共聚物促进超声介导基因转染的方法

摘要

本发明公开了一种共聚物促进超声介导基因转染的方法，主要解决现有非病毒载体基因转染率较低的问题。该方法是将共聚物和超声结合起来，应用不同的浓度，来检测各类共聚物对不同细胞系在超声介导中的基因转染作用，并通过流式细胞仪、荧光显微镜和细胞计数器进行细胞转染率和成活率的检测，从而获得不同共聚物在不同浓度时对超声介导基因转染的作用。从附图中人们可清晰地看到，在一定浓度范围内，这类共聚物和超声一起可作为一种有效的非病毒基因转染载体提高基因转染，这对疾病的基因治疗研究工作具有重要的指导意义。

说明书

                     技术领域

本发明涉及医学领域中对基因转染方法的研究，特别是采用非病毒载体来提高超声介导的基因转染方法的研究，具体地指一种共聚物促进超声介导基因转染的方法。

                     背景技术

基因疗法在治疗后天获得性和遗传性疾病的过程中，显示出了良好的应用前景。将外源性基因转导入细胞的载体大致分为两类：即病毒载体和非病毒载体。常用病毒载体的基因转染效率较高，然而由于这类载体可潜在诱发基因变异和免疫反应等不良反应，因此阻碍了其临床应用。非病毒载体，如阳离子脂质体、聚合物、以及物理方法中的电能和超声能量等为我们提供了更为安全的基因介导手段，并可反复应用而几乎不产生免疫反应，但采用这些非病毒载体的基因转染效率一般较低，提高基因转染率一直是医学研究工作者探索的目标。

共聚物(Pluronic block copolymers)分子是由亲水集团簇EO和疏水集团簇PO以EO_X-PO_Y-EO_X三联形式存在的，其中x、y是二者的集团数，二者数量的变化可决定整个共聚物分子的大小、结构和亲水性能。在微粒形成临界浓度(CMC)以下时，共聚物分子以单体的形式存在于水中，这时称为单聚体。当浓度在临界浓度(CMC)以上时，单聚体分子将相互聚合而成为微粒体。由于共聚物的这种两性特点，使其在制药业中常被广泛应用为增溶剂、乳化剂、稳定剂和佐剂，并且近年来逐渐地单独或与其它阳离子聚合物或与病毒载体一起被用作提高基因转染的载体。

研究显示，一些共聚物在高浓度(1～3％)时可降低血清蛋白对基因转染的负面影响，从而提高阳离子聚合物一DNA复合体的基因转染率并可降低其细胞毒性。在小鼠肌肉直接给药的研究实验中也显示，一些共聚物如F127等，无须与其它阳离子聚合物合并应用，可促使质粒DNA表达明显提高。然而，现有的研究实验也显示，只有动物在体研究共聚物才可促进基因转染，而体外细胞培养则显示，单独的共聚物并不能促进DNA的摄取、基因表达和免受DNA酶的破坏。

自从1987年Fechheimer将超声应用于基因转染以来，这种方法也被用作真核细胞的非病毒基因转染手段而获得了深入研究。超声可提高基因转染的原理一般认为是超声空化作用引起质膜通透性的短暂增加，这种被称为“超声穿孔”作用可使一些大分子物质，如质粒DNA、蛋白等进出细胞，从而达到较好的基因转染效果。目前已有不少将超声物理手段与其它化学载体相结合用于基因转染的报道，但应用超声和共聚物对基因转染影响的研究尚未见报道。

                    发明内容

本发明的目的就是要提供一种共聚物促进超声介导基因转染的方法，通过这种更有效的非病毒载体基因转染方法，大幅提高基因转染率。

为实现此目的，本发明所探索和研究出的共聚物促进超声介导基因转染的方法，包括以下步骤：

1)将共聚物溶解在生理盐水中，配制成共聚物溶液，过滤除菌后备用；

2)将细胞悬液接种在培养皿中隔夜培养，然后将培养皿中的培养液吸干，用磷酸缓冲液清洗，再吸干残液；

3)准备转染液：在试管中加入DNA、步骤1)所配制的共聚物溶液、和与步骤2)中细胞悬液对应的细胞培养液，使试管中DNA的最终浓度为8μg/ml，共聚物的最终浓度按mg/ml计量为0.001％～0.1％；

4)将步骤3)所准备的转染液加入到步骤2)的培养皿中，转染液的加入量与细胞悬液的接种量相同，置温箱中培养10～30分钟；

5)将治疗用超声仪探头面朝上安置在水槽中，水平面覆盖探头，然后将步骤4)所得待照射培养皿的底部浸在水中紧邻探头，并使待照射孔在探头的正上面，在照射过程中匀速移动培养皿使培养孔内的细胞受到均匀照射；

6)将经过步骤5)照射的培养皿置温箱中隔夜培养，次日先用荧光显微镜观察基因转染情况，然后用胰蛋白酶悬浮细胞，流式细胞仪检测细胞转染率后，用胎盘蓝染色检测细胞成活率。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤1)中，所选择的共聚物为F127、L61、或P85中的一种。选用这三种水溶性不同的共聚物分别代表三个亚类：F127，固态、水溶性、长EO短PO；L61，液态、脂溶性、长PO短EO；P85，糊剂、脂溶性、PO和EO段中等长度；这三种水溶性不同的共聚物概括了所有与其性能接近的共聚物。其步骤3)中，按mg/ml计量，F127的最佳转染浓度(STC)为0.001％～0.05％，L61的最佳转染浓度(STC)为0.001％～0.02％，P85的最佳转染浓度(STC)为0.001％～0.1％。对三种共聚物进行的促进超声介导基因转染实验表明，三种共聚物在其最佳浓度状态下可获得基因转染的最佳效果。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤2)中，所选用的细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠成肌细胞(C2C12)或小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)中的一种。选用至少三种细胞系为研究对象，可以确保本发明方法应用的广泛性。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤2)中，最好将细胞悬液隔孔接种在培养皿中隔夜培养，接种量以隔夜培养后细胞约90％融合为准。这样在照射超声时不致使邻近孔的细胞受到干扰照射。每次试验至少重复三遍以确保实验的再现性和可靠性。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤3)中，最好先将DNA和步骤1)所配制的共聚物溶液混合后，再加入与步骤2)中细胞悬液对应的细胞培养液。这样可确保制备转染液的顺序在每一次实验中一致，因为共聚物对DNA和培养液中血清蛋白等的结合力存在着差异，不同的顺序会影响共聚物与DNA的结合情况。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤5)中，水平面一般覆盖超声仪探头0.5cm，超声仪探头的照射功率为2～8J/cm²。其中所采用超声治疗仪的频率为1MHz，脉冲重复频率为100Hz，做功周期为20％，在1w/cm²的条件下照射20秒时，可得到较好的细胞基因转染率和成活率。

上述共聚物促进超声介导基因转染的方法，其步骤6)中，最好将培养液和胰蛋白酶细胞悬液共同收集在试管中，置于冰上并遮盖住，以保护细胞和荧光蛋白。同时，因为超声照射后部分细胞被完全破坏无细胞轮廓，单纯计数染色细胞和活细胞并不能反映死细胞数和死亡率，所以检测细胞成活率的较好计算方法为：样本细胞成活率＝样本组单位面积活细胞数/(对照组单位面积活细胞数+死细胞数)×100％，其中对照组为同种细胞、同样数量种植、未加入任何药物并未照射超声的组。

本发明将超声和共聚物联合起来，获得了一种更有效的非病毒载体基因转染方法。其优点在于：在临界浓度(CMC)范围附近，所有三类共聚物均可显著提高体外培养细胞超声介导的基因转染率，在其最佳转染浓度(STC)可使超声介导的基因转染率提高2～4倍。根据共聚物水溶性的高低，其STC与CMC有一定的变化规律：轻度脂溶性的P85，其STC和CMC大致相同；水溶性很高的F127的STC高于CMC；而脂溶性很高的L61的STC却低于CMC。不仅如此，共聚物在各自的STC下，P85所提高的基因转染率显著高于F127和L61。这一有趣的结果更是印证了本发明为一种有效的非病毒载体提高质粒DNA转染的方法。这在基因治疗研究中，特别是在肿瘤的基因治疗研究中有重要意义，因为我们发现，在这一浓度范围三类共聚物不但可提高超声介导的基因转染，同时可增加细胞毒性，尽管一些共聚物如F127本身无细胞毒性，但在可促进超声介导基因转染的浓度却使超声细胞毒性增加。

                     附图说明

图1为不同浓度的F127对小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)超声介导细胞成活率和基因转染率影响的直方图；

图2为不同浓度的L61对小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)超声介导细胞成活率和基因转染率影响的直方图；

图3为不同浓度的P85对小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)超声介导细胞成活率和基因转染率影响的直方图；

图4为以上三种共聚物在最佳提高超声介导基因转染浓度时对小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)的作用对比直方图；

图5为荧光显微镜下的共聚物对超声介导基因转染的促进作用的示范图。

                   具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步的详细描述：

分别选择小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)、小鼠成肌细胞(C2C12)、或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为对象，以绿荧光蛋白基因(pEGFP)为表达基因(DNA)，应用各种不同浓度的F127、L61或P85分别代表三类共聚物进行多种分析实验，采用超声治疗仪(Mark 3，EMS Limited，Oxford)的频率为1MHz，脉冲重复频率为100Hz，做功周期为20％，探头直径为13mm，超声功率设定为2～8Jcm^-2的低照射功率，最佳超声照射功率为在1w/cm²的条件下照射20秒，具体照射功率组合见表1。

    表1：各超声照射功率的不同照射强度组合

  照射强度(I)  照射时间(T，做功周期20％)  0.5wcm^-2  1wcm^-2  2wcm^-2  20s    40s    60s    80s  10s    20s    30s    40s  5s     10s    15s    20s  功率强度(Jcm^-2)  (I×T×20％)  2      4      6      8

本发明所述共聚物促进超声介导基因转染的方法，包括以下步骤：

1)分别将共聚物F127、L61或P85溶解在生理盐水中，配制成合适浓度的共聚物溶液，如0.5mg/ml和5mg/ml两种规格以方便后续步骤中的调配，经0.2μm微滤器过滤除菌后，存放在4℃的冰箱中冷藏备用；

2)分别将3T3-MDEI、C2C12、或CHO细胞悬液以500μl/孔的接种量，隔孔接种在24孔培养皿中，置37℃温箱中隔夜(24小时)培养，然后用微量加样器将培养皿中的培养液吸干，用400μl磷酸缓冲液清洗两遍，再吸干残液；

3)按以下顺序准备转染液：先在试管中加入DNA和步骤1)所配制的共聚物溶液，再加入与步骤2)中细胞悬液对应的细胞培养液，使试管中DNA的最终浓度为8μg/ml，各种共聚物的最终浓度按mg/ml计量在0.001％～0.1％之间，同时选一些共聚物的最终浓度在0.1％以上者作为比较组；

4)将步骤3)所准备的转染液也以500μl/孔的量，加入到步骤2)中对应细胞悬液的培养皿中，置37℃温箱中培养约20分钟；

5)将超声仪探头面朝上安置在水槽中，水平面覆盖探头约0.5cm，然后将步骤4)所得待照射培养皿的底部浸在水中紧邻探头，并使待照射孔在探头的正上面，在照射过程中匀速移动培养皿，使培养孔内的细胞受到均匀照射；

6)将经过步骤5)照射的培养皿置37℃温箱中隔夜培养(24小时)，次日先用荧光显微镜观察基因转染情况，然后用胰蛋白酶悬浮细胞，并将培养液和胰蛋白酶细胞悬液共同收集在试管中，置于冰上并遮盖住，再用流式细胞仪(FACS)检测细胞转染率，最后用胎盘蓝染色检测细胞成活率。其中，检测细胞成活率的计算方法为：样本细胞成活率＝样本组单位面积活细胞数/(对照组单位面积活细胞数+死细胞数)×100％，其中对照组为同种细胞、同样数量种植、未加入任何药物并未照射超声的组。

如图1示出不同浓度的F127对3T3-MDEI细胞超声介导细胞成活率和基因转染率的影响。在低浓度时(F1～F4)，F127可显著提高超声介导的基因转染率(p＜0.01)。在高浓度(＞F5)时，F127对超声介导的基因转染率显著降低。图中CON代表对照组，不含DNA和共聚物，也不照射超声；D代表DNA；US代表照射超声，1wcm^-2照射20s；F代表F127，F1～F5分别为5种逐渐递增浓度(mg/ml)的F127：0.005％、0.01％、0.025％、0.05％、0.1％。Viability(Via)表示细胞成活率；transfer rate(TR)表示基因转染率。

如图2示出不同浓度L61对3T3-MDEI细胞超声介导细胞成活率和基因转染率的影响。在低浓度时(L2～L4)，L61可显著提高超声介导的基因转染率(p＜0.01)。在较高浓度时(＞L5)，L61对超声介导的基因转染率显著降低。图中L1～L5分别为5种逐渐递增浓度(mg/ml)的L61：0.001％、0.0025％、0.005％、0.01％、0.025％。其他符号与图1相同。

如图3示出不同浓度P85对3T3-MDEI细胞超声介导细胞成活率和基因转染率的影响。在低浓度时(P1～P4)，P85可显著提高超声介导的基因转染(p＜0.01)。在高浓度时(＞P5)，P85对超声介导的基因转染率显著降低。P1～P6分别为6种逐渐递增浓度(mg/ml)的P85：0.01％、0.03％、0.05％、0.1％、0.25％、0.5％。其他符号与图1相同。

从图1～3所示三种共聚物对3T3-MDEI细胞超声介导的基因转染和细胞成活率影响的直方图可知，在不同的浓度范围(F1～F4、L2～L4、P1～P4)，三类共聚物均可显著提高超声介导的基因转染率。其中F127、L61和P85的最佳转染浓度分别约为：0.025％、0.01％和0.03％。在高浓度时(F127＞F5，P85＞P5，L61＞L5)，F127、P85和L61对超声介导的基因转染显著降低。

从图4所示上述三种共聚物在最佳提高超声介导基因转染浓度时对3T3-MDEI细胞的作用对比直方图可知，单应用共聚物并不能促进体外培养细胞的基因转染(D+F127、D+L61、D+P85组)；而三者在促进超声介导的基因转染中，其最佳转染浓度(F127、L61和P85分别为0.025％、0.01％和0.03％)与三者的微粒形成临界浓度(CMC)很接近，依次分别为0.0035％、0.022％和0.03％。根据共聚物水溶性的高低，其STC与CMC有一定的变化规律。轻度脂溶性P85的STC和CMC大致相同；水溶性很高的F127的STC高于CMC；而脂溶性很高的L61的STC却低于CMC。在各自STC下，P85所提高的基因转染显著高于F127和L61。

从图5的荧光显微镜照片中，可直观显示出共聚物对超声介导基因转染的促进作用。其中：绿色为转染表达绿荧光蛋白的细胞，蓝色为细胞核染色(PAD)。左上角的图E表示：DNA+US；右上角的图F表示：DNA+US+0.03％的F127；左下角的图G表示：DNA+US+0.01％的L61；右下角的图H表示DNA+US+0.03％的P85。

本发明采用三个细胞系：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠成肌细胞(C2C12)、和小鼠胚胎纤维原细胞(3T3-MDEI)同时对三类共聚物做出了大量的研究，从至少重复数百次的实验显示，所得结论一致，所以本发明具有一定的普遍性，对基因的治疗研究、特别是对肿瘤基因的治疗研究极为现实的意义。