理活性，如抗骨质疏松、抗病毒、抗突变、抑制血小板聚集、增强免疫功能、治疗肝炎和补肾壮阳等功效，因而受到人们的普遍关注。通过对国内外专利及文献检索发现，目前国内外尚未有一种稳定得到高纯度蛇床子素的产业化工艺方法，致使蛇床子素以总香豆素的药物形式使用，影响了其疗效的正常发挥，稳定性和重现性差。目前使用超临界萃取技术得到的蛇床子素纯度一般不超过87％。无法使蛇床子素作为单一组分药物在临床使用。目前，尚没有一个国家将其作为药物来研究开发，推向市场。

发明内容：

鉴于上述原因，本发明人对从中药蛇床子中提取分离蛇床子素的工艺方法进行了大量的实验研究，确定了大孔吸附树脂法，用于蛇床子素提取、分离、纯化的制备工艺方法，并进行了结构分析确证和稳定性加速实验研究，得到纯度稳定在98％以上的蛇床子素，从而完成了蛇床子素的工艺发明、和含有蛇床子素的药物组合物，以及该组合物在制备防治肿瘤、肿瘤辐射增敏和升高白细胞药物中的应用。

本发明的一个目的在于，公开了采用大孔树脂吸附洗脱法得到纯度大于98％的蛇床子素单体。

本发明另一个目的在于，公开了蛇床子素在用于制备抗肿瘤、肿瘤辐射增敏、升高白细胞药物方面的应用。

本发明再一个目的在于，公开了含有治疗有效量的蛇床子素，及与一种或一种以上药学上可接受的载体组成的药物组合物。

本发明进一步详细地公开了纯度大于98％的蛇床子素的制备工艺方法。本发明的技术方案通过以下内容予以实现：

一种高纯度蛇床子素，它是将中药蛇床子经乙醇煮提，大孔吸附树脂脱色富集，以及通过树脂分离纯化，结合重结晶得到纯度大于98％的蛇床子素。所述的大孔吸附树脂为NKA-9，NKA-12，D4020或AB-8。

具体按以下工艺步骤进行：

(1)提取：称取一定量的蛇床子药材，以60～95％乙醇煮提3～4次，每次1～2小时，合并乙醇提取液，浓缩回收乙醇；

(2)分离：将乙醇提取物经大孔树脂柱，以水洗、弃去前流出水溶性成分-I，30～45％乙醇洗除部分前流分-II；以50～90％乙醇洗脱部分-III，为含蛇床子素60％以上的香豆素成分；

(3)精制：，选取NKA-9大孔吸附树脂进行分离精制，以环己烷、氯仿∶石油醚(40∶1～10∶1)、乙酸乙酯∶石油醚(40∶1～10∶1)或正己烷洗脱，得到蛇床子素粗产物；蛇床子素以活性炭脱色，以甲醇-水、乙醇-水、石油醚、正己烷或环己烷重结晶得到纯度大于98％蛇床子素。

(4)树脂再生：树脂柱以乙酸乙酯、丙酮、甲醇或氯仿等洗脱吸附的色素后再生，重复使用。

本发明对提取、分离及精制工艺进行多次重复，使用了4个溶剂洗脱系统。使用了不同极性的4种大孔吸附树脂进行分离脱色吸附：NKA-12，NKA-9，D4020或AB-8；用于精制的吸附树脂为NKA-9，优化了提取分离工艺。产品纯度均保持在98％以上，部分产品纯度甚至可达100％(HPLC结果)。利用本工艺生产多批产品，稳定、重现性好。

对其稳定性进行加速实验考察(高温、高湿、强光照射)，结果发现其对高温、高湿、强光照射稳定、无分解，纯度及理化指标不变。技术指标达到一类新药报批的要求，工艺适合工业化生产。

           蛇床子素稳定性加速实验             批号：0309

蛇床子素经IR、UV、MS、¹H-NMR、元素分析、熔点、TLC及性状分析，与文献对比相一致。

蛇床子素具有如下理化特性：

在显微镜下鉴定产品为无色柱状结晶；在紫外灯下呈蓝色荧光。

Mp：82-84℃

TLC R_f值：0.68(对石油醚∶乙酸乙酯3∶1系统)

光谱分析：

1.红外光谱：

IR^KBr_maxcm^-1：2965，2910(CH₃，CH₂)；1720(α，β不饱和δ-内酯)；

1604，1461(苯环)，1383(偕甲基)

2.紫外扫描：

Shimadzu UV-3000紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。将蛇床子素溶于甲醇，配成2mg/50ml的溶液，进行紫外扫描，波长为200nm～800nm。扫描结果样品在220nm出现一强吸收峰，在254nm出现一小的肩峰，在310～330nm之间成强吸收峰带。

3.核磁共振氢谱：

甲基1.64(3H s)；1.82(3H s)；甲氧基3.89(3H s)；亚甲基3.50(2H J＝g.3d)；次甲基5.20(1H J＝t)；苯环6.80，7.26(2H J＝8.7dd)；酯环双键6.20，7.58(2H J＝9.4dd)

4.元素分析：

分子式：C₁₅H₁₆O₃，分子量：244.29；

计算值  C％      73.75％；H％     6.60％

实测值  C％      73.64％；H％     6.50％

5.质谱分析：244(分子离子峰)；229(去CH₃峰)；201(去峰)；189(去峰)；175(去峰)。

6.气相色谱——产品溶剂残余分析：

A.气相色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱，固定液为SE-54，柱子规格0.53mm×30m；柱温在50℃进样1ml；进样室温度为200℃；检测器为FID；载气为N₂，流速为50ml/min。

B.操作：样品顶空进样，温度60℃，30min。

C.气相色谱结果：甲醇标准品：进样量0.4214g，保留时间1.522min，峰形BB，峰面积242μVs蛇床子素样品：进样量0.78mg，保留时间1.546min，峰形BB，峰面积38μVs甲醇含量(38/242)×(0.78mg/0.4214g)＝0.29mg/g，为0.029％，残留量低，符合制药要求。

纯度测定：

1.高效液相层析：流动相为80％甲醇，检测波长为322nm，C18填料柱HPLC测试多批样品纯度均在98％以上，有时纯度可达100％。

药物组合物：

本发明的以蛇床子素为活性成分的药物组合物，含有治疗有效量的蛇床子素，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。其中，所述的蛇床子素治疗有效量为5～300mg；较好为15～200mg；最佳25～150mg。

所述的组合物包括口服制剂、注射油剂或外用制剂，其中口服制剂为片剂、各种胶囊、缓释片或滴丸；液体制剂为注射用油制剂；外用制剂为霜剂、膏剂、油剂或甘油制剂。

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与蛇床子素混合，当蛇床子素用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。

压片制成片剂的使用，用作赋型剂的辅料有MgSO₄、玉米淀粉、滑石粉，规格有：50mg、100mg、150mg、200mg。

蛇床子素油剂：将蛇床子素溶于注射用茶油、豆油等配成注射油剂。

各种药物制剂的制备具体操作如下：

(1).按配置总量计称取含10～70％蛇床子素，加入30～90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时压制成片，使每片含蛇床子素40～240mg。

(2).将制成的湿颗粒直接在60～70℃干燥2～4小时，然后充填入空胶囊壳中，使每粒胶囊含蛇床子素30～300mg。

(3).油剂的制备：是取1％～10％的蛇床子素与注射用油，如茶油配制成油剂，分装灭菌，制得。

(4).按配置总量计，称取10％～60％蛇床子素，加入40％～90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度(40～90℃)，使原料和辅料充分混熔，滴制成丸，使每粒滴丸含蛇床子素5～30mg。

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为5～300mg/kg；较好为15～200mg/kg；最佳为25～150mg/kg。可根据临床的病例表现适当加以改变。

本发明还公开了高纯度蛇床子素在用于制备防治肿瘤、肿瘤辐射增敏、升高白细胞药物方面的应用。其中，所述的抗肿瘤活性包括：制备治疗肝癌、淋巴瘤、宫颈癌药物方面的应用。例如蛇床子素对肝癌、(自发)淋巴瘤、(U₁₄)宫颈癌、对¹⁵⁷Csγ-射线致白细胞减少症的升白作用。

下面的药理实验证实了蛇床子素具有上述药理作用。

药效学研究包括：

(1)体外抗癌实验

(2)体内抗癌实验

(3)对射线的协同增效作用实验

(4)升高白细胞实验

(5)急性毒性实验

一、体外抑瘤作用：

实验方法：实验采用MTT检验方法。

(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.02％的EDTA消化后加入含有10～15％胎牛血清的RPMI-1640溶液，将细胞稀释成单细胞悬液，计数并调整细胞数并接种于96孔板。将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24小时。

(2)加药：将样品A、B分设1.55～200ug/ml等不同浓度，每浓度设4个复孔，对照设8个以上复孔。被检样品用RPMI-1640稀释，用DMSO助溶。加药后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72小时。

(3)加MTT：MTT以RPMI-1640溶解，每孔加50ul。再置37℃继续培养4小时后取出。

(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO 150ul。在酶标仪630nm处测定OD值。

评价指标：细胞生长抑制率。抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。以直线回归方法计算IC₅₀。结果：对肝癌细胞系Be1-7402的细胞毒性作用，IC₅₀为123.92ug/ml；对人肺腺癌A549，测定其IC₅₀为67.83ug/ml。

二、体内抑瘤作用：

抑制自发淋巴瘤实验

1材料

1.1动物选择：我所自行繁殖IRM-2纯系小鼠，30只，体重22-25g，雌雄兼用。

1.2瘤种：从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤传代培养。

1.3药物配制：取含量为99.6％的蛇床子素，研细并配制成浓度为0.095mg/ml，0.14mg/ml，0.21mg/ml的混悬液，溶剂为双蒸水，给药时振摇均匀。

2接种方法：选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，酒精消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。接种后第2天开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为1.11mg/kg、1.67mg/kg、2.25mg/kg，连续给药10天。

3疗效评价：停药后24小时处死动物称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。

肿瘤抑制率：C-T/C×100％

式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重

         蛇床子索对IRM-2小鼠自发淋巴瘤的抑制作用

结果表明，蛇床子素在2.50mg/kg时，对淋巴瘤的抑制率为74.2％，与阳性对照药环磷酰胺相当，而毒副反应却明显降低。

对小鼠肝癌H22的抑瘤实验

1材料

1.1动物选择：由中国医学科学院动物研究所提供昆明种小白鼠，72只，体重21-23g，雌雄各半。

1.2瘤种：小鼠肝痛H22引自天津医药工业研究所药理室，传代培养。

1.3药物配制：取含量为99.6％的蛇床子素，研细并配制成浓度为0.07mg/ml，0.14mg/ml，0.28mg/ml的混悬液，溶剂为双蒸水，给药时振摇均匀。

2接种方法：解剖前实验室用紫外灯消毒3小时，选择腹水生长6-7天的传代小鼠，脱臼处死，用碘酒，酒精消毒动物腹部皮肤，无菌条件下在超净台内吸取腹水，以生理盐水按1∶2稀释摇匀，癌细胞记数3.2×10⁷个/ml，在动物右上肢腋窝处皮下接种0.2ml/只，接种后第2天开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.84mg/kg、1.67mg/kg、3.30mg/kg，连续给药10天。

3疗效评价：停药后24小时处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重；并称取胸腺重量、脾脏重量和肝脏重量。

       蛇床子素对小鼠肝癌H22实体瘤的抑制作用

昆明种小鼠接H22肝癌给药后体重及脏器指数及重量的比较

*与顺铂阳性对照比，有显著性差异，P＜0.01

结论：药物抑瘤活性明显，比阳性对照药顺铂毒性明显降低。对射线的协同增效作用：

蛇床子素对1×5Gy ¹³⁷Csγ-射线照射小鼠宫颈癌U14的抑瘤增效作用

1、材料

1.1动物选择：由中国医学科学院动物研究所提供昆明种小白鼠，雌雄各半。

1.2瘤株：小鼠宫颈癌U14引自天津医药工业研究所药理室，传代培养。

1.3药物配制：取含量为99.6％的蛇床子素，研细并配制成浓度为0.07mg/ml，0.14mg/ml，0.28mg/ml的混悬液，溶剂为双蒸水，给药时振摇均匀。

2、方法：

2.1接种：选择腹水生长6～7天的传代小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，酒精消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内吸取腹水，以生理盐水按1∶2稀释摇匀，癌细胞记数为3×10⁷个，在动物左侧腋窝处皮下接种0.2ml。接种后第2天开始口服灌胃给药0.3ml/只，折合剂量为0.84mg/kg、

1.67mg/kg、3.30mg/kg，连续给药10天。

2.2照射：以1Gy ¹³⁷Csγ-射线在接种后第3天开始照射，每天1次共计照射5天。

2.3疗效评价：停药后24小时处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。取胸腺、脾脏称重，观察胸腺指数及脾指数；取一侧股骨，5mM氯化钙溶液冲洗骨髓，测定DNA含量。

蛇床子素对¹³⁷Csγ-射线照射宫颈癌U14的抑瘤增效作用

升高白细胞作用：

1.实验材料：

1.1动物：ICR小鼠40只，体重22～24g，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物有限公司。

1.2实验方法：

1.2.1药物配制：取含量为99.6％的蛇床子素，研细并配制成浓度为0.07mg/ml，0.14mg/ml的混悬液，溶剂为双蒸水，给药时振摇均匀。

1.2.2分组与给药：动物随机分为4组，10只/组，分别为照组、炔雌醇阳性对照组和蛇床子素(99.8％)1.67mg/kg和0.84mg/kg剂量组。照射后第3、2、1天连续3次给药，照射后再连续给药5天。口服灌胃，0.3ml/只，对照组给予双蒸水。

1.2.3致伤条件：¹³⁷Cs-γ射线一次性全身照射，剂量率为89.1404伦/分，剂量为4Gy。

1.2.4观察指标：

(1)白细胞计数：照射后第9天眼眶取血，白细胞稀释液稀释，电子显微镜下计数白细胞数。

         4Gy Cs¹³⁷γ-射线全身照射ICR小鼠抗放试验结果

注：*P＜0.01；股骨有核记数为×10⁹/L。

(2)DNA含量：照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，5mM氯化钙溶液冲洗骨髓。加入0.2N的高氯酸反应液，虑液用紫外分光光度计测定吸光度。

(3)取胸腺、脾脏，观察胸腺指数及脾指数。

结论：蛇床子素对4Gy Cs¹³⁷γ射线全身照射ICR小鼠抗放试验结果表明，蛇床子素对射线引起的白细胞低下有显著的升白作用，比对照组升高32.5％(P＜0.01)。

急性毒性实验：

昆明种小鼠每组6只，雌雄各半，分别口服灌胃给药800mg/kg、1600mg/kg、2000mg/kg时(药液已很粘稠)均无死亡，而且饮食、精神均正常。而其最佳有效抑癌剂量为1.00～2.50mg/kg，药物是非常安全的。

本发明的高纯度蛇床子素及其提取方法和现有技术相比具有如下的优点：

(1)利用蛇床子提取分离蛇床子素，具有含量高，提取收率高的特点。收率在1～2％之间，且药物资源丰富，价廉易得。

(2)采用大孔吸附树脂法提取分离蛇床子素具有工艺简单，分离快速可以实现规模化生产，工艺稳定可重复；有效成分提取完全，避免药物资源的浪费；树脂可以再生，溶剂可以回收重复利用而降低成本的特点。

(3)本发明的蛇床子素具有有效成分确切，纯度高，稳定性好，药效稳定的特点。

(4)由于有效成分确切，纯度高，杂质少，低溶剂残留，药物具有质量稳定可控制的特点。

附图说明：

图1为0309批蛇床子素的高效液相图谱，含量为99.8％。

图2为0403批蛇床子素的高效液相图谱，含量为99.6％。

图3为蛇床子素提取分离的工艺流程图。

具体实施方式：

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制剂实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。制剂可以采用本发明中的任意一批的化合物活性成分。下面通过实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

(1)100g蛇床子药材，加500～800ml的80％乙醇回流提取3次，每次回流1小时。合并乙醇液旋转蒸发，于65℃回收乙醇，残余水混浊液220ml上大孔吸附树脂住，有效柱长43cm，柱直径6cm(NKA-12)，上样并以1500ml水洗脱(水液I弃去)。而后以40％乙醇1500ml洗脱，得到棕色洗脱物，HPLC显示不含蛇床子素(得到II)。以75％乙醇洗脱得到蛇床子素为主的香豆素成分(得到III)。树脂柱以丙酮洗脱吸附的色素后再生。III部分回收溶剂在60℃烤箱干燥后得到浅黄色固体物质，HPLC检测蛇床子素含量在60％以上，以大孔树脂柱进行分离，选取NKA-9大孔树脂120g，有效柱长60cm，直径4.5cm，以正己烷洗脱，得到蛇床子素，待TLC监测蛇床子素出尽。换以丙酮洗脱，除去吸附的其他成分，树脂得以再生。回收溶剂，得蛇床子素1.7克，收率为1.7％。经活性炭脱色，乙醇-水重结晶，HPLC检测蛇床子素含量在99.8％(批号0309，见附图1)。

(2)200g蛇床子药材，加1000～1500ml的85％乙醇回流提取3次，每次回流2小时。合并乙醇液旋转蒸发，65℃回收乙醇，残余水混浊液300ml上大孔吸附树脂住，有效柱长60cm，柱直径7.5cm(AB-8)，上样并以1500ml水洗脱(水液I弃去)。而后以35％乙醇2500ml洗脱，得到棕色洗脱物，HPLC显示不含蛇床子素(得到II)。以70％乙醇洗脱得到蛇床子素为主的香豆素成分(III)。树脂柱以乙酸乙酯洗脱吸附的色素后再生。III部分回收溶剂后，以有机溶剂乙酸乙酯提取富集蛇床子素，HPLC检测蛇床子素含量在65％以上，以大孔树脂进行分离，选取NKA-9大孔树脂200g，有效柱长75cm，直径6.5cm，以环己烷，得到蛇床子素，待TLC监测蛇床子素出尽。换以丙酮洗脱，除去吸附的其他成分，树脂再生。回收溶剂，得蛇床子素3.9克，收率为1.95％。经活性炭脱色，甲醇-水重结晶，HPLC检测蛇床子素含量在99.6％(批号0403，见附图2)。

实施例2：

取蛇床子素50.0g，药用淀粉50.0g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装2#胶囊，每粒含蛇床子素0.1g。

实施例3：

取蛇床子素50.0g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制成1000片，每片含蛇床子素0.05g。

实施例4：

取蛇床子素40g，聚乙二醇-4000 20g，聚乙二醇-6000 60g，焦亚硫酸钠适量，加热熔融温度(40～90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成20000粒滴丸，使每粒滴丸含蛇床子素1.0～3.0mg。

实施例5：

无菌条件下取蛇床子素25g，加入到注射用茶油5000ml中，搅拌约30分钟溶解，灌封、灭菌，即得注射油剂。

在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。