公开/公告号CN1703239A
专利类型发明专利
公开/公告日2005-11-30
原文格式PDF
申请/专利权人 遗传工程与生物技术中心;
申请/专利号CN200380101132.3
申请日2003-10-08
分类号A61K39/00;C07K14/54;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人赵艳华
地址 古巴哈瓦那
入库时间 2023-12-17 16:46:38
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-09-24
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K39/00 授权公告日:20090916 终止日期:20181008 申请日:20031008
专利权的终止
2009-09-16
授权
授权
2006-01-18
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-11-30
公开
公开
本发明涉及免疫学领域,尤其涉及IL-15在主动免疫治疗与IL-15过表达相关的疾病中的新用途。
已知细胞因子IL-15为14-15KDa的糖蛋白,由两个研究小组同时描述为T细胞-激活生长因子(Grabstein K.H.等人,Science1994,264,965;Burton J.D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994,91,4935)。IL-15的mRNA广泛存在于细胞和组织中,但由于在转录水平和胞内运输方面对其表达有较强的转录后调控,因而很难在这些细胞内或细胞上清液中发现该蛋白质(Bamford RN.等人,J.Immunol 1998,160:4418-4426),(Kurys G等人,J Biol Chem2000,275:30653-30659)。
IL-15的生物学效应通过其与由α、β和γ三个亚基组成的细胞膜受体结合介导。IL-15Rα是该细胞因子的特异性亚基,与其具有非常高的亲合性Kd 10-11,β亚基与IL-2共有,而γ亚基为若干细胞因子:IL-2;IL-4;IL-7;IL-9;IL-15;IL-21的通用受体(BamfordRN.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994,91,4935),(GiriJG.等人,EMBO J.1995,14:3654-3663)。
IL-15为免疫刺激细胞因子,促进T、B和NK细胞的增殖与功能活性(Giri,J.G.,EMBO J.1994,13,2822-2830),激活嗜中性粒细胞,修饰单核因子的分泌(Girard D.,1996,Blood,88,3176;Alleva D.G.,1997,J.Immunol.,159,2941)。该细胞因子介导若干免疫反应步骤的不同效应,诱导CD56 NK细胞增殖,与IL-12一起作用,诱导IFNγ和TNFα((Ross ME,1997,Blood 89,910-918;Fehniger TA,1999,Transplant Proc,31,1476-1478)。
配体与T细胞受体的结合诱导IL-15Rα的表达以及若干活化抗原例如CD69、CD25和TNFRII的表达。IL-15同时也是人血液T淋巴细胞的化学引诱物(Wilkinson 1995,J.Exp.Med.181,1255-1259)。所有这些资料表明抗原提呈细胞表达的IL-15对于炎症部位的早期T细胞活化可能非常重要。
已在若干疾病过程中检测到IL-15,包括Crohn′s疾病(KirmanI.,1996,Am.J.Gastroenterol.91,1789),银屑病(Rückert R.2000,165:2240-2250),白血病(Yamada Y.1999,Leukemia andLimphoma,35(1-2):37-45)和类风湿性关节炎(RA),(McInnes I.B.1998,Immunology Today,19,75-79)。
Feldmann等人,1996,Annu Rv Immunol,14:397-440)提出,TNFα是细胞因子级联中的主要细胞因子,该级联包括IL-1β,IL-6,GM-CSF和若干炎症性细胞因子,例如与类风湿性关节炎(RA)发展与进展密切相关的Mip 1α、Mip 1β和IL-8。McInnes等人发现IL-15在这些疾病中表达异常,IL-15在滑液中浓度很高,且在滑膜细胞中有表达。他们认为IL-15在细胞因子级联中领先于TNFα,提出细胞接触依赖机制,其中IL-15激活的T细胞诱导巨噬细胞合成TNFα。而且,提出IL-15是T细胞迁移至滑液的重要因素(McInnes,1997,NatMed,3:189-195)。
Ziolkowska等人报道,IL-15诱导IL-17在RA患者关节的表达,已知该细胞因子刺激滑膜细胞释放若干炎症性介质例如IL-6,IL-8,GM-CSF和前列腺素E2,表明IL-15在RA的病理发生中具有重要作用(Ziolkowska y col 2000,J Immunol,164:2832-2838)。
T细胞募集和活化可能是IL-15局部合成的结果,这种非特异性活化可能导致无止境的炎症。所有这些表明IL-15抑制在疾病治疗上可能具有治疗潜力。
已经证明在动物模型中使用IL-15拮抗剂分子是有效的。Ruchatz等人制备了来自小鼠受体的α亚基(IL-15α)的可溶性片段,并证明将其给予DBA/1小鼠时该片段抑制胶原-诱导的关节炎(Ruchatz H.1998,J.Immunol.160:5654-5660)。
其他已获专利的IL-15拮抗物分子包括,一个或多个氨基酸残基发生突变的IL-15,以及能够结合成熟IL-15阻断其受体信号转导的单克隆抗体(专利US6001973、US6177079、US6168783和US6013480)。尽管前述专利文件中描述了它们的应用,但科学期刊上发表的不少结果证实了它们的功效。2002年5月,Genmab公司公开了使用Immunex专利抗IL-15抗体的I/II期临床试验,该专利应相当于前面提及的专利US6177079,但这些结果尚未发表。
其它的研究包括嵌合蛋白质MutIL15-Fc,其与携带IL-15受体的细胞结合,导致激活的免疫细胞数目减少至低于临界水平并诱导耐受,例如在同种异体移植排斥中发挥重要作用的自反应激活T细胞应答IL-15,表明这些细胞可被作为IL-15拮抗剂的MutIL15-Fc蛋白质抑制。
疫苗参考书目中有少数关于抗自身分子抗体生成的实例,例如,用于治疗EGF依赖性肿瘤的针对EGF的疫苗(专利US5894018),其功效已在临床试验中通过诱导阻断EGF活性抗体的产生得到证明。由于天然的自我耐受机制,针对自身蛋白质中和抗体的生成非常复杂。
在本发明中,以适当配方的IL-15主动免疫产生针对IL-15的中和自身抗体,能中和出现在自身免疫疾病和白血病患者中异常大量的该细胞因子。
本发明中,进行主动免疫产生中和IL-15的自身抗体,通过免疫方案调节IL-15水平。
发明详述
本发明的创造性和新颖性在于,疫苗组合物使用IL-15进行主动免疫治疗IL-15过表达相关疾病。
该疫苗组合物将用于人体,以便诱导针对自身IL-15的中和抗体的应答。
本发明还包括IL-15与载体蛋白融合以及任何含有它们的其它制剂。
本发明还涉及该疫苗单独使用,或与抗炎药物或其它细胞因子拮抗物联合使用的用途。
根据本发明的某些实施方案,哺乳动物表达载体包含编码IL-15的DNA序列以适当配方用于主动免疫。
根据本发明的某些实施方案,IL-15是从大肠杆菌获得的重组蛋白质,其糖基化模式与自身IL-15不同。在本发明某些实施方案中,IL-15为活性蛋白质,根据CTLL-2分析比活性为2-5×106U/mg。
本发明从LPS-激活的单核细胞中分离IL-15基因,克隆入大肠杆菌表达载体并从此来源纯化。通过CTLL2测定对T细胞增殖的诱导测定蛋白质生物学活性。
根据本发明的某些实施方案,设计寡核苷酸通过PCR扩增IL-15基因,并将该基因插入含有编码p64k蛋白质基因的大肠杆菌表达载体获得融合蛋白质p64kIL-15。IL-15蛋白质融合在p64k载体蛋白的C-末端区域,从该来源纯化。通过CTLL2测定对T细胞增殖的诱导测定蛋白质生物学活性。
通过使用macacus irus猴作为模型阐述本发明的概念验证(proof-of-concept),猴IL-15与人具有96.4%的同源性。
根据本发明提供结果,证明用IL-15或融合蛋白质p64kIL-15主动免疫,在免疫动物血清中均生成IL-15特异性的抗体应答和中和抗体。
根据本发明,本发明目的还延伸至DNA疫苗,其包括含有编码IL-15 DNA的载体,及其作为IL-15表达相关疾病基因治疗替代物的应用。
所述疫苗可与抗炎药或免疫抑制剂或其它常用于RA治疗的细胞因子拮抗物联合给药。
附图简述
图1:IL-15的纯度
图2:融合蛋白质的纯度
图3:ELISA试验结果,显示猴中抗IL-15抗体水平
图4:猴血清中IL-15中和抗体的测定
提供下列实例以说明本发明的实施方案
实例1:重组IL-15的获得
通过RT-PCR从LPS-激活的单核细胞中分离编码人IL-15的DNA,克隆入大肠杆菌表达载体。
用8M尿素从细胞沉淀中提取大肠杆菌表达的重组IL-15,用TSKG4000SW(Merck)层析,继之用RP-C4(J.T.Baker),在水/丙酮、TFA缓冲体系中层析纯化。通过刺激CTLL-2细胞系增殖,用MTT线粒体染色来测定生物学活性(Cosman y col 1984,Nature,312:768-771)。IL-15的比活性为2×106U/mg(图1)。
重组p64k-IL15融合蛋白质的获得
设计寡核苷酸引物通过PCR扩增IL-15基因,并将其插入大肠杆菌表达载体中p64k的C-末端,得到P64k-IL15融合蛋白质(图2)。
用弗氏压碎器(French press)破裂细胞后,蛋白质是可溶的。
向破裂上清液中加入硫酸链霉素至0.8%,于4℃放置1小时,10000转/分,4℃离心15分钟。使用硫酸铵进行两步沉淀,沉淀悬浮于20mM Tris,6mM EDTA,2M尿素,0.5mg/ml pefabloc中,经TSK DEAE PW离子交换层析与Superdex 200凝胶过滤纯化。
实例2:macacus irus猴模型的评价
对3组猴免疫方案进行了评价:用IL-15免疫、用融合蛋白质和安慰剂免疫。在弗氏佐剂中以每次接种100μg的蛋白质的量给予蛋白质。首次免疫使用弗氏完全佐剂,1个月后二次免疫用不完全弗氏佐剂,2个月后第三次免疫用不完全弗氏佐剂。第二和第三次免疫后1周,抽取血液评价猴血清中的抗IL15抗体水平。数据如图3所示。
实例3:猴血清中中和抗体的测定
有IL-15存在时细胞因子-依赖细胞系CTLL-2增殖。阻碍受体依赖信号转导的IL-15结合分子将会抑制该细胞系的增殖。
为了评价存在于猴血清中的抗体的中和能力,用50μl补充有10%胎牛血清(Gibco)的RPMI培养基(Gibco),将血清在96孔板(Costar,USA)中连续稀释。向各孔加入亚最佳量的IL-15(30pg),加入5×103细胞/孔的预先洗过的CTLL-2细胞。平板在5%CO2中,于37℃孵育48小时。使用MTT线粒体染色法测定增殖(Cosman等人,1984,Nature,312:768-771)。
从图3所示的结果可以看出抗体-介导的对IL-15诱导增殖的抑制。
发明优点:
-在整个时期内,生成抗体的水平比通过被动免疫获得的更稳定
-与被动免疫相比,患者给药次数更少
-每剂量需要的蛋白质数量和剂量数远低于用IL-15拮抗物分子治疗需要的量;这指示较低的生产成本。
机译: 含有il-15多肽和含有il-15复合物的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途
机译: 含有白介素15(il-15)的疫苗组合物
机译: 包含白介素15(IL-15)的疫苗组合物