一种新的以异种免疫细胞为细胞载体的细胞疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供了一种新的以异种免疫细胞为细胞载体的细胞疫苗及其制备方法，其中，所述细胞疫苗是用非宿主种属来源的异种免疫细胞作为细胞载体递呈患病哺乳动物体内病变靶细胞和/或病原体抗原的细胞疫苗。本发明以及该细胞疫苗制备的方法。该细胞疫苗能够激活宿主免疫系统并继而引起有效的免疫反应。利用本发明获得的细胞疫苗，可以用于预防和治疗某些发生或/和进展是由于逃避了激活包括T细胞在内的免疫细胞引发的免疫反应而引起的疾病。例如，这些疾病中包括所有的恶性肿瘤，以及由各种病原体引起的感染性疾病。

说明书

技术领域

本发明通常涉及到细胞免疫学、癌症和病毒治疗领域，提供了一种新的，其特征是用非宿主种属异种免疫细胞作为细胞载体的细胞疫苗，以及该细胞疫苗制备的方法。该细胞疫苗能够激活宿主免疫系统并继而引起有效的免疫反应。利用本发明获得的细胞疫苗，可以用于预防和治疗某些疾病，这些疾病的发生或/和进展是由于逃避了激活包括T细胞在内的免疫细胞引发的免疫反应而引起的。例如，这些疾病中包括所有的恶性肿瘤，以及由各种病原体引起的感染性疾病。

背景技术

1肿瘤细胞疫苗

肿瘤细胞能表达独特的抗原。这些抗原在正常机体内不存在(如某些病毒抗原、突变基因表达产物等)，或在胚胎时期表达但在成熟机体却不表达。对于机体的免疫系统来说，肿瘤的这些独特抗原属于“外来物”，它们能为免疫系统所识别，并激活免疫系统。早在上世纪初，人们就开始用经照射或病毒感染的肿瘤细胞或其溶解产物作为免疫原探讨其对荷瘤机体的治疗效果，但肿瘤细胞免疫原性弱，缓解率极低。后来，用来自患者自身肿瘤的完整肿瘤细胞注射，或用同种异体的完整肿瘤细胞或体外培养的细胞溶解产物注射，加以BCG或明矾等传统佐剂，或用半抗原修饰肿瘤细胞，虽都能诱导产生特异性的CTLs，但总效果仍不甚理想，只有个别患者的肿瘤消退或稳定期延长。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展，基因工程技术被引入肿瘤细胞疫苗的研究。人们用逆转录病毒、腺病毒等载体将外源基因导入肿瘤细胞内，以提高其免疫原性。目前，此种疫苗的研究已进入临床I期。转染的外源基因主要有MHC基因、B7分子基因、细胞因子基因、粘附分子基因等。细胞因子的运用很多，如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IFN-γ、GM-CSF等。虽然用肿瘤细胞进行免疫，不需鉴定其肿瘤特异性抗原，但其免疫原性弱、特异性差的缺点至今仍无法克服。

2基因疫苗

基因疫苗，也有人称之为基因免疫。此概念仅仅在几年前由Johnston第一次提出，但其发展异常迅速，已进入临床I期试验。它由基因治疗发展而来，即作者通常所说的裸DNA或多核苷酸疫苗。在一定条件控制下，用之接种后能表达外源抗原，激活免疫系统。在基因疫苗研究的起步阶段，一般是将编码目标蛋白的DNA直接进行肌注。肌注后的DNA能进入肌细胞，进而进行表达。这种免疫虽能诱导一定的抗肿瘤活性，但由于其诱导的免疫应答弱，效果不甚理想。DC作为当今肿瘤免疫治疗领域备受关注的焦点之一，它也被引入了基因疫苗研究领域。Buterfield等将编码MART1的cDNA在体外导入经GM-CSF和IL-4分化的鼠DC细胞，进行抗肿瘤效果研究。结果显示，与裸cDNA直接肌注及用MART1转染的腺病毒的免疫相比，有着更强的免疫效果。目前，基因疫苗普遍存在DNA的表达低，所诱导的免疫应答不足的缺点。

3基因工程疫苗

基因工程疫苗是利用重组DNA技术建立的疫苗。此种疫苗的研究主要沿着2个方向进行。一是用目标基因(如编码肿瘤特异性抗原的基因)取代作为载体的病毒的某些基因，使病毒带上目标基因，制成重组病毒。目前，用作载体的病毒主要有牛痘病毒和腺病毒。目标基因有痘基因、胚胎抗原基因、突变基因等，而研究最多的是CEA。CEA表达于约50％的乳腺癌细胞、70％的非小细胞肺癌和大部分结肠、胃、胰腺的肿瘤，可见其分布比较广泛。因此，用针对CEA的疫苗免疫机体后能产生针对许多相应个体的抗肿瘤作用，可克服1种疫苗仅对1种肿瘤起作用的局限性。但由于CEA的免疫原性弱，单用CEA的效果很不理想。牛痘病毒本身具有免疫原性，能作为佐剂提高抗原的免疫效果，应用CEA的cDNA与牛痘病毒制成重组病毒对26例成人乳腺癌患者的临床I期研究表明，此种疫苗不仅激发能与表达CEA的自身细胞反应的CTLs，而且使其中4例的病情稳定，其2例病情稳定达6个月以上。细胞因子为一种免疫调节因子。细胞因子IL 2与重组CEA痘病毒联合免疫，能明显增强特异性T细胞反应，并能使60％～70％的结肠癌(CEA+)小鼠肿瘤完全消退，延长无瘤生存期。以乌痘病毒为载体，制成的重组病毒(ALVAC CEA)，能明显增强其诱导免疫应答的能力；如先以rV CEA免疫，再以ALVAC CEA增强免疫，则效果更加明显。MUC I也颇受人们的重视，含MUC I基因的重组牛痘病毒能诱导抗MUC I的免疫应答；将MUC I和B7的基因一起导入牛痘病毒，则其诱导的免疫应答更强，能抑制小鼠肿瘤生长。基因工程疫苗的另一方向是以细胞因子作为佐剂，用其基因转染肿瘤细胞，以克服肿瘤细胞疫苗呈递抗原不足的缺点，使肿瘤细胞以类似于抗原呈递细胞(APC)的方式把抗原直接呈递给T细胞，从而增强免疫效果。近年来，研究较多的细胞因子有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IFN-γ、GM-CSF等。

T细胞不能直接识别抗原分子，抗原分子需要经过抗原递呈细胞处理加工并以与MHC分子形成复合物的形式递呈给T细胞后，才能为T细胞所识别。以上所述的方法的一个共同特征是通过患者自身细胞上的MHC类分子递呈靶抗原的，但由于MHC分子的多态性导致的某些人群免疫系统对某些抗原不敏感而导致对这些抗原免疫反应低下，而另一些人群免疫系统却对另一些抗原不敏感。这种情况下，使用宿主本身免疫系统处理并通过MHC分子递呈病变靶细胞和/或病原体的抗原，尽管增加病变靶细胞的免疫细胞激活信号，仍不能另人满意地激活机体针对病变靶细胞的免疫反应。因此，本发明利用异种免疫细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对病变靶细胞和/或病原体抗原成分进行处理并递呈到细胞膜表面，避免由于MHC分子的多态性导致的免疫盲区，使其能够被包括T细胞在内的免疫细胞直接识别。从而引发对无免疫原性和弱免疫原性的病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。

魏于全教授使用异种细胞疫苗免疫动物获得了良好的肿瘤抑制疗效，他使用的异种细胞疫苗的原理是：利用异种细胞与宿主相应肿瘤细胞的抗原有交叉反应，通过异种细胞免疫宿主后可以产生针对相应肿瘤的免疫保护反应。他使用的异种细胞疫苗的特征是：异种细胞作为靶抗原。而本发明所述的细胞疫苗的原理是：利用异种免疫细胞作为抗原递呈的载体，通过异种免疫细胞内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对病变靶细胞和/或病原体抗原成分进行处理并递呈到细胞膜表面，避免由于MHC分子的多态性导致的免疫盲区，使其能够被包括T细胞在内的免疫细胞直接识别。从而引发对无免疫原性和弱免疫原性的病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。而本发明所述的细胞疫苗的特征是：异种免疫细胞作为抗原处理递呈的载体，而病变靶细胞和/或病原体抗原作为靶抗原。

发明内容

本发明的特征是提供了能够激活宿主免疫系统并继而对病变靶细胞和/或病原体引起有效的免疫反应的细胞疫苗，制备这些细胞疫苗的方法。

本发明提供了一种新型细胞疫苗，其特征是用非宿主种属来源的异种免疫细胞作为细胞载体递呈患病哺乳动物体内病变靶细胞和/或病原体抗原的细胞疫苗，这种细胞疫苗能够直接刺激宿主免疫系统产生针对病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。

如上所述的异种免疫细胞具有抗原递呈能力，包括并不限于巨噬细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、内皮细胞等通常意义上的抗原递呈细胞，这些细胞通过导入所述患病哺乳动物体内病变细胞和/或病原体抗原的核苷酸序列或与这些靶抗原体外共培养等本领域已知的负载抗原的技术达到递呈患病哺乳动物体内病变靶细胞和/或病原体抗原的目的；用于本发明的主要差别在于它们的负载细胞是来源于异种的。

如上所述的异种细胞疫苗能够直接被宿主T淋巴细胞识别并激活宿主T淋巴细胞。这里的直接识别是指宿主T淋巴细胞上的TCR能够与异种细胞疫苗上的MHC-抗原肽复合物相互作用。由于T细胞抗原识别的MHC限制性，宿主T细胞并非能识别所有异种MHC-抗原肽复合物分子，因此，只有与宿主MHC分子空间结构十分相近的异种MHC分子与抗原肽形成的复合物分子才能被宿主T细胞识别。能够为宿主T细胞直接识别的异种细胞疫苗可以通过直接激活途径激活宿主T细胞。本文中的“激活”意为被诱导增殖。可通过混合淋巴细胞培养实验来检测本发明的细胞疫苗是否能够直接激活宿主T淋巴细胞，细胞疫苗与宿主T淋巴细胞体外混合培养后，宿主T淋巴细胞增殖可通过细胞记数或通过在过去的～18个小时培养中标准的[³H]-胸苷摄入分析而测定。用丝裂原如PHA刺激细胞显示出最大的增殖，并且用无诱导剂的培养细胞测到基线的增殖。实质上增殖的细胞将显示出高于基线水平的增殖。

如上所述的异种细胞疫苗能够够刺激宿主免疫系统产生针对病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。对肿瘤和病毒感染细胞最有效的免疫反应是细胞免疫，可通过体外被本发明细胞疫苗激活后的宿主T淋巴细胞对病变靶细胞杀伤活性来检测本发明细胞疫苗是否能够刺激宿主免疫系统产生针对病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。简述之，收集异种免疫细胞疫苗激活后的宿主T淋巴细胞作为效应细胞，用1640培养液洗涤2遍，计数，调整细胞浓度为1～10×10⁶/ml。病变靶细胞或病原体感染细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为2×10⁵/ml。效应细胞做3个复孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，并按照效靶比40∶1加入靶细胞，同时设靶细胞最大释放，自然释放，培养液空白对照和体积纠正对照，200ul/孔，每组3个复孔，离心250g 4分钟，37℃、5％CO₂孵箱培养6小时，在培养结束前45分钟，取出96孔板，在靶细胞最大释放组和体积纠正对照组每孔加入NP40溶解液20ul，离心250g 4分钟，继续培养45分钟后取出，每孔吸出50ul上清转移入另一96孔板，每孔加底物重溶液50ul，避光室温孵育30分钟，加入50ul终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测波长4901nm处的吸光度，按下列公式计算：CTL活性(％)＝(实验组-效应细胞自然释放组-靶细胞自然释放组+培养液空白对照组)/(靶细胞最大释放组-体积纠正对照组-靶细胞自然释放组+培养液空白对照组)×100％。

如上所述的异种免疫细胞能够提供直接激活宿主T淋巴细胞所需的高表达的激活信号分子，包括选自MHC-I类分子、MHC-II类分子、B7-1分子、和B7-2分子所组成的一组；可以通过用相应种属的IFN-γ或TNF-α处理，或经他们两者共同处理异种免疫细胞的方法达到；可以通过免疫荧光染色后流式细胞技术检测在异种免疫细胞上这些分子的表达。简言之，将异种免疫细胞悬液密度调整为5～20×10⁶/ml(培养液中或PBS中)；取0.1ml细胞悬液，按抗体效价加入荧光标记的单抗，避光、冰浴30min；加入固定液(4％多聚甲醛)2ml，避光10min，200×g离心5min，弃上清；加入0.5ml含1‰NaN3，1％NBS的PBS混匀，上机检测

本发明细胞疫苗制备方法包括的步骤是：(1)获得病变靶细胞和/或病原体异种免疫细胞的抗原成分或相应的编码抗原成分的核苷酸序列；(2)获得异种免疫细胞；(3)通过不同方法使异种免疫细胞处理并递呈上述抗原成分；(4)处理上述递呈病变靶细胞和/或病原体抗原成分的异种免疫细胞以在细胞内增强激活免疫系统的一级信号和共刺激信号；(5)灭活上述细胞并保留其抗原性。

病变靶细胞和/或病原体抗原来源的选择性方案包括但不限于病变靶细胞和/或病原体整体、浓缩纯化后的细胞和/或病原体成分、基因工程或化学方法合成的相应抗原分子、编码相应抗原分子的核苷酸序列。

病变靶细胞整体，一般指肿瘤细胞，可通过患者外周血进行取样获得，例如白血病和淋巴瘤等循环系统肿瘤。另外，也可通过手术方法取样肿瘤和从转移位点收集肿瘤细胞。如果肿瘤细胞较少，尤其是体积较小的原发癌时，可通过体外培养来扩增肿瘤细胞以确保充足供应。但尽可能使用未扩增的原发肿瘤细胞，因为关键的肿瘤抗原经过增殖过程后将会丢失。

或者用作肿瘤抗原来源的癌细胞可以用试剂如戊二醛、多聚甲醛或福尔马林加以固定。也可将他们溶解于离子或非离子去污剂如脱氧胆酸盐或辛基葡糖苷中或者用例如痘苗病毒裂解。如有必要的话，可澄清此溶解的细胞悬液并且进行任何一种生化分离方法从而富集或分离特定的肿瘤相关抗原。

病原体整体，一般指病毒颗粒，可通过患者外周血进行取样获得，例如HBV和HIV。

如果病变靶细胞和/或病原体抗原分子的蛋白质或核苷酸序列是已知的，可以通过本领域已知的多肽化学合成或基因工程的方法合成病变靶细胞和/或病原体抗原分子。

病变靶细胞和/或病原体的抗原来源包括但不限于病人个体来源病变靶细胞和/或病原体、目前已知晓的病变靶细胞和/或病原体的共同抗原。例如肿瘤相关抗原，病毒的保守区等。

异种免疫细胞可从相应动物体内分离原代培养获得，例如分离B细胞，可通过收集动物全血然后分离血液细胞群获得。用抗凝剂如柠檬酸盐或EDTA收集血液，通过任何合适方法制备的B淋巴细胞一般通过清洗而去除血小板，并且再悬于适当的培养基如补充以2％失活胎牛血清的AIM V中。适当的方法包括离心适当的培养基如FICOLL或HISTOPAQUE，亲和分离方法如用抗有关细胞表面标记的抗体在荧光细胞分离器中筛选或分类。

异种免疫细胞可使用目前已有的细胞系，也可以从动物组织中分离，进行体外原代培养。

使异种免疫细胞处理并递呈病变靶细胞和/或病原体的抗原成分的方法包括但不限于

(1)异种免疫细胞与抗原成分体外共培养。这里抗原成分一般指来源于病变靶细胞和/或病原体的蛋白质，包括病变细胞裂解成分和基因工程/化学方法合成的相应抗原。通过考马氏亮兰法定量蛋白抗原，然后以0.01mg～10mg抗原/10⁶异种免疫细胞的剂量混合，37℃，5％CO₂无血清标准培养基中培养3～7天。用无血清标准培养基洗涤2遍，除去游离的抗原。

(2)异种免疫细胞与病变靶细胞或病原体感染细胞体外融合，形成异种免疫细胞与病变靶细胞或病原体感染细胞的杂交细胞。简言之，将病变靶细胞或病原体感染细胞与异种免疫细胞以1∶1～10的比例混合(5×10⁷∶5～10×10⁷)，用10ml 37℃预温的RPMI-1640培养液洗涤一次，吸干培养液后在1min内缓慢加入50％PEG-140030滴，边加边在37℃水溶中连续轻轻振摇，随后以每分钟1ml的速度加入8ml预温的RPMI-1640培养液，离心100×g，5min，弃上清；将细胞重悬于15ml含15％人AB血清的RPMI-1640培养液中，加入10cm培养皿中，37℃5％CO₂培养4h，用培养液洗去未融合的异种免疫细胞，贴壁细胞(融合细胞及病变细胞)用含0.5％胰酶的培养液消化收集后再用培养液洗涤3次。

(3)向异种免疫细胞内导入相应靶抗原核酸分子。导入所述患病哺乳动物体内病变细胞和/或病原体抗原的核苷酸序列到异种免疫细胞内可通过本领域已知的任何一种方法完成，一般地，将所需靶抗原的编码序列可操作地连接到在靶细胞中具有组成性或诱导活性的启动子以及对于该蛋白转录和翻译所必须的其他控制元件和多聚-A序列上。将由此组成的表达盒用本领域已知的任何一种技术，如磷酸钙沉淀、用阳离子脂质体的插入或用对于该细胞为特异性的病毒载体导入细胞中。一种优选的方法是使用包括适当表达盒的LXSN逆转录病毒载体，如实施例中所说明的。另一种优选的方法是使用腺病毒。简言之，通过遗传加工商业上可得到的质粒如STRATAGENE公司所供应的质粒可制备的腺病毒重组表达载体。适当的感染条件和感染复数(MOI)可在预备实验中用报告基因如EGFP加以测定，并且然后用于抗原分子转移中。使用病毒载体的优势为该载体可以首先复制，并且然后感染和改变整个细胞群。因此，可将遗传上改变表达抗原的细胞建成细胞系。

处理递呈病变靶细胞和/或病原体抗原成分的异种免疫细胞以在细胞内增强激活免疫系统的一级信号和共刺激信号的方法包括但不限于用一种或多种细胞因子在体外处理，以提高对免疫细胞激活信号分子的表达。具体为用相应种属的IFN-γ或TNF-α处理，或经他们两者共同处理。

灭活处理递呈病变靶细胞和/或病原体抗原成分的异种免疫细胞并保留其抗原性的方法包括但不限于：(1)通过4000～6000radγ射线灭活；(2)细胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定。

本发明的原理是，利用异种免疫细胞能比同种免疫细胞更强烈有效激活宿主免疫系统，通过异种免疫细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对病变靶细胞和/或病原体抗原成分进行处理并递呈到细胞膜表面，使其能够被包括T细胞在内的宿主免疫细胞直接识别。从而引发对无免疫原性和弱免疫原性的病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。

在肿瘤或一些病毒感染疾病中，宿主免疫系统由于不能识别病变靶细胞和/或病原体或对其反应低下而导致疾病发生发展。由于MHC分子的多态性导致的某些人群免疫系统对某些抗原不敏感而导致对这些抗原免疫反应低下，而另一些人群免疫系统却对另一些抗原不敏感。这种情况下，使用宿主本身免疫系统处理并通过MHC分子递呈病变靶细胞和/或病原体的抗原，尽管增加病变靶细胞的免疫细胞激活信号，仍不能另人满意地激活机体针对病变靶细胞的免疫反应。因此，本发明利用异种免疫细胞的内源性(MHCI)及外源性(MHCII)抗原递呈途径对病变靶细胞和/或病原体抗原成分进行处理并递呈到细胞膜表面，避免由于MHC分子的多态性导致的免疫盲区，使其能够被包括T细胞在内的免疫细胞直接识别。从而引发对无免疫原性和弱免疫原性的病变靶细胞和/或病原体的免疫反应。

附图说明

图1为流式细胞技术检测人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗中MAGE-3分子表达示意图；

图2流式细胞技术检测人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗上MHC-I、II类分子、B7-1、2分子表达示意图；

图3MAGE-3大鼠异种细胞疫苗直接激活宿主T淋巴细胞比较柱状图；

图4免疫后小鼠T淋巴细胞对Mel 526细胞杀伤活性检测比较柱状图；

图5MAGE-3异种细胞疫苗异种免疫抗肿瘤作用的对照曲线图；

图6流式细胞仪检测免疫后小鼠血清中抗恶性黑色素瘤细胞株(Mel 526)抗体检测结果示意图。

具体实施例

下面列出的实施例是为了进一步引导本领域普通的技术人员而不是意为以任何方式限定本发明。

实例1：通过基因转导的方法制备人MAGE-3(Homo sapiens melanomaantigen family A，3)异种(大鼠)细胞疫苗

1.MAGE-3基因序列的获得

由大连宝生物公司全基因合成人MAGE-3的全长cDNA序列，并将其连接到pUC18质粒中。人MAGE-3在GENEBANK中的序列号为NM 005362

2.构建上述cDNA序列的真核表达载体。

本发明中的真核表达载体主要作用是能够使上述步骤1目标基因稳定地导入靶细胞中并稳定表达蛋白。本发明的细胞疫苗可以使用腺病毒表达载体、逆转录病毒载体、和一般的真核表达质粒来制备。

(1)、使用腺病毒表达载体

含有目标基因的pUC18质粒和腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV(Stratagene公司)经Kpn I及Xho I双酶切(Takara公司)，0.8％琼脂糖电泳胶回收获得约7.5kb的载体DNA和相应长度的目标基因。目的基因与载体DNA在16℃下经DNA快速连接酶(Takara公司)连接17h，连接产物转化新鲜感受态大肠杆菌DH5α，接种卡那霉素LB平板培养16h，挑取阳性克隆扩增培养，用小量质粒提取试剂盒(Omega公司)按说明书提取并纯化重组穿梭质粒。

分别对重组穿梭质粒酶切鉴定正确后，将正确重组的穿梭质粒用Pme I酶切(New England公司)线性化，转化含腺病毒骨架质粒的感受态pAdEasy-1-BJ5183细菌(Stratagene公司)。卡那霉素选择培养基和PCR筛选阳性克隆，扩增培养，提纯质粒。用Pac I(New England公司)酶切重组质粒，0.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切后产生约30kb和4.5kb左右的两条带。鉴定成功的重组子转化超感受态XL10-Gold菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到重组腺病毒基因组质粒。

重组腺病毒基因组质粒转染293细胞：重组腺病毒基因组质粒用Pac I酶切线性化，回收约30kb的大片段8μg，以无抗生素无血清的L-DMEM(Gibco公司)稀释为250μL；取LipofectamineTM2000脂质体(Invitrogen公司)10μL，无抗生素无血清的L-DMEM稀释为250μL，室温下放置5min后同前回收稀释的DNA混合，室温下放置20min，加入6孔培养板中的293包装细胞，轻轻混匀，37℃，5％CO₂培养箱中孵育，13天后便可观察到细胞病变效应(cytopathiceffect CPE)。收集完全病变培养孔中的细胞及培养液，-20℃和37℃反复冻融3次，上清加入293细胞中继续感染。收集病变的293细胞及培养液，按上述方法反复冻融3次，离心，上清加入1mg蛋白酶K、2mL1％SDS、10mmol/L EDTA和20mmol/LTris-HCl消化2h。离心取上清，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，获得病毒的DNA，以此为模板进行PCR鉴定。

鉴定正确后获得含有上述cDNA序列腺病毒表达载体

(2)使用逆转录病毒表达载体

分别提取酶切含有目标基因的pUC18质粒和pLXSN表达载体质粒(Clontech公司)DNA，经XhoI、StuI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分别回收5.7Kb pLXSN载体片段和相应长度的目标基因片段，以载体∶插入片段为1∶3的摩尔比按DNA快速连接试剂盒(Takara公司)说明连接，转化冷冻保存的JM109感受态菌，挑选阳性转化克隆，扩增，提取质粒，酶切鉴定重组子。

PA317细胞培养于含10％NCS的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂培养，胰酶/EDTA消化传代。取生长状态良好、增殖活跃的PA317细胞胰酶/EDTA常规消化，计数，以1×10⁵细胞/孔接种6孔塑料培养板，37℃，5％CO₂培养24h后(约70％汇合)，无血清DMEM洗3次去除残余血清，然后加入无血清DMEM，37℃，5％CO2 20min；另取DNA/脂质体比例为1ug/1μl的DOSPER(Roche公司)和重组DNA加入HBS中，以100μl/孔的量制备DNA-DOSPER混合液，室温放置15min，缓慢滴加至细胞中，培养6h，DMEM彻底洗去DOSPER，继续培养24h后，常规消化传代，以不同稀释比例接种于9cm培养皿或培养瓶中，加入G418(Roche公司)(500ug/ml)，隔天换液，洗去死细胞，12-14天后待抗性克隆长出，在显微镜下标记出生长良好的G418抗性克隆，以克隆环蘸取少许凡士林分隔细胞克隆，向克隆环中加入消化液消化细胞，转入24孔板内培养，然后转入培养瓶中扩增。

分别收获转基因PA317细胞和对照细胞，按10⁷/ml加入异硫氰酸胍变性液，匀浆，转移至15ml离心管中，加入1∶10体积10mol/L乙酸钠溶液，充分混匀，再加1.2倍体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，颠倒充分混合，振荡10sec，于冰上静置15min，离心12000rpm/10min(4℃)取上清入另一离心管，加入等体积的异丙醇，混匀，于-20℃放置1hr以上，离心12000rpm/20min(4℃)沉淀RNA，加入原体积的1/10变性液，旋转摇动充分溶解，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置1hr以上，离心12000rpm/20min(4℃)所得RNA沉淀用75％冷乙醇洗涤两次(注意勿打散沉淀物)，同上离心，真空抽干，溶于适量无RNase的去离子水中，紫外分光光度计测RNA含量和纯度。

RNA浓度(ug/μl)＝OD260×核酸稀释倍数×40/1000

RNA纯度：OD260/OD280不小于1.8-2.0，低于此值则重新抽提，-20℃短期保存。反转录合成DNA：反应条件；25℃×10min→42℃×60min→99℃×5min→4℃×5min

以反转录产物为模板进行PCR鉴定。

鉴定正确后获得含有上述cDNA序列的逆转录病毒表达载体

(3)一般的真核表达质粒

分别提取酶切含有目标基因的pUC18质粒和真核表达载体质粒pDNA3.1(Novagen公司)，经EcoRI、BamHI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分别回收pDNA3.1载体片段和相应长度的目标基因片段后，以载体∶插入片段为1∶3的摩尔比按DNA快速连接试剂盒说明连接，转化冷冻保存的JM109感受态菌，挑选阳性转化克隆，扩增，提取质粒，EcoRI、BamHI双酶切鉴定重组子。

鉴定正确后获得含有上述cDNA序列的真核表达载体

3.将构建好的重组真核表达载体导入大鼠来源的LCL 8664(ATCC)细胞系中，使大鼠LCL 8664细胞表达并递呈相应抗原。(其他异种哺乳动物的免疫细胞系也可用于制备本发明的细胞疫苗)

(1)、一般的真核表达质粒

提取含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1并经酶切鉴定、DNA浓度和纯度鉴定后备用。将B细胞于10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基培养。在DOTAP转染前1天传代于6孔板中，接种密度为1.5×10⁵/ml。

①脂质体转染方法

取6μg含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1入无菌EP管①中，HBS液稀释至60μl(DNA浓度为0.1μg/μl)；取36μl DOTAP液入另一EP管②中，HBS液稀释至120μl；将①和②轻柔混合后室温孵育15min；然后与6ml培养基混合备用。1,500rpm离心10min去除所有培养基，每孔中加入1ml转染液进行转染，6h后更换培养基继续培养。

②NucleofectorTM转染方法

离心收集B细胞，细胞数为10⁶，选择针对B细胞的转染液100μl重悬细胞，加入2μg含有目标基因的真核表达载体质粒pDNA3.1混合后移入Amaxa特制小杯；然后将小杯放入NucleofectorTM转染仪中，选择B细胞转染程序电转3s，取出小杯用500μl培养基冲洗后移入6孔板的一孔中培养。

通过RT-PCR鉴定目的基因在B细胞中的表达。

(2)、腺病毒表达载体

步骤2所述重组腺病毒经293细胞大量扩增和氯化铯梯度离心浓缩纯化后，病毒滴度可达到10¹⁰-10¹¹pfu，通过空斑形成实验检测确切的病毒滴度后，以MOI 50的浓度感染B细胞，感染率大于80％。继续培养3天后，可通过RT-PCR鉴定目的基因在B细胞中的表达。

(3)、逆转录病毒表达载体

步骤2所述重组腺病毒经PA317细胞大量扩增，将多聚赖氨酸加入过滤后的病毒上清后离心2h以浓缩病毒，病毒滴度可达到10⁶-10⁷pfu，通过空斑形成实验检测确切的病毒滴度后，将B细胞接种于培养瓶，加入浓缩病毒100μl、polybrene(聚凝胺)1.6μl，培养3h后续加培养液，继续培养24h后加入G418培养液选择培养，3天后纯化B细胞，

可通过RT-PCR鉴定目的基因在B细胞中的表达。

4.细胞因子体外诱导表达相应抗原B细胞上的免疫细胞激活信号分子的表达

将2×10⁶/ml的B细胞悬液，加入6孔板中，每孔3ml，细胞培养液为含10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，同时加入大鼠IFN-γ100U/ml和TNF-α50U/ml各0.1ml。37℃孵育48小时。

5.灭活表达相应抗原B细胞，并保持其抗原性。

(1)、物理方法

大量收集步骤3获得的表达相应抗原B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀通过6000radγ射线灭活固定表达相应抗原B细胞。用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为2×10⁶/ml。既制备出人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗。

(2)、化学方法

大量收集步骤3获得的表达相应抗原B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，于4℃冰箱内作用24小时，用PBS洗涤后，加入PBS液制成细胞悬液，于4℃冰箱内放置24小时，再用PBS液洗涤，以除去固定液，用血细胞记数板记数细胞后，用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为5×10⁶/ml。既制备出人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗。

实例1.2：流式细胞技术检测人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗中MAGE-3分子表达

将人MAGE-3大鼠B细胞疫苗细胞和大鼠B细胞悬液密度调整为1×10⁷/ml(培养液中或PBS中)；取0.1ml细胞悬液，大鼠B细胞作为空白对照，按工作浓度1∶50加入小鼠抗人MAGE-3的单抗(BD)，避光、冰浴30min；加入2ml 1‰NaN3，1％NBS的PBS，200×g离心5min，弃上清；将细胞重新悬于100ul 1‰NaN3，1％NBS的PBS，按工作浓度1∶50加入羊抗小鼠Goat F(ab’)2Fragment mouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，荧光标记的单抗，避光、冰浴30min；加入固定液(4％多聚甲醛)2ml，避光10min，200×g离心5min，弃上清；加入0.5ml含1‰NaN3，1％NBS的PBS混匀，上流式细胞仪(Coulter EliteESP)检测。流式细胞检测结果见图1。人MAGE-3大鼠B细胞疫苗细胞染色阳性，说明人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗中有MAGE-3分子表达。

实例1.3：流式细胞技术检测人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗上MHC-I、II类分子、B7-1、2分子表达

将人MAGE-3大鼠B细胞疫苗细胞和大鼠B细胞悬液密度调整为1×10⁷/ml(培养液中或PBS中)；取0.1ml细胞悬液，大鼠B细胞作为空白对照，按工作浓度1∶50加入带FITC荧光标记的抗大鼠MHC-I类、MHC-II类、B7-1、B7-2的单抗(BD)，避光、冰浴30min；加入2ml 1‰NaN3，1％NBS的PBS，200×g离心5min，弃上清；加入0.5ml含1‰NaN3，1％NBS的PBS混匀，上流式细胞仪(Coulter Elite ESP)检测。流式细胞检测结果见图2。人MAGE-3大鼠B细胞疫苗细胞染色强阳性，说明人MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗中MHC-I类、MHC-II类、B7-1、B7-2分子高表达。

实例1.4：混合淋巴细胞培养实验检测MAGE-3异种(大鼠)细胞疫苗直接激活宿主T淋巴细胞

无菌条件下制备BALB/c小鼠脾细胞悬液。取淋巴细胞分离液(Ficoll比重1.077)15ml加入灭菌离心管内。用毛细吸管吸取30ml稀释BALB/c小鼠脾脏细胞悬液，轻轻滴加在淋巴细胞分离液表面。用水平离心机2500rpm，20℃，离心20min。由上至下分出：血清、单个核细胞、淋巴细胞分离液、红细胞四条带。用毛细吸管轻轻插入呈白膜状的单个核细胞层，沿管壁周围吸出界面细胞，移入另一离心管内。用5倍以上的Hanks液悬浮细胞，1500rpm，离心10min，洗涤细胞一次。再加入Hanks液悬浮细胞，1000rpm，离心5min，洗涤细胞2次，即获得单个核细胞。把单个核细胞加入培养瓶，37℃，5％CO₂孵箱培养3小时，然后轻轻冲吸培养基(含非贴壁细胞)1000rpm，离心5min，以含10％小牛血清的RPMI1640培养基悬浮并调整细胞浓度为1×10⁷/ml。取1ml细胞悬液装入经预处理后尼龙毛柱，关闭阀门；37℃、5％CO₂孵育1小时。然后用20ml预温37℃的含20％小牛血清的RPMI1640培养基洗柱，流速1滴/秒(洗脱液中富含T淋巴细胞)。收集最初流出的5ml洗脱液即为富含T淋巴细胞的悬液。以a-醋酸萘酯酶染色法鉴定分离T淋巴细胞悬液纯度。常规台盼蓝染色法检测分离T淋巴细胞存活率。

用RPMI 1640完全培养基悬浮MAGE-3异种细胞疫苗、BALB/c小鼠T淋巴细胞，并调整两种细胞浓度为1×10⁷/ml。在96孔板上，MAGE-3异种细胞疫苗和BALB/c小鼠T淋巴细胞分别以1×10⁵/孔，5×10⁵/孔加入，每实验组3个复孔。另设阴性对照组，只加5×10⁵BALB/c小鼠T淋巴细胞；阳性对照组，加5×10⁵BALB/c小鼠T淋巴细胞和PHA。终体积为200μl，不足者以培养基补足。37℃，5％CO2、饱和湿度条件，培养96小时。培养结束前18小时加0.5uCi/孔3H-TdR。用细胞收集器将细胞收集于玻璃纤微滤纸上，蒸馏水反复冲洗，80℃烘干。液闪计数CPM值，结果用3孔平均值表示。

结果见图3

结果显示MAGE-3大鼠异种细胞疫苗能够直接激活宿主T淋巴细胞。

实例1.5：免疫后小鼠T淋巴细胞对Mel 526细胞杀伤活性检测

收集MAGE-3异种细胞疫苗免疫后的小鼠T淋巴细胞作为效应细胞，用1640培养液洗涤2遍，计数，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。Mel 526恶性黑色素瘤细胞和正常皮肤角朊细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml。效应细胞做3个复孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，并按照效靶比10∶1加入靶细胞，200ul/孔，每组3个复孔，离心250g 4分钟，37℃、5％CO₂孵箱培养6小时，设仅有淋巴细胞和仅有Mel 526细胞为对照孔。培养4小时后加10ul噻唑蓝(MTT，5mg/ml)，置37℃、5％CO₂孵箱中培养4小时。半小时后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100ul溶解紫兰色颗粒。半小时后用酶标仪(Bio-Rad：Model 3550-UV)测量595nm的光密度值(OD₅₉₅nm)，并计算细胞毒百分率。

结果见图4

结果显示免疫组小鼠脾细胞只对Mel 526细胞株有很强的杀伤活性。

实例1.6：MAGE-3异种细胞疫苗异种免疫抗肿瘤作用

将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠随机分为治疗组和对照组(每组10只)，治疗组小鼠每只腹腔内注射200ul，分别含有1×10⁶人MAGE-3大鼠B细胞疫苗和大鼠B细胞，同时对照组小鼠每只腹腔内注射0.9％生理盐水200ul，每周一次，共4次。最后一次细胞疫苗免疫后的第7天于治疗组和对照组小鼠背侧接种100ul，1×10⁷个恶性黑色素瘤细胞株(Mel 526)。每隔2天，用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，并观察小鼠体重变化及记录小鼠生存时间。将治疗组和对照组中小鼠的肿瘤体积对时间作曲线，其结果见图5。

可以看出，经MAGE-3大鼠B细胞疫苗免疫后的小鼠其肿瘤生长得到明显抑制。而仅仅大鼠B细胞疫苗免疫后的小鼠不具有抗肿瘤作用。

实例1.7：用流式细胞仪检测免疫后小鼠血清中抗恶性黑色素瘤细胞株(Mel526)抗体

免疫组和对照组小鼠于第三次免疫后的第5天经眼眶采血，收集小鼠血清，分别取1×10⁶个Mel 526细胞(MAGE3表达阳性恶性黑色素瘤细胞)、MCF-7细胞(经检测MAGE3表达阴性的乳腺癌细胞)、K562细胞(经检测MAGE3阴性的淋巴瘤细胞)移入流式样品管，用PBS液洗涤，每管加入稀释度为1∶500的小鼠治疗组和对照组血清100ul。以PBS液代替小鼠血清作为一抗空白对照。于4℃冰箱内避光作用1小时，用PBS液洗涤，每管又分别加入羊抗鼠Goat F(ab’)2 Fragment mouse IgG(H+L)-FITC(ImmunoTECH)，工作浓度1∶50，室温避光作用30分钟，用PBS液洗涤3次，细胞沉淀加PBS液1ml，上流式细胞仪(Coulter Elite ESP)检测，分析其抗Mel 526、MCF-7、K562抗体表达水平和平均荧光强度。

流式细胞仪检测抗体结果见图6

从Mel 526可以看出，用免疫组血清染色Mel 526细胞阳性，而MCF-7、K562细胞染色阴性，说明免疫组小鼠产生了抗Mel 526细胞抗体。未免疫组小鼠血清染色上述细胞均为阴性。

实例2：人肝癌异种细胞疫苗制备

1.肝癌癌细胞悬液的制备

在手术室取手术切除肝癌患者的新鲜肝癌组织15g，立即置于预冷并含有100μg/ml庆大霉素的无菌RPMI-1640培养液中。在超净工作台内将肝癌组织剪成2mm直径左右的小块，去除结缔组织及坏死组织，再以含0.1％IV型胶原酶、0.01％透明质酸酶、0.002％DNA酶的RPMI-1640培养液37℃消化1.5小时，用吸管轻轻吹打使组织分散为单细胞及细胞团悬液，过200目不锈钢筛网，过滤后的细胞悬液离心200g×5min，弃上清，再以RPMI-1640洗涤一遍，计数，将细胞数调整至约1×10⁶/ml悬于含15％血清的RPMI-1640培养液中，加入培养瓶内，置37℃、5％CO₂孵箱中培养。第二天将细胞从瓶中消化，洗涤，调整细胞密度为10⁷/ml，悬于RPMI-1640培养液中，供融合用。

2.猪脾细胞的分离

麻醉后，手术切取贵州小香猪脾脏组织约15g，立即置于含有40μg/ml庆大霉素的无菌RPMI-1640培养液中，在超净工作台中将脾组织剪成3mm左右直径的小块，用PBS洗涤去除血凝块和红细胞，轻轻加压通过200目不锈钢筛网，收集细胞悬液，用RPMI-1640培养液洗涤2次。加入18ml灭菌蒸馏水，轻轻振摇30秒(以破坏红细胞)，立即加入2ml 10×PBS(pH7.2)，加入30mlRPMI-1640洗涤，离心200×g，5min，弃上清∶将细胞重悬于100ml RPMI-1640培养液。

3.猪B淋巴细胞的分离纯化

加入抗猪CD3、CD4、CD8单克隆抗体至脾细胞悬液至终浓度各为0.1μg/ml，冰浴30min，用RPMI-1640培养液洗涤2次后加入100ml含补体的RPMI-1640培养液37℃水浴45min，离心200×g，5min，弃上清；用RPMI-1640洗涤2次后，准备活化。

4.肝癌细胞与猪B细胞的体外融合

将肝癌细胞与猪B细胞以1∶5的比例混合(5×10⁷∶2.5×10⁸)，用10ml 37℃预温的RPMI-1640培养液洗涤一次，吸干培养液后在1min内缓慢加入50％PEG-140030滴，边加边在37℃水溶中连续轻轻振摇，随后以每分钟1ml的速度加入8ml预温的RPMI-1640培养液，离心100×g，5min，弃上清；将细胞重悬于15ml含15％人AB血清的RPMI-1640培养液中，加入10cm培养皿中，37℃5％CO₂培养4h，用培养液洗去未融合的B淋巴细胞，贴壁细胞(融合细胞及肿瘤细胞)用含0.5％胰酶的培养液消化收集后再用培养液洗涤3次。

5.细胞因子体外诱导融合B细胞上的免疫细胞激活信号分子的表达

将2×10⁶/ml的融合B细胞悬液，加入6孔板中，每孔3ml，细胞培养液为含10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基，同时加入IFN-γ100U/ml和TNF-α50U/ml各0.1ml。37℃孵育48小时。

6.融合细胞照射

确定照射距离为5英尺，吸收剂量为50Gy，计算机系统根据照射当时的放射强度，自动计算并控制照射时间。用50Gy吸收剂的γ射线照射后，用软琼脂培养法观察照射后融合细胞集落形成试验，以证实该细胞确属无增殖能力细胞；照射前后检测MHC-II和B7表达，证实融合细胞的免疫原性无变化。

应用直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色，应用流式细胞仪分别检测B细胞激活前后表型和融合细胞表型，并根据融合细胞双阳性细胞，计算融合细胞百分数。

5.灭活表达相应抗原B细胞，并保持其抗原性。

(1)、物理方法

大量收集步骤3获得的表达相应抗原B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀通过6000radγ射线灭活固定表达相应抗原B细胞。用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为2×10⁶/ml。既制备出人肝癌异种细胞疫苗。

ii.化学方法

大量收集步骤3获得的表达相应抗原B细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，细胞沉淀加入1～3％多聚甲醛或1～10％甲醛固定，于4℃冰箱内作用24小时，用PBS洗涤后，加入PBS液制成细胞悬液，于4℃冰箱内放置24小时，再用PBS液洗涤，以除去固定液，用血细胞记数板记数细胞后，用0.9％的生理盐水制备细胞悬液，浓度为5×10⁶/ml。既制备出人肝癌异种细胞疫苗。

6.免疫效果的检测

通过用该疫苗体外刺激人淋巴细胞后，发现刺激后人淋巴细胞产生针对肝癌细胞的细胞毒性反应。

实例1.2：流式细胞技术检测人肝癌异种(猪)B细胞疫苗上MHC-I、II类分子、B7分子表达

将人肝癌异种(猪)B细胞疫苗和猪B细胞悬液密度调整为1×10⁷/ml(培养液中或PBS中)；取0.1ml细胞悬液，猪B细胞作为空白对照，按工作浓度1∶50加入带FITC荧光标记的抗猪MHC-I类(SLA)、MHC-II类(SLD)单抗(BD)和带FITC荧光标记的人CD28分子胞外区，避光、冰浴30min；加入2ml 1‰NaN3，1％NBS的PBS，200×g离心5min，弃上清；加入0.5ml含1‰NaN3，1％NBS的PBS混匀，上流式细胞仪(Coulter Elite ESP)检测。流式细胞检测结果显示人肝癌异种(猪)B细胞疫苗细胞荧光染色强阳性，说明人肝癌异种(猪)B细胞疫苗中MHC-I类、MHC-II类、B7分子高表达。

实例1.3：混合淋巴细胞培养实验检测肝癌异种(猪)B细胞疫苗直接激活人T淋巴细胞

抽取健康人外周血20ml，肝素抗凝，无菌下将血置于50ml的塑料离心管中，加入等体积的0.01MPBS稀释，另外于两个50ml的塑料管中加入20ml淋巴细胞分离液，轻轻将上述20ml稀释全血加入淋巴细胞分离液上，保持淋巴细胞分离液与血样品之间界面清晰，2500rpm离心30min，取出离心管，轻轻吸出界限清晰的白膜层于另一塑料管中，予以0.01MPBS，1500rpm离心7min洗涤淋巴细胞，反复洗涤4次，至洗涤液清亮为至，再加入Hanks液悬浮细胞，1000rpm，离心5min，洗涤细胞2次，即获得单个核细胞。把单个核细胞加入培养瓶，37℃，5％CO₂孵箱培养3小时，然后轻轻冲吸培养基(含非贴壁细胞)1000rpm，离心5min，以含10％小牛血清的RPMI1640培养基悬浮并调整细胞浓度为1×10⁷/ml。取1ml细胞悬液装入经预处理后尼龙毛柱，关闭阀门；37℃、5％CO₂孵育1小时。然后用20ml预温37℃的含20％小牛血清的RPMIl640培养基洗柱，流速1滴/秒(洗脱液中富含T淋巴细胞)。收集最初流出的5ml洗脱液即为富含T淋巴细胞的悬液。以a-醋酸萘酯酶染色法鉴定分离T淋巴细胞悬液纯度。常规台盼蓝染色法检测分离T淋巴细胞存活率。

用RPMI 1640完全培养基悬浮人肝癌异种(猪)B细胞疫苗、人外周血T淋巴细胞，并调整两种细胞浓度为1×10⁷/ml。在96孔板上，人肝癌异种(猪)B细胞疫苗和人外周血T淋巴细胞分别以1×10⁵/孔，5×10⁵/孔加入，每实验组3个复孔。另设阴性对照组，只加5×10⁵人外周血T淋巴细胞；阳性对照组，加人外周血T淋巴细胞和PHA。终体积为200μl，不足者以培养基补足。37℃，5％CO2、饱和湿度条件，培养96小时。培养结束前18小时加0.5uCi/孔3H-TdR。用细胞收集器将细胞收集于玻璃纤微滤纸上，蒸馏水反复冲洗，80℃烘干。液闪计数CPM值，结果用3孔平均值表示。

结果显示，肝癌异种(猪)B细胞疫苗组、阴性对照组和阳性对照组的CPM值分别为8653±683、1231±215和28631±1183，表明肝癌异种(猪)B细胞疫苗能够直接激活人T淋巴细胞。

实例1.4：免疫后人外周血T淋巴细胞对肝癌细胞杀伤活性检测

收集人肝癌异种(猪)B细胞疫苗免疫后的人外周血T淋巴细胞作为效应细胞，用1640培养液洗涤2遍，计数，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。病人体内获得肝癌细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml。效应细胞做3个复孔，每孔100ul，加入96孔U型板中，并按照效靶比10∶1加入靶细胞，200ul/孔，每组3个复孔，离心250g 4分钟，37℃、5％CO₂孵箱培养6小时，设仅有淋巴细胞和仅有肝癌细胞为对照孔。培养4小时后加10ul噻唑蓝(MTT，5mg/ml)，置37℃、5％CO₂孵箱中培养4小时。半小时后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100ul溶解紫兰色颗粒。半小时后用酶标仪(Bio-Rad：Model3550-UV)测量595nm的光密度值(OD₅₉₅nm)，并计算细胞毒百分率。

结果显示，治疗组、对照组T淋巴细胞对肝癌细胞的细胞毒百分率分别为70.68％和23.10％，表明免疫组人外周血T淋巴细胞对肝癌细胞有很强的杀伤活性。

实例1.5：肝癌异种(猪)B细胞疫苗异种免疫抗肿瘤作用

1.肝癌异种(猪)B细胞疫苗活化的T淋巴细胞抑制肝癌细胞移植瘤的生长实验

裸鼠10只，于右背部皮下接种肝癌细胞1×10⁶/只，接种2周后成瘤率100％，瘤径约5mm。随机选5只，在左背部皮下接种肝癌异种(猪)B细胞疫苗激活的T淋巴细胞1×10⁷只(治疗组)，另5只以同样部位注射等体积生理盐水(对照组)。接种3周后以肝癌异种(猪)B细胞疫苗激活的T淋巴细胞对治疗组裸鼠作第2次同样治疗。对照组注射等体积生理盐水。每周测量瘤体积1次，直到接种后第42天。肿瘤体积(mm³)＝长(mm)×宽(mm)×高(mm)。统计学处理：瘤体表达为X±S(mm)3，以T检验分析变量间差异。

结果显示，接种肝癌细胞42天后，治疗组、对照组肿瘤体积分别为(341±34)mm和(943±86)mm(P＜0.05)，与对照组相比，治疗组移植瘤生长受到明显的抑制(P＜0.05)。

2.肝癌异种(猪)B细胞疫苗活化的T淋巴细胞预防裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长实验

另10只裸鼠。第1天，在左背部皮下接种注射人T淋巴细胞2.5×10⁷、0.5ml/只，将其免疫细胞部分人源化。第8天，随机选5只再次注射肝癌异种(猪)B细胞疫苗激活的T淋巴细胞1×10⁷、0.5ml/只，作为预防组，另5只左背部皮下接种等体积生理盐水为对照。第12天将2×10⁶、0.1ml/只肝癌细胞接种于10只裸鼠右背部皮下。第16天预防组再次注射活化T细胞1×10⁷、0.5ml/只。每周观察1次接种移植瘤发生情况，直到接种后第42天。

结果显示，接种肝癌细胞35天后，治疗组、对照组肿瘤体积分别为(541±84)mm和(1743±186)mm(P＜0.05)，与对照组相比，治疗组移植瘤生长受到明显的抑制(P＜0.05)。