荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统

摘要

本发明提供了一种通过复合扩增14个短串联重复序列基因座，例如FAM：D2S1338、D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO；JOE：D3S1358、D8S1179、D16S539、PentaE；TMAR：D5S818、vWA、D13S317、D18S51和FGA来进行个人识别和亲子鉴定的荧光标记检验系统。上述基因座被证实在中国人群中具有高度的遗传多态性。由于这种特定的组合方式使得将扩增产物控制在400个碱基(bp)范围内，仅需标记三种荧光就可实现这14个基因座的复合扩增。本发明对上述14个短串联重复序列基因座及其等位基因在中国五个少数民族中的遗传特征进行了深入的研究，提供了等位基因标准对照体系和荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统，研发出适合中国人群的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链反应在一个反应中同时扩增多个短串联重复基因座。本发明还涉及一种通过复合扩增14个STR基因座来进行个人识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统。本发明的检验系统适合中国人群。

背景技术

短串联重复序列基因座(STR)是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是STR基因座具有片段小容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。因此美国FBI选择了13个STR基因座用于建立数据库——CODIS(Combined DNA Index System)：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、HUMTH01、TPOX、vWA。这些STR基因座通常被称为13个核心基因座。正因为STR所具备的优点和应用前景，法医学界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行开发性的研究。

90年代中后期以美国ABI公司为代表的研发商建立起荧光复合扩增体系。目前最具代表性的是ABI(Applied Biosystems，USA)公司的Identifiler^TM和Promega(USA)公司的PowerPlex16^荧光试剂盒。这两个试剂盒均包括上述13个核心基因座。

长期的DNA检验实践表明，短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族间存在一定的差异，各个基因座间差别也很大。在美国FBI推荐的13个核心基因座中，有部分基因座遗传多态性不高，或是不同人群间差异较大。由此给DNA检验技术的应用及其效率带来一定的影响。

我们对中国人群的短串联重复序列基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并以此为依据开发新的短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统，突破了现有13个核心基因座(FBI推荐)的模式，提高了DNA检验的效率，同时研发出荧光STR复合扩增检验系统。

发明内容：

本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链反应在一个反应中同时扩增多个短串联重复基因座。本发明还涉及一种通过复合扩增14个STR基因座来进行个人识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统。

本发明适合中国人群的14个短串联重复序列基因座STR基因座构成为：D2S1338、D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、D8S1179、D16S539、PentaE、D5S818、vWA、D13S317、D18S51和FGA。本发明对上述14个短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入的研究，表明这14个短串联重复序列基因座在中国人群中具有高度的遗传多态性和良好的等位基因频率分布。

在实际的检测中将上述14个短串联重复系列基因座加上用于鉴别人性别的Amelogenin基因座形成15个基因座同时检测的STR系统。

本发明提供了一种通过复合扩增15个STR基因座来进行个人识别和亲子鉴定的荧光标记STR复合扩增检验系统，其荧光组合方式为FAM荧光素标记：D6S1043+D21S11+D7S820+CSF1PO+D2S1338 ；JOE荧光素标记：D3S1358+D13S317+D8S1179+D16S539+PentaE；TMAR荧光素标记：AMEL+D5S818+vWA+D13S317+D18S51+FGA。由于这种特定的组合方式将扩增产物控制在400个碱基(bp)范围内。该基因座构成，突破了现有13个核心基因座(FBI推荐)的模式，更加符合法医学DNA检验的技术要求与中国人群的群体遗传学特征，并兼顾了国际交流与共享的标准需求。

本发明提供了荧光标记STR复合扩增体系的基因座组合设计方案。本发明选用了羧基荧光素作为蓝色荧光标记试剂；同时选择四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA)和六氯荧光素(JOE)分别作为黄色和绿色荧光标记试剂，内标选用CXR，构建了4色荧光组合方案。这种独创的基因座组合方式能够仅需标记三种荧光就可实现这15个基因座在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400个碱基(bp)范围内而实现高灵敏度。

本发明提供一种用于同时分析基因组DNA的多个STR基因座的荧光标记复合扩增系统，包括用于复合扩增分析的15个基因座的寡核苷酸引物，全部15个基因座的引物混合在一个试管内。复合扩增体系中的基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。

本发明提供一种与DNATyper15系统对应的等位基因标准对照物体系。

本发明在国内首先研制出15个基因座同时在单一反应中的复合扩增的四色荧光标记STR复合扩增检验系统(DNATyper15)，达到目前国际上荧光标记STR复合扩增试剂盒的最高水平。

其良好的应用效果主要表现在下述几个方面：

1.系统的灵敏度

本发明所研制的DNATyper15荧光标记STR复合扩增检验系统在DNA模板量为0.125ng的条件下，可检出全部15个基因座。

2.无关个体的相关概率

用DNATyper15荧光标记STR复合扩增检验系统对中国汉族群体共300多个样品进行遗传学调查的结果表明：该试剂在中国汉族人群中的总体随机匹配概率为3.49×10^-18，其累积非父排除率为0.9999996。

3.实际应用的效果

本发明所研制的DNATyper15荧光标记STR复合扩增系统已在国内10个省市的公安系统的案件检验工作中试用，试用结果表明该系统多态性高，平衡性较好，灵敏度高，分型结果准确，完全能够满足实际案件检验的需要。

发明详述

一、基因座的确定

对现有的STR基因座进行深入分析研究并优选新的高鉴别力基因座。对D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P0、D3S1358、D13S317、D16S539、TPOX、TH01、D5S818、vWA、D18S51、FGA、D2S1338、D19S433、Penta E、Penta D、D19S253、D12S391、D1S1612、D9S302、D18S535、D15S816、D6S1043等24个STR基因座在中国人群的遗传多态性开展调查研究。研究确立了STR基因座构成，即D2S1338、D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、D8S1179、D16S539、PentaE、D5S818、vWA、D13S317、D18S51和FGA。该基因座构成，突破了现有13个核心基因座(FBI推荐)的模式，更加符合法医学DNA检验的技术要求与中国人群的群体遗传学特征。

二、荧光标记STR复合扩增体系的基因座组合方案设计

本研究对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了羧基荧光素作为蓝色荧光标记试剂；同时选择四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA)和六氯荧光素(JOE)分别作为黄色和绿色荧光标记试剂，内标选用CXR，构建了4色荧光组合方案。

在确定4色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，在国内首次自行设计出15个基因座组合方式：蓝色(FAM)标记D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO和D2S1338；绿色(JOE)标记D3S1358、D13S317、D8S1179、D16S539和Penta E；黄色(TAMRA)标记Amelogenin、D5S818、VWA、D18S51和FGA，并根据各基因座所在位置自行设计出15个STR基因座的引物序列。

这种独创的基因座组合方式和引物设计能够仅需标记三种荧光就可实现这15个基因座在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400个碱基(bp)范围内而实现高灵敏度。

本发明在国内首先研制出15个基因座同时在单一反应中的复合扩增的四色荧光标记STR复合扩增检验系统(DNATyper15)，达到目前国际上荧光标记STR复合扩增试剂盒的最高水平。

三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立

1、基因座之间平衡度的调配

随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，通过多次的反复实验，不断调节引物浓度与配比，最后达到平衡。

2、复合扩增条件的建立

先对15个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究15个基因座复合扩增PCR反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如，循环参数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，建立起复合扩增体系，同时扩增出15个基因座。

附图说明

图1为用上述方法检验对无关个体DNA样品的STR分型结果；

图2为DNATyer15系统中全部基因座的等位基因分型标准物；

图3为用实施例1的方法检测一例父-子-母三联体亲子关系的结果图。

具体实施方式

实施例1

DNATyper15荧光标记STR复合扩增系统的复合扩增及荧光检测人类的STR

                 基因型

1、PCR扩增体系

DNATye15     5×反应液          4.0μl

DNTyper15    引物混合物         2.0μl

GoldTaqDNA   聚合酶             0.4μl

模板DNA样品                     1μl

水                              12.6μl

总反应体积                      20μl

2、扩增热循环

(1)将PCR扩增管置于热循环仪上。

(2)选择下面推荐的程序进行热循环。

(3)扩增后的样品应长期避光保存在-20℃，

9600和9700热循环仪的扩增程序

初始变性  变性  退火  延伸终延伸    保温             30循环95℃ 11分钟94℃ 1分钟59℃ 1分钟72℃ 1分钟60℃ 45分钟25℃维持

3、扩增产物用310或3100遗传分析仪荧光检测

(1)用ABI PTISM^ 310遗传分析仪检测扩增产物

①样品的准备

由内标600(ILS 600)及去离子甲酰胺组成的上样混合物：[(0.35μlILS600)×(进样数)]+[(12.0μl去离子甲酰胺)×(进样数)]，混合。将12μl混合物和1.0μl的扩增产物混合。准备上样。

②仪器设置

将样本及DNATyter15系统中的Allelic Ladder在95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，变性之后尽快电泳。

(2)用ABI PRISM^3100 DNA遗传分析仪检测扩增产物

样品准备

按下面方法准备由内标600(ILS 600)及去离子甲酰胺组成的上样混合物：[(0.35μl ILS 600)×(进样数)]+[(20.0μl去离子甲酰胺)×(进样数)]，混合。将15μl混合物和1.0μl的扩增产物混合。准备上样。

将样本95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟。之后尽快在ABI PRISM^3100遗传分析仪上电泳。

实施例2

应用DNATtper15荧光标记STR复合扩增系统进行亲子鉴定。

1、原理：

根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下，鉴定方法的基本原理可归纳为两点：①孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；②孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。也就是说在肯定孩子的某个等位基因为生父基因，而假设父并不带此等位基因时，可排除他为孩子的生父；在肯定孩子的某个等位基因来自于其父亲，而假设父也带有此等位基因时，不能排除他为孩子的生父。如果比对样品的分析不同，可以排除他们的亲缘关系，如果相同，则不能排除。理论上假设父与孩子之间在一个遗传标记上不符合遗传规律可以排除其父子关系，但由于突变的存在，尤其是微卫星标记(STR)的高突变率，一个基因座的排除，可能是由突变造成的，因此一个遗传标记的不符不能排除其亲子关系，要求在3个不同基因座同时排除才能否定其亲子关系。

在大多数情况下，母子关系是已知的，要求鉴定父亲和孩子是否亲生关系。

在所有检验的遗传标记均不排除的情况下，一般需计算父权概率。

2、亲权指数的计算(PI)：

父权指数(PI)，又叫亲子关系指数，是指被控父亲具备必需等位基因成为生物学父母的机会(X)与随机男人具备必需等位基因成为生物学父亲机会(Y)的比率。

PI＝X/Y＝f×c/f×g

f表示生母给孩子必需等位基因机会

c表示被控父亲给孩子必需等位基因机会

g表示随机男人给孩子必需等位基因机会，等于必需等位基因频率各个不连锁位点总的PI等于各个位点PI的乘积。

3、父子关系相对机会(RCP)

父权相对机会，又叫亲子关系相对机会，亲子关系概率或W值，表示被控父亲像生物学父亲的机会。

假定被控父亲是孩子生父或不是孩子生父的前概率相同，这时RCP与PI有如下关系：

RCP＝(PI/PI+1)×100％

总RCP＝总(PI/PI+1)×100％

4、亲子鉴定认定

传统遗传标记，世界范围内亲子鉴定认定标准为RCP≥99.73％。进入DNA时代，国内外没有统一标准，四川省高级人民法院立法亲子鉴定认定标准为RCP≥99.95％。

5、亲子鉴定排除

若检测的父-子、母-子有≥3个以上位点不符合孟德尔遗传定律，则排除亲子关系。