法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-02-12
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12Q1/68 授权公告日:20070117 终止日期:20121217 申请日:20041217
专利权的终止
2007-01-17
授权
授权
2006-04-05
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-02-08
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的研究一直是胃肠病工作者的热门课题,目前有关Hp耐药问题受到消化界和微生物学家的极大关注。许多资料显示Hp不仅可引起慢性胃炎、消化性溃疡,而且与胃癌、胃MALT淋巴瘤和一些心血管疾病、血液病、自身免疫性疾病、皮肤病等有关[1,2]。Hp感染者合并溃疡患者必须接受根除治疗[3],临床常规应用三联或四联疗法根除Hp即质子泵抑制剂或/和铋剂联合克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑/替硝唑等两种抗生素。而耐药菌株的出现给Hp的根除带来很大的困难,克拉霉素治疗其耐药菌株常预示着根除失败的可能性很大[4]。因此,在根除治疗前了解细菌的耐药性至关重要。而且由于抗生素滥用及应用不规范,耐药菌株的出现日益增多,导致Hp耐药率日益升高。研究表明:Hp克拉霉素耐药与23S rRNA基因A2142G、A2143G[5]和C2182T[6]点突变相关。
用于SNPs做基因分析是特指检测人类基因组中大量存在的单核苷酸变异,这与疾病易感性和毒物易感性有关[7]。SNPs不仅是人类种族和个体差异的标记,亦是决定不同人群种族和个体差异的标记,可以成为寻找疾病相关基因,进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。用于SNPs检测的常规方法有等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交,限制性内切酶法(RFLP),位点特异性引物PCR(PCR-SSP)和直接测序等。基因芯片技术的发展为新的SNPs的检测方法提供了可能性[8]。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术,它可将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上,这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合,通过对信号物质进行检测,对杂交结果进行计算机软件处理分析,从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。
与传统的方法相比,寡核苷酸芯片可以对胃粘膜活检标本直接进行菌株变异检测,对混合菌株感染时同样适用,而用细菌培养的方法却很难区分混合株,而且费时费力,培养相当困难。测序是一种经典的方法,但是往往只能检测优势株的序列;或者野生株和突变株的数量相当时才容易检测;而寡核苷酸芯片可以检测少量变异菌株。该方法可以让医生在短时间内准确判断患者的耐药情况。因此,寡核苷酸芯片检测细菌耐药具有其优越性。
参考文献:
[1]Gunn M,Stephens J,Thompson J,Rathbone B,Samani N.Significantassociation of CagA positive Helicobacter pylori strains with risk ofpremature myocardial infarction.Heart 2000;84:267-271.
[2]Zentilin P,Seriolo B,Dulbecco P,Caratto E,Liritano E,FascioloD,Bilardi C,Mansi C,Testa E,Savarino V.Eradication of Helicobacterpylori may reduce disease severity in rheumatoid arthritis.AlimentPharmacol Ther.2002,16:1291-1299
[3]NIH Consensus Conference.Helicobacter pylori in peptic ulcer disease.NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in peptic ulcerdisease.J Am Med Assoc 1994;272:65-9
[4]Loren L,Richard H,Hala EZ,Bich N,Michael O,Jean S.Bismuth-basedquadruple therapy using a single capsule of Bismuth biskalcitrate,metronidazole and tetracycline given with omeprazole versus omeprazole,amoxicillin and clarithromycin for eradication of Helicobacter pyloriin duodenal ulcer patients:a prospective,randomized,multicenter,North American trial.The American Journal of Gastrienterology,2003,98(3):562-7
[5]Versalovic JD,Shortridge K,Kibler MV,Griffy J,Beyer RK,Flam SK,Tanaka DY,Graham,MF Go.Mutat ion in 23S rRNA are associated withclarithromycin resistance in Helicobacter pylori.Antimicrob AgentsChemther.1996,40:477-80
[6]Matsuoka M,Yoshida Y,Hayakawa K,Fukuchi,S,Sugano K.Simultaneouscolonization of Helicobacter pylori with and without mutations in the23S rRNA gene in patients with no history of clarithromycin exposure.Gut 1999;45:503-7
[7]Khner M K,Beerli P,Yamato J,et al.Usefulness of single nucleatidepolymorphism data for estimating populationparameters.Genetics,2000,156:439-447
[8]Hirschlhorn J N,Sklar P,Lindblad-Toh K,et al.SBE-TAGS:an array-basedmethod for efficient single-nucleotide polymorphism genotyping.ProcNatl Acad Sci USA,2000,97:12164-12169
发明内容
本发明的目的是提供一种幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。
Hp克拉霉素耐药基因多态性检测芯片:在载体上设有如下探针:
Hp克拉霉素耐药基因多态性检测芯片制备方法步骤为:
1)芯片载体的处理:玻片用铬酸洗液浸泡过夜,水洗,24~26%氨水中过夜,水洗,玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇溶液中,用冰醋酸调节PH至4~4.5,95%乙醇超声清洗,150~160℃烘干3~5小时,5~10%戊二醛处理成醛基化;
2)引物及探针的合成:针对Hp的23S rRNA基因A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G多态性位点设计了一组探针,它的长度范围在15-17个碱基(表1),针对Hp的23S rRNA基因设计合成1对引物,长度21个碱基(表2),每条引物中各有一条Cyp-3信号分子标记。所有寡核苷酸引物或探针均采用标准亚磷酰胺化学方法在ABi 8089DNA自动合成仪上合成,寡核苷酸的合成采用标准亚磷酰氨化学方法,固定探针在3’端以氨基修饰,氨基与探针序列之间以间隔臂(spacer,聚乙二醇亚磷酰胺试剂)相连。荧光标记引物用Cy3亚磷酰胺试剂在普通引物序列的5’末端直接以标准亚磷酰胺化学合成法进行荧光标记。合成后用浓氨水50~60℃脱保护,切割13~17小时,OPC柱纯化,紫外定量后真空干燥浓缩,-20~-80℃保存备用;
3)基因芯片制备及后处理:将探针至终浓度为100μmol/L;用750mmol/L NACl,75mmol/L乙酸钠,5%glycerol,1%Ficoll and 0.1%SDS合成点样液;前述两者1∶1稀释,并取10μL至96孔板,用芯片点样仪点至醛基化玻片上,每点体积约为0.5nL,点心间距为500μm,点直径约为200μm,每条探针重复点2次。寡核苷酸探针在玻片上的排列如下。点样完毕后,室温放置24小时后备用。
Hp克拉霉素耐药基因多态性检测芯片用于检测Hp克拉霉素耐药的23s rRNA基因多态性和分型。
本发明将经过选择的探针点样于玻片上,分别与经PCR扩增的23S rRNA基因片段进行杂交,一次性获得各位点的多态情况,从而实现对Hp的23S rRNA相关基因多态性进行快速、简捷、高通量检测和分型,具有重要的社会和经济效益。
具体实施方式
本发明玻片上固相化的探针为寡核苷酸探针(表2),其序列根据Hp23S rRNA基因A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G多态性位点设计。
所说引物是针对Hp的23S rRNA的基因特征设计设计合成引物(表2),用于上述基因的扩增。
信号分子标记是针对Hp的23S rRNA的基因序列扩增的引物。信号分子标记是荧光分子。
表1:Hp克拉霉素耐药基因多态性检测芯片的探针
表2:乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的引物
实施例1:核苷酸基因芯片的制备:
1)芯片载体的处理:玻片用铬酸洗液浸泡过夜,水洗,25%氨水中过夜,水洗。玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇溶液中,用冰醋酸调节PH至4.5,95%乙醇超声清洗,160℃烘干4小时,10%戊二醛处理成醛基化。
2)引物及探针的合成:本发明针对Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多态性位点设计了一组探针(见表1)。针对Hp的23S rRNA基因设计合成了2条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cyp-3荧光标记。所有寡核苷酸引物或探针均采用标准亚磷酰胺化学方法在ABi 8089DNA自动合成仪上合成,寡核苷酸的合成采用标准亚磷酰氨化学方法,固定探针在3’端以氨基修饰,氨基与探针序列之间以间隔臂(spacer,聚乙二醇亚磷酰胺试剂)相连。荧光标记引物用Cy3亚磷酰胺试剂在普通引物序列的5’末端直接以标准亚磷酰胺化学合成法进行荧光标记。合成后用浓氨水55℃脱保护,切割15小时,OPC柱纯化。紫外定量后真空干燥浓缩,-80℃保存备用。
3)基因芯片制备及后处理:将探针至终浓度为100μmol/L;用750mmol/L NACl,75mmol/L乙酸钠,5%glycerol,1%Ficoll and 0.1%SDS合成点样液;前述两者1∶1稀释,并取10μL至96孔板,用芯片点样仪点至醛基化玻片上,每点体积约为0.5nL,点心间距为500μm,点直径约为200μm,每条探针重复点2次。寡核苷酸探针在玻片上的排列如图1。点样完毕后,室温放置24小时。
实施例2:核苷酸基因芯片的制备:
1)芯片载体的处理:玻片用铬酸洗液浸泡过夜,水洗,24%氨水中过夜,水洗,玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇溶液中,用冰醋酸调节PH至4.0,95%乙醇超声清洗,150℃烘干3小时,9%戊二醛处理成醛基化;
2)引物及探针的合成:针对Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多态性位点设计了一组探针(见表1)。针对Hp的23S rRNA基因设计合成了2条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cyp-3荧光标记。所有寡核苷酸引物或探针均采用标准亚磷酰胺化学方法在ABi 8089DNA自动合成仪上合成,寡核苷酸的合成采用标准亚磷酰氨化学方法,固定探针在3’端以氨基修饰,氨基与探针序列之间以间隔臂(spacer,聚乙二醇亚磷酰胺试剂)相连。荧光标记引物用Cy3亚磷酰胺试剂在普通引物序列的5’末端直接以标准亚磷酰胺化学合成法进行荧光标记。合成后用浓氨水50℃脱保护,切割13小时,OPC柱纯化,紫外定量后真空干燥浓缩,-20℃保存备用;
3)基因芯片制备及后处理:将探针至终浓度为100μmol/L;用750mmol/L NACl,75mmol/L乙酸钠,5%glycerol,1%Ficoll and 0.1%SDS合成点样液;前述两者1∶1稀释,并取10μL至96孔板,用芯片点样仪点至醛基化玻片上,每点体积约为0.5nL,点心间距为500μm,点直径约为200μm,每条探针重复点2次。寡核苷酸探针在玻片上的排列如图1。点样完毕后,室温放置24小时。
实施例3核苷酸基因芯片的制备:
1)芯片载体的处理:玻片用铬酸洗液浸泡过夜,水洗,26%氨水中过夜,水洗,玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇溶液中,用冰醋酸调节PH至4.5,95%乙醇超声清洗,160℃烘干5小时,11%戊二醛处理成醛基化;
2)引物及探针的合成:针对Hp的23S rRNA A2142G、A2142C、A2142T、A2143G、A2143C、A2143T、C2182T、C2182A和C2182G的基因多态性位点设计了一组探针(见表1)。针对Hp的23S rRNA基因设计合成了2条引物(见表2)。每条引物中各有一条Cyp-3荧光标记。所有寡核苷酸引物或探针均采用标准亚磷酰胺化学方法在ABi 8089DNA自动合成仪上合成,寡核苷酸的合成采用标准亚磷酰氨化学方法,固定探针在3’端以氨基修饰,氨基与探针序列之间以间隔臂(spacer,聚乙二醇亚磷酰胺试剂)相连。荧光标记引物用Cy3亚磷酰胺试剂在普通引物序列的5’末端直接以标准亚磷酰胺化学合成法进行荧光标记。合成后用浓氨水60℃脱保护,切割17小时,OPC柱纯化,紫外定量后真空干燥浓缩,-80℃保存备用;
3)基因芯片制备及后处理:将探针至终浓度为100μmol/L;用750mmol/L NACl,75mmol/L乙酸钠,5%glycerol,1%Ficoll and 0.1%SDS合成点样液;前述两者1∶1稀释,并取10μL至96孔板,用芯片点样仪点至醛基化玻片上,每点体积约为0.5nL,点心间距为500μm,点直径约为200μm,每条探针重复点2次。寡核苷酸探针在玻片上的排列如图1。点样完毕后,室温放置24小时。Hp克拉霉素耐药基因检测芯片的使用方法为:
1)载有寡核苷酸探针的玻片使用前0.2%SDS和清水各洗两次,空气干燥后待用,完成将探针共价固相化于玻片表面。
2)为产生单链的目标片段采用不对称PCR扩增的方法,正向引物HPF(5’-CTGCATGAATGGCGTAACGAG-3’)与荧光标记反向引物HPR(5’-CAAGGATGACTCCATAAGAGC-3’)的比例优化为1∶10。20μL反应体系中含有1.5mM MgCl2,dNTP各200μmol/L,正向引物0.1μmol,反向引物1μmol,Hp DNA50ng,1×PCR缓冲液和1U Taq酶。PCR扩增条件为:预变性94℃5min;变性94℃30sec,退火55℃30sec,延伸72℃30sec,共30循环;最后延伸72℃5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
3)Cy3-标记的不对称PCR产物与杂交液(750mmol/L NACl,75mmol/L sodiumacetate,0.1%SDS,1ug/ml鲑精DNA,2.5%甲酰铵)按2∶8混合,将10μL混合液转移至芯片的杂交区域。芯片置于杂交盒中在42℃水浴中保温1小时。杂交后取出芯片依次在洗液A(150mmol/L NACl,15mmol/L乙酸钠,0.2%SDS),洗液B(30mmol/L NACl,3mmol/L乙酸钠)和洗液C(15mmol/L NACl,1.5mmol/L乙酸钠)中各洗涤1分钟。待干后芯片用激光共聚焦扫描仪GenePix 4000(Axon Instrument)在激发波长532nm,发射波长570nm(Cy3)扫描,产生并分析精度为10μm的16位TIFF图象。
Hp克拉霉素耐药基因检测芯片使用实例:
胃粘膜活检标本取自在浙江大学医学院附属第一医院消化科行胃镜检查的病人,共54例患者入选,其中男性30例,女性24例,平均年龄44.3岁(25-86岁)。所有入选患者胃粘膜病理和PCR检查均为阳性。胃窦和胃体各取2块粘膜组织,其中一份置于10%福尔马林固定,用于病理HE染色,另一份用于提取DNA。患者接受胃粘膜活检均签署知情同意书。按常规提取DNA用上述方法检测。结果为:经病理和PCR证实为Hp阳性的54例标本,杂交结果显示2142位点均为野生型(54/54);A2143G突变率为11.11%(6/54),尚未发现A2143C和A2143T的突变;C2182T突变率为12.96%(7/54),尚未发现C2182A和C2182G的突变,其余均为野生型。
测序验证:
测序采用CEQTM TDCS试剂盒(BECKMAN COULTERTM,USA),在CEQTM 2000XL测序仪(BECKMAN COULTER TM,USA)上进行。结果寡核苷酸微阵列技术与测序检测Hp 23S rRNA基因多态性结果完全一致。
机译: 核酸-真核基因组片段,其制备方法及其在检测限制性片段中的用途-抗原基因多态性(rflps)
机译: 磷酰胺基核酸衍生物,其制备方法,药物,其制备方法,DNA芯片,其制备方法,生物传感器检测试剂,药物以及这些衍生物在制备药物中的用途,检测试剂
机译: 磷酰胺基核酸衍生物及其制备方法和试剂;药物,其制备方法,检测试剂,其制备方法,PNA生物传感器芯片,反义,试剂及其制备方法和所述衍生物的用途