一种用于去除转基因植物中选择标记基因的方法

摘要

本发明描述了一种植物病毒表达载体，可在植物细胞中瞬时、高效表达位点特异性重组酶，以消除转基因植物中的选择标记基因的一种新方法。该方法是将植物病毒表达载体导入转基因植物的细胞，来瞬时表达位点特异性重组酶，去除两个同向重组位点间的选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因植物。其中之一例是如下图所示：用烟草花叶病毒表达载体p35S－m30B:cre，通过农杆菌Agrobacterrium tumefaciens CGMCC NO.1176，用侵染法在烟草细胞中瞬时表达Cre重组酶，去除pGNG转基因SR1烟草中两个同向lox位点间的选择标记基因nptII，得到的无选择标记基因的转基因烟草。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，是一种用瞬时表达位点特异性重组酶的植物病毒表达载体去除转基因植物中选择标记基因的方法。具体的讲，涉及可在植物细胞中表达Cre重组酶的一种病毒表达载体p35S-m30B：cre，通过农杆菌侵染法在植物细胞中瞬时、高效表达Cre重组酶，以消除转基因植物中的选择标记基因的一种新方法。

背景技术

随着植物基因工程技术的发展，许多种类的植物可以被遗传转化以改良其性状或作为生物反应器生产有用的蛋白，如重要的医用蛋白。在植物的转化操作中，通常只有很少数的植物细胞被转化。为了将转化和未转化的细胞快速简便的区分开，选择标记基因成为转化载体的必要组成成分。目前使用较多的选择标记基因有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、除草剂basta抗性基因等。

然而，一旦获得遗传稳定的转基因植物，选择标记基因便失去了在转化体中继续存在的必要性，并且下面这些不利因素决定了有必要从转化体中去除选择标记基因：1.目前所能用的选择标记基因数量有限，若同一个体常需多次转化，每次筛选均用不同标记，比较困难。2.可能引起转基因植物中目的基因发生基因沉默。3.环境安全性问题，主要是选择标记基因在不同生物间的水平转移，可能引起对生态平衡的破坏。4.公众对转基因食品和产品的接受性，很多转基因生物制品最终会投放到市场，如口服疫苗、改良品质的作物等，目的基因以外的其它基因的存在尤其是抗性基因的存在会引起公众对健康的担心。

目前，利用共转化系统、转座子系统、位点特异性重组系统等均可实现去除转基因植物中的选择标记基因的目的。位点特异性重组系统主要由2个组分组成：位点特异性重组酶和重组位点。由于位点特异性重组系统的确定性和精确性，它们在基因重组的操作上具有很大的应用价值。在去除转基因植物选择标记基因的研究中，可利用的位点特异性重组系统有来源于噬菌体P1(bacteriophage P1)的Cre/lox系统、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μ质粒的FLP/FRT系统、接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)pSRl质粒的R/RS系统，但以Cre/lox重组系统的应用最为广泛^{【1】【2】}。

Cre重组酶是一个分子量为38kDa的位点特异性重组酶，它可介导在两个lox位点(一段长度为34bp的DNA序列)间的DNA发生切除、整合或倒位的反应^【3】。用Cre/lox体系消除转基因植物中的标记基因就是利用Cre重组酶可介导两个同向lox位点间的DNA片段切除的特性，一般步骤是：将选择标记基因克隆到两个同向lox位点之间，首先通过抗性筛选得到转化体，然后将Cre重组酶在获得的转基因植物中表达，在Cre重组酶的作用下将lox位点间的选择标记基因消除。

早在1991年，Dale和Ow首次利用来自噬菌体P1的Cre/lox系统消除选择标记基因，他们采用杂交或再次转化的方法表达Cre重组酶，成功消除了转基因烟草中的标记基因。但是因为杂交和二次转化引入Cre重组酶时，必须需要另一个选择标记基因，所以只有通过后代分离才能获得只表达目的蛋白而无任何选择标记的转基因植物，这种操作需要较长的周期^【4】。最近，Cre/lox系统还被用来消除质体基因组中的选择标记基因，但同样需用二次转化法或杂交来稳定表达Cre重组酶，最后利用后代分离获得无标记基因的、质体被转化的植物^{【5】【6】}。

为克服以上述的需经后代分离才能获得无选择标记基因的转基因植物而带来的实验周期长的缺点，并且为了避免因稳定表达Cre重组酶而产生的植物表型畸变现象^【7】，科研工作者尝试用农杆菌介导的瞬时提供Cre重组酶的方式来消除标记基因。在1999年，Gleave等就利用Cre酶的瞬时表达来消除标记基因，因无需杂交而大大缩短了周期，但是负选择标记基因一胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的同时使用是必须的，否则效率极低^【8】；在2001年，Zuo J等利用雌激素诱导型启动子控制Cre重组酶的表达实现选择标记基因和Cre基因的共消除，获得了无选择标记基因的转基因拟南芥^【9】，但其所用的雌激素诱导剂对环境安全并不友好。

发明内容

本发明的目的在于针对以上存在的问题，为了克服当前在本技术领域去除转基因植物中选择标记基因的方法所存在的缺陷，提供一种能在植物细胞中瞬时表达Cre重组酶的病毒表达载体，一种对环境安全，又可消除转基因植物中选择标记基因的新方法。具体地讲，该方法步骤包括：

构建含有两个同向重组位点的植物转化载体，把选择标记基因克隆在两个重组位点之间；用含此种植物转化载体的农杆菌转化植物，获得含选择标记基因的转基因植物；

构建一种由植物组成型启动子驱动的表达位点特异性重组酶的植物病毒表达载体；

将植物病毒表达载体导入转基因植物的细胞，来瞬时表达位点特异性重组酶，去除两个同向重组位点间的选择标记基因，在不含任何抗生素的培养基上经过组织培养，获得无选择标记基因的转基因植物的方法。

所述的植物转化载体中的两个同向重组位点包括：Cre重组酶识别的lox位点、FLP重组酶识别的FRT位点或R重组酶识别的RS位点等。

所述的选择标记基因包括：卡那霉素抗性基因(npt II)、潮霉素抗性基因(hpt)或除草剂basta抗性基因(bar)等。  所述的植物转化载体之一是pGNG，其中选择标记基因一卡那霉素抗性基因(npt II)被克隆在两个同向重组位点-lox位点之间。  所述的转基因植物是用植物转化载体pGNG转化农杆菌LBA4404，借助农杆菌介导的叶盘转化法获得含选择标记基因npt II的转基因SRl烟草(Nicotiana tabacum cv.SR1)。

所述的病毒表达载体可以采用烟草花叶病毒(TMV)表达载体、黄瓜花叶病毒(CMV)表达载体、马铃薯X病毒(PVX)表达载体或烟草脆裂病毒(TRV)表达载体等。

所述的组成型启动子可以采用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、农杆菌的Nos启动子或聚泛素基因启动子等。

所述的位点特异性重组酶可以是识别lox位点的Cre重组酶、识别FRT位点的FLP重组酶或识别RS位点的R重组酶。

所述的病毒表达载体，其中之一是将烟草花叶病毒(TMV)载体30B经过改造而构建的病毒表达载体p35S-m30B：cre，其中含有组成型启动子一花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，并且含有位点特异性重组酶-Cre重组酶基因。

所述的将病毒表达载体导入植物细胞中的方法包括：农杆菌侵染法、基因枪接种法、摩擦接种法等。

所述的将病毒表达载体导入植物细胞中的方法之一是用病毒表达载体p35S-m30B：cre转化农杆菌EHA105，获得的重组农杆菌agro 35S-m30B：cre，借助农杆菌侵染法将TMV载体导入pGNG转化的SRl烟草细胞中，表达Cre重组酶。本专利申请人于2004年6月10日已将病毒表达载体根癌土壤杆菌Agrobacterrium tumefaciens agro 35S-m30B：cre保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏登记号为：CGMCC NO.1176。

所述的无选择标记基因的转基因植物是重组农杆菌CGMCC NO.1176与pGNG转化的SR1烟草的叶片共培养，瞬时表达Cre重组酶，在不含任何抗生素的培养基上获得的去除选择标记基因的转基因烟草。

本发明的最后一个目的是按照本发明所述的方法，用植物病毒载体瞬时表达位点特异性的重组酶，在去除转基因植物中选择标记基因和基因表达调控中的应用。

目前可利用Cre/lox系统、FLP/FRT系统和R/RS系统等位点特异性重组系统来去除转基因植物中的选择标记基因，主要是利用位点特异性重组酶(Cre、FLP和R)可介导两个同向重组位点(Cre识别的lox、FLP识别的FRT和R识别的RS)间的DNA序列发生切除重组，重组过程不需任何额外的能量和辅助因子^{【1】【2】}。如上所述的用于植物转化的载体是含有两个同向重组位点的载体，其中之一是含有两个同向的lox位点的pGNG，并且选择标记基因npt II克隆在两个lox位点之间，实施例1详细描述了该载体的构建，其具体结构如图1-B所示；用pGNG转化农杆菌LBA4404获得含pGNG的重组农杆菌；借助农杆菌介导的叶盘转化法用含pGNG的重组农杆菌转化SR1烟草叶片^【10】；用Southern blot和Western blot分析转基因烟草，证实获得了pGNG的转基因烟草。如上所述的一种表达位点特异性重组酶的病毒载体，其中之一是采用35S启动子驱动TMV载体m30B瞬时表达Cre重组酶，实施例3详细地叙述了该病毒表达载体p35S-m30B：cre的构建，其具体结构如图1-D所示。如上所述的将表达位点特异性重组酶的病毒载体导入转基因植物以获得无选择标基因的植物，是用病毒表达载体p35S-m30B：cre转化农杆菌EHA105，获得重组农杆菌agro 35S-m30B：cre，用重组农杆菌agro 35S-m30B：cre与pGNG转基因烟草的叶片共培养，在不含任何抗生素的培养基上获得再生苗，用Southern blotting、RT-PCR分析证实获得了无选择标记基因再生植株。最后，用PCR方法、Kan抗性实验、GFP荧光观察和GUS染色分析获得的无选择标记基因再生苗的T1后代植株，证实无选择标记基因的性状可以稳定遗传。

本发明提供了一种消除转基因植物中的选择标记基因的新方法的一个示例，即利用TMV表达载体m30B瞬时、高效、系统扩散地表达Cre重组酶，消除了转基因SR1烟草中两个同向lox位点间的选择标记基因npt II，证实了这种策略的可行性。与已报道的稳定表达Cre重组酶去除转化体中的选择标记基因的方法相比^【4】，用m30B瞬时表达Cre重组酶保证了不需杂交和后代分离就可获得无标记基因转化体，这样缩短了周期；而且我们的实验还证明表达Cre重组酶的病毒载体cDNA未整合到无选择标记基因转化体的染色体中，这避免了因Cre的稳定表达而引起的植物表型畸变现象^【7】。因为TMV载体可以在pGNG转化的烟草中高效、系统扩散地表达Cre重组酶，保证了不需任何筛选就可获得高达9.4％消除率，与用5-氟胞嘧啶筛选无标记基因转化体的策略^【8】、用雌激素诱导剂控制Cre重组酶的表达来去除选择标记基因的方法相比较^【9】，用病毒载体瞬时表达Cre重组酶去除选择标记基因的策略不需要任何额外的化学试剂就可获得理想效果，这样简化了实验操作，避免了有害化合物的使用，又节省了开支。我们的实验还表明，无选择标记基因的转化体后代不带病毒。

总之，用TMV载体m30B瞬时表达Cre重组酶去除pGNG转化的SR1烟草中两个同向lox位点间的选择标记基因npt II为实例，证实了病毒载体瞬时表达位点特异性重组酶可以快速、简便地去除转基因植物中的两个同向重组位点间的选择标记基因，获得无选择标记基因转化体，这样既避免了因选择标记基因存在引起的环境安全性问题，又利于转基因作物的推广和公众对转基因产品的接受。

应当指出的是，通过本发明所述的方法去除转基因植物中选择标记基因是本技术领域的一般技术人员，完全可以理解的。同时，本方法还可用于(1)无需二次转化而经过瞬时表达Cre重组酶的病毒载体侵染转基因植物直接获得无选择标记基因的种子；(2)除普通烟外其他TMV可侵染的转基因作物中选择标记基因的消除；(3)使用其他的病毒载体瞬时表达Cre重组酶，来消除该类病毒载体能侵染的转基因作物中选择标记基因的消除。所以本发明还包括Cre基因克隆入除p35S-m30B外，构建的能瞬时表达Cre重组酶的其他的病毒载体。

附图说明

为了更好地理解本发明内容，下面结合附图作进一步描述：

图1.植物转化载体结构和选择标记基因消除示意图

(A)lox-MCS-lox示意图；(B)植物转化载体pGNG示意图；(C)pGNG重组后结构示意图；(D)病毒表达载体p35S-m30B：cre示意图H：HindIII，E：FcoRI，示lox位点的方向，示外壳蛋白(CP)的亚基因组启动子

图2.转pGNG烟草的分子水平分析

(A)Western blot分析，一抗为兔抗GFP血清，二抗是碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG

(B)Southern杂交分析，HindIII酶切处理50微克(μg)烟草总DNA，用³²P标记的GUS编码区作杂交探针

G1-G6：pGNG转化的烟草株系，P：pBI121，N：野生型烟草，H：HindIII

图3.农杆菌接种SR1烟草两周后观察GFP荧光的观测

(A)用agro 35S-m30B：GFP接种后，在长波长UV照射下，观察病毒的扩散

(B)用agro 35S-30B：GFP接种后，在长波长UV照射下，观察病毒的扩散

箭头示注射接种部位

图4.agro 35S-m30B：cre接种pGNG转化体两周后GUS染色

箭头示注射接种的部位

图5.无选择标记基因再生苗的Southern杂交分析

(A)Southern杂交分析选择标记基因的消除

agro 35S-m30B：cre侵染G1、G4的T1代无菌苗，获得再生植株，NindIII+EcoRI酶切处理30μg烟草总DNA，用³²P标记的GUS编码区作杂交探针。

G1：G1的T1代苗，G4：G4的T1代苗，G1R1：G1的T1代苗的再生苗，G1R3：G1的T1代苗的再生苗，G4R4：G4的T1代苗的再生苗，N：野生型烟草，H：HindIII，E：EcoRI

(B)Southern杂交分析病毒基因组cDNA

agro 35S-m30B：cre侵染G1、G4的T1代无菌苗，获得再生植株，EcoRI酶切处理30μg烟草总DNA，用³²P标记的Cre编码区作杂交探针。P：p35S-m30B：cre，N：野生型烟草，G1R1：G1的T1代苗的再生苗，G1R3：G1的T1代苗的再生苗，G4R4：G4的T1代苗的再生苗，E：EcoRI

图6.无选择标记基因转基因苗的RT-PCR分析

agro 35S-m30B：cre侵染G1、G4的T1代无菌苗，获得再生植株，用引物CR1/CR2检测病毒载体的cp，用引物C3/C2检测插入TMV表达载体的Cre基因

G1R1：G1的T1代苗的再生苗，G1R3：G1的T1代苗的再生苗，G4R4：G4的T1代苗的再生苗，M：DNA ladder(从上到下：1.2，0.9，0.7，0.5，0.3，0.1kb)，N：野生型烟草

图7.无选择标记基因转化体后代的PCR分析和PCR产物的测序

(A)萌发无选择标记基因的转化体的T1代苗，选取GUS染色为阳性的植株，用引物P1/P2进行PCR分析

G1R1：G1的T1代苗的再生苗，G1R3：G1的T1代苗的再生苗，G4R4：G4的T1代苗的再生苗，R1S1、R1S2：G1R1的T1代苗，R3S3、R3S4：G1R3的T1代苗，R4S5、R4S6：G4R4的T1代苗，M：DNA ladder(从上到下：1.2，0.9，0.7，0.5，0.3，0.1 kb)，N：野生型烟草

(B)测序分析PCR产物

图8.无选择标记基因的转化体后代的GFP荧光观察(A)和GUS组织化学染色(B)

萌发转化体的T1代苗，长波长UV下观测绿色荧光或用X-Gluc进行GUS染色

1，3：G1的T1代苗，2，4：G1R1的T1代苗

具体实施方式

为了对本发明的构思和技术要点予以更好地理解，现通过以下实施例进一步进行描述，但是决不是对本发明技术的限定。

实施例1：植物转化载体pGNG的构建、农杆菌介导的叶盘转化和转基因烟草的分子检测

1.植物转化载体pGNG的构建

植物表达载体pGNG在pBI121(购自Clontech公司)基础上改建^【11】，pGNG的构建过程简述如下：人工合成131bp的含有两个同向lox位点和多个酶切位点的lox-MCS-lox(图1A)，用一对引物M1(5′-TTCAAGCTTCGGTCTAGATAACTTCGT一3 ′)和M2(5′-ACGGAATTCGGTACCCGCG-3′)进行PCR扩增，lox-MCS-lox两端分别含HindIII和EcoRI切点(下划线示出)。PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟(min)，按以下程序进行扩增：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃45秒(s)；35个循环；循环结束后72℃延伸10min。用lox-MCS-lox置换掉pBI121的RB和LB间SacII-EcoRI片段(含Nos P-nptII-Nos T-35S P-gus-Nos T)，生成pBI121 lox-MCS-lox(lox-MCS-lox两侧的HindIII和EcoRI切点仍保留)，测序表明引入的lox-MCS-lox DNA片段完全正确。另将lox-MCS-lox片段用HindIII和EcoRI酶切后，克隆到同样酶切的pBI221(购自Clontech公司)中，构建来自pBI221 lox-MCS-lox。将来自pBI221的CaMV 35S启动子和来自pBI121的GUS-Nos T片段克隆到lox-MCS-lox前后，构建pBI221-35S-lox-MCS-lox-GUS。HindIII+EcoRI酶切pBI221-35S-lox-MCS-lox-GUS回收35S-lox-MCS-lox-GUS片段，克隆到同样酶切的pBI121 lox-MCS-lox中，构建pBI121-35S-lox-MCS-lox-GUS。然后用引物GF1(5′-TGGATCCAACAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′)和引物GF2(5′-CGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC- 3′)进行PCR扩增，从pBIN35S-mgfp5-ER(Jim HASELOFF博士惠赠)^【12】扩增出gfP，扩增的gfP用BamHI+SacI酶切回收，克隆到同样酶切的pBI221 lox-MCS-lox中，构建成pBI221 lox-GFP-lox。用SacI+SalI酶切pX6-GFP(JianruZUO博士惠赠)^【13】回收含Nos P-nptII-Nos T的片段，插入同样酶处理的pBI221 lox-GFP-lox中，获得pBI221 lox-GFP-nptII-lox。最后，XbaI+SalI酶切pBI221 lox-GFP-nptII-lox，回收含GFP-Nos P-nptII-Nos T的片段，克隆到同样酶切的pBI121-35S-lox-MCS-lox-GUS中，生成植物转化载体pGNG(图1B)。

将pGNG转化农杆菌LBA4404(购自Gibco BRL公司)，在含利福霉素(Rif，30mg/L)、链霉素(50mg/L)、Kan(50mg/L)的LB培养基上得到转化子，并进一步经PCR鉴定gfp，选出含有pGNG的菌株。

2.叶盘转化法获得转基因烟草

接种含pGNG的农杆菌到3.5毫升(ml)的LB液体培养基中，在28C、300rpm的摇床上培养过夜后用于植物转化，农杆菌培养液用1/2MS培养液稀释10倍，至每毫升约1×10⁶至1×10⁷个细菌。选取长有4-5片真叶的SR1烟草无菌苗为试验材料，剪取叶片，去掉主叶脉，切成约1cm见方的小块，然后将叶片小块置于稀释的根癌农杆菌菌液中浸泡20min。用无菌滤纸吸干叶表面菌液，把叶片置于MS共培养培养基(MS无机盐+B5维生素+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+30g/L蔗糖+0.8g/L phytogel)上共培养，使切口处与培养基充分接触，28℃暗培养2天。然后，将烟草叶盘转入MS分化培养基(MS无机盐+B5维生素+1.2mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+500mg/L羧苄青霉素+300mg/L Kan+30g/L蔗糖+0.8g/L phytogel)上培养，两周继代一次。培养大约4周后，可观察到叶片边缘长出愈伤组织小块，并开始分化长出小绿点，逐步长成分化芽。当分化芽长至1厘米左右时，将生长状态良好的小芽转移到MS生根培养基(MS无机盐+B5维生素+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+0.8g/L phytogel+500mg/L羧苄青霉素+200mg/L Kan)上进行生根培养，分化芽在MS生根培养基上培养3周后，能够长出正常根，形成完整的植株后，移栽到温室里继续培养。

3.转基因烟草表达GFP的Western blot检测

称取转基因烟草的新鲜叶片100mg，液氮冷冻研磨。将粉末转入200微升(μl)加样缓冲液(125mM Tris-HCl pH8.0；20％甘油；4％SDS；0.05％溴酚兰；2％巯基乙醇)中，100℃煮10min，离心后，然后取植物总蛋白样品约100μg进行SDS-PAGE(15％的分离胶和4％的浓缩胶)。电泳结束后，用Bio-Rad半干电泳转移仪将蛋白转移至甲醇预处理的PVDF膜上。恒压9伏，转移30min。将膜置于封闭缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4；30mM NaCl；1mM EDTA；0.1％Tween-20；3％BSA)中，室温轻摇过夜。将膜置于兔抗GFP血清中(1：3000；20mMTris-HCl pH 7.4；30mM NaCl；1mM EDTA；0.1％Tween-20；1％BSA稀释)室温轻摇1小时(h)；用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4；30mM NaCl；1mM EDTA；0.1％Tween-20)洗膜三次，每次10min。将膜置于碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG中(1：5000；20mM Tris-HClpH 7.4；30mM NaCl；lmM EDTA；0.1％Tween-20；1％BSA稀释)，室温轻摇1h。用洗涤缓冲液洗膜三次，每次10min。最后，用NBT和BCIP显色(Promega)。结果显示6株pGNG转化的烟草均可观察到一条特异性的蛋白带，并且分子量大小与原核表达的GFP一致，表明GFP在转基因植物中得到表达(图2A)。

4.转基因烟草的Southern blot检测

转基因烟草的总DNA提取：称取1g烟草的新鲜叶片，液氮冷冻充分研磨后，加入10ml CTAB提取缓冲液(Tris 100mM，pH 8.0；NaCl1.4M；EDTA 20mM；CTAB 2％)，65℃温育45min；加入等体积预冷的氯仿颠倒混匀，10,000rpm离心10min；转移上清至另一灭菌的50ml离心管，加入等体积异丙醇，轻轻地颠倒混匀，可见白色絮状沉淀出现。轻轻挑出沉淀(或5,000rpm离心10min，转移沉淀)放入5ml离心管中，75％乙醇洗涤，晾干。加入2ml去离子水溶解，加5μlRNase(10g/L)室温静置半小时除RNA。加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)抽提，离心后转移上清到另一5ml离心管。加入1/10体积3M的醋酸钠(pH 5.5)及2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置1h，13,000rpm离心15min沉淀DNA。70％乙醇洗涤，沉淀，晾干，500μl去离子水溶解。取2μl电泳检测，若纯度不够或降解太多，应重新纯化或提取。

烟草基因组DNA的酶解及电泳：取约50μg的烟草总DNA，在500μl体系中加入足量的HindIII，将酶、缓冲液和DNA反应体系混合均匀，酶切过夜。消化完毕后，加入1/10体积3 M醋酸钠(pH 5.5)及2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置2h，13,000rpm离心20min沉淀DNA。70％乙醇洗涤，沉淀，晾干，加入40μl TE溶解。电泳之前，将DNA在65℃水浴保温10min。0.8％琼脂糖电泳，电压60伏，同时用HindIII处理的pBI121作为阳性对照。电泳结束后，在紫外灯下观察并拍照。

DNA向尼龙滤膜的毛细管转移：用锋利刀片修去凝胶的无用部分，并在加样孔一端切去一角，作为以下操作过程中凝胶方位的标记。将修理后的凝胶置于数倍体积的脱嘌呤液(0.25M HCl)中浸泡并温和地振摇，至上样缓冲液中的溴酚兰变为桔黄色；随后以去离子水漂洗凝胶，在将其浸泡于数倍体积的变性液(0.5M NaOH；1.5M NaCl)中，室温下温和地振摇，至上样缓冲液中的溴酚兰变回原来的蓝色。利用水平电泳槽作为转膜器皿，在两个槽中倒入转移液(即变性液)，使两边液面水平一致，用一张Whatman 3MM滤纸作为搭桥连接两个槽，用一张长和宽均略大于凝胶的Whatman 3MM滤纸放在平台上，当平台上方的滤纸浸湿后，用玻璃棒赶走气泡；再放一张浸湿的略大于胶的3MM滤纸，赶除气泡；裁一张尼龙膜Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech)，滤膜的长度和宽度比凝胶大1毫米，并将其一角切去；滤膜用去离子水浸润，随后用变性液(0.5M NaOH；1.5M NaCl)浸泡5min；将凝胶从变性液中取出，放在平台湿润的3MM滤纸上，赶除气泡，用Parafilm膜封闭凝胶周边，在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重叠；在上面铺一张浸湿的略大于胶的3MM滤纸，赶除气泡；再放一叠略小于3MM滤纸的纸巾，并在上面放一块铁板，然后用一个约500g的重物压实。DNA转移过夜，结束后，揭去凝胶上方的纸巾和滤纸，翻转尼龙膜以挨膜的一面在上，用铅笔标记凝胶加样孔的位置。滤膜用20×SSC(3M NaCl；0.3M Sodium citrate)洗膜3min，以去除膜表面的琼脂糖胶，用滤纸吸干后，紫外交联4min。

标记探针和杂交探针标记：

标记探针用Random Primed DNA Labeling Kit(购自Roche公司)。

反应条件是：大约100ng GUS基因片段溶于9μl去离子水，100℃水浴10min，放置在冰上；

在上述体系中再加入以下组分

Hexanucleotide mixture                    2μl

dATP、dGTP、dTTP混合物                    3μl

Klenow酶                                  1μl

[α-³²P]dCTP                              5μl

37℃保温30min后，在体系中加入EDTA(0.2M，pH 8.0)2μl，100℃水浴5min。用去离子水浸润交联的滤膜，之后放入杂交管中，膜上含有DNA的一面朝向管内，加入15ml溶解好的预杂交液(1.5×SSPE；1％SDS；0.5％BSA；0.5g/L Sperm DNA；10％Dextran Sulfate)，65℃预杂交2h后，在杂交管中加入标记好的探针混合液，65℃杂交过夜。倒掉杂交液，用2×SSC(含SDS 0.1％)溶液200ml洗膜15min，重复2次：换用1×SSC(含SDS 0.1％)溶液200ml洗膜15min，重复2次；以上过程均在杂交箱中完成。用盖革计数器检测检测尼龙膜上的放射性活性，放射强度应呈现明显梯度，膜上不含杂交探针的部分只有很微弱的信号。否则用0.1×SSC(含SDS 0.1％)溶液洗膜。将洗好的滤膜取出，除去膜上残存的液体，用保鲜膜包好，压X光片，在-80℃放射自显影一定时间后冲洗胶片。

Southern杂交结果表明在所选择的4株转基因苗中，pGNG的T-DNA已稳定整合到植物的基因组中(图2B)。结合转基因株系T1代苗的Kan抗性实验结果(表1)，确证G1含单拷贝T-DNA，而G4和G6也可能是单拷贝转基因烟草，我们选择G1和G4两个转基因烟草株系进行消除nptII的操作。

表1 pGNG转基因烟草T₁代中Kan抗性基因的分离情况

 烟草株 系  Kan^r植株  数  Kan^s植株  数  分离比  x²  x²_0.05 G1 G2 G3 G4 G5 G6 SR1  130  164  142  124  160  116  0  43  34  10  48  8  38  187  3∶1  5∶1  15∶1  3∶1  20∶1  3∶1  -  0.002  0.036  0.028  0.775  0  0.009  -  3.841  3.841  3.841  3.841  3.841  3.841  -

实施例2：病毒表达载体的改造及其检测。

1.病毒表达载体的改造

SalI+XhoI酶切pCambia1300(Richard JEFFERSON博士惠赠)^【13】后回收6.8kb片段，自连生成pCambia1300del，去除了pCambia1300中的潮霉素抗性基因(35S P-hpt)。用T1(5′-GTATTTTTACAACAATTACCAACAACAAC-3′)和T2(5′-ATCTATTCTAGAAAACTTACAAAACCAGG-3′)为上游和下游引物，从30B载体(William DAWSON博士惠赠)^【14】中PCR扩增出TMV RNA的5′端片段TMVF1；扩增的程序与实施例1.1相同，只是循环过程中72℃延伸时间为90s。XbaI处理TMVF1，与StuI+XbaI酶切的pCassSK(改建Shouwei DING博士惠赠的pCass2而成)^{【15】【16】}连接，构建成pCassTMVF1，测序证实PCR扩增的片段完全正确。PstI和PvuII酶切pCassTMVF1，回收35S P-TMVF1-35S T片段，克隆到同样酶处理的pCambia1300del中构建pCambia1300del-TMVF1。30B载体用NcoI酶切，补齐，XbaI酶切后回收约4.4kb片段(TMV RNA的中间部分)；pCambia1300del-TMVF1用SacII部分酶切，削平，再用XbaI酶切，回收约8.7kb的片段，将两片段连接获得pCambia1300del-TMVF2。SphI酶切30B载体，削平，再用ApaI处理回收约1.6kb片段(TMV RNA的3′端片段)；SacI部分酶切pCambia1300del-TMVF2，削平，再用ApaI酶切回收约13kb质粒片段；将两片段连接构建成重组载体pCambia1300del-TMV，命名为p35S-30B^【17】。

为了改善病毒表达载体在烟草中的移动能力，根据Toth等的报道，用引物MP1(5′-AAGCTTATTGATAGTGGATACGTCTGTTTAGCCGGTGTCGTCACG-3′)和引物MP2(5′-AGCCGACGAGGCCCT-3′)将三个最有效的突变位点，即L72(TTG)→V72(GTT)和T104(ACT)→T104(ACC)(在引物中用方框示出)^【18】，引  30B的MP基因，构建p35S-m30B。以pBIN35S-mgfp5-ER^【12】为模板，用引物GF3(5′-ATTAATTAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′)和GF4(5′-ACTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3′)进行PCR扩增gfP，扩增的程序与实施例1.1相同，只是循环过程中72℃延伸时间为1min。回收大约800kb的扩增片段，克隆到pGEM-T vector(购自Promega公司)中，得到携带有gfP的pGEM-T-GFP，经序列测定证实gfP与原始序列相同。在pGEM-T-GFP中，gfP的5′端经PCR引入了PacI酶切位点，3′端引入了XhoI酶切位点；用PacI+XhoI酶切pGEM-T-GFP回收gfP，分别克隆到p35S-30B和p35S-m30B构建成病毒表达载体p35S-30B：GFP和p35S-m30B：GFP。

将p35S-30B和p35S-m30B分别转化农杆菌EHA105^【19】，在含Rif(30mg/L)、Kan(50mg/L)  的LB培养基上筛选得到重组农杆菌agro 35S-30B：GFP和agro 35S-m30B：GFP。

2.农杆菌注射法接种

接种重组农杆菌agro 35S-30B：GFP和agro 35S-m30B：GFP到3.5ml的LB培养基中，在28℃、300rpm的摇床上培养过夜；1ml过夜培养物接种到50ml新的LB中，含有30mg/L的Rif、50mg/L的Kan、20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)和10mM MES(pH5.6)，在28℃、300rpm的摇床上培养过夜；用离心机在3000rpm收集农杆菌，用MMA(10mM MgCl₂；10mM MES pH 5.6；100μM acetosyringone)调OD₆₀₀等于1.0；室温下静置3h，用2ml注射器(不带针头)对烟草SR1植株的叶片作注射。继续培养两周后进行GFP荧光观测。

3.病毒侵染烟草的荧光观察

在手提式紫外灯(UV Products，model B 100AP)的长波长紫外线(UV)下，观察接种植物的绿色荧光，并用数码相机(NikonCoolpi×995)照相。尽管在农杆菌接种的烟草中均可观测到GFP荧光，但是注射接种agro 35S-30B：GFP的烟草，只能在接种的叶片上观测到病毒的扩散(图3B)，而接种MP改造过的agro 35S-m30B：GFP的烟草，病毒扩散速度比较快，可在非接种叶片上观测到绿色荧光(图3A)。结果表明病毒载体的MP改造后，移动能力确实被改善，这样，在相同的时间内，m30B载体应该比30B载体能侵染更多的宿主细胞，所以我们选择MP改造的病毒载体来瞬时表达Cre重组酶，希望可以提高无标记基因转化体在所有再生植株中的比例。

实施例3：瞬时表达的Cre重组酶在转基因烟草叶片中介导的重组、无选择标记基因的再生植株的检测。

1.病毒表达载体p35S-m30B：cre的构建

用引物Cl(5′-ATTAATTAATGTCCAATTTACTGACCGTACAC-3′)和C2(5′-ACTCGAGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG-3′)从pCambia 1300-Cre^【11】中PCR扩增出Cre基因，PCR操作的程序与实施例1.1相同，只是循环过程中72℃延伸时间为90s。扩增后回收大约1kb的片段，克隆到pGEM-T vector中，生成pGEM-T-Cre，经序列测定证实Cre基因序列完全正确。用PacI+XhoI处理pGEM-T-Cre，回收Cre基因，克隆到同样酶处理的p35S-m30B中，生成病毒表达载体p35S-m30B：cre(图1D)，转化农杆菌EHA105^【19】后获得重组农杆菌agro 35S-m30B：cre，保藏号是CGMCC NO.1176。

2.农杆菌注射法接种和GUS表达的观察

农杆菌注射法接种与实施例2.2相同，只是重组农杆菌为CGMCCNo.1176 agro 35S-m30B：cre，而接种植物为pGNG转化的烟草植株。接种两周后对接种植株的叶片进行GUS染色。先用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)漂洗叶片，然后浸入1mM X-Gluc的缓冲液中(4℃避光保存)，抽真空5min后37℃反应过夜。用70％乙醇65℃脱色1h，观察并用数码相机(Nikon Coolpi×995)照相。结果表明在agro 35S-m30B：cre接种的pGNG转基因苗中，所有接种叶片中均检测到GUS的表达，表明在接种叶片的组织中Kan抗性基因已被消除。但是在接种植株的系统叶片上没有检测到GUS活性(图4)。

3.农杆菌共培养法获得无选择标记基因的烟草

与实施例1.2中烟草叶盘转化操作完全相同，只是植物材料是转基因烟草G1和G4的有GFP荧光的T1代无菌苗，所用农杆菌是agro 35S-m30B：cre；另外，共培养完毕后，将叶片置于不含任何抗生素的分化培养基上诱导植株再生。

农杆菌共培养法转化后，共获得32株再生苗。取这些植株的不同部位进行GUS组织染色，操作与实施例3.2相同。结果表明有11株再生苗可检测到GUS活性，但是绝大多数转化体(8株)只能在一些组织中检测到GUS表达，其中只有3株(G1R1；G1R3；G4R4)在所有组织中均可检测到GUS的活性(表2)，推测这3株转基因苗可能已被消除了选择标记基因。取G1R1、G1R3和G4R4的叶片作为外植体，快速扩繁获得154株再生苗，其中65株来自G1R1、36株来自G1R3、53株来自G4R4，用X-Gluc进行GUS染色，结果表明154株扩繁苗在所有组织中表达GUS。提取转化体G1R1、G1R3和G4R4的基因组DNA作Southern blot分析，具体操作与实施例1.4相同，只是在这个实验中，在检测选择标记基因消除时用NindIII+EcoRI处理30μg烟草总DNA，用³²P标记的GUS编码区作杂交探针；在检测病毒载体cDNA是否整合到烟草染色体中时，用EcoRI酶切烟草总DNA，用³²P标记的Cre编码区作杂交探针。Southern杂交结果表明，确实发生了Cre重组酶介导的切除反应，因为pGNG中两个lox位点间的DNA片段被切除后，使HindIII+EcoRI的酶切片段的大小由4.1kb转变为3.0kb(图1B；图1C)，结果与预测的相符(图5A)。但是p35S-m30B：cre的T-DNA未整合到植物染色体中(图5B)，这样就无需后代分离即可获得无选择标记、表达目的基因蛋白(GUS)的转化体。

表2 agro 35S-m30B：cre侵染G1和G4获得的再生苗的分析

PGNG转基因烟草株系  再生苗总数有GUS活性的再生苗无选择标记基因的再生苗G1 2272G4 1041

4.去除选择标记基因的再生植物的RT-PCR检测

用盐酸胍的方法从G1R1、G1R3和G4R4中提取植物总RNA，用试剂盒AMV Reverse Transcriptase(Promega，USA)合成cDNA的第一条链(具体操作按试剂盒说明书进行)。然后以这条链为模板进行PCR反应。用引物C3(5′-AGATATCTCACGTACTGACGGTGG-3′)和C2(5′-ACTCGAGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG-3′)扩增Cre基因，扩增的程序与实施例1.1相同，只是循环过程中72℃延伸时间为90s。用引物CR1(5′-TGAACTGGTTCGTGGAACTGGC-3′)和CR2(5′-GGCCGCTACCCGCGGTTA-3′)扩增病毒载体中的CP基因，扩增的程序与实施例1.1相同，但是循环过程中72℃延伸时间为1min。反应结束后，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。结果表明，尽管获得的转基因苗中有病毒的存在，但是Cre基因并不存在了(图6)，可能是因为插入病毒载体的Cre基因已经通过病毒内部重组丢失了，这样Cre重组酶只是在病毒载体侵染的初期瞬时表达。

实施例4：无选择标记基因转化体的后代检测

1.无选择标记基因转化体T1代苗的PCR检测

在G1R1、G1R3和G4R4的T1代苗中，选择有GUS活性的烟草植株。称取烟草叶片50mg，液氮冷冻研磨后，加入400μl提取缓冲液(2％CTAB；100mM Tris pH8.0；20mM EDTA；1.4M NaCl)，65℃温浴30min，每隔15min轻轻混匀一下。加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，混匀；10,000rpm离心 5min，吸出上清。再用等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)抽提一次；吸出上清，加入等体积的异丙醇，混匀，可观察到DNA沉淀生成。14,000rpm离心 20min，弃上清，用75％乙醇洗一次。晾干，加入适量的去离子水溶解DNA。取1μl(约200ng-1μg)总DNA，用35S启动子上的引物P1(5′-CTCAGAAGACCAAAGGGC-3′)和gus上的引物P2(5′-CACGGGTTGGGGTTTCTACAGG-3′)进行PCR扩增，扩增的程序与实施例1.1相同。PCR完毕后，取5μl PCR反应混合物，在1％琼脂糖胶上电泳。结果表明，从所有转化体中均扩增出一个约450bp的片段，与预测的大小相同(图7)。将PCR产物克隆入pGEM-T vector，连接后进行测序，结果显示确实发生了Cre重组酶介导的位点特异重组：两个lox位点间的DNA序列被消除，使GUS基因紧接在CaMV 35S启动子之后。

2.无标记基因转化体的后代的Kan抗性检测、GFP荧光观测和GUS染色

在含Kan(100mg/L)的MS培养基上萌发G1R1、G1R3、G4R4的T₀代种子，观测后代对Kan的抗性。结果表明，G1R1、G1R3、G4R4的T₀代种子在含Kan的培养基上萌发后，幼苗全部白化，说明它们均失去了Kan抗性。在不含Kan的MS培养基上萌发G1R1、G1R3、G4R4的T₀代种子，蓝光激发下，用荧光显微镜(Olympus SZX9，Japan)观察幼苗的绿色荧光并拍照，发现在MS萌发的幼苗可正常发育，但是T₁代苗均无GFP荧光，表明两个lox位点间的DNA序列已被切除。对G1R1、G1R3、G4R4的T1代幼苗进行GUS组织化学染色，方法与实施例3.2中叙述的相同，处理后在解剖镜下观察并照相，发现尽管G1R1和G1R3的后代中只有约75％幼苗有GUS活性，但是所有的G4R4的后代都可用X-Gluc染成蓝色(图8)，推测agro 35S-m30B：cre侵染时所选的G1的T₁代苗为杂合体，而G4的T₁代苗为纯合体。最后用RT-PCR扩增CP基因以在无标记基因转化体的后代中分析病毒载体，方法与实施例3.4中相同，结果表明无标记基因转化体的T1代苗中不存在病毒。

结论

利用农杆菌注射法在烟草SR1上接种agro 35S-30B：GFP和agro35S-m30B：GFP，通过绿色荧光的观察，证实TMV的MP改造后，病毒载体移动的能力得到改善(图3)；在pGNG转化的烟草上注射接种agro35S-m30B：cre，通过GUS染色证实在接种叶片中，病毒载体瞬时表达的Cre重组酶可介导两个同向lox位点间发生切除重组(图4)。用agro35S-m30B：cre转化转基因烟草株系G1和G4，结果在获得的32株再生苗中，3株为无选择标记基因的转基因苗，即G1R1、G1R3和G4R4，并且它们可通过组织培养大量扩繁无选择标记基因再生苗。通过Southern杂交证实选择标记基因的消除是因为Cre重组酶介导了两个同向lox位点间的DNA的切除，并且病毒载体基因组的cDNA未整合的植物的染色体中(图5)。而RT-PCR结果表明G1R1、G1R3和G4R4中存在的病毒是已经丢失了Cre基因的重组病毒(图6)，说明Cre重组酶是在植株再生过程中瞬时表达的。通过对G1R1、G1R3和G4R4的T1代苗的分析(图7)(图8)，证实无选择标记基因的性状可以稳定遗传，并且T1代苗已经脱毒。因此，用病毒载体瞬时表达Cre重组酶来消除转基因植物中选择标记基因是一个简便、有效的新方法。

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