促红细胞生成素在心脏病中的新用途

摘要

本发明涉及促红细胞生成素治疗心脏病中铁分布紊乱的用途。

说明书

本发明涉及促红细胞生成素的新用途，特别是心脏病中铁分布紊乱的治疗。

已知多种疾病中存在铁代谢异常。在贫血症中，体内整体性缺铁导致无法生成足量的血液。另一与铁相关的代谢疾病是血色病，其中体内铁的总浓度高于正常，从而导致多种疾病，例如器官被破坏。

铁分布紊乱有别于上述的贫血症及血色病，因为体内铁的总体浓度正常。一方面，铁聚积于多种器官并可造成这些器官的损伤甚至是破坏；另一方面，以正常量存在的铁在造血中的用途受损，导致相当于与贫血症相关疾病的次级作用。

直到现在才清楚心脏病患者受铁分布紊乱影响的可能性很大。可通过多种通常用于诊断铁状态的参数来诊断铁分布紊乱。基于测量铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体，可以评估一个心脏病患者体内的总铁浓度是否正常。如果浓度异常，则网织红细胞内血红蛋白浓度降低是铁分布紊乱的指征。另一指征为，在体内总铁浓度正常的心脏病患者中，C反应蛋白(CRP)浓度的持续/长期升高。P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf及R.Roeddiger曾在2001年7月29日至8月2日Chicago，IllinoisAACC/CSCC年会报告中描述了诊断铁分布紊乱的方法。

到目前为止，还没有针对患铁分布紊乱的心脏病患者的治疗。因此本发明的基本问题是为心脏病中的铁分布紊乱提供治疗，从而最大程度地减小或抑制上述不利影响。已令人惊奇地发现促红细胞生成素对于心脏病中的铁分布紊乱具有有利的作用。因此根据本发明，将促红细胞生成素用于治疗心脏病中铁分布紊乱，使该问题得以解决。

除非另有说明，列出以下定义以说明和限定在此描述本发明时所使用的各术语的意义及范围。

此处所用的术语“低级烷基”指具有一至六个碳原子的直链或支链烷基。低级烷基的实例包括甲基、乙基及异丙基，优选甲基。

此处所用的术语“低级烷氧基”指R’-O-基团，其中R’为上面描述的低级烷基。

术语“心脏病铁分布紊乱”指发生在心脏病患者中的铁分布紊乱。此铁分布紊乱可以例如具有如上所述的特征。具体而言，铁分布紊乱具有以下参数特征：可溶性转铁蛋白受体的浓度[mg/L]除以log(铁蛋白浓度[μg/L])小于3.5，同时C反应蛋白浓度高于5mg/L。

术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白”指这样的蛋白质，其在体内具有引起骨髓细胞增加产生网织红细胞和红细胞的生物活性并选自人促红细胞生成素及其以下定义的类似物。

术语“聚乙二醇化促红细胞生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”指与一至三个如下定义的聚乙烯衍生物共价连接的促红细胞生成素蛋白。

附图描述

图1：人EPO的一级结构(165个氨基酸)(SEQ ID NO：1)。

图2：人EPO的一级结构(166个氨基酸)(SEQ ID NO：2)。

更具体而言，本发明涉及促红细胞生成素在制备治疗心脏病中铁分布紊乱的药物中的用途。心脏病的实例如冠心病、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心力衰竭、充血性心力衰竭和/或心功能不全。在优选的实施方案中，本发明涉及如上定义的用途，其中心脏病指心功能不全。

本发明对于制备含促红细胞生成素作为药物活性成分的药物组合物特别有用。所用术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白”或“EPO”定义如下：这些术语具体指一种糖蛋白，如人促红细胞生成素，如具有列于(SEQ ID NO：1)或(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列或基本上与之同源的氨基酸序列，其生物特性涉及刺激红细胞的产生以及刺激骨髓中定向红系祖细胞的分裂和分化。如这里所用的，这些术语包括经过特意修饰的此类蛋白质，例如经定点诱变法或随机突变法修饰。这些术语还包括具有一至六个附加糖基化位点的类似物、在糖蛋白的羧基端具有至少一个附加氨基酸的类似物(其中附加氨基酸含有至少一个糖基化位点)，以及具有如下氨基酸序列的类似物，即氨基酸序列含有至少一个糖基化位点的重排。这些术语包括天然和重组产生的人促红细胞生成素。在本发明优选的实施方案中，促红细胞生成素蛋白为人促红细胞生成素。

如下文详细描述，EPO的制备和纯化为本领域所熟知。促红细胞生成素指的是天然或重组蛋白质，优选人源，例如来自任何常规来源(如组织、蛋白质合成、用天然或重组细胞的细胞培养)的阿法依泊汀(epoetin alfa)或倍他依泊汀(epoetin beta)。包括任何具有促红细胞生成素活性的蛋白质，如突变蛋白或经修饰蛋白质。在本发明优选的实施方案中，促红细胞生成素蛋白为阿法依泊汀或倍他依泊汀。可通过重组DNA技术或内源性的基因活化途径，经CHO-、BHK-或HeLa细胞系表达制备重组促红细胞生成素。蛋白质的表达，包括经内源基因活化，是本领域众所周知的，并已公开于如美国专利号5,733,761、5,641,670和5,733,746，国际专利公开号WO93/09222、WO94/12650、WO95/31560、WO90/11354、WO91/06667和WO91/09955，其各自内容均在此处引入作为参考。如上描述的用途，其中优选通过内源基因活化表达促红细胞生成素蛋白。优选的制备促红细胞生成素糖蛋白产品的EPO种类为人EPO种类。更为优选的EPO种类为具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所列出的氨基酸序列的人EPO，其中尤其优选氨基酸序列SEQ ID NO：1。因此，本发明优选的实施方案涉及如上描述的用途，其中促红细胞生成素蛋白具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的氨基酸序列。

另外，促红细胞生成素还可以是具有一至六个附加糖基化位点的糖蛋白类似物。因此，本发明也涉及前述用途，其中促红细胞生成素蛋白具有经加入一至六个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列。加入一个或多个寡糖的蛋白质糖基化发生在多肽主链的特定位置，且极大地影响了蛋白质的物理性质，如蛋白质的稳定性、分泌、亚细胞定位以及生物学活性。糖基化通常有两种类型。O-连接的寡糖附着于丝氨酸或苏氨酸残基，而N-连接的寡糖则附着于精氨酸残基。在O-连接及N-连接的寡糖链中均存在的寡糖之一为N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是含有9个或更多碳原子的氨基糖家族。唾液酸常为N-连接及O-连接寡糖的末端残基，且由于它带有负电荷，赋予该糖蛋白酸性特征。人促红细胞生成素具有165个氨基酸，含有三条N-连接和一条O-连接的寡糖链，这些寡糖链约占该糖蛋白总分子量的40％。N-连接的糖基化发生于第24位、38位及83位的精氨酸残基，O-连接的糖基化则发生于第126位的丝氨酸残基。这些寡糖链经由末端唾液酸残基修饰。酶去除糖基化促红细胞生成素的所有唾液酸残基，会导致体内活性而不是体外活性的丧失，因为促红细胞生成素的唾液酸化阻止了其与肝脏结合蛋白的结合及结合后的清除。

术语“促红细胞生成素”包括人促红细胞生成素的类似物，所述类似物可具有一处或多处人促红细胞生成素氨基酸序列的改变，从而增加了唾液酸附着位点的数目。这些糖蛋白类似物可通过包括添加、缺失或替换氨基酸的定点诱变形成，所述诱变增加或改变可供糖基化的位点。唾液酸含量水平高于人促红细胞生成素的糖蛋白类似物是通过增加不影响生物学活性所需的二级或三级构象的糖基化位点而产生。本发明中的糖蛋白也包括糖基化位点处糖类附着水平增加的类似物，所述类似物通常涉及紧邻N-连接或O-连接位点的一个或多个氨基酸替换。本发明中的糖蛋白也包括从红细胞生成素羧基端延伸一个或多个氨基酸并提供至少一个额外的糖基位点的类似物。本组合物中的促红细胞生成素蛋白也包括其氨基酸序列包含至少一个糖基化位点的重排的类似物。此种糖基化位点重排涉及在人促红细胞生成素中缺失一个或多个糖基化位点和加入一个或多个非天然产生的糖基化位点。通过增加促红细胞生成素上的糖链数目，并由此增加每个红细胞生成素分子中的唾液酸数目，可能会赋予有利的性质，如增强的溶解性、更高的蛋白水解抗性、降低的免疫原性、增长的血清半衰期，以及增加的生物活性。具有附加糖基化位点的促红细胞生成素类似物的详细情况公开于Elliot在1995年3月1日发表的欧洲专利申请640619。

在优选的实施方案中，本发明的药物组合物含有其氨基酸序列包含至少一个附加糖基化位点的促红细胞生成素蛋白。例如但不仅限于含有选自下列修饰的人促红细胞生成素序列的促红细胞生成素：

Asn³⁰Thr³²；

Asn⁵¹Thr⁵³；

Asn⁵⁷Thr⁵⁹；

Asn⁶⁹；

Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹；

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²；

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²；

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰；

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹；

Asn¹³⁶Thr¹³⁸；

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰；

Thr¹²⁵；和

Pro¹²⁴Thr¹²⁵。

此处使用的用于氨基酸序列修饰的表示指在未经修饰的相应蛋白质(如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的hEPO)中上标数字所代表的位置处变为各上标数字前紧邻的氨基酸。

促红细胞生成素蛋白也可以是在糖蛋白的羧基端具有至少一个附加氨基酸的类似物，其中该附加氨基酸含有至少一个糖基化位点。该附加氨基酸可以含有来自人绒毛膜促性腺激素羧基端的肽片段。优选该糖蛋白为选自如下的类似物：(a)具有自羧基端延伸的Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro ProPro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile LeuPro Gln氨基酸序列的人红细胞生成素；(b)进一步包含Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的(a)的类似物；以及(c)进一步包含Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的(a)的类似物。

促红细胞生成素蛋白也可以是其氨基酸序列含有至少一个糖基化位点的重排的类似物。所述重排可以包括：人促红细胞生成素中任一N-连接的糖基位点的缺失，以及在人促红细胞生成素氨基酸序列中的第88位添加N-连接的糖基位点。优选该糖蛋白为选自Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO、Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO、和Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO的类似物。还有一种类似物为阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)，在前述用途中优选的促红细胞生成素蛋白为阿法达贝泊汀。

更具体而言，如上所述的本发明药物组合物中的促红细胞生成素蛋白也可以包括其聚乙二醇化衍生物。促红细胞生成素的聚乙二醇化衍生物及其制备为本领域公知，并描述于如WO01/02017、EP-A-1064951、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO93/25212、WO94/20069、WO95/11924，美国专利号5,56、EP-A-584,876、WO92/16555、WO94/28024、WO97/04796，美国专利号5,359,030及5,681,811，美国专利号4,179,337，日本专利号，WO98/32466，美国专利号5,324,650。在上述用途中优选的促红细胞生成素为聚乙二醇化促红细胞生成素。聚乙二醇化促红细胞生成素种类的优选实施方案参见下文描述的衍生物。

因此，本发明也涉及以上描述的用途，其中促红细胞生成素蛋白为缀合物，该缀合物含有如上描述的促红细胞生成素蛋白，其具有至少一个游离氨基，在体内具有促使骨髓细胞增加产生网织红细胞和红细胞的生物活性，且选自人促红细胞生成素及其类似物，该类似物含有经添加一至六个糖基化位点或重排至少一个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素序列；该促红细胞生成素与n个式-CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR的聚(乙二醇)基团共价连接，其中每个聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所述的氨基之一形成酰胺键；其中R为低级烷基，x为2或3；m为约450至约900；n为1至3；且选择n与m使该缀合物减去促红细胞生成素蛋白后的分子量为20至100千道尔顿。本发明还提供了含此处所述缀合物的药物组合物，其中n为1的缀合物的百分比至少为百分之九十，优选至少百分之九十二，或优选为组合物中所有缀合物的百分之九十六。

更具体而言，上述缀合物可以用式(I)表示

             P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n      (I)

其中，P为此处所述的促红细胞生成素蛋白的残基(即，不含有氨基或与式I中羧基形成酰胺键的氨基)，在体内具有促使骨髓细胞增加产生网织红细胞和红细胞的生物活性；其中，R为低级烷基；x为2或3；m为约450至约900；n为1至3；且选择n与m使该缀合物减去促红细胞生成素蛋白后的分子量为20至100千道尔顿。根据本发明，R为任一低级烷基。优选R为甲基的缀合物。

符号“m”代表聚(环氧乙烷)基团中环氧乙烷残基(OCH₂CH₂)的数目。环氧乙烷的一个PEG(聚乙二醇)亚单位的分子量为约44道尔顿。因此，该缀合物的分子量(EPO的分子量除外)取决于数字“m”。在本发明的缀合物中，“m”为约450至约900(对应的分子量为约20kDa至约40kDa)，优选为约650至约750(对应的分子量为约30kDa)。选择数字m，从而使产生的本发明缀合物具有与未经修饰的EPO相当的生理活性，该活性可能表现为等于、高于未经修饰EPO的相应活性或为其一部分。分子量“约”为某一数值是指该分子量位于通过如常规分析技术测定的该数值的一个合理范围内。数字m的选择为使得每个与促红细胞生成素糖蛋白共价连接的每一聚(乙二醇)基团的分子量都在约20kDa至约40kDa之间，优选约30kDa。

在本发明的缀合物中，数字“n”为与促红细胞生成素蛋白中的游离氨基(包括赖氨酸残基的ε-氨基和/或氨基端氨基)经由酰胺键共价连接的聚(乙二醇)基团的数目。本发明的缀合物中每分子EPO可以具有一个、两个或三个PEG基团。“n”为1至3的整数，优选“n”为1或2，更为优选“n”为1。上述缀合物中的优选缀合物含有这样的化合物，其中x为2，m为650至750，n为1，且R为甲基。

式(I)的化合物可制备自以下已知的聚合物材料：

其中R和m如上所述，通过将式II的化合物与促红细胞生成素糖蛋白缩合而成。x为3的式II化合物为α-低级烷氧基，聚(乙二醇)的丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。X为2的式II化合物为α-低级烷氧基，聚(乙二醇)的丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以利用任何可使活性酯与胺反应生成酰胺的常规方法。在上述反应中，例举的琥珀酰亚胺酯是造成酰胺形成的离去基团。如式II化合物的琥珀酰亚胺酯在产生携带蛋白质的缀合物中的用途公开于1997年9月30日发行的美国专利号5,672,662中(Harris等人)。

人EPO含有9个游离氨基，它们是氨基末端的氨基和8个赖氨酸残基的ε-氨基。已发现在pH7.5、蛋白质∶PEG比例为1∶3、反应温度为20-25℃的条件下，聚乙二醇化试剂与式II的SBA化合物结合可以产生单、双以及痕量的三聚乙二醇化物的混合物。当聚乙二醇化试剂是式II的SPA化合物时，在相似条件下(除蛋白质∶PEG的比例为1∶2外)主要产生单聚乙二醇化物。可以采用混合物的形式，或采用经阳离子交换层析分离的不同聚乙二醇化物的形式施用聚乙二醇化EPO。通过控制反应条件(如反应物的比例、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间等)，可以改变不同聚乙二醇化物的相对量。

本发明进一步的优选实施方案涉及以上描述的用途，其中促红细胞生成素蛋白为缀合物，该缀合物含有如上描述的选自人促红细胞生成素及其类似物，具有至少一个游离氨基，并在体内具有促使骨髓细胞增加产生网织红细胞和红细胞的生物活性的促红细胞生成素蛋白，所述促红细胞生成素类似物中具有经过添加一至六个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素蛋白的一级结构；该促红细胞生成素蛋白与一至三个低级烷氧基聚(乙二醇)基团共价连接，其中每一聚(乙二醇)基团均借助式-C(O)-X-S-Y-的衔接物共价连接，以衔接物的C(O)与所述的氨基之一形成酰胺键，从而与促红细胞生成素蛋白共价相连，衔接物中X为-(CH₂)_k-或-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，k为1至10，Y为

              或

每个聚(乙二醇)部分的平均分子量为约20千道尔顿至约40千道尔顿，而该缀合物的分子量为约51千道尔顿至约175千道尔顿。

该类促红细胞生成素也可以由式(III)表示

          P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n    (III)

其中R可以为任一低级烷基。优选的低级烷基为甲基。X可以为-(CH₂)_k-或-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，其中k为1至约10。优选的k为1至约4，更为优选的k为1或2。最优选的X为-(CH₂)。

在式1中，Y为

              或

优选

       或

更优选

           

在式(III)中，选择数字m使产生的式(III)缀合物与未经修饰的EPO具有相当的生理活性，该活性可表示为等于、高于未经修饰EPO的相应活性或为其一部分。m表示的是PEG单元中环氧乙烷残基的数目。-(OCH₂CH₂)-的一个PEG亚单位的分子量为约44道尔顿。因此，该缀合物的分子量(EPO的分子量除外)取决于数字m。分子量“约”为某一数值是指，该分子量位于由常规分析技术测定的该数值的一个合理范围内。m为约450至约900范围内的整数(对应的分子量为20至40kDa)，优选的m为约550至约800(约24至35kDa)，而最为优选的m是约650至约700(约29至约31kDa)。

在式(III)中，数字n是通过酰胺键与PEG单元共价连接的促红细胞生成素蛋白中赖氨酸ε-氨基的数目。本发明缀合物中每分子的EPO可具有一个、两个或三个PEG单元。n为介于1至3的整数，优选的n为1或2，更为优选的n为1。

优选的式(III)的促红细胞生成素蛋白可由下式表示：

      和

在本发明最优选的实施方案中，促红细胞生成素缀合物可由下式表示：

在上式中，n为1至3的整数；m为450至900的整数；R为低级烷基；X为-(CH₂)_k-或-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，而P则为不具有氨基或与X形成酰胺键的基团的促红细胞生成素蛋白残基。

其他优选的促红细胞生成素糖蛋白产物由下式表示：

                   和

更为优选的促红细胞生成素糖蛋白产物可由下式表示：

这些促红细胞生成素蛋白可以经下列途径制备：

(a)将促红细胞生成素蛋白(以式P-[NH₂]_n表示)中赖氨酸的ε-氨基与双功能试剂(以式Z-CO-X-S-Q表示)进行共价反应，形成下式表示的具有酰胺键的中间体：

                   P-[NH-CO-X-S-Q]_n

其中P为缺少形成酰胺键的氨基的促红细胞生成素蛋白；n为1至3的整数；Z为反应基，例如羧酸NHS酯；X为-(CH₂)_k-或-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，其中k为1至约10；而Q则为保护性基团，如烷酰基，例如乙酰基。

(b)将步骤(a)中得到的具有酰胺键的中间体与活化的、以式W-[OCH₂CH₂]_m-OR表示的聚(乙二醇)衍生物进行共价反应，形成下式表示的促红细胞生成素糖蛋白产物：

其中W为Y的巯基化活性形式；m为约450至约900范围的整数；R为低级烷基；而Y则如上所定义。

在该实施方案中，双功能试剂优选N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基丙酸酯，或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯，Z优选N-羟基-琥珀酰亚胺，而活化的聚(乙二醇)衍生物W-[OCH₂CH₂]_m-OR优选选自碘代-乙酰基-甲氧基-PEG、甲氧基-PEG-乙烯砜，以及甲氧基-PEG-马来酰亚胺。

更具体而言，式(III)的促红细胞生成素蛋白可以如下制备：将巯基与EPO共价连接(“活化”)，并将产生的活化EPO与聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶联。根据本发明，用于制备聚乙二醇化EPO的第一步包括巯基与EPO的-NH₂基团的共价连接。EPO的此步活化通过双功能试剂完成，该双功能试剂带有保护性巯基和额外的反应基，反应基如活性酯(如琥珀酰亚胺酯)、酐、硫酸酯、羧酸及硫酸的卤化物。该巯基由本领域已知的基团(如乙酰基)所保护。这些双功能试剂能够与赖氨酸的ε-氨基反应形成酰胺键。该反应的第一步列于如下：

EPO，n及X如上描述，Z为本领域已知的反应基，例如下式的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)取代物：

在优选的实施方案中，赖氨酸ε-氨基的活化是通过与具有琥珀酰亚胺基部分的双功能试剂反应形成的。该双功能试剂可携带不同种类的间隔臂，例如-(CH₂)_k-或-CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-，其中k为1至约10，优选为1至约4，更为优选为1或2，最优选为1。这类试剂的实例如N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯(SATA)

乙酰硫基烷基-羧酸-NHS-酯，如

或

        

        2-(乙酰硫基)-(乙氧基)_K-乙酸-NHS-酯

其中k定义如上。

双功能试剂的制备为本领域已知。2-(乙酰硫基)-(乙氧基)_k-乙酸-NHS-酯的前体描述于DE-3924705，而其乙酰硫基化合物的衍生则由March，J.在《Advanced Organic Chemistry》，McGraw-Hill，1977，375-376中描述。SATA可经商业途径获取(Molecular Probes，Eugene，OR，USAand Pierce，Rockford，IL)。

可以通过调整反应参数而选择添加到EPO分子上的巯基数目，即调整蛋白质(EPO)浓度和蛋白质/双功能试剂的比例。优选情况下，通过每EPO分子共价连接1至5个巯基来激活EPO，更为优选的是每EPO分子连接1.5至3个巯基来激活EPO。该范围为参照覆盖EPO蛋白群体的巯基统计分布而定。

该反应可在如pH为6.5-8.0的缓冲水溶液(如10mM磷酸钾、50mMNaCl，pH为7.3)中进行。双功能试剂可在DMSO中加入。反应完成之后(优选30分钟后)，通过加入赖氨酸终止反应。过量的双功能试剂可以经过本领域已知的方法分离，如透析或柱过滤法。添加到EPO上的平均巯基数目可以通过如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49(1967)中描述的光度法测定。

上述反应后，进行活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物的共价偶联。合适的PEG衍生物为平均分子量为约20至约40kDa，更为优选的是约24至约35kDa，最优选为分子量约30kDa的活化PEG分子。

活化的PEG衍生物为本领域已知，如Morpurgo，M.等人在J.Bioconj.Chem.(1996)7第363页中对PEG-乙烯砜进行了描述。直链及支链PEG种类适于制备式1的化合物。活性PEG试剂的实例有碘代-乙酰-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜：

或

这些碘-活性物质的用途为本领域已知，如Hermanson，G.T.在《Bioconjugate Techniques》，Academic Press，San Diego(1996)147-148页中进行了描述。

最优选的是，使用(低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺)如甲氧基-PEG-马来酰亚胺(分子量30000；Shearwater Polymers，Inc.)，通过马来酰亚胺活化PEG类。低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下：

或

其中R和m如上所描述，优选

与低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的偶联反应是在缓冲水溶液(如10mM磷酸钾、50mM NaCl，2mMEDTA，pH为6.2)中原位切割保护性巯基后进行的。保护性基团的切割可以在如25℃、pH为6.2的DSMO中与羟胺反应约90分钟进行。为了进行PEG修饰，活化的EPO/低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比应在约1∶3至约1∶6，优选1∶4。可以通过加入半胱氨酸，以及将剩余巯基(-SH)与N-甲基马来酰亚胺或其他能够形成二硫键的恰当化合物的反应来终止反应。由于任何剩余的活性巯基与诸如N-甲基马来酰亚胺或其他适宜的保护性基团发生反应，本发明的缀合物内的EPO糖蛋白可能含有此类保护性基团。通常此处描述的方法将会产生不同分子的混合物，这些分子带有由不同数目的保护性基团保护的数目各异的巯基，被保护巯基的数目取决于该糖蛋白上未与PEG-马来酰亚胺缀合的活化巯基的数目。

当用N-甲基马来酰亚胺封闭聚乙二醇化蛋白质上剩余巯基时，其形成的是相同类型的共价键，而二硫化物将会在分子内硫化物/二硫化物交换反应中导致以二硫键与封闭试剂偶联。用于该类封闭反应的优选封闭试剂为氧化型谷胱甘肽(GSSG)、半胱氨酸和胱氨。尽管使用半胱氨酸不会在聚乙二醇化蛋白质上引入额外的净电荷，使用封闭试剂GSSG或胱氨会导致额外的负电荷或正电荷。

式(III)的化合物的进一步纯化，包括单-、双-以及三-聚乙二醇化EPO类物质的分离，可以经本领域已知的方法(例如柱层析法)进行。

优选聚乙二醇化促红细胞生成素蛋白衍生物含有至少百分之九十的单PEG缀合物。通常需要促红细胞生成素糖蛋白的单-PEG缀合物，因为它们往往比双-PEG缀合物具有更高的活性。单-PEG缀合物的百分比，以及单-、双-PEG类物质的比例可以通过如下控制：收集洗脱峰附近较大范围的级分以降低单-PEG缀合物的百分比，或收集较窄范围的级分以提高组合物中单-PEG缀合物的百分比。单-PEG缀合物占约百分之九十可使产量和活性间达良好平衡。有时也需要这样的组合物，例如，其中单-PEG缀合物(n等于1)至少占缀合物总量的百分之九十二或至少百分之九十六。在本发明的实施方案中，n等于1的缀合物的百分比为百分之九十至百分之九十六。

含有聚乙二醇化促红细胞生成素的药物组合物为本领域所公知，且已有所描述(如国际专利申请号WO01/87329中)。组合物中可以含有10至10000μg如上所述的促红细胞生成素蛋白/ml。优选情况下，该组合物含有10至1000μg促红细胞生成素蛋白/ml，如10、50、100、400、800或2500μg/ml。此外，组合物中可以含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、10-200mmol/l硫酸盐、10至50mmol/l磷酸盐，pH为6.0至6.5。该组合物还可以含有高达20mM的甲硫氨酸，1-5％的多元醇(w/v)，高达0.1％的pluronic F68(w/v)，以及任选地高达1mM CaCl₂。这类组合物的实例之一含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、40mmol/l硫酸盐、10mmol/l磷酸盐、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH为6.2。该组合物的另一选择可含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、10至100mmol/l NaCl、10至50mmol/l磷酸盐，pH为6.0至7.0，任选地1-5％(w/v)的多元醇。此外，该组合物可以含有高达20mM的甲硫氨酸、高达0.1％的pluronic F68(w/v)，以及任选地7.5μmol/l CaCl₂。具体地，该组合物中可以含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、100mmol/l NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，以及10mmol/l磷酸盐，pH为7.0。

本发明也涉及含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、10-50mmol/l精氨酸、pH6.0至pH6.5、10-100mmol/l硫酸钠的上述组合物。另外，该组合物可以含有高达20mM的甲硫氨酸、高达0.1％的pluronicF68(w/v)，任选地高达1mmol/l的CaCl₂，及任选地1-5％(w/v)的多元醇。具体地，该组合物中可以含有每ml 10至10000μg促红细胞生成素蛋白、40mmol/l精氨酸、pH为6.2、30mmol/l硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，以及任选地1mmol/l的CaCl₂。

本发明的优选实施方案涉及到如下组合物，其含有10-10000μg/ml促红细胞生成素，优选25-2500μg/ml促红细胞生成素，以及

a)10mM磷酸钠/钾、100mM NaCl，pH为7.0或

b)10mM磷酸钠、120mM硫酸钠，pH为6.2或

c)10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)，pH为6.2或

d)10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH为6.2或

e)40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)，pH为6.2或

f)40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH为6.2。

在最优选的实施方案中，组合物中含有促红细胞生成素蛋白量为50、100、400、800或2500μg/ml。最优选的组合物含有10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH为6.2，或40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％pluronic F68(w/v)，pH为6.2。此类组合物的其它细节可从WO01/87329中得知。

本发明还涉及治疗心脏病中铁分布紊乱的方法，包括施用有效量的如上描述的促红细胞生成素蛋白。本发明还涉及治疗心脏病中铁分布紊乱的药物，其特征在于该药物含有有效量的促红细胞生成素蛋白。心脏病的实例，如冠心病、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合症、心力衰竭、充血性心力衰竭和/或心功能不全。联系上文提及的方法和药物，优选的心脏病形式为心功能不全。如上描述的优选方法和药物中，促红细胞生成素蛋白为如上所定义的。

在心脏病中铁分布紊乱的治疗中，可以按如每周两次150单位/kg体重的剂量施用EPO。剂量可以根据病人的个体需要进行调整，也可以处于一定的范围(如100-200单位/kg)。依据所用EPO衍生物的半衰期，施用量可以如介于每周1或3次。根据病人的个体需要，医师也可以选择不同的剂量。

本发明中EPO或EPO缀合物的比活性，可以通过多种本领域已知的多种试验测定。本发明中经纯化EPO蛋白的生物活性为：与未注射或对照组的被试者相比，通过注射向病人施用EPO蛋白能够使骨髓细胞增加产生网织红细胞以及红细胞。可以根据Annable等人在Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47：99-112，以及Pharm.Europa Spec.Issue ErythropoietinBRP Bio 1997(2)中介绍的方法测试在本发明中获取及纯化的EPO蛋白或其片段的生物学活性。本领域中(如Pharm.Europa Spec.IssueErythropoietin BRP Bio 1997(2)，以及the monography of erythropoietinof Ph.Eur.BRP)描述了另一个用于测定EPO蛋白活性的生物试验—正常红细胞(normocythaemic)小鼠实验。

通过下面的实施例可以更好地理解本发明，这些实施例说明了此处描述的发明，但并不对其进行限制。

                      实施例

如P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf和R.Roeddiger在2001年7月29日至8月2日Chicago，Illinois召开的AACC/CSCC年会报告中描述的，在心脏插管后，通过测定CRP(C反应蛋白)、铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体参数，检查患有心脏病的中年男性的铁分布紊乱情况。结果显示存在铁分布紊乱。以每周两次皮下使用150单位/kg的Rceormon^TM(可商业获得的促红细胞生成素蛋白)治疗病人，最长治疗时间为12周。随后对上述参数的测定显示铁缺乏的紊乱有所改善。

                                  序列表

<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司

<120>促红细胞生成素在心脏病中的新用途

<170>PatentIn版本2.0

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

  1               5                  10                  15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

             20                  25                  30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

         35                  40                  45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

     50                  55                  60

Gln Glv Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

                 85                  90                  95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

            100                 105                 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

        115                 120                 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

    130                 135                 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145                 150                 155                 160

Cys Arg Thr Gly Asp

                165

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

  1               5                  10                  15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His

             20                  25                  30

Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

         35                  40                  45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

     50                  55                  60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

 65                  70                  75                  80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp

                 85                  90                  95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

            100                 105                 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

        115                 120                 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

    130                 135                 140

ryr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145                 150                 155                 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

                165