血清游离DNA中上皮生长因子受体(EGFR)外显子19－21缺失变异的基因测序技术

摘要

本发明提供了一种测定分离的血清DNA样品中上皮生长因子外显子19－21突变的方法，该方法包括：a)提供分离的血清样品，在93－97℃下用试剂处理所述分离的血清样品，所述试剂基本上由乙酸/乙酸钾缓冲液、十二烷基硫酸钠和水组成，其中十二烷基硫酸钠的浓度为60－120毫克/毫升，所述试剂的pH为3－5；b)离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血清样品中游离DNA的沉淀；c)取步骤b)所得DNA沉淀，测定该游离DNA中是否存在上皮生长因子外显子19－21突变。用本发明方法可从100－500μl血清中获得足够的DNA进行EGFR外显子19－21的基因扩增和测序。

说明书

技术领域

本发明涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本发明涉及一种从血清游离DNA中检测上皮生长因子受体外显子19-21基因缺失变异的新方法。

背景技术

近年来，以上皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗(Molecularly TargetedTherapy)受到了国内外肿瘤界的普遍关注，其中EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂Genfitinib(又称Iressa或ZD1839)和Erlotinib(又称Tarceva或OSI-774)已被美国食品药品管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌，这些药物治疗其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌和胃癌等)目前也在进行临床试验之中。我国已在最近批准Genfitinib进入临床，预期Erlotinib也将在今后几年中获得批准。

美国、日本和台湾学者最近报道，肿瘤细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是上述药物奏效一个必要的前提条件。现有资料显示，对突变型肿瘤，Gefitinib和Erlotinib的有效率高达80％-90％，而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。所以，检测这一体细胞遗传改变可以有针对性地选用这类药物进行治疗，使得历经多次化疗失败的晚期肿瘤得到有效控制。

EGFR酪氨酸激酶由2个亚单位(又称小叶，Lobe)组成(图1)，其氨基端小叶(N-Lobe)含有二个重要结构，一是ATP磷酸结合环(P-Loop)，由5条平行的β-折迭构成，其中第1和第2条折迭间的连接肽中GSGSFG序列是ATPγ-磷酸基团的主要结合位点；二是αC螺旋(αC Helix)，此螺旋中含有ATP的α-和β-磷酸基团结合位点。当αC螺旋与ATP结合后，其构像发生改变，从而引起受体自身磷酸化和激酶活化。羧基端小叶(C-Lobe)是一个由螺旋状多肽组成的球形结构，连接N-Lobe和C-Lobe之间的环称为活化环(A-Loop)，此环是酪氨酸激酶的活性中心，由20-30个氨基酸组成，其中DFG序列在所有酪氨酸激酶中是高度保守的，改变此序列的组成或构像将显著影响激酶活性。

EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21-24编码C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19-21，这些突变可以分为三种类型，一是外显子19的碱基缺失，二是外显子20的点突变或碱基插入突变，这些突变出现在αC Helix的两侧，突变改变了ATP结合囊(ATP-binding pocket，简称ABP)的角度，从而导致EGFR高表达并明显增强癌细胞对Gefitinib和Erlotinib的敏感性。第三类突变出现在外显子21，尤其是第858位密码子的碱基替换突变，此突变位于DFG序列附近，其作用是使A-Loop的稳定性增高。实验证明，该突变可使癌细胞对Gefitinib的敏感性提高近100倍。美国学者Shigematsu等分析了617例肺癌组织，发现上述三类突变占EGFR基因突变发生率的94％，这类突变有以下特征：(1)亚洲人高于欧美人种；(2)女性高于男性；(3)腺癌高于其他类型；(4)非吸烟者高于吸烟者。这些特征与Gefitinib和Erlotinib的临床疗效基本吻合。

鉴于以上研究结果，不少国际著名学者(如美国哈佛医学院附属麻省总医院院长Chabner教授)指出，Gefitinib和Erlotinib等药物靶向治疗临床研究的下一步目标是依据EGFR基因检测结果选择治疗对象，通过筛选最合适的病人进行有针对性的靶向治疗。这种新颖肿瘤靶向治疗策略的优点是：(1)药物疗效可以达到80％-90％，病人能够最大限度地受益；(2)避免了不合理用药所造成的病人医疗费用增加和社会医疗资源浪费。因而这一基因检测新技术应用于临床，每年可使数百万病人得益，其社会意义和经济价值十分巨大。

但是，这项由美国科学家首创的基因测序技术目前只能以肿瘤组织为检测材料，据估计只有60％左右的病人适合这项诊断，因而其临床应用还存在诸多障碍，主要是：(1)晚期肿瘤尤其当病灶较大时多处于破裂出血的高危状态，应用穿刺活检等损伤性诊断手段获取肿瘤组织进行检测，可能带来医疗风险。(2)一部分晚期肿瘤病人、特别是术后复发者可能因病灶所处的特殊解剖位置(如脑转移)而无法进行穿刺活检。因此，有必要通过深入研究开发解决上述问题。

近十年来发现，恶性肿瘤病人的血液中存在游离的DNA(Circulating DNA)。此类游离DNA中90％以上来自肿瘤，其来源大致有：(1)微转移(Micrometastatsis)癌细胞，此类癌细胞从原发肿瘤脱落进入血循环后发生凋亡或坏死，从而将遗传物质释放到血液中。(2)原发肿瘤中癌细胞凋亡或坏死并将遗传物质释放到血液中。(3)活跃增殖的癌细胞在DNA复制时将一部分新合成的DNA片段排放到细胞外从而进入血循环。

由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。因此采用血液中游离的肿瘤DNA检测EGFR基因缺失变异既可以达到诊断目的，又更容易被患者及医务人员接受。

但是，肿瘤病人血液中游离DNA的含量极低，平均只有100ng/ml左右。因而高效分离此类DNA并进行EGFR外显子基因扩增和测序，技术难度很高，目前国内外均没有成功的报道。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供了一套有效的解决方案，其可以从100-500μl血清中获得足够的DNA进行EGFR外显子19-21的基因扩增和测序。

本发明提供了一种测定分离的血清样品中上皮生长因子外显子19-21突变的方法，该方法包括：a)提供分离的血清样品，在93-97℃下用试剂处理所述分离的血清样品，所述试剂基本上由乙酸/乙酸钾缓冲液、十二烷基硫酸钠和水组成，其中十二烷基硫酸钠的浓度为60-120毫克/毫升，所述试剂的pH为3-5；b)离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血清样品中游离DNA的沉淀；c)取步骤b)所得DNA沉淀，测定该游离DNA中是否存在上皮生长因子外显子19-21突变。

此处术语“基本上由……组成”指该试剂可以含有任何其它组分，这些组分可以具有任何的含量，只要这些组分及含量的存在对于本发明试剂在分离提取血清样品中游离DNA上的效果没有实质性影响即可。在一个较佳的实施方案中，每100毫升所述试剂由60毫升的5M乙酸钾、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸钠以及余量水组成。

在本发明的方案中，分离的血清样品是本领域技术人员很容易获得的，例如可以通过静脉抽取获得血液样品，然后置洁净离心管内4℃放置过夜，然后1500转/分钟离心5分钟，留置上层血清-70℃冰箱保存。

在另一个较佳的实施方案中，在所述步骤c)中，用于测定的DNA量大于6.25ng。

在另一较佳的实施方案中，在所述步骤c)中，所述测定该游离DNA中是否存在上皮生长因子外显子19-21突变的方法是：用SEQ ID NO：1-6所述的序列为引物对DNA进行PCR扩增，然后进行基因测序，并与上皮生长因子外显子19-21的野生型序列进行比较。

在本发明的方法中，步骤a)中加热处理的主要目的有二个，一是促使DNA双螺旋解离，二是引起蛋白变性。因而通过加热后离心，可以很容易使核酸与蛋白分离，其中蛋白位于离心管底部白色沉淀中，而核酸溶解在上部水相(酸性缓冲液)内。通常处理温度超过80℃便可达到上述目的，但将温度设置在93-97℃效果更好。在一个较佳的实施方案中，宜在95℃下处理所述血清样品。另外，该方法还包括在所述步骤b)之后、步骤c)之前的将所得DNA沉淀溶解于水中的步骤。

附图简述

图1显示了EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区结构示意图。

图2显示了EGFR外显子19-21的PCR产物电泳结果。

图3显示了肺腺癌及腺鳞癌中共检的EGFR外显子19-21突变的序列分析图谱。

图4显示了H460细胞基因组DNA的EGFR外显子19基因扩增结果，其中M为DNA分子量标准，泳道1-9中DNA模板量分别为200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562和0.781ng。

图5显示了肺癌病人血清游离DNA的EGFR外显子19的扩增结果，其中图上方数字表示样本编号。

图6显示了血清DNA中EGFR外显子19的基因缺失图谱。

较佳实施方案

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

实施例1：肺癌组织EGFR外显子19-21的PCR扩增及基因测序

1.1材料与方法

肿瘤组织

采集手术切除的肺癌组织20例，组织类型为肺腺癌15例，腺鳞癌5例。其中男性11例，女性9例，年龄为44-77岁，平均为57.8岁。

肿瘤组织在采集后1小时内快速冻存于液氮中，然后-80℃深低温冰箱保存。同时选取与肿瘤相距5cm以上的正常肺组织作为对照。

DNA提取

取50mg组织样本，采用DNAezsol基因组DNA抽提试剂盒(上海申能博采公司)提取基因组DNA，DNA提取过程按照试剂盒说明书操作。

引物设计

根据Genbank数据库公开发表人上皮生长因子受体(EGFR)基因(AY588246)序列，采用美国应用生物系统(ABI)公司的Primer Express软件分别在外显子19，20和21设计了3组引物(表1)。上述引物均由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

表1EGFR基因外显子19-21的PCR引物

  外显子  引物  核苷酸位置  碱基序列(5’-3’)  Tm  产物  19  上游  157524-157547  aac gtc ttc ctt ctc tct ctg tca  (SEQ ID NO：1)  57  150  bp  下游  157653-157673  cca cac agc aaa gca gaa act  (SEQ ID NO：2)  57  20  上游  164120-164147  tcc agg aag cct acg tga tg  (SEQ ID NO：3)  57  195  bp  下游  164292-164312  tta cct ttg cga tct gca cac  (SEQ ID NO：4)  58  21  上游  174537-174557  tct tct ctg ttt cag ggc atg  (SEQ ID NO：5)  57  196  bp  下游  174713-174732  ggc tga cct aaa gcc acc tc  (SEQ ID NO：6)  57

PCR扩增及基因测序

DNA的PCR扩增采用Pfu高保真DNA聚合酶(购自立陶宛MBI Fermantas公司)，PCR反应液内含DNA 4μl(100ng)，10x缓冲液5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游及下游引物(20μM)各1μl，Pfu酶(2.5U/μl)1μl，用DEPC-H₂O补充至50μl。PCR反应条件为95℃5分钟变性，然后95℃30秒，57℃30秒，72℃45秒，40个循环；72℃延伸7分钟。

PCR产物用于1.6％琼脂糖凝胶电泳，条件为100V 30分钟，凝胶经EB染色后摄片。PCR产物经柱分离纯化后采用上游引物进行基因测序，测序工作由北京奥科生物技术有限公司上海分公司完成。

1.2结果

采用Pfu高保真DNA聚合酶对基因组DNA中EGFR外显子19-21进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后显示呈现清晰的条带(图2)。

对PCR扩增产物纯化后进行测序，结果如下：

A.外显子19

20例正常肺组织均为野生型，而肺癌组织中存在3种类型的缺失突变(表2)，类型1有3例(655T，693T和864T)，该型突变缺失了15个碱基，导致EGFR蛋白第746-750位氨基酸(ELREA)丢失，简称del E746-A750。类型2有2例(775T和856T)，该型突变缺失了9个碱基(ttaagagaa)，并且其后的鸟嘌呤(G)转换为胞嘧啶(C)，导致EGFR蛋白第747-749位氨基酸(LRE)丢失，同时引入1个新的突变，由原来的丙氨酸(A)变为脯氨酸(P)，简称del L747-E749insP。类型3有1例(694T)，该型突变由二个碱基缺失组成，导致EGFR蛋白第746-752位氨基酸(LREATS)丢失，同时引入1个新的突变，由原来的746位的谷胺酰胺(E)变为颉氨酸(V)，简称del E746-S752insV。

表2肺癌组织中EGFR基因外显子19碱基缺失图谱

  编号  碱基序列(2416-2448)  氨基酸序列(744-754)  野生型  atcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaa  IKELREATSPK  655T  atcaa---------------aacatctccgaaa  IK-------TSPK  693T  atcaa---------------aacatctccgaaa  IK-------TSPK  864T  atcaag---------------acatctccgaaa  IK-------TSPK  775T  atcaaggaa---------ccaacatctccgaaa  IKE-----PTSPK  856T  atcaaggaa---------ccaacatctccgaaa  IKE-----PTSPK  694T  atcaagg--tt----------------ccgaaa  IKV--------PK

注：核苷酸及氨基酸序列参照Genbank X00588，以下同。

B.外显子20

外显子20中存在2类碱基替换突变(图3)，类型1仅见于正常肺组织(16例/20例)，该突变发生在第2542位碱基，由鸟嘌呤(G)转变为胸腺嘧啶(T)，这种G＞T转换导致EGFR蛋白第786位的颉氨酸(V)变为苯丙氨酸(F)，简称V785F。类型2仅见于肺癌组织(共2例，694T和862T)，该突变使得第789-793位密码子atc acg cag ctc atg变成ttc tcg tag ctc ttt，导致氨基酸序列ITQLM被FS-LF替换，简称I789F-M793F，其中第791密码子由cag变成终止密码tag，但该突变是否引起蛋白翻译终止，尚需进一步研究证实。

C.外显子21

外显子21只检出1类碱基替换突变，该突变仅出现在肺癌组织中，共7例(图3)，该突变发生在第2759位碱基，由胸腺嘧啶(T)转变为鸟嘌呤(G)，这种T＞G转换导致EGFR蛋白第858位的亮氨酸(L)变为精氨酸(R)，简称L858R。

因此，20例肺腺癌及腺鳞癌中共检出EGFR外显子19-21突变14例，阳性率达70％(表3)，这些突变的序列分析图谱见图3。

表3肺癌组织中EGFR基因的缺失突变

  编号  性别  年龄  类型  分期  外显子19  外显子20  外显子  21  632T  女  52  腺癌  T2N0  野生型  野生型  L858R  655T  女  66  腺鳞癌  T2N0  del E746-  A750  野生型  野生型  669T  女  67  腺癌  T2N0  野生型  野生型  野生型  693T  女  54  腺癌  T4N2  del E746-  A750  野生型  野生型  694T  男  58  腺癌  T2N2  del E746-S752insV  I789F-M793F  野生型  716T  女  54  腺癌  T2N2  野生型  野生型  L858R  727T  男  51  腺鳞癌  T2N1  野生型  野生型  野生型  728T  男  57  腺癌  T2N2  野生型  野生型  L858R  755T  女  77  腺癌  T2N0  野生型  野生型  L858R  775T  女  56  腺癌  T2N0  del L747-E749insP  野生型  野生型  787T  男  53  腺癌  T2N0  野生型  野生型  L858R  811T  男  56  腺鳞癌  T3N0  野生型  野生型  L858R  813T  女  64  腺癌  T2N0  野生型  野生型  L858R  820T  男  67  腺鳞癌  T4N2  野生型  野生型  野生型  847T  男  37  腺癌  T2N2  野生型  野生型  野生型  848T  男  69  腺癌  T2N0  野生型  野生型  野生型  856T  男  44  腺癌  T2N3  del L747-E749  insP  野生型  野生型  860T  男  54  腺癌  T2N3  野生型  野生型  野生型  862T  男  57  腺鳞癌  T2N3  野生型  I789F-M793F  野生型  864T  女  62  腺癌  T2N2  del E746-  A750  野生型  野生型

实施例2：血清游离DNA的提取及EGFR外显子基因测序

2.1材料与方法

血清制备方法：静脉抽取3ml血液后，置洁净离心管内4℃放置过夜，然后1500转/分钟离心5分钟，留置上层血清-70℃冰箱保存。

血清游离DNA的抽提：血清游离DNA的抽提采用PAS血液游离DNA抽提试剂。关于PAS血液游离DNA抽提试剂，可参见上海奇诺肿瘤生物高新技术有限公司于2005年4月4日提交的申请号200511024851.0的专利申请，该专利申请全文纳入本文作为参考。

具体而言，取5M乙酸钾60毫升，将其与冰乙酸11.5毫升混合，加入100毫克十二烷基硫酸钠，然后加入水补足至100毫升，制得所述PAS血液游离DNA抽提试剂。该试剂保存于室温，保存期为6个月。采用上述制得的血液游离DNA抽提试剂进行血清游离DNA的抽提，其操作步骤如下：

1.1.5ml Eppendorf管内加入500微升上述血液游离DNA抽提试剂，95℃预热5分钟；

2.加入100-500微升血清，95℃加热5分钟，剧烈振荡20秒；

3.13,000rpm离心5分钟；

4.转移300-700微升上清至新Eppendorf管内，加入等量异丙醇，室温5分钟；

5.13,000rpm离心5分钟；

6.弃上清，加入700微升70％乙醇；

7.13,000rpm离心5分钟；

8.弃上清，加入700微升70％乙醇；

9.13,000rpm离心5分钟；

10.弃上清，倒置Eppendorf管，室温干燥DNA沉淀；

11.溶解DNA于20微升H₂O中-70℃保存。

PCR扩增和基因测序方法见实施例1。

2.2结果

健康人血清DNA含量平均为18.81ng/ml血清，而肿瘤病人血清DNA含量平均为117.55ng/ml血清(见专利申请200511024851.0)。根据以上数值计算，0.5ml血清经过提取后DNA平均浓度约为0.5-2.9ng/μl。因而要对这些样本进行PCR扩增和基因测序，首先必须了解PCR反应的敏感性，为此，我们将H460细胞基因组DNA进行系列稀释后进行PCR扩增，结果显示DNA模板量需达到6.25ng时，其扩增产物才可用于基因测序(图4)。

因此，可以预期，若用4μl DNA进行PCR反应，肿瘤病人样本可以获得足够的扩增产物供基因测序，而大部分健康人样本不能获得足够的扩增产物。试验结果证实(图5)，10例健康志愿者的血清样本经PCR反应后均观察不到扩增产物，而20例肺癌病人血液样本都获得了清晰产物条带。

对上述血清DNA样本同时进行EGFR外显子19-21的PCR扩增和测序，结果发现外显子19缺失突变有3例，此3例均为腺癌。但其突变主要影响第748和749位密码子，引起EGFR蛋白中精氨酸(R)和谷氨酰胺(E)缺失并被赖氨酸(K)替换，简称del R748-E749insK，这种突变方式在肺癌组织中未曾见过，在国外文献中也没有相同的报道(表4及图6)。

表4血清DNA中EGFR外显子19测序结果

  编号  碱基序列(2416-2448)  氨基酸序列(744-754)  野生型  atcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaa  IKELREATSPK  8  atcaaggaattaa----aagcagcatctccgaaa  IKELK-ATSPK  20  atcaaggaattaa----aagcagcatctccgaaa  IKELK-ATSPK  24  atcaaggaattaa----aagcagcatctccgaaa  IKELK-ATSPK

此外，在20例血清样本中检出2例(7号和62号)存在外显子21的L858R突变，此2例均为腺癌。但外显子20突变未检测到。

因此，20例血清样本共检出EGFR外显子19-21突变5例，突变占肺腺癌及腺鳞癌病人总数的55.6％(表5)。血清游离DNA中EGFR基因突变的检出率与肿瘤组织的检出率相同。

表5血清游离DNA中EGFR基因的缺失突变

  编号  性别  年龄  类型 外显子19  外显子20  外显子21  2  男  75  鳞癌 野生型  野生型  野生型  3  男  78  鳞癌 野生型  野生型  野生型  5  男  76  鳞癌 野生型  野生型  野生型  6  女  54  腺癌 野生型  野生型  野生型  7  男  58  腺癌 野生型  野生型  L858R  8  男  53  腺癌 del R748-E749insK  野生型  野生型  17  男  65  鳞癌 野生型  野生型  野生型  20  女  63  腺癌 del R748-E749insK  野生型  野生型  21  女  57  鳞癌 野生型  野生型  野生型  24  男  57  腺癌 del R748-E749insK  野生型  野生型  32  男  61  鳞癌 野生型  野生型  野生型  34  男  58  腺鳞癌 野生型  野生型  野生型  39  男  49  鳞癌 野生型  野生型  野生型  40  女  64  腺鳞癌 野生型  野生型  野生型

  47  女  63  鳞癌  野生型  野生型  野生型  52  男  62  小细胞  野生型  野生型  野生型  53  女  65  鳞癌  野生型  野生型  野生型  61  男  69  鳞癌  野生型  野生型  野生型  62  女  58  腺癌  野生型  野生型  L858R  64  女  65  腺癌  野生型  野生型  野生型

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

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序列表

<110>上海奇诺肿瘤生物高新技术有限公司

<120>血清游离DNA中上皮生长因子受体(EGFR)外显子19-21缺失变异的基因测序技术

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<170>PatentIn version 3.1

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